Chiết xuất Herba Cistanche tăng cường trạng thái và hô hấp Glutathione ty thể ở tim chuột, với khả năng tạo ra các protein tách rời

Giới thiệu

Tái tưới máu cơ tim thiếu máu cục bộ trước đây gây ra một loạt thay đổi về ty thể, bao gồm tăng sản xuất các loại oxy phản ứng (ROS), Ca2+tình trạng quá tải và suy giảm sản xuất adenosine triphosphate (ATP), tất cả đều có thể dẫn đến hoại tử và/hoặc chết tế bào qua trung gian apoptosis (Redegeld và cộng sự, 1992; Lemasters và cộng sự, 1998). Vì ty thể đóng một vai trò quan trọng trong việc xác địnhTrong số phận của các tế bào cơ tim sau thử thách thiếu máu cục bộ/tái tưới máu (I/R), do đó, việc bảo vệ chống lại tổn thương I/R cơ tim phải hướng tới việc bảo tồn tính toàn vẹn về cấu trúc và chức năng của ty thể. Việc duy trì chuyển hóa năng lượng của ty thể sau thử thách I/R là đặc biệt quan trọng vì chức năng co bóp của tim gần như phụ thuộc hoàn toàn vào ATP do ty thể tạo ra. Các tế bào cơ tim còn sống nhưng không co bóp thì rất ít có tác dụng.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Herba Cistanche, toàn bộ cây khô củaCistanche DeserticolaYC Ma (Orobanchaceae), là một loại cây ký sinh mọc chủ yếu ở các vùng sa mạc phía bắc và đông bắc Trung Quốc. Herba Cistanche, được phân loại là loại thảo dược “tiếp thêm sinh lực” trong y học Trung Quốc, được kê đơn để điều trị chứng suy thận, vô sinh ở phụ nữ và táo bón phát sinh do khô ruột ở bệnh nhân già (Chen, 1998). Các nghiên cứu trước đây trong phòng thí nghiệm của chúng tôi đã chỉ ra rằng metanolchiết xuất Herba Cistanchetăng khả năng tạo ATP của cơ tim (Leung & Ko, 2008) và bảo vệ chống lại tổn thương I/R cơ tim ở chuột (Leung, 2006). Trong khi việc kích thích khả năng tạo ATP song song với việc tăng cường vận chuyển điện tử của ty thể (Leung & Ko, 2008), việc bảo vệ tim mạch chống lại tổn thương I/R do điều trị bằng Herba Cistanche có liên quan đến việc giảm sự suy giảm ATP của cơ tim (Leung, 2006). Trong nghiên cứu hiện tại, để xác định vai trò của ty thể trong hoạt động bảo vệ tim mạch của Herba Cistanche, chúng tôi đã nghiên cứu tác động của việc điều trị bằng Herba Cistanche đối với tình trạng glutathione của ty thể, hàm lượng Ca2+, điện thế màng và tốc độ hô hấp ở tim chuột. .

Nguyên liệu và phương pháp

Nguyên liệu thảo dược

Herba Cistanche được mua từ một đại lý thảo dược địa phương (có trụ sở tại Hồng Kông) (Lee Hoong Kee). Loại thảo mộc này đã được nhà cung cấp xác nhận và mẫu chứng từ (HKUST00301) đã được gửi tại Khoa Hóa sinh, Đại học Khoa học & Công nghệ Hồng Kông (HKUST). Việc chiết xuất metanol của loại thảo dược này đã được tiến hành, dựa trên các nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng chiết xuất này giúp tăng cường sản xuất ATP của ty thể và bảo vệ chống lại tổn thương I/R ở tim chuột (Leung, 2006; Leung & Ko, 2008). Tóm lại, Herba Cistanche (400 g) được cắt thành từng miếng nhỏ và chiết xuất bằng cách đun nóng hồi lưu trong 300mL metanol ở 60 độ trong 2 giờ, như đã mô tả trước đây (Leung & Ko, 2008). Thủ tục được lặp lại hai lần. Dịch chiết gộp được làm khô bằng cách làm bay hơi dung môi dưới áp suất giảm; năng suất là 42% (w/w) đối với lượng thảo dược thô. Dịch chiết được bảo quản ở 4 độ cho đến khi sử dụng. Mặc dù các loại thảo mộc Trung Quốc thường được chiết xuất bằng nước để dùng qua đường uống, nhưng trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi, metanol đã được sử dụng để thuận tiện cho việc xử lý và bảo quản mẫu (Yim & Ko, 2002), và chúng tôi nhận thấy việc chiết xuất metanol là đạt yêu cầu về mọi mặt.

