HLA-G được biểu hiện rộng rãi bởi các tế bào Mast ở các vùng xơ hóa cơ quan ở gan, phổi và thận

edmund.chen@wecistanche.com

Trừu tượng:Trước đây chúng tôi đã chứng minh rằng các tế bào mast biểu hiện HLA-G có liên quan đến các vùng của vi rút viêm gan C gây raGanxơ hóa. Ở đây, chúng tôi nhằm mục đích xác định xem liệu biểu hiện HLA-G trong tế bào mast có phải là đặc trưng cho căn nguyên vi rút hay không,Gan, hoặc quá trình chung của xơ hóa. Chúng tôi đã liệt kê các tế bào HLA-G cộng và tế bào mast bằng hóa mô miễn dịch của (i)Ganchặn khỏi 41 trường hợp xơ gan do rượu, (ii) 10 trường hợp xơ hóa phổi vô căn (IPF), và (iii) 10 trong số renalxơ hóa. Bản chất của các tế bào HLA-G cộng được xác định bằng phương pháp phát huỳnh quang miễn dịch đa hợp sử dụng phần mềm. Hơn một nửa trong số tất cả các tế bào HLA-G cộng là tế bào mast ở các khu vực xơ sợi của bệnh xơ gan do rượu và IPF. bên trongthận,bị xơ hóa, các tế bào HLA-G plus thực sự là tế bào mast nhưng không thể đếm được. Hơn nữa, trong một số trường hợpGanvà phổi, chúng tôi quan sát thấy một số nút tế bào, là các nang thứ cấp hoặc thứ ba, trong đó HLA-G được biểu hiện nhiều bởi tế bào lympho B. Kết luận, HLA-G cộng với các tế bào mast có thể được quan sát thấy trong các vùng sợi của tất cả các cơ quan được nghiên cứu. Các nghiên cứu trước đây cho thấy vai trò bảo vệ của HLA-G cộng với các tế bào mast chống lại quá trình viêm và xơ hóa. Các nang quan sát có tế bào lympho B biểu hiện HLA-G cũng có thể củng cố vai trò chống xơ sợi của chúng.

Từ khóa:xơ hóa; HLA-G; tế bào mast; nang noãn; Tế bào lympho B; chống xơ hóa; Quả thận; Gan

Giới thiệuCác bệnh mãn tính dẫn đến xơ hóa các cơ quan có liên quan đến tỷ lệ tử vong và bệnh tật đáng kể, chiếm tới 45 phần trăm số ca tử vong ở các nước phát triển [1]. Tỷ lệ mắc các bệnh xơ hóa đang gia tăng đều đặn và là một vấn đề sức khỏe cộng đồng quan trọng. Các bệnh xơ hóa có thể ảnh hưởng đến tất cả các cơ quan, chẳng hạn nhưGan, thận, phổi và tim. Bệnh lý xơ hóa được đặc trưng bởi sự lắng đọng quá mức của các thành phần của chất nền ngoại bào (ECM), chẳng hạn như collagen. Sự tích tụ ECM như vậy phá hủy cấu trúc bình thường của cơ quan và dẫn đến rối loạn chức năng cơ quan và thất bại với sự thay đổi các chức năng chuyên biệt của từng cơ quan, tức là đối vớiGan, chức năng giải độc, cho phổi, chức năng trao đổi khí, vàquả thận,chức năng của năm mươi. Ngoài ra, xơ hóa có thể thúc đẩy sự phát triển của ung thư. Cấy ghép để thay thế cơ quan xơ thường là lựa chọn điều trị tốt nhất. Quá trình xơ hóa xảy ra để phản ứng với chấn thương hoặc tổn thương mô sau phản ứng viêm dai dẳng hoặc quá mạnh. Bệnh xơ hóa, ban đầu có thể đảo ngược, có thể tiến triển đến trạng thái không thể phục hồi [2]. CácGancó thể bị thương do vi rút (viêm gan B, C, D, E), độc tố nấm, ký sinh trùng, tự kháng thể, chế độ ăn nhiều chất béo và uống quá nhiều rượu, là nguyên nhân thường gặp củaGanxơ hóa [3] và thậm chí là nguyên nhân chủ yếu ở một số quốc gia. Khi những lời lăng mạ được lặp lại,Ganphát triển bệnh viêm gan mãn tính với xơ hóa, sau đó là xơ hóa hoặc xơ gan tiến triển, đây là một trạng thái dễ mắc ung thư biểu mô tế bào gan (HCC).

Ở phổi, bệnh xơ hóa phổi tự phát (IPF) đại diện cho bệnh phổ biến nhất trong một nhóm bệnh bao gồm bệnh xơ hóa phổi quá mẫn và bệnh phổi dạng thấp. Bệnh phổi mô kẽ xơ sợi tiến triển mãn tính không rõ nguyên nhân này hiếm gặp, ảnh hưởng đến ba triệu người trên toàn thế giới. Tuy nhiên, IPF có liên quan đến tử vong sớm. Thật vậy, IPF dẫn đến suy hô hấp tiến triển và cũng đại diện cho một yếu tố nguy cơ độc lập đối với ung thư phổi [4]. Ghép phổi nên được coi là một lựa chọn cho những bệnh nhân trẻ tuổi mắc bệnh ở giai đoạn nặng.

Thậnxơ hóa là con đường chung cuối cùng của nhiều bệnh tiến triểnbệnh thận.Tỷ lệ mắc bệnh mãn tínhbệnh thận, dẫn đến giai đoạn cuốibệnh thận, đã gia tăng đáng kể, ảnh hưởng đến 10 phần trăm dân số thế giới, với tỷ lệ tử vong cao [5]. Ngoài ra, bệnh nhân mãn tínhbệnh thậntăng nguy cơ phát triểnquả thậnung thư (gấp 10 lần so với dân số chung), với tổn thương hai bên và / hoặc đa ổ thường xuyên [6].

