Suy giảm chức năng tự động hút máu phụ thuộc ATG16L thúc đẩy xơ hóa mô kẽ thận trong rối loạn chức năng ghép thận mãn tính thông qua việc kích ứng EndMT bằng con đường tín hiệu NF-kB
Mar 18, 2022
Zeping Gui1,2†, Chuanjian Suo1†, Zijie Wang 1†, Ming Zheng1, Shuang Fei1, Hao Chen1, Li Sun1, Zhijian Han1, Jun Tao1, Xiaobin Ju1, Haiwei Yang1, Min Gu2*và Ruoyun Tan1*
Mãn tínhthậnrối loạn chức năng ghép (CAD) gây ra bởi nhiều yếu tố, bao gồm xơ cứng cầu thận, tắc mạch, giãn kẽ và teo ống thận (IF / TA). Tuy nhiên, các yếu tố nổi bật nhất củaCADlà IF / TA. Các nghiên cứu của chúng tôi đã xác định rằng quá trình chuyển đổi nội mô trung mô (EndMT) là một nguồn quan trọng để tạo ra tất cả IF / TA. Đặc điểm của EndMT là mất chất đánh dấu nội mô và thu nhận các kiểu hình của trung mô hoặc nguyên bào sợi. Autophagy là một con đường thoái hóa nội bào được điều chỉnh bởi các protein liên quan đến autophagy và đóng một vai trò quan trọng trong nhiều điều kiện nuôi cấy. Tuy nhiên, việc autophagy có góp phần vào fi sự hình thành củathậnallograft và cơ chế như vậy xảy ra như thế nào vẫn chưa rõ ràng. Gen 16 like autophagy (ATG16L) là một gen quan trọng liên quan đến autophagy (ARG) cần thiết cho sự hình thành autophagosome. Ở đây, chúng tôi lần đầu tiên phân tích các mô của bệnh nhân ghép thận từ bộ dữ liệu Gene Expression Omnibus (GEO) và 60 bệnh nhân cấy ghép từ trung tâm của chúng tôi. Những người nhận có chức năng thận ổn định được coi là khôngCADnhóm và tất cả bệnh nhân trongCADnhóm được chẩn đoán mô bệnh học vớiCAD. Kết quả cho thấy ATG16L, với tư cách là một ARG khác biệt đáng kể, ít được thể hiện trongCADnhóm so với nhóm không sử dụng CAD. Hơn nữa, chúng tôi nhận thấy có ít thực quản và tự thân hơn trong thận được cấy ghép củaCADbệnh nhân, và việc điều chỉnh giảm autophagy là một yếu tố tiên lượng xấu. Trong ống nghiệm, chúng tôi phát hiện ra rằng việc hạ gục ATG16L đã tăng cường quá trình EndMT ở ngườithậntế bào nội mô cầu thận (HRGECs). In vivo, những thay đổi của EndMT và autophagic fl ux sau đó được phát hiện ở chuộtthậnmô hình cấy ghép củaCAD. Chúng tôi đã chứng minh sự xuất hiện của EndMT và chỉ ra rằng sự dồi dào của ATG16L đi kèm với sự thay đổi cơ chế tự động thực vật theo các giai đoạn khác nhau của quá trình ghép thận. Về mặt cơ học, tác động của ATG16L, đặc biệt trong tế bào nội mô, làm giảm sự phân hủy NF-kB và bài tiết trong các cytokine bắt đầu (IL -1 b, IL -6 và TNF-a), có thể tạo điều kiện cho EndMT. Kết luận, thông lượng tự hoạt động tự động phụ thuộc ATG16L gây ra bởi cấy ghép cho thấy sự mất mát tăng dần theo thời gian.
Các cytokine gây viêm từ quá trình này thúc đẩy EndMT, do đó dẫn đến sự tiến triển củaCAD. ATG16L đóng vai trò là bộ điều chỉnh tiêu cực của EndMT và phát triểnthậngraft fi brosis, và autophagy có thể được khám phá như một mục tiêu điều trị tiềm năng cho rối loạn chức năng ghép thận mãn tính.