Chăm sóc động vật và điều trị bằng thuốc

Chuột cái Sprague-Dawley trưởng thành (8–10 tuần tuổi; 200–230 g) được nhốt trong phòng được kiểm soát độ ẩm, với chu kỳ tối/sáng 12 giờ, ở khoảng 22 độ và được phép ăn uống tự do. Các con vật được phân ngẫu nhiên vào các nhóm khác nhau, mỗi nhóm có năm con. Chuột đã nhận đượcChiết xuất Herba Cistanchetrong dạ dày ({0}},2 g/mL trong nước) ở mức 0,5g/kg hoặc 1,0 g/kg trong 3 ngày liên tiếp. Động vật đối chứng (không được điều trị) chỉ nhận được nước. 24 giờ sau liều cuối cùng, mô tâm thất được lấy từ động vật đã được gây mê để phân tích sinh hóa. Tất cả các giao thức thử nghiệm đã được phê duyệt bởi Ủy ban Thực hành Nghiên cứu, HKUST.

Chuẩn bị các phần ty thể

Các mô tâm thất được băm nhỏ (~{0}}.6g) được đồng nhất hóa ở mức 10-gấp (w/v) dung dịch đệm sucrose lạnh như đá [0,32M sucrose, 1mM ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA), 50mM Tris/HCl; pH 7.4] sử dụng thiết bị đồng nhất thủy tinh Teflon, ở tốc độ 4000 vòng/phút, với 25–30 hành trình. Các viên ty thể được điều chế từ các chất đồng nhất mô bằng cách ly tâm ở tốc độ 800×g ở 4 độ trong 30 phút, và độ tinh khiết được xác định bằng cách đo các hoạt tính đặc hiệu tương đối của succinate dehydrogenase và lactate dehydrogenase trong phần nổi phía trên và viên, tương ứng, như được mô tả trước đây (Evans, 1992). Các viên ty thể được lơ lửng trong 1mL dung dịch đệm đồng nhất.

Đo nồng độ glutathione giảm trong ty thể và mức độ glutathione bị oxy hóa

Mức glutathione giảm ty thể (GSH) được xác định bằng phương pháp enzym bằng cách sử dụng 5,59-dithiobis(2- axit nitrobenzoic) (DTNB) và glutathione reductase (GR), trong một quy trình được sửa đổi từ Griffith (198{{17} }). Một phần nhỏ (210 µL) của phần ty thể được trộn với 90 µL của 10% (v/v) 5-axit sulfosalicylic (SSA) và hỗn hợp được ly tâm ở tốc độ 600 × g trong 10 phút. Để đo mức glutathione bị oxy hóa (GSSG), 100 µL chất nổi phía trên SSA được trộn với 10 µL 20% (w/v) 2-vinylpyridine và 10 µL 60% (v/v) trietanolamine trong ống microfuge. Mỗi ống được phép đứng ở nhiệt độ phòng trong ít nhất 1 giờ. Hỗn hợp phản ứng chứa 0,63mM DTNB và 0,053mM NADPH (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate khử) trong dung dịch đệm phosphat (0,1M, với 5mM Na2 EDTA; pH7,5) được ủ trước ở 30 độ trong 2 phút. Một phần mẫu (30 µL) chất nổi phía trên mẫu SSA (tổng glutathione) hoặc mẫu GSSG được thêm vào giếng của đĩa microtiter giếng 96-và 180 µL hỗn hợp phản ứng được làm ấm trước, chứa 0,525U/ mL GR, được thêm vào tiếp theo. Sự thay đổi độ hấp thụ ở bước sóng 412nm được theo dõi bằng phép đo quang phổ trong 5 phút. Nồng độ GSH và GSSG được ước tính từ đường cong hiệu chuẩn sử dụng GSH và GSSG [hòa tan trong 3% (w/v) SSA] làm chất chuẩn và được biểu thị dưới dạng nmol/mg protein. Mức GSH được ước tính bằng cách lấy tổng GSH trừ đi gấp đôi lượng GSSG.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ CẢI THIỆN CHỨC NĂNG TÌNH DỤC PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Đo hàm lượng Ca{0}} của ty thể