Bất kể cơ quan nào phát triển bệnh xơ hóa, điều quan trọng là phải hiểu các cơ chế liên quan đến sự xuất hiện của nó để phát triển các liệu pháp ngăn ngừa nó. Đặc biệt, tình trạng viêm nhiễm mãn tính dẫn đếnGanhoặcthậnxơ hóa và kiểm soát nó có thể giúp hạn chế sự tiến triển của nó và sự khởi phát của suy nội tạng hoặc ung thư. Cytokine và chemokine đóng vai trò trung tâm trong cả việc định hướng phản ứng miễn dịch và duy trì quá trình viêm nhiễm [7,8]. Ngoài các phân tử miễn dịch này, các protein khác, chẳng hạn như HLA-G, một phân tử HLA lớp Ib nổi tiếng với các đặc tính điều hòa miễn dịch, đã được nghiên cứu [9]. Trước đây chúng tôi đã chứng minh rằng HLA-G được biểu hiện bởi các tế bào mast có liên quan đến khu vực của vi rút viêm gan C gây raGanxơ hóa [10,11]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã điều tra xem liệu biểu hiện HLA-G trong tế bào mast có phải là nguyên nhân gây bệnh virus hay không,Gan, hoặc quá trình xơ hóa, không phân biệt cơ quan. Chúng tôi xác định đặc điểm biểu hiện HLA-G trong tế bào mast và tế bào miễn dịch trên các khối paraffifin của nhóm thuần tập gồm 41 bệnh nhân xơ gan do rượu, 10 bệnh nhân IPF và 10 bệnh nhân bịthậnxơ hóa. Việc xác định chính xác các tế bào biểu hiện HLA-G được thực hiện bằng cách sử dụng phương pháp huỳnh quang miễn dịch bốn lần trên các phần paraffifin và phần mềm phân tích riêng biệt sự phát huỳnh quang và hợp nhất nó trên ba trường hợpGanxơ hóa do rượu gây ra và hai của IPF.

Kết quả

Biểu hiện định lượng và bản chất của tế bào HLA-G cộng với bệnh xơ hóa do rượuMột nghiên cứu hóa mô miễn dịch ban đầu được thực hiện trên một loạt các mẫu xơ hóa do rượu (n=41), cho phép liệt kê các tế bào HLA-G plus và CD117 plus trên toàn bộ các trang trình bày bằng cách liệt kê bán tự động bằng phần mềm HALO. Kết quả được tóm tắt trong Bảng 1.

Các tế bào HLA-G plus và CD117 plus được đếm trên toàn bộ bề mặt của các slide nối tiếp của 41 trường hợp xơ gan do rượu bằng phần mềm HALO với thuật toán thích hợp sau hóa mô miễn dịch với 4H84, nhận biết HLA-G và anti-CD117 / c-kit. Giá trị trung bình, độ lệch chuẩn và phạm vi được chỉ định cho các ô HLA-G cộng và CD117 cộng: 555 ± 699 ô HLA-G cộng / (41–2686) và 200 ± 271 CD 117 cộng (12–1113).

Các đặc điểm hình thái học của tế bào HLA-G cộng trong biểu đồ xơ gan do rượu tương ứng với tế bào mast (Hình 1A). Trong một số trường hợp, đánh dấu kép cho CD117 và các tế bào mast ở người được thực hiện và cho thấy rằng các tế bào cộng thêm CD117 ở gan là các tế bào mast trong vùng sợi (Hình 1A). Ba trường hợp điển hình của xơ gan do rượu đã được nghiên cứu bằng phương pháp soi cầu miễn dịch tứ phương và nhuộm Sirius Red bằng phần mềm HALO để xác định chính xác các tế bào HLA-G plus. Diện tích trung bình của xơ hóa tương ứng với 19,4 phần trămGankhăn giấy. Việc xác định các tế bào HLA-G cộng cho thấy 51 phần trăm là tế bào mast (Bảng 2; Hình 1A, 1B1) được xác định bởi tryptase tế bào mast người cộng với kiểu hình CD1177 hoặc tryptase tế bào mast người cộng với đồng nhuộm cho CD117. Tế bào mô đệm biểu hiện HLA-G nằm trong vùng sợi xơ (Hình 1B1). Ngược lại, 49 phần trăm các tế bào HLA-G cộng không phải là tế bào mast cũng không phải tế bào cộng CD117 (Bảng 3) và thường được nhóm lại với nhau thành các nút (Hình 1B2). Do đó, việc ghi nhãn khác đã được thực hiện trên các vùng khác nhau để xác định các ô này (Bảng 4). Sự phân chia lại của các loại tế bào HLA-G plus khác nhau tùy thuộc vào khu vực củaGanmô được kiểm tra (Bảng 3 và 4). Nhìn chung, 63% các tế bào HLA-G cộng trong vùng xơ sợi dường như là tế bào mast so với chỉ 3% trong các nút. Ngoài ra, 68 phần trăm tế bào HLA-G cộng trong các nút cùng biểu hiện CD20, một dấu hiệu của tế bào lympho B (Hình 1C1) và 3 phần trăm CD3 (Hình 1C2). HLA-G cộng với CD117 tryptase tế bào mast HLA-G cộng với CD117 HLA-G cộng với CD117 tryptase tế bào mast và HLA-G cộng với CD117 cộng với tế bào mast-cell cộng tryptase được đếm trong ba trường hợp đại diệnGanxơ hóa bằng phần mềm HALO với thuật toán thích hợp. Các tế bào được đếm ở hai vùng khác nhau của mẫu xơ gan do rượu, tức là vùng xơ và nút tế bào, trong một trường hợp đại diện làGanxơ hóa bằng phần mềm HALO với thuật toán thích hợp. Không có tế bào HLA-G cộng với đồng biểu hiện CD31, một dấu hiệu của tế bào nội mô hoặc CD1a, một dấu hiệu của tế bào đuôi gai.

