Biểu hiện Alpha Defensin 5 ở người trong thận và đường tiết niệu của con người

Để biết thêm thông tin: ali.ma@wecistanche.com

John David Spencer và cộng sự

trừu tượng

Tiểu sử:Các cơ chế duy trì sự vô trùng trong đường tiết niệu vẫn chưa được hiểu đầy đủ. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra tầm quan trọng của peptide kháng khuẩn (AMP) trong việc bảo vệ đường tiết niệu khỏi nhiễm trùng. Ở đây, chúng tôi mô tả đặc điểm biểu hiện và mức độ liên quan của AMP human alpha-defensin 5 (HD5) ở ngườiquả thậnvà đường tiết niệu ở những đối tượng bình thường và bị nhiễm trùng.

Phương pháp luận / Kết quả chính:Sử dụng RNA được phân lập từ con ngườiquả thận, niệu quản và mô bàng quang, chúng tôi đã thực hiện PCR định lượng theo thời gian thực để cho thấy rằng DEFA5, gen mã hóa HD5, được biểu hiện thành phần trong toàn bộ đường tiết niệu. Với viêm bể thận, biểu hiện DEFA5 tăng lên đáng kể trongquả thận. Sử dụng phân tích immunoblot, sản xuất HD5 cũng tăng lên khi bị viêm bể thận. Nhuộm HD5 khu trú miễn dịch vào niệu quản của bàng quang và niệu quản. Trong thận, HD5 chủ yếu được sản xuất ở nephron xa và ống góp. Sử dụng xét nghiệm immunoblot và ELISA, HD5 không được phát hiện thường xuyên trong các mẫu nước tiểu của người không bị nhiễm trùng đồng thời có nghĩa là sản xuất HD5 trong nước tiểu tăng lên khi nhiễm trùng đường tiết niệu do E.coli.

Kết luận / Ý nghĩa:DEFA5 được biểu hiện khắp đường tiết niệu ở những đối tượng không bị nhiễm bệnh. Cụ thể, HD5 được thể hiện trong suốt niệu quản của đường tiết niệu dưới và trong các ống góp củaquả thận. Với nhiễm trùng, biểu hiện HD5 tăng lên trongquả thận, và mức độ có thể được phát hiện trong nước tiểu. Theo hiểu biết của chúng tôi, phát hiện của chúng tôi đại diện cho việc đầu tiên định lượng sự biểu hiện và sản xuất HD5 trong thận người. Hơn nữa, đây là báo cáo đầu tiên phát hiện sự hiện diện của HD5 trong các mẫu nước tiểu bị nhiễm bệnh. Kết quả của chúng tôi cho thấy HD5 có thể có một vai trò quan trọng trong việc duy trì sự vô trùng của đường tiết niệu.

Tác dụng phụ của Cistanche và Cistanche tubulosa đối vớiquả thậnbệnh, bấm vào đây để lấy mẫu

Giới thiệu

Đường tiết niệu, ngoại trừ niệu đạo, thường vô trùng mặc dù nó nằm gần hệ thực vật trong phân. Các cơ chế chính xác mà đường tiết niệu duy trì sự vô trùng của nó vẫn chưa được hiểu rõ. Các cơ chế được đề xuất góp phần bảo vệ đường tiết niệu bao gồm dòng chảy của nước tiểu, thay đổi độ pH và độ thẩm thấu của nước tiểu, làm rỗng bàng quang thường xuyên, các thành phần bảo vệ hóa học của biểu mô và sự bong tróc / dòng chảy của biểu mô của các tế bào miễn dịch hiệu ứng với sự kích thích của vi khuẩn [1]. Ngoài ra, các peptide kháng khuẩn (AMPs) gần đây đã được chứng minh là có vai trò quan trọng trong việc duy trì sự vô trùng của đường tiết niệu [2]. AMPs là các phân tử cation được biểu hiện bởi các tế bào bạch cầu thực bào và các tế bào biểu mô. Ở người và các loài động vật có vú khác, Defensins là một họ chính của AMP. Defensins thường có hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng chống lại vi khuẩn gram dương và gram âm, vi rút, nấm và động vật nguyên sinh [2,3]. Các chất bảo vệ ban đầu được tổng hợp dưới dạng tiền protein và trải qua quá trình xử lý để trở thành các peptit trưởng thành, có hoạt tính sinh học [4]. Ở người, defensins được phân loại thành một trong hai họ tùy thuộc vào mô hình cầu nối disulfide của chúng - alpha-defensins hoặc beta-defensins [5].

