Hình ảnh thận: Từ ánh sáng đến kính hiển vi siêu phân giải
Mar 17, 2022
Liên hệ: ali.ma@wecistanche.com
Maria Lucia Angelotti1,2, Giulia Antonelli1,2 Carolina Conte1,2và Paola Romagnani1,2
TRỪU TƯỢNG
Những thành tựu quan trọng trongquả thậncác cơ chế sinh lý và sinh lý bệnh phần lớn có thể được coi là tiến bộ trong công nghệ kính hiển vi. Phần lớn những gì chúng ta biết về kiến trúc củaquả thậndựa trên những mô tả cơ bản của các nhà hiển vi giải phẫu sử dụng kính hiển vi ánh sáng và sau đó là phân tích siêu cấu trúc được cung cấp bởi kính hiển vi điện tử. Hai kỹ thuật này được sử dụng cho các hệ thống phân loại bệnh thận đầu tiên và để cập nhật liên tục. Gần đây hơn, một loạt các kỹ thuật hình ảnh mới đã bổ sung phân tích trong các chiều không gian và thời gian. Kính hiển vi đồng tiêu cho phép chúng tôi hình dung tuần tự các phần quang học dọc theo trục z và sự sẵn có của phần mềm phân tích cụ thể đã cung cấp kết xuất ba chiều của các mẫu mô dày hơn. Kính hiển vi đa photon cho phép chúng tôi điều tra đồng thờiquả thậnchức năng và cấu trúc trong thời gian thực. Kính hiển vi hình ảnh có tuổi thọ huỳnh quang cho phép chúng tôi nghiên cứu sự phân bố trong không gian của các chất chuyển hóa. Kính hiển vi siêu phân giải tăng độ nhạy và độ phân giải lên đến mức quy mô nano. Với kính hiển vi điện tử lạnh, các nhà nghiên cứu có thể hình dung các phân tử sinh học riêng lẻ ở cấp độ nguyên tử trực tiếp trong các mô và hiểu được sự tương tác của chúng ở cấp độ dưới tế bào. Cuối cùng, phép đo phổ khối lượng hình ảnh ion hóa / khử hấp thụ laser hỗ trợ ma trận cho phép đo hàng trăm phân tử khác nhau cùng lúc trên các phần mô ở độ phân giải cao. Đánh giá này cung cấp một cái nhìn tổng quan vềquả thậnchiến lược hình ảnh, tập trung vào tác động có thể có của những cải tiến công nghệ gần đây nhất.
Từ khóa:hóa mô miễn dịch,quả thậnsinh thiết, podocytes,gầnhình ống, tế bào gốc
Cistanche herba cho bệnh thận, bấm vào đây để lấy mẫu
GIỚI THIỆU
Cácthận củasự phức tạp về cấu trúc hấp dẫn được yêu cầu để thực hiện các chức năng sinh lý đa dạng của nó. Ban đầu, nghiên cứu vềquả thậnbị giới hạn trong các quan sát vĩ mô và không thể phủ nhận sự đóng góp của chúng trong việc chẩn đoán các bệnh thận. Các biểu hiện lâm sàng đã được mô tả nhưng cơ chế bệnh sinh cơ bản vẫn chưa được biết rõ. Những thành tựu trong việc hiểu biết về sinh lý học và sinh lý bệnh của thận phần lớn có thể là do sự tiến bộ liên tục trong lĩnh vực kính hiển vi. Nỗ lực lúcquả thậnhình ảnh bắt đầu từ rất lâu trước đây [1]. Năm 1666, nhà giải phẫu học Malpighi đã kiểm traquả thậnmô bằng kính hiển vi ánh sáng có công suất ước tính là 25–30 và lần đầu tiên mô tả cầu thận là 'một tuyến trong đó nước tiểu được tách ra khỏi máu' [2]. Đóng góp này đã bị bỏ qua cho đến năm 1842 khi cấu trúc nephron được khám phá bằng kính hiển vi ánh sáng mạnh hơn gấp 10 lần của Sir William Bowman. Bowman đã phát hiện ra nang quanh cầu thận (sau này được đặt tên là nang Bowman) về mặt giải phẫu kết nối với phần đầu tiên của ống [3]. Năm 1862, Jacob Henle mô tả đoạn ống hình vòng cung lấy tên ông, nối ống vỏ não và nhú thận.