Hình 1. Bản chất của các tế bào HLA-G trên một trường hợp đại diện củaGanxơ hóa. (A) Trong đoạn đầu tiên, hai bức ảnh bên trái cho thấy biểu hiện của HLA-G và CD117 về một trường hợp tiêu biểu củaGanxơ hóa trong số 41 trường hợp sử dụng hóa mô miễn dịch, với 4H84 nhận biết HLA-G và kháng thể CD117 nhận ra các tế bào c-kit. Các slide đã được so sánh bởi Mayer hematoxylin. Các nhịp xơ được bao quanh bởi một đường màu đỏ. Các khu vực trong vòng tròn có địa hình tương ứng với các slide nhuộm màu HLA-G và CD117. Hình chữ nhật cho thấy độ phóng đại mạnh của các khu vực này cho thấy rằng hai ô HLA-G khớp với hai ô CD117. Hơn nữa, chúng có hình thái tương thích với tế bào mast. Ảnh chụp ở dạng huỳnh quang kép (CD117 / tryptase của tế bào Mast) với ba ảnh ở bên phải tương ứng với sự huỳnh quang đơn giản (DAPI tô màu hạt nhân bằng màu xanh lam, CD117 màu xanh lục, tryptase tế bào mast màu đỏ) cho thấy phần lớn các tế bào được đồng nhãn Trong màu vàng. Các tế bào CD117 phần lớn là tế bào mast. (B) Tứ giác miễn dịch huỳnh quang trên một trường hợp đại diện củaGanxơ hóa (trong số ba) sử dụng DAPI với màu xanh lam nhân, HLA-G (với kháng thể 4H84) với màu giả xanh lục, CD117 có màu giả lục lam, tryptase tế bào mast có màu giả đỏ và hình ảnh tổng hợp hoặc hợp nhất. Ở bên phải, màu đỏ Sirius được thể hiện. 1 và 2 tương ứng với hai khu vực khác nhau củaGan,tương ứng với khoảng thời gian xơ hóa và nút tế bào. Phần lớn các tế bào HLA-G đồng biểu hiện CD117 và men tryptase của tế bào mast trong quá trình xơ hóa (1). Ngược lại, phần lớn các tế bào HLA-G không phải là tế bào mast đồng biểu hiện, ngoại trừ một số tế bào HLA-G ở ngoại vi của nút tế bào (2), gần hoặc trong quá trình xơ hóa. (C) Tăng gấp bốn lần phát huỳnh quang miễn dịch trên các tế bào nút củaGanxơ sợi thể hiện ở B2, với DAPI, HLA-G với màu giả xanh lục, CD20 với màu hồng hoa vân anh, hoặc CD3 với màu giả lục lam, tương ứng ở 1 và 2. Đối sánh màu Sirius Red ở bên phải. Hình vuông hiển thị một khu vực địa hình giới hạn chứa các ô dương tính HLA-G và các ô tương ứng trong vùng đó. Hình ảnh tổng hợp cho thấy đồng nhãn màu hồng của HLA-G và CD20. Không quan sát thấy sự đồng nhuộm giữa HLA-G với màu giả xanh lục và CD3 với màu giả lục lam.

Số lượng tuyệt đối của HLA-G cộng, CD3 cộng (tế bào lympho T), CD20 cộng (tế bào lympho B) và tế bào tryptase cộng với tế bào mast (tế bào mast) được xác định bằng phần mềm HALO với thuật toán thích hợp trên một trường hợp đại diện và được biểu thị trên mm2.

Phân tích các tế bào HLA-G cộng trong IPFTrong nghiên cứu đầu tiên được thực hiện trên một loạt IPF (n=10) bằng hóa mô miễn dịch, như đã mô tả trước đây, chúng tôi ước tính số lượng tế bào HLA-G cộng là 135 ± 62 / mm2 và số lượng tế bào cộng với CD117 là 227 ± 134 / mm2 (Bảng 5). Tế bào HLA-G cộng với tế bào cộng với CD117 trong bệnh xơ hóa phổi (Hình 2A). Phân tích HALO của phương pháp soi cầu miễn dịch tứ phương và nhuộm Sirius Red cho thấy bản chất của các tế bào HLA-G là khác nhau tùy thuộc vào khu vực mô học của phổi (Bảng 6). Thật vậy, 63% tế bào HLA-G cộng trong các vùng sợi là tế bào mast (B1, C1), trong khi chúng chỉ bao gồm 7% tế bào HLA-G cộng trong các nút (B2, C2). Hầu hết các ô cộng HLA-G trong các nút cùng biểu hiện CD20 (Hình 2B).