Trong đường tiết niệu, beta-Defensin được biểu hiện rộng rãi khắp niệu quản. Tế bào biểu mô lótquả thậnquai Henle, ống lượn xa và ống góp biểu hiện một cách cấu thành beta-defensin 1 (hBD1) của người. Mặc dù nồng độ hBD1 trong nước tiểu không đủ để tiêu diệt vi khuẩn xâm nhập, nhưng hBD1 cung cấp một lớp phủ kháng khuẩn có tác dụng nhanh cho lumen ống và ngăn ngừa nhiễm trùng bằng cách ức chế sự gắn kết của vi khuẩn vào urothelium [6]. Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng trạng thái oxy hóa khử của hBD1 ảnh hưởng đáng kể đến hiệu lực kháng khuẩn, do đó peptit bị khử hoạt động mạnh hơn nhiều so với dạng oxy hóa liên kết với disulfide [7]. Ý nghĩa của điều này ở bề mặt niệu quản vẫn chưa được xác định. Một loại Defensin khác, human beta-defensin 2 (hBD2) không được biểu hiện thành phần trong mô thận khỏe mạnh; tuy nhiên, biểu hiện hBD2 được gây ra bởi nhiễm trùng [8].

Không giống như beta-defensins, vai trò của alpha-defensins có nguồn gốc từ biểu mô không được mô tả rõ ràng trong đường tiết niệu. Sự biểu hiện và chức năng của alpha-defensins HD5 và HD6 hầu hết đã được báo cáo ở ruột non, nơi chúng được Panethcells tiết ra vào các đoạn ruột và góp phần vào sự cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột [9]. HD5 cũng đã được bản địa hóa ở các vùng sinh dục nam và nữ, với bằng chứng cho thấy rằng nó có thể cảm ứng và quan trọng trong việc loại trừ nhiễm trùng [10,11,12]. HD5 trong nước tiểu đã được phát hiện ở những bệnh nhân đã trải qua quá trình tái tạo tân sinh hồi tràng và chuyển hướng nước tiểu của ống hồi tràng, theo đó nguồn sản xuất HD5 chủ yếu được ghi nhận từ các tế bào Paneth hồi tràng [13,14]. HD5 có hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn gram dương và vi khuẩn gram âm thông thường [15]. HD5 cũng có hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi rút gây bệnh uropathogenic như adenovirus và vi rút BK [16,17,18]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi cung cấp mô tả ban đầu và định lượng biểu hiện HD5 ở ngườiquả thậnvà xác định rõ hơn biểu hiện của nó ở đường tiết niệu dưới trong quá trình vô khuẩn và nhiễm trùng.

Kết quả

MRNA DEFA5 được biểu hiện thành phần trong bàng quang, niệu quản và thận của con người

PCR thời gian thực định lượng chứng minh rằng tất cả bàng quang, niệu quản vàquả thậncác mẫu không bị nhiễm trùng được biểu hiện DEFA5. Biểu hiện DEFA5 ở đường tiết niệu dưới nhiều hơn đáng kể so với đường tiết niệu trên (p=0. 014). Trong bàng quang (n=4), biểu hiện DEFA5 trung bình là 4.656637 phiên mã trên 10 ng RNA và ở niệu quản (n=4), biểu hiện DEFA5 trung bình là 4.1126170 phiên mã trên 10 ngRNA (Hình 1A) . Trong thận (n=6), biểu hiện DEFA5 trung bình là 2.9376274 phiên mã trên 10 ng RNA. Biểu hiện DEFA5 được phân tích riêng biệt ở vỏ thận, tủy và khung chậu. Biểu hiện của DEFA5 không thay đổi đáng kể theo vùng thận (p=0. 45).

Biểu hiện DEFA5 và biểu hiện peptit HD5 tăng khi bị viêm bể thận

Phân tích định lượng PCR thời gian thực được thực hiện trênmô thận vớiviêm thận bể thận cho thấy biểu hiện DEFA5 tăng đáng kể so với các mô thận không bị nhiễm trùng. Với viêm đài bể thận (n=6), biểu hiện DEFA5 trung bình tăng lên 7.82961.052 phiên mã trên 10 ng RNA (p=0. 019) (Hình 2A).

Để đánh giá thêm sự gia tăng biểu hiện này với bệnh viêm bể thận, chúng tôi đã thực hiện phân tích immunoblot trên cùngquả thậnmô được sử dụng để phân tích PCR thời gian thực để đánh giá sự gia tăng đồng thời trong sản xuất peptit HD5 (Hình 2B, bảng giữa). }) so với không bị nhiễmquả thậnmô (n=6). Không bị nhiễmquả thậnmô biểu hiện 300625 ng HD5 / gam trọng lượng mô ướt trong khiquả thậnmô có pyelonephritisexpressed 6 0 0621 ng HD5 / gam trọng lượng mô ướt (p, 0,0001). Các khối đã được thăm dò lại với GAPDH để phục vụ như một kiểm soát tải (Hình 2B, bảng ở giữa) và một vết bạc cũng được thực hiện để xác nhận việc tải protein bằng nhau (Hình 2B, bảng trên).