Từ khóa:rối loạn chức năng ghép thận mãn tính, thậnxơ hóa kẽ, ATG16L, autophagy, EndMT, cytokine viêm
Để biết thêm thông tin: ali.ma@wecistanche.com
GIỚI THIỆU
Quả thậncấy ghéplà một trong những phương pháp điều trị tối ưu cho bệnh nhân bị nhiễm độc niệu vì nó giúp cải thiện đáng kể chất lượng cuộc sống của họ (1). Tuy nhiên, có một số lượng tương đối cao các rối loạn chức năng thận sau khi ghép do sự suy giảm chức năng thận tiến triển mãn tính, đây là yếu tố chính ảnh hưởng đến sự tồn tại lâu dài của thận được ghép (2). Rối loạn chức năng ghép thận mãn tính (CAD), trước đây được gọi là bệnh thận toàn phần mãn tính, là một tình trạng đa yếu tố liên quan đến xơ hóa mô kẽ thận tiến triển. Các yếu tố khác nhau được biết đến là nguyên nhân góp phần làm mất chức năng của thận, bao gồm, nhưng không giới hạn ở, thải ghép cấp tính và mãn tính, thiếu máu cục bộ và tái tưới máu trong quá trình tái tạo mô và hồi phục, và độc tính trên thận do thuốc (3).
CADđược đặc trưng về mặt hình thái bởi sự biến dạng, thoái hóa kẽ thận tiến triển và teo ống thận (IF / TA), và bệnh xơ cứng cầu thận (4). Trong số đó, IF / TA là yếu tố quan trọng quyết định chức năng tạo allograft của thận, nhưng cơ chế mà nó xảy ra vẫn chưa được biết rõ. Một số yếu tố đã được xác định là góp phần vào tỷ lệ cao của mất allograft ở thận. Trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi, chúng tôi cũng đã xác định rằng quá trình bệnh lý chính của CAD là bệnh lý suy thận IF / TA, được đặc trưng bởi sự lắng đọng quá mức của chất nền ngoại bào trong mô kẽ và ống thận được cấy ghép (5). Các nghiên cứu đã xác minh rằng collagens chủ yếu được tiết ra bởi nguyên bào myo, và sự tiết collagens dẫn đến lắng đọng chất nền ngoại bào và sau đó ghép thận IF / TA. Có bốn tế bào chính tham gia vào quá trình hình thành nguyên bào myo: tế bào biểu mô, tế bào nội mô, nguyên bào nuôi có nguồn gốc từ tủy xương và tế bào ngoại vi mạch (6, 7). Chúng đóng một vai trò quan trọng trong việc sửa chữa và bảo vệ tính toàn vẹn của mô thận. Trong số đó, các kích thích bên ngoài cho phép phân biệt các tế bào thận nội tại như tế bào biểu mô thành nguyên bào nuôi myo, có thể tạo ra chất nền ngoại bào. Quá trình này được gọi là quá trình chuyển đổi từ biểu mô sang trung mô (EMT). EMT thường liên quan đến ba loại: (I) tạo phôi, (II) sửa chữa và xơ hóa mô, (III) di căn (8). Một số nghiên cứu đã được thực hiện để làm sáng tỏ các cơ chế phân tử và tế bào của EMT loại II trong bệnh lý nội tạng (9, 10), tuy nhiên, vai trò của EMT trong các quá trình tạo nguyên bào sơ cấp khác nhau trong quá trình tiến triển CAD vẫn chưa được kết luận.