Hình 2. Bản chất của các tế bào HLA-G trên một trường hợp đại diện của IPF. (A) Trong đoạn đầu tiên, bức ảnh bên trái cho thấy màu Sirius Red của một trường hợp đại diện trong số mười IPF, bức ảnh giữa cho thấy sự phản công của Mayer hematoxylin bằng cách sử dụng hóa mô miễn dịch. Các khu vực trong vòng tròn tương ứng về mặt địa hình trên lam nhuộm HLA-G và CD117 với 4H84 nhận biết tế bào c-kit nhận biết kháng thể HLA-G và CD117. Các hình chữ nhật cho thấy độ phóng đại mạnh của các khu vực này, cho thấy rằng các tế bào HLA-G không khớp với các tế bào CD117. (B) Tứ giác miễn dịch huỳnh quang trên một trường hợp đại diện củaGanxơ sợi trong số hai sử dụng DAPI với nhân xanh lam, HLA-G (với kháng thể 4H84) với màu giả xanh lục, CD117 có màu giả lục lam, tryptase tế bào mast có màu giả đỏ và hình ảnh tổng hợp hoặc hợp nhất. Ở bên phải Sirius Red được đại diện; 1 và 2 tương ứng với hai khu vực khác nhau của phổi, tương ứng là khoảng xơ hóa và nút tế bào. (C) Miễn dịch huỳnh quang tứ cực với DAPI, HLA-G với màu giả xanh lục, tryptase với màu giả đỏ, CD3 với màu giả lục lam, CD20 với màu giả hồng hoa vân anh, trên cùng một trường hợp IPF được trình bày trong (B) . (C1) tương ứng với vùng (B1). Trong (C1), phần lớn các tế bào HLA-G tương ứng với các tế bào mast trong khu vực xơ hóa, trong khi rất hiếm tế bào mast là HLA-G trong nút được hiển thị trong (C2). Phần lớn các tế bào của nút là CD20. Phân tích HALO cho thấy hầu hết các tế bào HLA-G cộng là tế bào lympho B.

Các tế bào HLA-G cộng và CD117 cộng được đếm cho 10 trường hợp bằng phần mềm HALO với thuật toán thích hợp, sau hóa mô miễn dịch. Giá trị trung bình, độ lệch chuẩn và phạm vi được chỉ định.

Phân tích tế bào HLA-G cộng với xơ thậnTrong nghiên cứu một loạt 10 trường hợpthậnxơ hóa bằng hóa miễn dịch, chúng tôi tìm thấy 133 ± 102 tế bào HLA-G cộng / mm2 và 426 ± 207 tế bào cộng thêm CD117 / mm2 (Bảng 7). Không có sự phù hợp giữa các tế bào HLA-G cộng và CD117 cộng (Hình 3A).

Hình 3. Bản chất của các tế bào HLA-G trên một trường hợp đại diện củathậnxơ hóa. (A) Trong đoạn đầu tiên, bức ảnh bên trái cho thấy màu Sirius Red, bức ảnh giữa cho thấy sự phản công của Mayer hematoxylin bằng cách sử dụng hóa mô miễn dịch. Các khu vực trong vòng tròn có địa hình tương ứng với các slide nhuộm màu HLA-G và CD117, với 4H84 nhận dạng HLA-G và CD117 nhận dạng các tế bào c-kit. Mũi tên màu đỏ là các ô dương tính. Các hình chữ nhật cho thấy độ phóng đại mạnh của các khu vực này cho thấy rằng các tế bào HLA-G không khớp với các tế bào CD117. (B) Miễn dịch huỳnh quang bốn lần trên một trường hợp đại diện củaGanxơ hóa bằng cách sử dụng DAPI với màu xanh lam nhân, HLA-G (với kháng thể 4H84) với màu giả xanh lục, CD117 có màu giả lục lam, tryptase tế bào mast có màu giả đỏ và hình ảnh tổng hợp hoặc hợp nhất. Ở bên phải, Sirius Red được thể hiện. Tế bào nhuộm màu vàng trên hợp nhất tương ứng với HLA-G cộng với tế bào mast. (C) Các khu vực nhuộm màu lục lam tương ứng với nhiều ống chỉ biểu hiện CD117. Tế bào nhuộm màu vàng trên hợp nhất tương ứng với HLA-G cộng với tế bào mast.

Các tế bào HLA-G cộng và CD117 cộng được đếm cho 10 trường hợpthậnxơ hóa bằng phần mềm HALO với thuật toán thích hợp, sau hóa mô miễn dịch. Giá trị trung bình, độ lệch chuẩn và phạm vi được chỉ định cho các ô HLA-G plus và CD117 plus. Ghi nhãn bốn lần với phần mềm HALO cùng với Sirius Red và phân tích hình thái học cho thấy sự không đồng nhất đáng kể của việc ghi nhãn trên một phần củaquả thậnkhông chỉ theo vùng giải phẫu mà còn trong cùng một khoang giải phẫu (Hình 3B, C). Do đó, việc thống kê và tính toán tỷ lệ phần trăm tế bào HLA-G cộng với không có liên quan trong cơ quan này. Thật vậy, kiểm tra bằng kính hiển vi cho thấy vết bẩn bám mạnh vào chu vi của các ống có CD117 không đồng nhãn với chu vi của tế bào mast (Hình 3C). Các tế bào HLA-G cộng là các tế bào mast và nằm ở kẽ trong ổ viêm (Hình 3B, C).

Thảo luậnSự biểu hiện của các protein HLA-G lần đầu tiên được chứng minh trong các nguyên bào tế bào ở giao diện thai nhi - mẹ [12]. Trong điều kiện cơ bản, sự biểu hiện của nó phần lớn bị hạn chế ở các mô đặc biệt, chẳng hạn như giác mạc [13], tuyến ức [14] và các đảo nhỏ của tuyến tụy [15]. Tuy nhiên, một số loại tế bào cũng có thể biểu hiện nó, chẳng hạn như tế bào biểu mô phế quản [16], tế bào trung mô [17], tế bào thuộc dòng đơn bào [18–20], tiền chất hồng cầu và nội mô [21], trong những điều kiện đặc biệt . Trước đây chúng tôi đã chứng minh rằng các tế bào mast có thể biểu hiện HLA-G ở trạng thái cơ bản, với sự biểu hiện tăng lên trong một số môi trường giàu cytokine nhất định, đặc biệt là xơ sợimô gan.Chúng tôi đã điều tra xem liệu HLA-G có thể được biểu hiện bởi các tế bào mast liên kết vớiGanxơ hóa do nguyên nhân khác hoặc xơ hóa ở cơ quan khác bằng cách nghiên cứu 41 trường hợp do rượu gây raGanxơ gan, 10 trong số IPF và 10 trong sốthậnxơ hóa.