HD5 peptide được sản xuất khắp thận và đường tiết niệu của con người

Nhuộm miễn dịch được thực hiện để xác định vị trí sản xuất HD5 trong đường tiết niệu. Hóa mô miễn dịch (IHC) cho thấy HD5immunoreactivity hiện diện khắp niệu quản và bàng quang của tất cả các mẫu được khảo sát (n=4, Hình 3). IHC cũng cho thấy HD5 được tạo ra trong các ống của vỏ thận và tủy của tất cả mẫu vật (n=6, Hình 4). Miễn dịch huỳnh quang (IF) chứng minh rằng HD5 biểu hiện nhiều nhất ở nephron xa và các ống góp (Hình 5). Các kẽ và cầu thận không cho thấy hoạt tính miễn dịch HD5. Phương pháp nhuộm miễn dịch thể hiện trong Hình 3, 4 và 5 được thực hiện bằng cách sử dụng kháng thể đơn dòng chống HD5 của chuột (8C8) nhận biết propeptide HD5 (Abcam, Cambridge, MA). Kết quả tương tự khi sử dụng kháng thể đa dòng chống HD5 của thỏ nhận biết propeptide HD5 và peptide trưởng thành (dữ liệu không được hiển thị) - cho thấy rằng HD5 được lưu trữ dưới dạng propeptide.

Với viêm bể thận, nhuộm màu miễn dịch HD5 tăng lên rõ rệt. Hoạt tính miễn dịch HD5 tăng lên khắp các nephron gần, nephron xa và các ống góp (Hình 4 và Hình 5). Cũng như ở các mẫu không bị nhiễm trùng, các cầu thận và kẽ thận không có biểu hiện HD5 khi bị nhiễm trùng. Đối chứng âm tính cho thấy không có phản ứng miễn dịch HD5.

Nước tiểu của người bị nhiễm bệnh chứa nồng độ có thể đo được của HD5 peptide

Phân tích immunoblot, sử dụng kháng huyết thanh đa dòng của thỏ phát hiện tiền chất proHD5 và các dạng xử lý tiếp theo đã xác định được mức độ HD5 có thể đo được ở 13 trong số 15 mẫu nước tiểu được thử nghiệm bị nhiễm vi khuẩn E.coli sinh niệu (Hình 6A và B). Khi hiện tại, nồng độ HD5, bình thường hóa thành creatinin nước tiểu, dao động từ 299,8–669,7630 ng HD5 / mg Cr nước tiểu (110,67 ng / mL – 276,67 ng / mL), tương ứng với 11,10–27,67 nmol / L. Mẫu nước tiểu không bị nhiễm virut (n=15), HD5 bằng hoặc thấp hơn giới hạn phát hiện là (, 50 ng). Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym (ELISA) trên cùng một mẫu nước tiểu, sử dụng kháng thể đơn dòng của chuột (8C8) chỉ phát hiện tiền chất proHD5, phát hiện mức proHD5 có thể đo được ở 13 trong số 15 mẫu bị nhiễm bệnh được thử nghiệm. Nồng độ proHD5 trong nước tiểu dao động từ 122,78–490,060,03 ng HD5 / mg Cr trong nước tiểu (30,02 ng / mL – 200,5 ng / mL) khi có (Hình 7).

Thảo luận

Trong nghiên cứu này, chúng tôi cung cấp đặc điểm ban đầu của HD5 ở ngườiquả thận, niệu quản và bàng quang. HD5 đã được chứng minh là một AMP quan trọng giúp ngăn ngừa nhiễm trùng xâm nhập vào ruột và được điều chỉnh trong đường sinh dục trong quá trình nhiễm trùng [11,18,19,20,21]. Các AMP có nguồn gốc từ biểu mô, như HD5, đã được chứng minh là quan trọng trong việc duy trì sự vô trùng ở đường tiết niệu [8,22,23,24]. Sự thiếu sót trong các khả năng bảo vệ niêm mạc bẩm sinh này có thể dẫn đến nhiễm trùng cấp tính và / hoặc mãn tính [25,26].

Kết quả PCR thời gian thực định lượng của chúng tôi chứng minh rằng DEFA5 được thể hiện một cách cấu thành trong con ngườithận, niệu quản và bàng quang. Biểu hiện DEFA5 tăng từ đường tiết niệu trên xuống đường tiết niệu dưới - theo dòng chảy của dòng nước tiểu và sự gần gũi ngày càng tăng với điểm xâm nhập của hệ vi sinh vật. Theo hiểu biết của chúng tôi, đây là nghiên cứu đầu tiên định lượng biểu hiện DEFA5 trong thận và bàng quang của con người. Gần đây, Townes và cộng sự đã chứng minh rằng niệu quản đoạn xa bình thường có thể biểu hiệnDEFA5 [14]. Kết quả của chúng tôi cũng cho thấy rằng DEFA5 được biểu hiện một cách cấu thành bởi niệu quản đoạn xa. Mặc dù biểu hiện DEFA5 trong đường tiết niệu thấp hơn gần 100- lần so với biểu hiện trong các mô tiêu hóa, nhưng biểu hiện cơ bản của biểu mô niệu của DEFA5 có thể so sánh với biểu hiện của các bệnh lý đường tiết niệu được mô tả trước đây như cathelicidin, hBD -1, hBD -2 và ribonuclease 7 [6,8,22,24,27].