Nhờ sự ra đời của kính hiển vi ánh sáng, một phân loại mô học củaquả thậnbệnh tậtđã trở nên khả thi [1]. Cơ hội quan sát những gì đang xảy ra ở thận bị bệnh cho phép người ta hiểu rằng những thay đổi bệnh lý khác nhau đáng kể giữa những bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng giống nhau. Tuy nhiên, những nghiên cứu đầu tiên về những thay đổi bệnh lý trong mô thận được thực hiện trên các mẫu mổ tử thi, hầu hết dẫn đến mô tả các bệnh mãn tính. Việc thiếu thông tin về sự tiến triển của các bệnh lý thận và vấn đề kỹ thuật của các hiện tượng tự tiêu, liên quan đến việc sử dụng các mô sau khi chết, đã hạn chế hiểu biết về các bệnh của con người. Năm 1951, sự ra đời củaquả thậnsinh thiết cho phép quan sát và nghiên cứu trực tiếp không chỉ các bệnh mãn tính mà còn cả các bệnh thận cấp tính. Trong khi đó, kính hiển vi dần trở nên tinh vi hơn với độ nhạy và độ phân giải ngày càng tăng dần lên đến mức kích thước nano. Trong bài đánh giá này, chúng tôi sẽ cung cấp một cái nhìn tổng quan về những khám phá cơ bản về thận nhờ những tiến bộ trong công nghệ kính hiển vi, tập trung vào các khả năng phát triển từ những phát triển kỹ thuật gần đây nhất.
ĐÁNH GIÁ MIỄN DỊCH HỌC CỦA KIDNEY
Dán nhãn miễn dịch và kính hiển vi huỳnh quang
Khả năng thu được một đoạn mô sống đại diện cho phép áp dụng các kỹ thuật mới nổi yêu cầu bảo quản mô tối đa, chẳng hạn như các phương pháp hóa mô miễn dịch (huỳnh quang trước, sau đó là enzym). Trên thực tế, vào năm 1950, Coons đã phát triển phương pháp ghi nhãn kháng thể bằng chất huỳnh quang isocyanate, tức là miễn dịch huỳnh quang, mà không phá hủy khả năng phản ứng đặc biệt với kháng nguyên mô của chúng. Kể từ đó, miễn dịch huỳnh quang đã được kết hợp trong quy trình chẩn đoán để đánh giá các mẫu sinh thiết thận đông lạnh. Lần đầu tiên, các kỹ thuật này cho phép quan sát các globulin miễn dịch nội thận (Igs) và lắng đọng bổ thể ở những bệnh nhân bị ảnh hưởng bởi viêm cầu thận, góp phần phân biệt các bệnh sinh lý khác nhau bên dưới một số tổn thương mô không đặc hiệu, ví dụ, trong bệnh viêm cầu thận hình lưỡi liềm [4]. Ngoài ra, khả năng quan sát kiểu nhuộm đặc trưng và sự kết hợp của fluorescein với các kháng thể không phải là Immunoglobulin G (IgG) đã dẫn đến việc nhận biết các lắng đọng Immunoglobulin A (IgA) trong bệnh thận IgA, cũng như lắng đọng bổ thể trong bệnh viêm cầu thận sau nhiễm trùng và viêm cầu thận tăng sinh màng [4].
Kính hiển vi cùng tiêu điểm
Kính hiển vi huỳnh quang đã trải qua nhiều cải tiến kỹ thuật đáng kể với sự ra đời của kính hiển vi đồng tiêu vào cuối những năm 1980. Các yếu tố chính trong kính hiển vi đồng tiêu là điểm chiếu sáng được tập trung và quét trên mẫu vật và một khẩu độ đồng tiêu thay đổi (lỗ kim) ở phía trước máy dò cho phép thu ánh sáng chỉ từ một phần mỏng xung quanh mặt phẳng tiêu điểm (được gọi là phần quang học). Kính hiển vi đồng tiêu cho phép các nghiên cứu in vivo đầu tiên về thận trong các mô hình thực nghiệm và quan sát sự hấp thu và vận chuyển của các phân tử huỳnh quang qua các ống còn nguyên vẹn.thậnsau khi chọc thủng. Điều này cho phép các nghiên cứu về chức năng của ống trong điều kiện sinh lý và bệnh lý [5].
The possibility to sequentially image optical sections along the z-axis and the availability of specific analysis software permitted a three-dimensional (3D) rendering of thicker tissue specimens, showing the frequent inconsistency and misrepresentations provided by 2D analyses [6, 7] (Figure 1A and a'). In addition, the introduction of genetically encoded fluorescent proteins in transgenic mice permitted the labeling of specific cells and tracing them directly within tissues without immunostaining (lineage tracing strategy) [6, 7, 8]. However, confocal microscopy still did not resolve details >200 nm, do giới hạn nhiễu xạ của ánh sáng nhìn thấy, hiện tượng tẩy trắng và độc tính quang.