Nhiễm trùng, chấn thương nhiễm độc và chuyển hóa, và các bệnh truyền nhiễm vô căn có thể thúc đẩy sự phát triển của bệnh xơ hóa vì tổn thương mãn tính gây ra sự chết rụng của các tế bào nhu mô, giải phóng các cytokine tiền sinh và gây viêm như TGF-. Các tế bào sản xuất collagen phân biệt với các tế bào trung mô thường trú để phản ứng với tổn thương. Chuyển tiếp từ biểu mô sang trung mô là một hiện tượng xâm nhập của tế bào chuyển tiếp được quan sát thấy đối với các tế bào cholangiocytes trongGan, tế bào phổi ở phổi, và tế bào biểu mô hình ống ởquả thận[22]. Tế bào apoptotic gây ra sự gia tăng nồng độ TGF- trong tất cả các cơ quan. Tuy nhiên, các đặc điểm cụ thể của quá trình tạo sợi có thể được phân biệt ở các cơ quan khác nhau. bên trongGan,apoptosis liên quan đến tế bào gan, trong khi nó ảnh hưởng đến các tế bào biểu mô trong phổi vàquả thận[22]. Do đó, các nguyên bào sợi thường trú trongquả thậnvà phổi kích hoạt thành nguyên bào sợi cơ biểu hiện a-SMA, collagen1, trong khiGanmyofifibroblast giữ lại các dấu hiệu đặc hiệu thần kinh của chúng [23].

bên trongGan,tế bào hình sao gan đóng góp hơn 80% tổng số tế bào sản xuất collagen. Ở phổi, tổn thương của các tế bào màng phổi có liên quan đến quá trình apoptosis của các tế bào nội mô. Vai trò của quá trình viêm trong IPF còn nhiều tranh cãi. IPF điển hình không cho thấy sự xâm nhập của tế bào viêm, nhưng một số tác giả cho thấy vai trò của quá trình viêm trong sự biệt hóa của nguyên bào sợi phổi thành nguyên bào sợi sản xuất ECM [24]. Tổn thương biểu mô phế nang lặp đi lặp lại không rõ nguyên nhân và quá trình apoptosis biểu mô phế nang có liên quan đến IPF [25]. bên trongquả thậnvàGan,các tế bào myelomonocytic được tuyển chọn từ tủy xương và chiếm lần lượt từ 14 đến 15 phần trăm và 8 đến 12 phần trăm của các nguyên bào sợi cơ. Không có khả năng hồi phục của xơ hóa trong phổi trái ngược vớiGanvàquả thậntrong trường hợp không bị thương và nếu chưa đạt được điểm trở lại. Thật vậy, các quá trình tiêu viêm bị hạn chế trong IPF, đặc biệt là ở giai đoạn đầu của bệnh, trong khi tổn thương biểu mô phế nang lặp đi lặp lại không rõ nguyên nhân và quá trình apoptosis biểu mô phế nang có thể thúc đẩy sự tăng sinh và hoạt hóa của nguyên bào sợi phổi hoặc nguyên bào sợi cơ [25].

Đối vớiGanxơ hóa, một quá trình chữa lành vết thương thất bại củaquả thậnmô sau khi bị tổn thương lâu dài, mãn tính dẫn đến sản xuất và bài tiết các cytokine tiền viêm, cũng như TGF-, đóng một vai trò quan trọng trong quá trình tạo sợi. Ví dụ, trongGanxơ hóa, TGF-, được biểu thị bằng một lượng nhỏ trong HSC tĩnh lặng, nhanh chóng được tạo ra bởi loại tế bào này sau khichấn thương gan.Ngoài HSC, các nguồn TGF- khác đã được mô tả như tiểu cầu, đại thực bào, tế bào gan và cả tế bào mast [26]. TGF - 1 được lưu trữ trong ma trận ở dạng tiềm ẩn và sau khi được kích hoạt, nó sẽ thúc đẩy quá trình chuyển đổi từ nguyên bào sợi sang nguyên bào sợi, là cơ sở cho quá trình xơ hóa. Ngoài ra, nó ức chế sự suy thoái ECM bằng cách ức chế các metalloprotease và thúc đẩy TIMP ức chế tự nhiên. Do đó, nó tạo ra ECM thông qua các cơ chế phụ thuộc hoặc không liên quan đến SMAD 3- [27]. Thật vậy, tồn tại một sự tương tác lẫn nhau giữa các tế bào mast và TGF-. TGF- là một chất hấp dẫn mạnh đối với tế bào mast; thực sự, các quá trình bệnh lý qua trung gian TGF- thường liên quan đến sự tích tụ tế bào mast [28]. Ngoài ra, tế bào mast là một trong những nguồn chính của IL -17 thúc đẩy quá trình xơ hóa phụ thuộc TGF - - [29]. TGF- cũng đã được báo cáo để thúc đẩy hoặc ngăn chặn các chức năng của tế bào mast. Thật vậy, TGF- ức chế sự biểu hiện của thụ thể IgE có ái lực cao Fc1RI, thụ thể này kích hoạt các tế bào mast [30]. Mặt khác, nó ức chế sự tăng sinh tế bào mast, làm suy giảm và sản xuất một số phân tử tác động như histamine và TNF- [31]. Do sự gia tăng MC trong quá trình xơ hóa, tác động của TGF- lên các chức năng của MC có thể quan trọng trong việc điều chỉnh các phản ứng viêm nhiễm để duy trì quá trình xơ hóa.