Trái ngược với đường tiêu hóa trưởng thành, nơi DEFA5 được biểu hiện ở mức độ cao trong cả tình trạng sức khỏe và nhiễm trùng / viêm, dữ liệu PCR thời gian thực định lượng của chúng tôi chứng minh rằng biểu hiện DEFA5 trongquả thậnđược điều chỉnh tăng đáng kể với nhiễm trùng [27,28,29]. Hình thức biểu hiện cảm ứng này tương tự như biểu hiện DEFA5 ở đường sinh sản nữ, nơi biểu hiện DEFA5 tăng lên khi bị viêm vòi trứng [30]. Về đường tiết niệu, Townes và cộng sự đã chỉ ra xu hướng biểu hiện DEFA5 qua niệu quản nhiều hơn ở những bệnh nhân bị nhiễm trùng tiểu đã trải qua chuyển hướng tiết niệu qua ống hồi tràng [14]

Phân tích immunoblot của chúng tôi bổ sung cho dữ liệu PCR thời gian thực bằng cách chứng minh rằng sản xuất peptit HD5 tăng lên khi bị viêm bể thận. Mô hình sản xuất HD5 cảm ứng này tương tự như mô hình sản xuất HD5 ở một số thành viên của họ beta-defensin. HBD2 cho thấy mô hình sản xuất cảm ứng khi nhiễm trùng đường tiết niệu và / hoặc viêm thận bể thận mãn tính [8,31,32]. Sản xuất HD5peptide đã được chứng minh là tăng ở đường sinh dục trên của nữ và niệu đạo của nam bị viêm [11,30].

Sử dụng phương pháp nhuộm miễn dịch, chúng tôi chứng minh rằng HD5 được sản xuất đồng đều trong suốt niệu quản và bàng quang. Bởi vì phần lớn các trường hợp nhiễm trùng tiểu là do hệ thực vật trong phân đi vào bàng quang, những kết quả này cho thấy rằng biểu hiện HD5 xuất hiện ở những vị trí thường xuyên tiếp xúc với vi sinh vật nhất [33]. Do đó, HD5 được đặt ở vị trí lý tưởng để ngăn ngừa sự lây nhiễm vi sinh vật đang gia tăng. bên trongquả thận, HD5 chủ yếu được tạo ra ở nephron xa và ống góp. Những phát hiện này cho thấy rằng HD5 được sản xuất ở những vị trí mà nó sẽ được định vị để có hoạt tính kháng khuẩn tối ưu. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng các đặc tính chống vi khuẩn của defensins phụ thuộc vào nồng độ muối - với nồng độ muối cao hơn sẽ làm giảm hoạt động kháng khuẩn [23,34,35]. Chúng tôi suy đoán rằng nồng độ muối thấp của nephron xa và ống góp cung cấp môi trường thuận lợi cho hoạt động kháng khuẩn HD5.

Phân tích Immunoblot và ELISA cũng chứng minh rằng HD5 được tiết vào nước tiểu ở mức độ thấp. Với kích thước (8,1 kDa và 3,7 kDa) và điện tích dương của proHD5 và HD5 đã được xử lý hoàn toàn, có thể một số peptide HD5 trong nước tiểu bắt nguồn, ít nhất là một phần, từ dịch lọc huyết tương. Tuy nhiên, có rất ít bằng chứng cho thấy HD5 vẫn tồn tại trong huyết tương [27]. Ngoài ra, để xuất hiện trong nước tiểu, HD5 cần phải thoát khỏi cơ chế hấp thụ peptide hiệu quả ở ống lượn gần [6,36]. Cuối cùng, các mẫu nước tiểu được sử dụng đã trải qua quá trình ly tâm trước khi thực hiện xét nghiệm, loại bỏ các nguồn HD5 trong tế bào.

Ở các nồng độ được phát hiện, HD5 trong nước tiểu không có khả năng kháng khuẩn trực tiếp chống lại các vi sinh vật gây uropathogenic vì HD5 đã qua xử lý hoàn toàn có nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) giữa 6–10 mg / mL đối với vi khuẩn gen uropatho gram âm phổ biến [15]. Tuy nhiên, nồng độ trên bề mặt niêm mạc có thể cao hơn. Hơn nữa, phân tích immunoblot chứng minh rằng nồng độ HD5 lớn hơn đáng kể trongquả thận. Những kết quả này cho thấy HD5 tham gia vào quá trình bảo vệ niêm mạc của đường tiết niệu. Một mô hình tương tự được thấy vớihBD1, trong đó nồng độ hBD1 trong nước tiểu không đủ để biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn nhưng nồng độ peptit cao hơn được phát hiện gần ống thận [6,31].