Hàm lượng Ca{0}} của ty thể được đo bằng đầu dò huỳnh quang nhạy Ca2+-, Fluo-5N AM ester (Đầu dò phân tử, Eugene, OR) sử dụng Bộ đếm nhiều nhãn Victor2 (Mẫu 1420; PerkinElmer, Turku, Phần Lan), như được mô tả trong Menze et al. (2005). Hằng số phân ly Ca2+ (giá trị Kd) được xác định bằng cách sử dụng bộ hiệu chuẩn Ca2+ hợp lệ trong khoảng nồng độ 1–1000 µM; theo dữ liệu của nhà sản xuất bộ sản phẩm, giá trị Kd ước tính là 90–100 µM, với độ tin cậy cao. Một phần nhỏ (25µL) của phần ty thể (nồng độ cuối cùng là 0,5 mg protein/mL) được trộn với 25 µL dung dịch đệm ủ {100mM KCl và 30mM MOPS [3-(N-morpholino)propanesulfonic acid]; pH7,2} trong 96-đĩa microtiter đen giếng. Hỗn hợp được ủ ở 25 độ trong 15 phút; Sau đó, 25 µL digtonin (50 µg/mL) và 25 µL Fluo-5N AM ester (1 µM trong 0,005% (w/v) Pluronic F-127) được thêm vào. Bằng cách tạo điều kiện cho sự thẩm thấu của màng, sự xâm nhập của thuốc nhuộm huỳnh quang vào ty thể qua trung gian Digitonin. Chúng tôi nhận thấy rằng nồng độ Fluo-5N trong các chế phẩm ty thể của tim chuột đã tăng 20-gấp đôi khi có sự hiện diện của Digitonin. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 25 độ trong 30 phút và đo huỳnh quang ở bước sóng kích thích 488nm và bước sóng phát xạ 532nm. Hàm lượng Ca2+ của ty thể được ước tính bằng cách sử dụng đường chuẩn và biểu thị dưới dạng µmol/mg protein.

Đo điện thế màng ty thể

Điện thế màng (ΔΨm) được đánh giá bằng phương pháp được sửa đổi từ phương pháp của Bonavita et al. (2003), sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang, đầu dò cation ưa mỡ 5,596,69- tetrachloro-1,193,39-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide, thường được gọi là JC-1. Các phần dịch (50 µL) của các phần ty thể (được điều chỉnh thành 1mg protein/mL) được ủ ở 37 độ với 50 µL dung dịch cơ chất (chứa 6mM pyruvate và 6mM malate), 25 µL dung dịch adenosine diphosphate (ADP) (30mM) đã xử lý trước, và 25 µL 3 µM JC{18}}, trong bóng tối. Giá trị ΔΨm thu được bằng cách đo huỳnh quang ở bước sóng 535nm (FL1) so với 580nm (FL2), sử dụng Bộ đếm đa nhãn Victor2. JC-1 hình thành các tập hợp trong ty thể, mang lại giá trị huỳnh quang FL2 cao và cho thấy tiềm năng bình thường của ty thể. Mất ΔΨm dẫn đến giảm huỳnh quang FL2 (JC-1 tổng hợp ở mức độ thấp hơn) và đồng thời tăng huỳnh quang FL1 (từ các đơn phân JC-1). Dữ liệu được biểu thị dưới dạng tỷ lệ của giá trị huỳnh quang FL1 / FL2. Carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP), một chất làm sụp đổ ΔΨm, đã được sử dụng để xác nhận thử nghiệm.

Đo hô hấp của ty thể

Tốc độ hô hấp của ty thể được đo ở 37 độ bằng thiết bị Hansatech Oxygraph-Plus được trang bị điện cực oxy loại Clark (Sarasota, FL, Hoa Kỳ). Các phân đoạn ty thể (0,6 mg protein/mL) được tạo huyền phù trong dung dịch đệm hô hấp chứa 125mM KCl, 20mM MOPS, 10mM Tris, axit tetraacetic ethylene glycol 0,5mM (EGTA) và 2mM KH2 PO4; pH 7,2. Sau khi ủ ở 37 độ trong 2 phút, mỗi mẫu nhận được 50 µL dung dịch cơ chất (5mM pyruvate và 5mM malate). Tốc độ hô hấp được đo khi có mặt (Trạng thái 3) của 1mM ADP và sau khi phosphoryl hóa tất cả ADP thành ATP (Trạng thái 4). Tỷ lệ tỷ lệ hô hấp ở Trạng thái 3:Trạng thái 4 là chỉ số kiểm soát hô hấp, biểu thị mức độ chặt chẽ của sự kết hợp giữa hô hấp và quá trình phosphoryl hóa (Javadov và cộng sự, 2005; Kuwabara và cộng sự, 1997). Trước khi thêm dung dịch cơ chất, tốc độ hô hấp ở Trạng thái 1 được đo cho đến khi bắt đầu hô hấp ở Trạng thái 2 và tốc độ hô hấp ở Trạng thái 2 được ước tính trước khi bổ sung ADP.