TÌM HIỂU RÀO CẢN LỌC GLOMERULAR: KÍNH HIỂN VI ELECTRON
Nỗ lực đầu tiên để vượt qua giới hạn độ phân giải của kính hiển vi ánh sáng và huỳnh quang là vào năm 1931 khi Ernst Ruska và Max Knoll phát minh ra kính hiển vi điện tử (EM), sử dụng chùm electron gia tốc, thay vì chùm ánh sáng, làm nguồn kích thích, và có khả năng phân giải cao hơn kính hiển vi ánh sáng (lên đến 0. 2 nm). Vì sự đổi mới này, năm 1986 Ernst Ruska đã được trao giải Nobel Vật lý. Nhờ sức mạnh phân giải tăng lên, người ta sớm thấy rõ rằng cầu thận không chỉ đơn giản là một bộ lọc cơ học, mà là một cơ quan cực kỳ phức tạp bao gồm ba lớp: tế bào nội mô, màng đáy cầu thận (GBM) và tế bào nang [9]. Transmission EM (TEM) cho phép hình dung các tế bào cầu thận từ bên trong [10] và tiết lộ rằng các tế bào nội mô có thân tế bào mỏng, trong khi tế bào podocytes có thân tế bào lớn, và kéo dài các quá trình 'chân' sơ cấp và thứ cấp được neo vào GBM và liên kết với nhau qua các mối nối tuyến tính (màng chắn nhẹ) (Hình 1B). Hơn nữa, quét EM (SEM), thu nhận các điện tử bị tán xạ ngược, cho phép hình dung các tế bào cầu thận từ bề mặt bên ngoài của chúng [10] và tiết lộ rằng các quá trình chân của các tế bào podocytes lân cận xen kẽ và bao phủ GBM (Hình 1C). EM vẫn là một công cụ mạnh mẽ không chỉ để hiểu siêu cấu trúc cầu thận bình thường mà còn để hiểuquả thậnsinh lý học và sinh lý bệnh [11]. Nhiều nghiên cứu được thực hiện trên các mẫu người hoặc trong các mô hình thử nghiệm đã tiết lộ rằng các quá trình bệnh tật khác nhau có liên quan đến một tập hợp các mô hình thay đổi cấu trúc đặc biệt, ngụ ý cập nhật thêm về hệ thống phân loại đang phát triển củaquả thậnbệnh tật. Khả năng kỹ thuật để hình dung sự phức tạp hơn nữa của siêu cấu trúc của thận đã chứng minh cho sự chuyên môn hóa của các nhà nghiên cứu bệnh học 'thận'.
Một kỹ thuật SEM gần đây, dựa trên một máy dò có độ nhạy cao, cho phép nghiên cứu phần sâu nhất của màng ngăn khe và cho thấy rằng nó được đặc trưng bởi các lỗ rỗng với kích thước khác nhau [12]. Ở chuột, sự khởi đầu của protein niệu có liên quan đến lỗ chân lông to, làm tăng khả năng những thay đổi siêu cấu trúc của cơ hoành có thể gây ra những thay đổi về tính nhạy cảm của cầu thận [12]. Là một tiến bộ kỹ thuật hơn nữa, SEM mặt khối cho phép chuyển từ chế độ xem 2D sang 3D của hàng rào lọc cầu thận với độ phân giải đủ để tuân theo cấu trúc nano của các quá trình tế bào mỏng nhất ở chuột khỏe mạnh, chuột bị bệnh và trongquả thậnphát triển [13, 14].
Cuối cùng, việc kết hợp EM với hệ thống phân tích vi tia X (kính hiển vi tia X) cho phép phân tích nguyên tố các tế bào hoặc các bộ phận của tế bào ở cấp độ siêu cấu trúc. Kính hiển vi tia X sử dụng TEM quét với chùm điện tử hẹp để kích thích mẫu. Sự va chạm của các electron năng lượng cao từ chùm tia với các nguyên tử trong mẫu vật tạo ra năng lượng dưới dạng các photon tia X. Tín hiệu tia X này, được thu thập bằng máy dò bán dẫn phân tán năng lượng, được sử dụng để xác định các phần tử có trong mẫu vật, với độ phân giải tốt nhất là 30 nm. bên trongquả thận, phương pháp vi phân tích tia X đã được Beck và Thurau sử dụng thành công để nghiên cứu sự vận chuyển ion qua ống biểu mô [15] và nồng độ nguyên tố nội bào trong tế bào ống [16].