Bởi vì IHC chứng minh rằng proHD5 là một dạng chính củaHD5 trongquả thậnvà bởi vì cả proHD5 trưởng thành và proHD5 đều được phát hiện trong nước tiểu, chúng tôi suy đoán rằng HD5 chủ yếu được tiết ra một phân tử tiền chất và sau đó trải qua quá trình phân giải protein để tạo ra các dạng trưởng thành - tương tự như đường tiêu hóa và sinh dục [11,30,37]. Trong ruột non, các tế bào Paneth sản xuất trypsin, chất này phân cắt propeptit HD5 để peptit được xử lý hoàn toàn là dạng chủ yếu trong lòng ruột [37]. Trong niệu đạo của nam giới, quá trình xử lý và kích hoạt các enzym quan trọng đối với HD5 là các protease bạch cầu trung tính do các bạch cầu trung tính tuyển chọn vào vị trí nhiễm trùng [11]. Sự đóng góp của trypsinogen biểu mô, trypsin niệu và / hoặc protease bạch cầu trung tính vào quá trình xử lý HD5 ở đường tiết niệu trong quá trình nhiễm trùng vẫn còn được xác định. Hơn nữa, ảnh hưởng của những thay đổi trong môi trường tiết niệu lên chức năng HD5 (thay đổi độ thẩm thấu, pH và nồng độ cation) cũng vẫn còn được xác định.

Kết luận, đây là nghiên cứu đầu tiên xác định và định lượng sự biểu hiện và sản xuất HD5 trong đường tiết niệu. Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng HD5 là một AMP có nguồn gốc từ biểu mô có thể đóng một vai trò quan trọng trong khả năng miễn dịch bẩm sinh của lium niệu ở người, ngăn chặn sự chuyển dịch của các mầm bệnh xâm nhập vào hệ tuần hoàn. Việc làm sáng tỏ các yếu tố điều chỉnh quá trình sản xuất HD5 có thể mang lại cái nhìn sâu sắc mới về cơ chế bệnh sinh của UTIs ở những bệnh nhân có nguy cơ mắc UTIs và những bệnh nhân bị nhiễm trùng mãn tính.

Phương pháp

Phê duyệt nghiên cứu

Sự đồng ý bằng văn bản được thông báo đã nhận được từ tất cả các bệnh nhân tham gia nghiên cứu này. Đối với các đối tượng dưới 18 tuổi, cần có sự đồng ý bằng văn bản của cha mẹ / người giám hộ. Hội đồng Đánh giá Tổ chức của Bệnh viện Trẻ em Toàn quốc (NCH) đã phê duyệt nghiên cứu này cùng với quy trình và tài liệu về sự đồng ý (IRB 07-00383).

Mô người và mẫu nước tiểu

Mô bàng quang và niệu quản đoạn xa không bị nhiễm trùng (n=4) được lấy từ trẻ em được cấy ghép lại niệu quản vì những lý do khác ngoài nhiễm trùng tái phát. Không bị nhiễmquả thậnmẫu (n=6) được lấy từ những bệnh nhân phẫu thuật cắt thận vì khối u thận. Các mẫu mô không có dấu hiệu đại thể của bệnh hoặc viêm.Quả thậnmô của bệnh nhân bị viêm bể thận mãn tính được cung cấp bởi Mạng lưới Hợp tác xã HumanTissue (n=6) [38]. Hai nhà giải phẫu bệnh độc lập đã xác nhận chẩn đoán mô bệnh học của viêm thận bể thận. Các mẫu mô được đông lạnh nhanh hoặc được bảo quản dưới dạng các phần nhúng parafin cố định bằng formalin trung tính. Các phần của mô thận không bị nhiễm trùng được mổ xẻ thành vỏ, tủy hoặc bể thận trước khi bảo quản (n=4).

Các mẫu nước tiểu không bị nhiễm trùng và nhiễm trùng được lấy từ những trẻ đến khám tại khoa cấp cứu NCH hoặc phòng khám thận. Chẩn đoán nhiễm trùng tiểu được thực hiện bằng cách cấy nước tiểu dương tính theo Học viện Nhi khoa Hoa Kỳ [39]. Tất cả các mẫu nước tiểu bị nhiễm bệnh đều có .106 CFU / mL ofE.coli. Giá trị pH nước tiểu dao động từ 5,5 đến 8,5 (nước tiểu trung bình 6,9). Thành phần ion nước tiểu không được đo lường. Các mẫu nước tiểu được ly tâm để loại bỏ cặn lắng trong nước tiểu, và bổ sung cocktail chất ức chế protease (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).

Sự cô lập axit Ribonucleic và phiên mã ngược

RNA tổng số được phân lập từ mô đông lạnh bằng cách sử dụng Hệ thống phân lập PromegaTotal RNA (Promega, Madison, WI, Hoa Kỳ). Tổng hợp ForcDNA, 4–8 mg RNA tổng số được phiên mã ngược với men phiên mã ngượcSuperscript III sử dụng oligo- (dT) 12–18primer theo quy trình của nhà cung cấp (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).