Như trong bệnh viêm gan siêu vi C gây raGanxơ hóa, chúng tôi tìm thấy một nửa số tế bào HLA-G cộng trong xơ gan do rượu là tế bào mast (Bảng 2) và chỉ 34% tế bào mast biểu hiện HLA-G, với độ biến thiên riêng lẻ cao được thể hiện bằng độ lệch chuẩn (Bảng 1) . Ngoài ra, chúng tôi đã quan sát thấy một sự phân chia lại riêng biệt theo khu vực củaGan,trong đó 63–92 phần trăm tế bào HLA-G cộng ở vùng sợi xơ là tế bào mast, trong khi chỉ 3–23 phần trăm là tế bào mast trong các nút tế bào (Bảng 3). Tương tự, một mô hình khác được quan sát thấy đối với tế bào mast, vì 92% tế bào mast ở vùng sợi sợi biểu hiện HLA-G, trong khi chỉ 23% biểu hiện HLA-G trong các nút tế bào (dữ liệu không được hiển thị). Do đó, sự biểu hiện của HLA-G không bị giới hạn bởi căn nguyên vi rút củaGanxơ gan. Thật vậy, chúng tôi thu được một kết quả tương tự đối với phổi. Trong IPF, 63% tế bào HLA-G cộng với các vùng sợi xơ là tế bào mast, trong khi chỉ 7% trong số đó ở các nút là tế bào mast (Bảng 6). Các trường hợp củathậnxơ hóa là đặc biệt. Do số lượng lớn các ống, không thể đếm chính xác các tế bào trong các vùng sợi vì các tế bào mast đã lọc trong các ống. Chỉ quan sát bằng kính hiển vi định tính có thể được thực hiện, cho thấy một số tế bào HLA-G cộng là tế bào mast, mà không thể phân biệt ống với vùng sợi (Hình 3). Do đó, HLA-G dường như được biểu hiện bởi các tế bào mast trong bệnh xơ sợi thông qua bề mặt tế bào và các phân tử trong tế bào chất, không phân biệt cơ quan. Trước đây chúng tôi đã chứng minh rằng các tế bào mast của người trong quá trình nuôi cấy có thể tạo ra các dạng HLA-G hòa tan trong môi trường được điều hòa ở trạng thái cơ bản và sự bài tiết đó tăng lên sau khi được kích thích bằng các cytokine, bao gồm IL -10 [10].

Phần trăm tế bào mast cao hơn (hơn một nửa) biểu hiện HLA-G trongGanvà phổi có thể được giải thích bởi các thành phần truyền nhiễm của bệnh xơ hóa. Thật vậy, với tư cách là các tế bào miễn dịch bẩm sinh, số lượng tế bào mast tăng lên trong tình trạng viêm nhiễm, và chúng cũng có thể giải phóng các chất trung gian tiền viêm [32]. Số lượng tế bào mast tăng lên trong các bệnh xơ sợi. Thật vậy, mật độ tế bào mast trong phổi của bệnh nhân IPF cao hơn so với những người có bệnh lý phổi khác [33] và phổi bình thường. Tương tự, con ngườibệnh thậnđi kèm với sự gia tăng số lượng tế bào mast trongthậnvỏ não, đặc biệt là ở vùng xơ hóa [34], vì tế bào mast hiếm khi được quan sát thấy ở người khỏe mạnhthận.

Các công bố trước đây cho biết rằng các tế bào mast không có hoặc chỉ được tìm thấy một cách thưa thớt trong gan, phổi của người bình thường vàthận[35]. Sự tiến bộ của kiến ​​thức về tế bào mast đã chỉ ra rằng tế bào mast là tế bào miễn dịch bẩm sinh có thể được quan sát thấy ở tất cả các mô, nhưng chúng có nhiều hơn ở những vị trí tiếp xúc với môi trường. Hơn nữa, chúng thể hiện một lượng lớn các thụ thể cho phép chúng phản ứng với các kích thích và tương tác với các tế bào khác [36].Thậncác tế bào mast về mặt chức năng giống như các tế bào trong phổi. Dữ liệu mâu thuẫn đã được báo cáo về vai trò của tế bào mast trong quá trình xơ hóa. Một số tác giả đã đề xuất rằng các tế bào mast có liên quan đến quá trình xơ hóa vì chúng đóng một vai trò trong quá trình viêm nhiễm cấp tính và mãn tính, khởi phát nó. Ngoài ra, tế bào mast có thể tiết ra histamine, heparin và IL -4, giúp tăng cường sự tăng sinh của nguyên bào sợi. Tuy nhiên, những người khác [37,38], bao gồm cả chúng tôi [39], đã chỉ ra rằng tế bào mast đóng vai trò chống xơ sợi: ví dụ, trong các mô hình động vật, chẳng hạn như chuột và chuột cống bị thiếu hụt tế bào mast. Okazaki và cộng sự. cho thấy rằng xơ hóa gây ra nghiêm trọng hơn ở chuột thiếu tế bào mast hơn ở chuột hoang dã [38].