Phân tích thống kê

Dữ liệu được phân tích bằng phân tích phương sai một chiều (ANOVA) để so sánh nhiều nhóm. Các giá trị khác biệt nhỏ nhất có ý nghĩa (LSD) được sử dụng để xác định những khác biệt đáng kể giữa hai nhóm khi giá trị p < 0.05.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ CẢI THIỆN CHỨC NĂNG TÌNH DỤC PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Kết quả

Như thể hiện trong Hình 1 và 2, xử lý bằng metanolchiết xuất Herba Cistanche({{0}}.5 hoặc 1,0g/kg/ngày×3) đã nâng cao đáng kể tình trạng glutathione của ty thể trong tim chuột, bằng chứng là mức độ GSH tăng phụ thuộc vào liều lượng (11–30%) và giảm Mức GSSG (31%).

Liều điều trị bằng Herba Cistanche làm giảm nồng độ Ca2+ của ty thể trong tim chuột một cách phụ thuộc vào liều lượng so với đối chứng; mức ức chế là 41% ở liều 1.0 g/kg (Hình 3).

Điều trị bằng Herba Cistanche làm tăng ΔΨm của ty thể, bằng chứng là tỷ lệ FL1/FL2 giảm (14–16%). CCCP (100 µM) gây ra sự sụp đổ ΔΨm, được biểu thị bằng sự gia tăng tỷ lệ FL1/FL2 (Hình 4).

Điều trị Herba Cistanchehô hấp của ty thể được tăng cường, bằng chứng là tốc độ hô hấp ở Trạng thái 3 cao hơn đáng kể (84%) ở động vật thử nghiệm so với đối chứng (Bảng 1). Mức độ hô hấp ở Trạng thái 2 và Trạng thái 4 lần lượt tăng lên 47 và 80%, nhưng sự kích thích hô hấp ở Trạng thái 4 bị ức chế hoàn toàn bởi 1mM guanosine-5'-diphosphate, một chất ức chế protein tách cặp 2/3. Điều trị bằng Herba Cistanche không ảnh hưởng đến chỉ số kiểm soát hô hấp, được ước tính bằng tỷ lệ nhịp thở ở Trạng thái 3/Trạng thái 4.

Cuộc thảo luận

Ty thể phân lập từ tim chuột được điều trị bằng Herba Cistanche cho thấy tình trạng glutathione được tăng cường, được biểu thị bằng mức GSH tăng và mức GSSG giảm. Việc duy trì trạng thái oxy hóa khử glutathione của ty thể là rất quan trọng để bảo vệ tim khỏi chấn thương I/R (Chiu & Ko, 2003). Hàm lượng Cytosolic Ca2+ tăng lên trong quá trình thiếu máu cục bộ cơ tim, thông qua sự hấp thu của cơ quan đơn vận chuyển Ca2+ của màng bên trong (Ataka và cộng sự, 1992; Grover và cộng sự, 1990), dẫn đến Ca{{6} của ty thể. } tích lũy. Kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng việc điều trị bằng chiết xuất Herba Cistanche đã nâng cao tình trạng oxy hóa khử glutathione của ty thể và giảm mức Ca2+ của ty thể, có thể bảo vệ chống lại tổn thương I/R cơ tim (Leung, 2006). Việc điều trị bằng Herba Cistanche không có khả năng làm giảm mức GSSG và Ca{11}} ở liều cao hơn 1,0 g/kg, có thể liên quan đến sự tồn tại của cơ chế điều hòa tự giới hạn ảnh hưởng đến khả năng oxy hóa khử glutathione và tình trạng canxi trong ty thể.