Nhân bản Plasmid cụ thể của gen cho các đường cong chuẩn

Mã hóa cDNA DEFA5 và GAPDH được nhân bản thành một 4- vectơ plasmid Topo (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Plasmid đã được giải trình tự để xác nhận rằng

cấu trúc đã thu được. Các độ pha loãng nối tiếp của plasmid dành riêng cho gen được định lượng (bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ ở 260 và điện di trên gel agarose nhuộm ethidium bromide) và được sử dụng trong PCR thời gian thực để tạo ra các đường cong chuẩn cho mỗi phản ứng.

Định lượng thời gian thực PCR

PCR thời gian thực định lượng được thực hiện bằng cách sử dụng cDNA sợi đơn từ ngườiquả thận, niệu quản và mô bàng quang với các cặp mồi oligonucleotide cụ thể bằng cách sử dụng Hệ thống PCR thời gian thực 7500 (Hệ thống sinh học ứng dụng, Carlsbad, CA, Hoa Kỳ). Các mồi nối exon của PCR được thiết kế và trình tự được xác nhận bằng cách sử dụng DNAstarH Laser Gene SeqBuilder (mồi chuyển tiếp DEFA5 : 59- TCC CTC CTG CAG GTG ACC CCA -39 và mồi ngược DEFA5 59- GTG GCT CTT GCC TGA GAA CCT GA -39).

Tóm lại, cDNA tương ứng với 1 0 RNA được dùng dưới dạng atemplate trong phản ứng 25 ml chứa 2. 0 mM của mỗi mồi và 16 hỗn hợp Light-Cycler-Fast Start DNA Master SYBR Green. Điều kiện PCR là: biến tính ban đầu ở 95uC trong 10 phút, tiếp theo là 40 chu kỳ với mỗi chu kỳ bao gồm biến tính ở 94uC trong 30 giây, ủ ở 64uC trong 30 giây và kéo dài ở 72uC trong 30 giây. Sự phát xạ huỳnh quang từ chu kỳ này sang chu kỳ khác được theo dõi ở bước sóng 530 nm và được phân tích bằng 7500Software V2.0.3 (Hệ thống sinh học ứng dụng). Các tiêu chuẩn plasmid dành riêng cho gen đã được đưa vào mọi phản ứng. Là một đối chứng tích cực, RNA ở hồi tràng cuối được bao gồm trong mỗi bộ phản ứng, và kết quả được so sánh với các tiêu chuẩn đã công bố trước đây [27].

Để xác nhận sự khuếch đại PCR của sản phẩm dự định, mẫu đại diện được phân tích bằng điện di trên gel agarose 1,5%. Các sản phẩm được hình dung bằng cách nhuộm ethidium bromidest và so sánh với các tiêu chuẩn kích thước DNA để xác nhận kích thước sản phẩm đã xác định (không được hiển thị). Ngoài ra, một đường cong đặc trưng nhiệt độ nóng chảy của mọi phản ứng PCR được xác định khi kết thúc mỗi phản ứng.

Kháng thể HD5

Propeptit HD5 (AA 20-94) và các dạng được xử lý một phần (AA 36-94 và 56–94) được xác định bằng cách sử dụng kháng thể đơn dòng (8C8) chống HD5 của chuột (Abcam) có bán trên thị trường. Propeptit HD5 và peptit trưởng thành (AA 63-94) được xác định bằng cách sử dụng kháng huyết thanh đa dòng của thỏ được mô tả trước đây [13,40].

Immunoblot

Các phần giống nhauquả thậncác mẫu vật được sử dụng để phân tích PCR thời gian thực định lượng (trọng lượng ướt 3–6 mg) được nghiền thành bột bằng cối và chày trong nitơ lỏng và được hòa tan trong đệm RIPA với chất ức chế protease. Protein trong nước tiểu được chiết xuất từ ​​các mẫuurine bằng Bộ công cụ vi lượng cô đặc protein trong nước tiểu ProteospinTM (Norgen Biotek Corporation, Thorold, ON, Canada). Nồng độ protein trong thận và nước tiểu được định lượng bằng Xét nghiệm Bradford đã sửa đổi và được xác nhận bằng cách đọc anOD280 nm. Nồng độ bằng nhau của mô thận hoặc protein trong nước tiểu được nạp vào gel gradient natri dodecyl sulfat 18% và được điện di. Để đảm bảo lượng protein cân bằng, người ta tiến hành nhuộm bạc.

Sau khi tách điện di, các protein được chuyển vào màng nitrocellulose. Sau khi cố định bằng 0. 05 phần trăm glutaraldehyde trong TBS, các màng này bị chặn lại trong sữa không có chất béo 5 phần trăm trong 30 đến 60 phút và được ủ trong dung dịch pha loãng 1: 1, 000 kháng huyết thanh HD5 đa dòng của thỏ qua đêm. . Sau khi rửa sạch, kháng thể thứ cấp, kháng thể IgG liên hợp với peroxidase của cây cải ngựa, được pha loãng theo tỷ lệ 1:10, 000 (Công nghệ tín hiệu tế bào, Danvers, MA, Hoa Kỳ), được áp dụng trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Các khe miễn dịch từquả thậncác mô cũng được thăm dò bằng kháng thể kháng GAPDH (Sigma Aldrich) trong hai giờ ở nhiệt độ phòng và sau đó được ủ với kháng thể thứ cấp được mô tả ở trên. Các protein được hình dung bằng hệ thống phát hiện ECL và màng phát quang hóa học theo hướng dẫn của nhà sản xuất (BioExpress, Kaysville, UT, USA).