Hơn nữa, các tế bào mast đã được chứng minh là phân cực trong ung thư, tương tự như các đại thực bào [40]. Tế bào mast chống viêm biểu hiện các cytokine, chẳng hạn như IL -10, và số lượng của chúng có liên quan tỷ lệ nghịch với mức độ trầm trọng của tình trạng viêm, trong khi tế bào mast tiền viêm tương quan với bối cảnh tiền viêm. Có khả năng là các tế bào mast chống viêm biểu hiện đặc biệt HLA-G, bởi vì (i) một mối liên quan đã được chỉ ra trong một số mô hình là mức IL -10 và biểu hiện HLA-G và (ii) HLA-G có tác dụng chống viêm. Tế bào mast biểu hiện HLA-G có thể xuất hiện ở giai đoạn đầu của bệnh, trong giai đoạn phát bệnh, để chống lại quá trình viêm, đây là phản ứng đầu tiên đối với tổn thương. Trong các tài liệu, người ta đã báo cáo rằng Il {11}}, bằng cách giảm phản ứng viêm, có thể ức chế sự tăng sinh và tổng hợp collagen của nguyên bào sợi [41]. Thật vậy, IL -10 có thể đóng một vai trò bảo vệ đối với người nghiện rượubệnh gan[42]. Ngược lại, nồng độ IL -10 trong huyết thanh cao hơn được tìm thấy ở bệnh nhân IPF so với người bình thường và mức IL -10 cao nhất trong dịch rửa phế quản phế nang đã được chứng minh ở bệnh nhân IPF so với bệnh sarcoid hoặc viêm phổi quá mẫn [43]. Chúng tôi có thể giải thích điều đó bằng thành phần hành tinh kém quan trọng hơn. Trongthậnxơ hóa, nó đã được chứng minh trong mô hình chuột rằng tình trạng thiếu IL -10 trở nên trầm trọng hơnquả thậnsự viêm nhiễm và xơ hóa [44]. Ở người, điều trị bằng liệu pháp miễn dịch IL -10 cục bộ kết hợp với chất đối kháng TGF giúp cải thiện tình trạng mãn tínhbệnh thận [45].

Một kết quả có liên quan khác là quan sát các tế bào HLA-G cộng trong các nút tế bào, gần các vùng xơ trong một số trường hợp hiếm của xơ gan do rượu. Các tế bào này có hình thái đặc trưng bởi một nhóm các tế bào dễ nhận biết có kích thước từ nhỏ đến trung bình, gợi ý một tập hợp bạch huyết. Đặc điểm hình thái của chúng gợi ý đến các nang, là cấu trúc được hình thành chủ yếu bởi các tế bào lympho B. Bốn phương pháp miễn dịch huỳnh quang trong các nút đã xác nhận giả thuyết này, vì 68% tế bào HLA-G cộng với đồng biểu hiện CD20, đây là một dấu hiệu đặc biệt của tế bào lympho B (Bảng 3). Các cấu trúc tương tự cũng được quan sát thấy trong IPF, với kết quả tương tự, cho thấy 76% tế bào HLA-G cộng trong các nút là tế bào lympho B (Bảng 6). Sự hình thành tân sinh lympho đã được báo cáo trong bệnh xơ hóa. Do đó, dưới một số vấn đề bệnh lý nhất định, chẳng hạn như tình trạng viêm nhiễm kéo dài, các tập hợp tế bào có thể phát triển thành một cấu trúc có tổ chức cao giống như mô lympho thứ cấp, tức là các cơ quan lympho cấp ba hoặc các nang lympho ngoài tử cung [46]. Các nang lympho như vậy chứa các vùng giàu tế bào T và các nang tế bào B riêng biệt với các trung tâm mầm [47]. Cơ chế mà các tế bào B lọc trong tổ chức nang ngoài tử cung và trung tâm mầm được kiểm soát bởi độc tố lymphotoxin - 1 2 và các chemokine bạch huyết, chẳng hạn như phối tử CC-chemokine 19 (CCL19), CCL21, phối tử CXC-chemokine 12 (CXCL12), và CXCL13, điều chỉnh hoạt động di chuyển của tế bào lympho. Ngoài lym photoxin và chemokine, kích thích kháng nguyên cũng được yêu cầu để gây ra và duy trì sự hình thành nang trứng. Những nang như vậy không được quan sát thấy trong nhóm thuần tập của chúng tôi về virus viêm gan C gây raGanxơ hóa và chỉ được tìm thấy ở một trong ba trường hợp do rượu gây raGanxơ hóa, gợi ý một giai đoạn riêng biệt của bệnh. Thật vậy, chức năng của các cơ quan lympho ngoài tử cung và mối tương quan của chúng với tình trạng viêm nhiễm và xơ hóa vẫn chưa rõ ràng. Một số nghiên cứu đã chỉ ra một vai trò mới và đáng ngạc nhiên của tế bào B trong việc điều hòa nguyên bào sợi trong quá trình xơ hóa, trong đó tác dụng tạo sợi của chúng tương tự như TGF- và cũng được tăng cường bởi yếu tố kích hoạt tế bào B (BAFF) [48].

Sự liên quan của nguồn tế bào của HLA-G trong quá trình xơ hóa không chỉ mang tính mô tả mà còn cả chức năng. HLA-G có tác dụng ức chế chức năng của tất cả các loại tế bào lympho [49] và tế bào đuôi gai [20,50] thông qua các thụ thể đặc biệt của nó, chẳng hạn như ILT2 và ILT4. Sự hiện diện của HLA-G trên các tế bào miễn dịch này, ngoài việc là một dấu hiệu của quá trình viêm, còn là một dấu hiệu của một phản ứng miễn dịch thích hợp bằng cách làm giảm tình trạng viêm. Thật vậy, HLA-G được biết là có vai trò bảo vệ chống lại các phản ứng viêm quá mức, như đã được thể hiện trước đây trong sốc nhiễm trùng [51]. Ngoài ra, trước đây chúng tôi đã nghiên cứu sự tương tác qua lại giữa tế bào mast và tế bào hình sao gan và cho thấy rằng nó dẫn đến sự thu hút của tế bào mast và làm giảm đáng kể sản xuất collagen của tế bào HSC thông qua sản xuất HLA-G [39]. Ngoài ra, sự biểu hiện của HLA-G bởi tế bào B trong nang ngoài tử cung cũng có thể góp phần chống lại tác dụng tạo sợi của tế bào lympho B trên nguyên bào sợi bằng cách ức chế tế bào B thông qua cơ chế tự tiết.