ĐÁNH GIÁ SINH LÝ RENAL VỚI VI SINH VẬT NHIỀU LẦN
Kính hiển vi đa photon (MPM) cung cấp một tiến bộ hơn nữa trongquả thậnnghiên cứu, nghĩa là khả năng đồng thời điều tra các mối quan hệ chức năng và cấu trúc thận trong thời gian thực [17]. Khác với kính hiển vi ánh sáng thông thường, kích thích hai photon phụ thuộc vào sự hấp thụ đồng thời của hai photon có bước sóng kích thích gấp đôi cần thiết để kích thích fluorophore trong kích thích một photon cổ điển (Hình 1D). Việc sử dụng tia hồng ngoại xung, tia laser kích thích năng lượng thấp có sẵn trên thị trường đã làm tăng sự thâm nhập vào mô sâu và giảm thiểu độc tính quang (Hình 1D). Điều này cho phép các nhà nghiên cứu hình dung trực tiếp các quá trình tế bào động ở động vật sống, một tính năng trước đây không thể đạt được với bất kỳ kỹ thuật nào khác. MPM cho phép định lượng các chức năng thận cơ bản và các thay đổi bệnh lý như tính thấm cầu thận, lưu lượng máu trong mạch, mức lọc cầu thận đơn nephron, và lưu lượng ống [17] (Hình 1E và F). Ngoài ra, MPM cho phép nghiên cứu các quá trình nội bào để phản ứng với tổn thương, bao gồm chết và rụng tế bào, lăn bạch cầu, tuyển dụng và gián đoạn GBM [17]. Những cải tiến kỹ thuật hơn nữa đã cho phép hình ảnh trong ổ bụng kéo dài trong nhiều ngày đến vài tuần [18], kết hợp với chuột chuyển gen biểu hiện các protein huỳnh quang, đã được sử dụng để theo dõi số phận của các tế bào đơn lẻ trực tiếp in vivo trong thận khỏe mạnh và bị thương [19] và hiểu rõ hơn về cơ chế thay thế và tái tạo tế bào thận.
Kỹ thuật hình ảnh không nhãn cũng có thể thực hiện được với MPM, khai thác khả năng tự phát huỳnh quang tự nhiên của nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NADH) để nghiên cứu trạng thái oxy hóa khử của tế bào hình ống sau khi bị thương [20]. Ngoài ra, thế hệ hài hòa thứ hai từ collagen sợi được sử dụng để định lượng sự lắng đọng collagen, một dấu hiệu của xơ hóa thận [21]. Thế hệ sóng hài thứ hai là một quá trình quang học phi tuyến tính, trong đó hai photon kích thích có cùng bước sóng tương tác với các cấu trúc không đối xứng tâm trong các mô sinh học, chẳng hạn như collagen hoặc vi ống, và tạo ra một photon mới với một nửa bước sóng.
Một sự đổi mới gần đây của kính hiển vi trong ổ mắt là sự ra đời của một ống nội soi đa cực thu nhỏ được sử dụng thành công để hình ảnh thận ở những con chuột còn sống được gây mê [22]. MPM xâm lấn tối thiểu này có thể mở đường cho chẩn đoán in vivo thời gian thực, không cần cắt bỏ mô và trong thời gian rất ngắn.
THE KIDNEY IN 3D: KỸ THUẬT XÓA TISSUE VÀ KÍNH HIỂN VI MỞ RỘNG
Bất chấp những cải tiến về công nghệ, một trong những giới hạn chính đối với hình ảnh thể tích sâu hơn là độ mờ của mô thận, làm choquả thậnmột trong những cơ quan khó khăn nhất về mặt quang học. Đây là lý do tại sao kỹ thuật làm sạch mô đã được nhiều người quan tâm [23]. Mục đích của các phương pháp này là chuyển đổi một mô không trong suốt thành một mô trong suốt, bảo tồn các protein và cuối cùng là các chất đánh dấu huỳnh quang, để tạo hình ảnh các lát mô dày. Sự kết hợp giữa bù trừ quang học với kính hiển vi hiện đại cung cấp khả năng phân tích hình thái học, chẳng hạn như định lượng thể tích và số lượng cầu thận, trong các mô dày hoặc thậm chí trong thận còn nguyên vẹn [24]. Các ứng dụng khác bao gồm phân tích các đoạn ống riêng biệt [25], chức năng của chúng [26] và định lượng sự mất tế bào podocyte [27].
Để hình ảnh khối lượng lớn mô và đồng thời giải quyết các chi tiết cấu trúc tốt, một phương pháp kỹ thuật mới đã được giới thiệu gần đây, đó là kính hiển vi mở rộng (ExM). Ý tưởng là mở rộng về mặt vật lý toàn bộ cơ quan 4- thành 5- gấp lại trong khi vẫn bảo toàn kiến trúc tổng thể và nội dung proteome 3D. Bằng cách sử dụng một polyme giãn nở, được tổng hợp trực tiếp trong mẫu vật, các phân tử gần hơn giới hạn nhiễu xạ của ánh sáng được phân tách đẳng hướng trong không gian đến khoảng cách lớn hơn và do đó có thể được phân giải quang học ngay cả bằng kính hiển vi huỳnh quang thông thường. Ngoài ra, ExM cung cấp độ trong suốt quang học cao hơn và giảm sự tán xạ ánh sáng, cho phép người ta hình dung được khối lượng mô lớn hơn. Sử dụng cách tiếp cận này, vị trí của nhiều protein trong màng ngăn khe và GBM có thể được phân tích ngay cả với kính hiển vi đồng tiêu thông thường [28]. Ví dụ, nó có thể tiết lộ hiệu quả của quá trình bàn chân ở chuột proteinuric, cả trong 2D và 3D, ở độ phân giải nanomet chưa từng đạt trước đây [29]. Gần đây ExM đã được sử dụng để đánh giá logic mô bệnh học lâm sàng của các mẫu vật nhúng parafin đã được nhuộm với hematoxylin và eosin [30]. Kỹ thuật này có thể vi phạm hiệu quả của quá trình chân ở mức độ nano mà trước đây chỉ có thể thực hiện được với EM. Những tiến bộ trong hình ảnh thể tích cho phép phân tích 3D độ phân giải cao của toàn bộ cơ quan theo cách mà hạn chế chính đối với hình ảnh sâu hiện được khắc phục bằng khả năng cho các kháng thể thâm nhập vào mô.