HD5 được định lượng bằng cách so sánh cường độ dải thu được với sự pha loãng nối tiếp của protein proHD5 chuẩn tái tổ hợp (Peptides International, Louisville, KY, Hoa Kỳ).Quả thậnNồng độ HD5 được tiêu chuẩn hóa theo trọng lượng mô ướt. Nồng độ U niệu HD 5 được chia cho creatinin nước tiểu để thiết lập tỷ lệ HD 5- trên creatinin (mg / mg) trong nước tiểu được chuẩn hóa để tính đến độ loãng của nước tiểu. Nồng độ creatinine trong nước tiểu được xác định bằng cách sử dụng xét nghiệm creatinine microplate của Oxford Biomedical Research (Rochester Hills, Michigan, Hoa Kỳ).

Hóa mô miễn dịch

Sau khi khử trùng, bù nước và lấy kháng nguyên, một khối biotin và một khối protein không có huyết thanh đã được thực hiện (Superblock, ScyTek Laboratories, Logan, UT, USA). Các phiến kính được ủ qua đêm ở 4uC với kháng thể đơn dòng HD5 (8C8) của chuột (1: 2 {{1 0}} 0; Abcam) hoặc kháng huyết thanh đa dòng của thỏ (1: 500), sau đó là kháng thể đánh dấu sinh học kháng đa giá được pha tạp Streptavidin / HRP (Phòng thí nghiệm ScyTek). Các phần được phát triển bằng cách sử dụng 0,1 phần trăm diaminobenzidine tetrachloride với 0,02 phần trăm hydrogen peroxide và được liên kết với hematoxylin. Các phần đối chứng âm tính được ủ với huyết thanh không miễn dịch thay cho kháng thể HD5.

Miễn dịch huỳnh quang

Quá trình huỳnh quang miễn dịch đánh dấu đôi được thực hiện để giúp xác định vị trí biểu hiện HD5 trongquả thận. Ống góp được đánh dấu kép cho các tế bào chính có kháng thể aquaporin -2 đa dòng của dê (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) [41]. Vòng Henle được đánh dấu kép với kháng thể uromodulin kháng chuột đa dòng (Sigma-Aldrich) và ống lượn gần được đánh dấu kép bằng aquaporin đa dòng của dê -1 (Santa Cruz) [41,42]. Thuốc chống dê đa dòng cho lừa Rhodamine (Phòng thí nghiệm Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, Hoa Kỳ), thuốc chống chuột rhodamine (Phòng thí nghiệm JacksonImmunoResearch) và thuốc chống thỏ đa dòng lừa FITC (Santa Cruz) đóng vai trò là kháng thể thứ cấp.

Tất cả các phần đã được chuẩn bị như đã nêu ở trên. Chúng được ủ với hỗn hợp kháng huyết thanh chuột chống lại HD5 (1: 200) (Abcam), AQP -2 (1: 500), uromodulin (1: 500), AQP -1 (1: 400) atroom nhiệt độ trong 90 phút. Kháng thể thứ cấp được áp dụng trong 90 phút ở nhiệt độ phòng và các phần được gắn bằng cách sử dụng môi trường gắn với DAPI. Huyết thanh không miễn dịch được sử dụng như một đối chứng âm tính. Các slide được kiểm tra bằng kính hiển vi aLeica DM4000B và được chụp ảnh kỹ thuật số bằng máy ảnh / phần mềmSpot RT (Dụng cụ chẩn đoán, SterlingHeights, MI, USA).

ELISA

Link Biotin Antibody Labeling Kit, Novus Biologicals) kháng thể đơn dòng cho chuột trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng, peroxidase củ cải streptavidin-ngựa (Biolegend, San Diego CA, USA) được thêm vào trong 30 phút. Sau khi ủ với dung dịch chất nền TMB trong 15 phút (Kem-En-Tec Diagnostics), phản ứng được kết thúc bằng dung dịch STOP (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) và đọc ở bước sóng 450 nm. Nồng độ HD5 từ xét nghiệm ELISA được chia cho lượngcreatinine trong nước tiểu để thiết lập tỷ lệ HD 5- trên-creatinine trong nước tiểu (mg / mg) được chuẩn hóa để giải thích cho sự pha loãng của nước tiểu như đã mô tả ở trên.

Người giới thiệu

1. Weichhart T, Haidinger M, Horl WH, Saemann MD (2008) Các khái niệm hiện tại về cơ chế bảo vệ phân tử hoạt động trong quá trình nhiễm trùng đường tiết niệu. Tạp chí điều tra lâm sàng Châu Âu 38 Suppl 2: 29–38.