Với việc ghép thận, luôn có khả năng tăng khả năng tổn thương đối với vi mạch và vi mạch của allograft, do vị trí vật lý của nội mô allograft khiến nó trở thành mục tiêu lựa chọn ban đầu cho tổn thương allograft (11). Allografts hoạt động như các mục tiêu tiềm năng cho đáp ứng miễn dịch qua trung gian của khá nhiều loại huyết thanh trong các cytokine kích thích. Các nghiên cứu chỉ ra rằng nhiều cytokine kích thích liên quan đếnCADquá trình (12) và các tế bào nội mô tại các vị trí của thận không chỉ tham gia vào quá trình chuyển hóa mà còn là cơ quan điều hòa quá trình chuyển hóa (11). Nghiên cứu trước đây của chúng tôi cho thấy rằng TNF ‐ a được thể hiện nhiều hơn trongCADnhóm hơn nhóm không sử dụng CAD. TNF-a cũng tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình EMT trong các tế bào hình ống gần của con người (HK2) (13). Do có sự tiếp xúc mật thiết giữa các tế bào nội mô và máu, lưu thông trong các tế bào điều hòa và các cytokine sẽ tấn công đầu tiên vào lớp nội mô allograft. Kích thích mãn tính từ các cytokine gây viêm dẫn đến các tế bào nội mô bị rối loạn cấu trúc tế bào và môi trường bên trong, dẫn đến tổn thương nội mô. Các nghiên cứu mới nổi cho thấy tổn thương nội mô góp phần làm lắng đọng chất nền ngoại bào và đóng một vai trò quan trọng trong các bệnh xơ hóa cơ quan. Gần đây, quá trình chuyển đổi từ nội mô sang trung mô (EndMT) được coi là nguyên nhân chính gây tổn thương nội mô và thúc đẩy sự tiến triển của IF / TA trong bệnh thận ứ nước (5, 9). EndMT là một loại EMT đặc biệt. Nó được đặc trưng bởi các tế bào mất dần các dấu hiệu nội mô, chẳng hạn như CD31 và CD34, và đạt được kiểu hình nguyên bào nuôi trung mô hoặc myo, chẳng hạn như actin cơ trơn (a-SMA), collagen I và fi bronectin (FN). Cơ chế quản lý cho EndMT vẫn là một vấn đề phức tạp. Sự xuất hiện của EndMT có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như stress oxy hóa, thiếu oxy và các chấn thương khác nhau (14, 15). Nhưng hầu như tất cả các yếu tố điều tiết này cuối cùng kết hợp với nhau trong một hoạt động trực tiếp, đó là trong các cytokine điều hòa. Trong các nghiên cứu trước đây của chúng tôi, chúng tôi đã chỉ ra rằng EndMT là một yếu tố quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của IF / TA và CAD thông qua các con đường tín hiệu TGF-b / Smad (5). Ngoài ra, vẫn còn các học giả khác cho rằng biểu thức TGF-b được điều chỉnh bởi TNF ‐ a (16). Vì vậy, trong các cytokine kích thích như TNF-a cũng có thể là một yếu tố gây bệnh quan trọng trong tổn thương nội mô mạch máu đặc trưng cho sự tiến triển của CAD. Mặc dù các yếu tố ban đầu của EndMT là khác nhau trong các môi trường vi mô khác nhau, nhưng kết quả cuối cùng là giống nhau. Do đó, có thể đưa ra giả thuyết rằng phải có một cơ chế điều tiết trung tâm trong việc sản xuất các cytokine điều hòa và sự tiến triển của EndMT.