NGHIÊN CỨU HỒ SƠ KIM LOẠI: KÍNH HIỂN VI HÌNH ẢNH TRONG NƯỚC-TẦN SỐ
Cácquả thậnlà cơ quan trao đổi chất có hàm lượng ti thể cao. Dạng khử của NADH và các chất chuyển hóa khác có tính huỳnh quang tự nhiên và quá trình tự phát huỳnh quang này có thể được sử dụng như một chỉ số của trạng thái oxy hóa khử [20]. Tuy nhiên, phổ phát xạ của các fluorophores nội sinh này chồng chéo lên nhau, và việc xác định chúng một cách riêng biệt là không thể. Nhưng thời gian tồn tại của huỳnh quang (tức là thời gian phân rã của huỳnh quang) được phát hiện là khác nhau đáng kể. Do đó, kính hiển vi hình ảnh có tuổi thọ huỳnh quang (FLIM) cho phép nghiên cứu các cấu hình trao đổi chất [31]. Gần đây, bằng cách sử dụng sự kết hợp của MPM và FLIM, người ta đã có thể mô tả các dấu hiệu trao đổi chất cụ thể của tế bào và theo dõi những thay đổi về trao đổi chất in vivo trong quá trìnhquả thậnbệnh [32]. FLIM dự kiến sẽ cung cấp thêm thông tin chi tiết vềquả thậntrao đổi chất in vivo trong sức khỏe và bệnh tật.
ĐỘ PHÂN GIẢI ĐỆM SAU GIỚI HẠN: HÌNH ẢNH SIÊU PHÂN GIẢI CỦA KIDNEY
Kính hiển vi ánh sáng tiêu chuẩn phải đối mặt với giới hạn của độ phân giải quang học vượt quá 200 nm. Các công nghệ mới, được gọi là hình ảnh siêu phân giải, hiện cho phép kính hiển vi huỳnh quang cho hình ảnh vượt quá giới hạn nhiễu xạ của nó như một điểm khởi đầu của kỷ nguyên kính nano [33]. Những cách tiếp cận này kết hợp độ phân giải nano với những ưu điểm của việc ghi nhãn huỳnh quang nhiều màu. Để ghi nhận tác động tiềm tàng của những đổi mới này, giải Nobel Hóa học 2014 đã được trao cho Eric Betzig, Stefan Hell và William Moerner 'vì sự phát triển của kính hiển vi huỳnh quang siêu phân giải. Các chiến lược khác nhau của hình ảnh siêu phân giải có thể được áp dụng để giải quyết các câu hỏi sinh học khác nhau. Những cách tiếp cận này có thể được nhóm lại thành hai loại chính, tùy thuộc vào việc siêu phân giải được khai thác ở cấp độ phân tử đơn lẻ hay ở cấp độ đồng bộ [33].
Kỹ thuật dựa trên tập hợp
Các kỹ thuật dựa trên tổ hợp phá vỡ giới hạn nhiễu xạ bằng cách điều biến theo thời gian và không gian chùm ánh sáng kích thích. Trong số đó, hình ảnh suy giảm phát xạ kích thích siêu phân giải (STED) sử dụng hai tia laser, một tia laser kích thích và một tia laser suy giảm, chuyển dịch đỏ, chồng chất (tia laser STED), có hình dạng bánh rán, để ngăn chặn sự phát xạ huỳnh quang từ các fluorophores nằm tắt tâm của sự kích thích. Sự triệt tiêu này đạt được thông qua phát xạ kích thích và chỉ cho phép thu tín hiệu xuất phát từ tiêu điểm có kích thước dưới giới hạn nhiễu xạ (Hình 2A). Hình ảnh STED được sử dụng để hình ảnh màng ngăn khe trong quang học được xóaquả thậnmô (Hình 2B – c ') và cho phép xác định vị trí của sự phân bố trong không gian của podocin và nephrin ở quy mô nanomet lên đến độ sâu ít nhất là 30 lm [34]. Ngoài ra, khả năng quan sát và định lượng hiệu quả của quá trình bàn chân trong một mô hình thực nghiệm có thể làm cho hình ảnh STED trở nên hữu ích cho các nghiên cứu về hàng rào lọc cầu thận [34].