Những bệnh nhân và những phương pháp

Người bệnhMột nhóm gồm 41Gannhững bệnh nhân ghép tạng bị xơ gan do rượu đã được nghiên cứu. Các bệnh nhân đã được thông báo về quy trình, và không có sự phản đối (Ủy ban Đạo đức Bệnh viện, thông báo số 16.47). Mười mẫu khối paraffifin củathậnxơ hóa và 10 của IPF (Ủy ban Đạo đức Bệnh viện, thông báo số 16.123), được ẩn danh hoàn toàn và không thể đảo ngược, đã được nghiên cứu theo các nguyên tắc của Tuyên bố Helsinki. Các đặc điểm lâm sàng và sinh học của ba nhóm được tóm tắt tương ứng trong các Bảng 8–10.

Phương pháp luận

Hóa mô miễn dịch và huỳnh quang miễn dịchCác mô có nguồn gốc từGanvàthậnhoặc sinh thiết phổi. Các phần nối tiếp nhúng paraffifin (dày 4 µm) đã được chuẩn bị và nhuộm mô học tiêu chuẩn, tức là màu HES và dán nhãn Sirius Red của collagen, đã được thực hiện. Song song đó, hóa mô miễn dịch và huỳnh quang miễn dịch được thực hiện trên các phần nối tiếp của các phần nhúng paraffifin từ cùng một khối sau quá trình khử định nghĩa và một quy trình truy xuất kháng nguyên. Các kháng thể chính (mAbs) như sau: chuột đơn dòng HLA-G kháng người (Exbio, 4H 84 2 µg / mL hoặc 1: 100, Vestec, Cộng hòa Séc), bộ kit kháng người đa dòng CD117 / c của thỏ , nhận biết tế bào tủy và tế bào mast (Dako, 1: 200, Coppenhagen, Đan Mạch), tryptase đơn dòng kháng người (hum) tế bào mast ở chuột (clone AA1, Dako, 1: 1000), đặc hiệu cho tế bào mast, CD3 đơn dòng kháng người (Thermo Scientififics, SP7, 1: 500, Waltham, MA, USA), đặc hiệu cho tế bào lympho T và CD20 đơn dòng kháng người (Dako, M0755, 1: 600), đặc hiệu cho tế bào lympho B.

Tóm lại, các phiến kính cho hóa mô miễn dịch được ủ với kháng thể chính trong hệ thống tự động Discovery Ultra (Roche, Meylan, Pháp). Kháng thể chính liên kết được tiết lộ bằng cách sử dụng kháng thể thứ cấp IgG chống chuột hoặc thỏ được đánh dấu sinh học (Vector, ABCYS, les Ulis, France, 1: 7 0 0) và diamino-benzidine (bộ phát hiện DAB MAP, Roche , Meylan, Pháp), tiếp theo là màu hematoxylin của Mayer. Để xác định chính xác bản chất của các tế bào HLA-G cộng, bộ ba (DAPI, CD117, tryptase tế bào mast), bộ bốn (DAPI, HLA-G, CD117, tryptase tế bào mast) và bộ ba (DAPI, HLA-G, CD3, Sau đó, nhuộm miễn dịch huỳnh quang CD20, tryptase tế bào mast) được thực hiện trên ba trường hợp điển hình của bệnh xơ gan do rượu và hai trường hợp đại diện của IPF. Khải huyền được thực hiện bằng cách sử dụng bộ dụng cụ Discovery FAM, rhodamine, DCC và Cy5 (hệ thống y tế Ventana, Illkirch, Pháp). Sau khi nhuộm, hình ảnh của toàn bộ bề mặt của mặt cắt được số hóa ở độ phóng đại 20 × hoặc 40 × bằng máy quét đồng tiêu (Máy quét Pannoramic, 3DHistech, Budapest, Hungary). Hóa mô miễn dịch và nhuộm huỳnh quang miễn dịch đa hợp được phân tích bằng phần mềm phân tích kỹ thuật số HALO (V3.0.311). Phần mềm đã được đào tạo để nhận ra bệnh xơ hóa (Sirius Red) bằng cách sử dụng mô-đun Định lượng vùng (V2.1.3), trong khi mô-đun Fish-IF (v1.2.2) được đào tạo cho các mẫu được dán nhãn bằng thuốc nhuộm. Toàn bộ các phần của mỗi mẫu được chọn để phân tích với thuật toán tương ứng. Dữ liệu được trích xuất sang một phần mềm bảng tính để phân tích.

Sự kết luậnCông trình này kết hợp với các thí nghiệm dữ liệu trước đây của chúng tôi về vai trò chống bảo vệ của tế bào mast thông qua biểu hiện HLA-G [39] cho thấy rằng tế bào mast đóng vai trò chống xơ sợi và bảo vệ thông qua sự biểu hiện của HLA-G trong các tình huống xơ sợi. Vai trò này được củng cố bởi các tế bào lympho B biểu hiện HLA-G trong các nang ngoài tử cung. Nhìn chung, những sợi tơ này cho thấy vai trò bảo vệ đối với HLA-G được biểu hiện bởi các tế bào mast trong các cơ quan sợi.