2. Zasloff M (2007) Các peptide kháng khuẩn, khả năng miễn dịch bẩm sinh và đường tiết niệu vô trùng bình thường. J Am Soc Nephrol 18: 2810–2816.

3. Lehrer RI, Lichtenstein AK, Ganz T (1993) Defensins: peptide kháng khuẩn và gây độc tế bào của tế bào động vật có vú. Annu Rev Immunol 11: 105–128.

4. Valore EV, Ganz T (1992) Xử lý sau chuyển dịch của các chất bảo vệ trong các tế bào tủy sống của con người chưa trưởng thành. Máu 79: 1538–1544.

5. Liu L, Zhao C, Heng HH, Ganz T (1997) Beta-defensin -1 và alpha-defensin của người được mã hóa bởi các gen liền kề: hai họ peptit có cấu trúc liên kết disulfua khác nhau có chung tổ tiên. Hệ gen 43: 316–320.

6. Valore EV, Park CH, Quayle AJ, Wiles KR, McCray PB, Jr., et al. (1998) Human beta-defensin -1: một peptide kháng khuẩn của các mô niệu sinh dục. J Clin Đầu tư 101: 1633–1642.

7. Schroeder BO, Wu Z, Nude S, Groscurth S, Marcinowski M, et al. (2011) Sự giảm liên kết disulfide cho thấy hoạt động kháng khuẩn mạnh mẽ của beta-defensin ở người 1. Bản chất 469: 419–423.

8. Lehmann J, Retz M, Harder J, Krams M, Kellner U, et al. (2002) Sự biểu hiện của beta-Defensins 1 và 2 ở người trong thận bị nhiễm trùng mãn tính do vi khuẩn. BMC lây nhiễm Dis 2: 20.

9. Bevins CL (2006) Tế bào Paneth bảo vệ: các phân tử tác động chính của khả năng miễn dịch bẩm sinh. Các giao dịch của Hội Sinh hóa 34: 263–266.

10. Quayle AJ, Porter EM, Nussbaum AA, Wang YM, Brabec C, et al. (1998) Sự biểu hiện gen, sự hình thành miễn dịch và sự bài tiết của defensin ở người -5 trong đường sinh sản nữ của con người. Am J Pathol 152: 1247–1258.

11. Porter E, Yang H, Yavagal S, Preza GC, Murillo O, et al. (2005) Các cấu hình defensin khác biệt trong bệnh viêm niệu đạo do Neisseria gonorrhoeae và Chlamydia trachomatis cho thấy các tương tác mới của tế bào biểu mô-bạch cầu trung tính. Nhiễm Immun 73: 4823–4833.

12. Com E, Bourgeon F, Evrard B, Ganz T, Colleu D, et al. (2003) Sự biểu hiện của các chất chống vi khuẩn trong đường sinh sản đực của chuột cống, chuột nhắt và người. Sinh học sinh sản 68: 95–104.

13. Porter EM, Poles MA, Lee JS, Naitoh J, Bevins CL, et al. (1998) Phân lập các chất bảo vệ đường ruột của con người khỏi nước tiểu tân sinh hồi tràng. Thư FEBS 434: 272–276.

14. Townes CL, Ali A, Robson W, Pickard R, Hall J (2011) Khả năng chịu đựng vi khuẩn niệu sau khi chuyển hướng nước tiểu có liên quan đến hoạt động của peptide kháng khuẩn. Tiết niệu 77: 509 e501–508.

15. Wang AP, Su YP, Wang S (2010) Tính nhạy cảm với vi khuẩn và cơ chế tái tổ hợp alpha defensin 5 của người làm tăng các chủng kháng kháng sinh trên lâm sàng. Afr J Microbiol Res 4: 626–633.

16. Gropp R, Frye M, Wagner TO, Bargon J (1999) Sự bảo vệ của biểu mô làm suy giảm nhiễm virus adenoviral: ngụ ý cho liệu pháp gen qua trung gian adenovirus. Liệu pháp gen người 10: 957–964.

17. Smith JG, Nemerow GR (2008) Cơ chế trung hòa adenovirus bởi Human alpha-defensins. Vật chủ tế bào & vi khuẩn 3: 11–19.

18. Dugan AS, Maginnis MS, Jordan JA, Gasparovic ML, Manley K, và cộng sự. (2008) Human alpha-defensins ức chế sự lây nhiễm của virus BK bằng cách tập hợp các virion và ngăn chặn sự liên kết với các tế bào chủ. Tạp chí hóa học sinh học 283: 31125–31132.

19. Zhang D, Liu ZH, Liao QP, Ma JM, Sun YF, et al. (2009) Nghiên cứu khả năng miễn dịch tại chỗ của nhiễm trùng đường sinh dục dưới. Zhonghua fu chan ke za zhi 44: 13–15.

20. Quayle AJ (2002) Đáp ứng miễn dịch bẩm sinh và sớm đối với thách thức mầm bệnh trong đường sinh dục nữ và vai trò quan trọng của tế bào biểu mô. Tạp chí miễn dịch học sinh sản 57: 61–79.