Kính hiển vi STED yêu cầu các quy trình cụ thể để chuẩn bị mẫu, các fluorophores đặc biệt và đào tạo kỹ thuật. Vì lý do này, trong vài năm gần đây, người ta đã chú ý nhiều hơn đến một kỹ thuật siêu phân giải khác, kính hiển vi chiếu sáng có cấu trúc (SIM), có thể mở rộng giới hạn nhiễu xạ thêm hai lần cả theo phương và trục. SIM sử dụng thiết lập kính hiển vi trường rộng với kiểu chiếu sáng sọc mịn, cho phép thu thập thông tin tần số cao (tương ứng với các chi tiết nhỏ trong mẫu) ở tần số không gian thấp hơn. Bằng cách thu được nhiều hình ảnh với các kiểu chiếu sáng của các pha và hướng khác nhau, hình ảnh có độ phân giải cao có thể được tái tạo (Hình 3A). SIM tương thích với các fluorophores tiêu chuẩn, không yêu cầu chuẩn bị mẫu cụ thể và cho phép hiển thị 3D. Với tất cả những ưu điểm này, các nghiên cứu khác nhau đã được thực hiện để đánh giá khả năng sử dụng SIM như một công cụ chẩn đoán nhanh [35], ví dụ, với thời gian quay vòng tiềm năng ngắn hơn EM. Gần đây, một SIM 3D và xử lý hình ảnh tự động đã được sử dụng như một công cụ chẩn đoán nhanh tình trạng tràn dịch khớp ở chân bằng cách sử dụng các đoạn parafin thường quy từ sinh thiết của những bệnh nhân mắc bệnh ít thay đổi [36] (Hình 3B và C). Khả năng xác định thành công các thay đổi trong các bệnh được biết là biểu hiện bệnh lý ở kích thước nano đã khẳng định SIM là một công cụ đầy hứa hẹn để chẩn đoán thông thường.
Phương pháp chụp ảnh dựa trên bản địa hóa đơn phân tử
Các kỹ thuật này dựa vào khả năng bật và tắt theo chu kỳ các phân tử huỳnh quang riêng lẻ quá gần để phân giải. Trong những cách tiếp cận này, các phân tử trong vùng giới hạn nhiễu xạ có thể được kích hoạt tại các thời điểm khác nhau để chúng có thể được chụp ảnh riêng lẻ và sau đó được định vị với độ chính xác nanomet bằng cách tính toán tìm tâm của chúng (Hình 3D). Trong số các cách tiếp cận này, kính hiển vi tái tạo quang ngẫu nhiên (STORM) lần đầu tiên được giới thiệu trongquả thậnnghiên cứu vào năm 2013, với một nghiên cứu tiết lộ tổ chức phân tử phức tạp của GBM ở độ chính xác nanomet, bao gồm định hướng của các phân tử bên trong [37]. Trên mô hình chuột mắc hội chứng thận hư bẩm sinh hiếm gặp, STORM cho thấy sự tích hợp và định hướng chính xác của laminin 521 trong GBM sau khi tiêm tĩnh mạch, mở đường cho các lựa chọn điều trị tiên tiến cho bệnh nhân [38]. Một nghiên cứu khác mô tả tổ chức của bộ xương actin trong tế bào podocytes ở độ phân giải quy mô phân tử [39] (Hình 3E – I). Theo một phát hiện mới, tế bào vỏ chứa các bó actin co lại được kết nối với các bó actin không co trong các quá trình chân. Trong các mô hình tổn thương podocyte, cấu trúc actin trong quá trình bàn chân bị tháo rời, dẫn đến sự sụp đổ của cấu trúc co bóp trong cơ thể chính [39].
ĐÁNH GIÁ CẤU TRÚC 3D CỦA CÁC BỆNH LÝ SINH HỌC CƠ BẢN Ở CẤP ĐỘ ATOMIC: VI SINH VẬT CRYO-ELECTRON
Cho đến gần đây, khả năng nghiên cứu cấu trúc của các phân tử sinh học cơ bản chỉ giới hạn trong kính hiển vi điện tử, với độ phân giải vài nanomet. Các rào cản kỹ thuật, chẳng hạn như làm hỏng mẫu bởi chùm điện tử cường độ cao, độ tương phản hình ảnh thấp và chuyển động của phân tử sau khi tương tác với các điện tử hoặc khó bảo quản nước trong mẫu sinh học trong chân không được áp dụng bên trong buồng EM, khiến không thể phân giải các phân tử dưới kích thước này . Làm lạnh mẫu có thể làm giảm sự bốc hơi nước và hư hỏng do điện tử gây ra [40]. Từ ý tưởng này, cryo-EM đã được giới thiệu vào những năm 1950. Một vài năm trước, sự ra đời của máy dò đếm đơn điện tử mới cuối cùng đã đẩy độ phân giải vượt quá giới hạn trước đây. Năm 2017, giải Nobel Hóa học được trao cho Jacques Dubochet, Joachim Frank và Richard Henderson vì đã 'phát triển kính hiển vi điện tử lạnh để xác định cấu trúc có độ phân giải cao của các phân tử sinh học trong dung dịch'. Những tiến bộ này hiện nay cho phép xác định cấu trúc của các phân tử sinh học trong dung dịch [41].