Ty thể tạo ra một gradient proton điện hóa xuyên qua màng trong bằng cách vận chuyển điện tử. Độ dốc này được ATP synthase sử dụng để phosphoryl hóa ADP thành ATP. Giảm tiềm năng màng ty thể, như trong tình trạng thiếu oxy/tái oxy hóa sau tổn thương tế bào cơ tim nuôi cấy (Chiu và cộng sự, 2008), dẫn đến giảm sản xuất ATP. Điều trị bằng Herba Cistanche, có thể làm tăng tiềm năng màng ty thể của cơ tim, có thể tăng cường sản xuất ATP, đặc biệt trong quá trình tái tưới máu sau thiếu máu cục bộ. Một lần nữa, sự tồn tại của cơ chế điều hòa tự giới hạn có thể giải thích tại sao tác dụng điều trị của Herba Cistanche đối với tiềm năng màng ty thể không phụ thuộc vào liều lượng.

Phương pháp điều trị bằng Herba Cistanche đã làm tăng đáng kể tốc độ hô hấp Trạng thái 3 trong ty thể của tim chuột, được đánh giá bằng mức tiêu thụ oxy. Phát hiện này phù hợp với kết quả thu được từ các phép đo in vitro và tại chỗ về khả năng tạo ATP của ty thể (Leung & Ko, 2008). Điều thú vị là, mặc dù việc điều trị bằng Herba Cistanche làm giảm mức ATP ở trạng thái ổn định của cơ tim (dữ liệu không được hiển thị), nhưng việc điều trị đã tăng cường tạo ra ATP của ty thể. Sự tham gia của quá trình hô hấp không liên tục có thể giải thích những quan sát trái ngược này. Quá trình phosphoryl oxy hóa tách rời xảy ra khi các proton được di chuyển qua màng trong của ty thể trở lại ma trận ty thể, do đó làm tiêu tan điện thế màng được hình thành bởi chuỗi vận chuyển điện tử. Điều này dẫn đến việc giảm động lực của proton thúc đẩy sự hình thành ATP (Garvey, 2003). Kết quả là nồng độ Ca2+ và quá trình sản xuất ROS trong ty thể bị suy giảm đáng kể (Teshima và cộng sự, 2003). Đề xuất này phù hợp với kết quả của nghiên cứu hiện tại, cho thấy nồng độ Ca2+ của ty thể giảm ở tim được điều trị bằng Herba Cistanche. Liên quan đến hô hấp tách rời, quá trình tổng hợp các protein tách cặp (UCP) có thể được thực hiện bằng phương pháp xử lý Herba Cistanche. UCP được biết là có tác dụng tách rời quá trình phosphoryl hóa oxy hóa và sự biểu hiện của UCP1 ở tim chuột biến đổi gen được bảo vệ chống lại tổn thương cơ tim do I/R gây ra (Hoerter và cộng sự, 2004). Tác dụng tách cặp của UCP bị ức chế bởi purine nucleotide diphosphate và triphosphate (như ADP, ATP, guanosine diphosphate (GDP) và GTP) (Echtay et al., 2002). Trong nghiên cứu hiện tại, các thông số của ty thể như điện thế màng và tốc độ hô hấp được đo với sự có mặt của ADP (dưới dạng cơ chất); do đó tác dụng tách cặp của UCP bị ức chế. Tuy nhiên, khi đo nhịp thở ở Trạng thái 4 của ty thể khi không có ADP, tỷ lệ này ở ty thể được điều chế từ tim được điều trị bằng Herba Cistanche cao hơn so với ở tim của nhóm đối chứng không được điều trị. Tốc độ hô hấp ở Trạng thái 4 phản ánh mức tiêu thụ oxy của ty thể khi proton rò rỉ trở lại ma trận ty thể thông qua cơ chế không liên quan đến F1 F{17}}ATPase (Garvey, 2003). Khả năng tham gia của UCP vào sự gia tăng hô hấp ở Trạng thái 4 do Herba Cistanche gây ra được hỗ trợ bởi phát hiện rằng sự tăng cường này đã bị GDP ngăn chặn (Bento và cộng sự, 2007).

Tóm lại, điều trị bằng Herba Cistanche có thể nâng cao trạng thái glutathione của ty thể, giảm mức Ca{0}} của ty thể và tăng tiềm năng màng ty thể cũng như tốc độ hô hấp ở tim chuột. Sự tăng cường trạng thái glutathione của ty thể và khả năng hoạt động cũng như việc tạo ra UCP giả định có thể liên quan đến khả năng bảo vệ tim mạch được cung cấp bởiĐiều trị Herba Cistanchesau chấn thương I/R.

CISTANCHE TUBULOSA THỰC VẬT TỰ NHIÊN CHIẾT XUẤT CISTANCHE PHGS75% ECH 30% ACT 12%