Trongquả thậnnghiên cứu, cấu trúc của các protein cơ bản đã được xác định ở cấp độ nguyên tử [42, 43]. Trong số đó, cấu trúc của polycystin của con người -2, mà các đột biến của chúng gây ra bệnh đa nang trội trên cơ thể nhiễm sắc thểquả thậnbệnh [44], và cấu trúc của 6 kênh ion hình chuẩn tiềm năng thụ thể thoáng qua, mà đột biến gây ra FSGS ở người [43], được xác định với độ phân giải của một vài angstrom [44].
TÌM HIỂU CƠ SỞ RÕ RÀNG CỦA BỆNH KIDNEY: VIÊM PHỔI TÍCH HỢP KIDNEY
Vài năm gần đây, sự quan tâm ngày càng tăng đối với các phương pháp tiếp cận không nhãn có thể lập bản đồ cụ thể và đồng thời tổng phổ của các phân tử trong mô [45]. Trong số đó, phép đo phổ khối lượng hình ảnh ion hóa / khử hấp thụ laser ma trận (MALDI-IMS) cho phép đo hàng trăm phân tử khác nhau cùng lúc trực tiếp trên các phần mô ở độ phân giải cao. Trong thí nghiệm MALDI-IMS, một phần mô mỏng, đông lạnh hoặc nhúng parafin, được phủ một lớp ma trận hấp thụ năng lượng laser và thúc đẩy quá trình ion hóa các chất phân tích mô. Phép phân tích trong khối phổ kế tạo ra phổ cho mỗi tọa độ x / y. Sau khi đo MALDI, phần mô tương tự có thể được nhuộm bằng các quy trình hóa mô và mô miễn dịch truyền thống để tích hợp mô hình phân tử với các chi tiết mô học. Trong nghiên cứu về thận, MALDI-IMS được sử dụng để nghiên cứu thuốc, chất chuyển hóa, lipid, peptide và protein trong các mô bình thường và bị bệnh [45].
Một trong những ứng dụng thường xuyên nhất của MALDI-IMS là xác định các dấu ấn phân tử để phân loại ung thư biểu mô tế bào thận [46] và thiết lập ranh giới thực sự giữa mô ung thư và mô bình thường ở cấp độ phân tử cũng như mô học [47]. MALDI-IMS cũng đã được sử dụng thành công để nghiên cứu độc tính của thuốc trên thận nhằm phát hiện sớm chất độcquả thậncơ chế thiệt hại do ứng viên dược qua trung gian [48]. Hơn nữa, MALDI-IMS được sử dụng để nghiên cứu lipid và vai trò của chúng trong các bệnh lý thận, chẳng hạn như bệnh thận do đái tháo đường [49], chấn thương thận cấp tính [50] và đa nangquả thậnbệnh [51], và cũng để tiết lộ hồ sơ chuyển hóa nội sinh để hiểu sâu hơn về các cơ chế liên quan đến bệnh [52]. Việc xác định các cấu hình phân tử cũng đã được hoàn thiện cho các dấu ấn sinh học khả dĩ có thể là các dấu ấn sinh học tiên lượng và chẩn đoán tiềm năng mới [53, 54].
KẾT LUẬN VÀ KIỂM TRA TƯƠNG LAI
Những cải tiến liên tục trong kỹ thuật hình ảnh đã từng bước giải quyết nhiều rào cản kỹ thuật quan trọng trongquả thậnnghiên cứu và đã cho phép mô tả động về cấu trúc và chức năng của thận bình thường và thận bị bệnh. Thật vậy, sự ra đời của các công nghệ kính hiển vi mới đã cho phép những khám phá khoa học cơ bản và sau đó thay đổi quan điểm của chúng ta về sinh lý học và sinh lý bệnh của thận, hiện có thể được hình dung dưới dạng 3D và thậm chí được quay trong video, nơi thời gian biểu thị chiều thứ tư. Với sự đổi mới công nghệ gần đây của kính hiển vi siêu phân giải và sự tiến bộ của kỹ thuật hình ảnh phân tử, các nhà nghiên cứu giờ đây có thể hình dung trực tiếp các phân tử sinh học riêng lẻ trực tiếp trong các mô và xác định cách chúng tương tác ở cấp độ tế bào và dưới tế bào.
Khả năng áp dụng những công cụ này cho bệnh lýquả thậncác mẫu vật, tập trung vào các chi tiết phân tử và dưới tế bào trong sinh thiết lâm sàng, sẽ giúp phân loại lại bệnh. Hiện tại vẫn chưa rõ nếu và khi nào điều này sẽ tạo ra ảnh hưởng đến việc chẩn đoán bệnh thận hoặc thậm chí đến việc quản lý bệnh nhân.
KINH PHÍ
Nguồn vốn do Hội đồng Nghiên cứu Châu Âu cung cấp trong khuôn khổ chương trình nghiên cứu và đổi mới Horizon 2020 của Liên minh Châu Âu (thỏa thuận tài trợ 648274).
NGƯỜI GIỚI THIỆU
1. Weening JJ, Jennette JC. Các mốc lịch sử trong bệnh lý thận. Virchows Arch 2012; 461: 3–11
2. Malpighi M. De Viscerum Structura tập thể dục anatomica. Bologna1666
3. Bowman W. Về cấu trúc và việc sử dụng các cơ quan Malpighia củaquả thận, với những quan sát về sự lưu thông qua tuyến đó. Philos Trans R Soc A 1842; 132: 57–80
4. D'Agati VD, Mengel M. Sự gia tăng của bệnh lý thận trong thận học: cấu trúc chiếu sáng chức năng. Là JQuả thậnDis 2013; 61: 1016–1025
5. Ohno Y, Birn H, Christensen EI. Kính hiển vi quét laser đồng tiêu in vivo và vi điểm ở những con chuột còn nguyên vẹn. Nephron Exp Nephrol 2005; 99: e17 – e25
6. Phong tỏa Romoli S, Angelotti ML, Antonelli G. CXCL12 ưu tiên tái tạo các podocyte bị mất trong nephron vỏ não bằng cách nhắm mục tiêu cơ chế phản hồi podocyte-progenitor nội tại.Quả thậnVào năm 2018; 94: 1111–1126
7. Lazzeri E, Angelotti ML, Paired A và cộng sự. Phì đại tế bào ống liên quan đến nội tiết và tăng sinh tiền thân phục hồi chức năng thận sau cấp tínhquả thậnvết thương. Nat Commun 2018; 9: 1344
8. LeHir M, Kriz W. Những hiểu biết mới về các dạng cấu trúc gặp trong bệnh xơ vữa cầu thận. Curr Opin Nephrol Hypertens 2007; 16: 184 - 191 9. Tisher CC. Giải phẫu chức năng củaquả thận. Hosp Pract năm 1978; 13
10. Kính hiển vi điện tử Liapis H. trongquả thậnnghiên cứu: thấy là tin. Ultrastruct Pathol 2013; 37: 340–345
11. ML mạnh, Evers P. Chiều thứ ba trong chẩn đoán thận. Soi kính hiển vi điện tử của thận bình thường và bất thường. S Afr Med J năm 1979; 55: 174–177
12. Gagliardini E, Conti S, Benigni A và cộng sự. Hình ảnh siêu cấu trúc xốp của khe lọc biểu mô cầu thận. J Am Soc Nephrol 2010; 21: 2081–2089
13. Lausecker F, Tian X, Inoue K và cộng sự. Vinculin cần thiết để duy trì tính toàn vẹn của hàng rào cầu thận.Quả thậnVào năm 2018; 93: 643–655
14. Ichimura K, Kakuta S, Kawasaki Y và cộng sự. Hình thái quá trình phát triển của tế bào podocyte được phát hiện qua kính hiển vi điện tử quét mặt khối. J Cell Sci 2017; 130: 132–142
15. Rick R, Dorge A, Beck FX và cộng sự. Phân tích vi mô bằng tia X thăm dò điện tử về sự vận chuyển ion xuyên biểu mô.Ann N YAcad Sci 1986; 483: 245–259
16. Thurau K, Dorge A, Mason J và cộng sự. Nồng độ nguyên tố nội bào trong tế bào ống thận. Một phân tích vi hạt điện tử. Klin Wochenschr 1979; 57: 993–999
17. Peti-Peterdi J, Kidokoro K, Riquier-Brison A. Kỹ thuật in vivo mới lạ để hình dungquả thậngiải phẫu và chức năng. Kidney Int 2015; 88: 44–51
18. Schuh CD, Haenni D, Craigie E, và cộng sự. Kích thích đa photon bước sóng dài có lợi cho trong quỹ đạoquả thậnhình ảnh.Quả thậnVào năm 2016; 89: 712–719
19. Hackl MJ, Burford JL, Villanueva K và cộng sự. Theo dõi số phận của tế bào biểu mô cầu thận in vivo bằng cách sử dụng hình ảnh đa quang nối tiếp trong các mẫu chuột mới có thẻ dòng huỳnh quang. Nat Med 2013; 19: 1661–1666
20. Hall AM, Unwin RJ, Parker N, và cộng sự. Hình ảnh đa quang cho thấy sự khác biệt về chức năng ti thể giữa các đoạn nephron. J Am Soc Nephrol 2009; 20: 1293–1302