Autophagy là một con đường tế bào chịu trách nhiệm cho sự phân hủy protein và bào quan (17). Quá trình autophagy còn được gọi là thông lượng autophagic, và độ mạnh của quá trình này thường thể hiện mức độ kích hoạt của autophagy. Autophagy liên quan đến các quá trình sinh lý bệnh khác nhau của thận, bao gồm xơ cứng cầu thận, bệnh thận do tiểu đường và bệnh thận nang (18). Một số nghiên cứu báo cáo rằng autophagy là một quá trình bảo vệ tế bào. Một biện pháp bảo vệ cổ điển cho giả định này được thấy ở những con chuột bị cắt bỏ ATG5 ống lượn gần, nơi mà việc cắt bỏ này đã thúc đẩy tình trạng suy thận trầm trọng hơn do suy giảm chức năng autophagy (19). Các nghiên cứu khác cũng phát hiện ra rằng các tế bào biểu mô ống lượn gần có điều kiện hạ gục ATG5 làm trầm trọng thêm tình trạng tổn thương thận cấp tính trong giai đoạn đầu, nhưng làm giảm tốc độ tiến triển của chứng ứ nước thận trong quá trình phục hồi hoặc sửa chữa (20). Tuy nhiên, sự tương tác cụ thể giữa autophagy và EMT hoặc EndMT trên bệnh brosis vẫn còn gây tranh cãi. Một số nghiên cứu cho rằng sự ức chế autophagy có thể gây ra EMT và brosis bằng cách ảnh hưởng đến nhiễu xuyên âm của biểu mô-fi broblast trong chứng tắc nghẽn phổi vô căn (21). Những người khác cho thấy Rapamycin thúc đẩy EndMT thông qua việc kích hoạt autophagy trong quá trình lão hóa sớm (22). Gen ATG16L chủ yếu bao gồm ATG16L1 và ATG16L2. ATG16L2 đồng nhất và dị liên kết với ATG16L1. Nhưng ATG16L2 ít liên quan đến autophagy hơn (23). ATG16L1 đã được xác định là một gen quan trọng liên quan đến autophagy, thúc đẩy sự hình thành autophagosome ở màng sinh chất, và đóng một vai trò quan trọng trong dạng lipid được lipid hóa của LC3 (23). Ở đây, ATG16L1 được gọi chung là ATG16L. Là một yếu tố quan trọng trong quá trình tự động, ATG16L đã từng được báo cáo rằng có liên quan đến cơ chế bệnh sinh của một số bệnh trong cơ thể. Ví dụ, đột biến ATG16L gây ra khuynh hướng phát triển bệnh Crohn (24). Tuy nhiên, cơ chế hoạt động của ATG16L và autophagy vẫn chưa được nghiên cứu kỹ lưỡng theo cách tiếp cận mục tiêu như trong quản lý và tiên lượng ghép thận. Vì vậy, vai trò động lực của autophagic fl ux và autophagy phụ thuộc ATG16L phải là trọng tâm của nghiên cứu đối với các phương pháp trị liệu tiềm năng trong quá trình phát triển CAD.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã khám phá vai trò tiềm năng của tính năng autophagy phụ thuộc ATG16L trong quá trình phát triển CAD. Chúng tôi tiết lộ rằng việc mất ATG16L và autophagy có liên quan đến sự xuất hiện của EndMT ở bệnh nhân CAD lâm sàng và chuột được ghép thận. Sau đó, chúng tôi phát hiện ra rằng mức độ EndMT và chứng giãn kẽ thận do tăng sinh sau khi thay đổi hoạt động autophagy bằng cách loại bỏ gen ATG16L. Ngoài ra, các cơ chế tiềm ẩn cũng được khám phá bằng cách giải trình tự RNA, chúng tôi nhận thấy rằng sự suy giảm ATG16L góp phần vào việc kích hoạt con đường yếu tố hạt nhân-kB (NF-kB) và bài tiết cytokine trong cơ thể, sau đó thúc đẩy sự tiến triển EndMT.
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Chuẩn mực đạo đức
Các giao thức của nghiên cứu tuân thủ Tuyên bố của Helsinki và Istanbul. Các nghiên cứu trên người đã được kiểm tra và ủy quyền bởi ủy ban đạo đức địa phương của Bệnh viện trực thuộc First Af thuộc Đại học Y Nam Kinh (ID: IACUC -2010020). Sự đồng ý đã được thông báo từ tất cả những người nhận cấy ghép cũng như những bệnh nhân cắt thận tham gia vào nghiên cứu này.
Các nghiên cứu liên quan đến chuột đã được kiểm tra và ủy quyền bởi ủy ban đạo đức địa phương của Bệnh viện đầu tiên thuộc Đại học Y Nam Kinh (ID: IACUC -2010020). Chủ sở hữu đưa ra sự đồng ý bằng văn bản được thông báo về việc động vật của họ tham gia vào nghiên cứu này.
Bộ sưu tập mẫu
Sixty of adults who had received living or deceased donor kidney transplants started to be followed up from January 2010 to December 2017 at First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University. Patients with serum creatinine level consistently < 141.46 mmol/L (1.6 mg/dl) for at least 12 months after kidney transplantation and no other complications such as episodes of significant rejection, drug toxicity injury, and infection were assigned to the non-CAD group. Patients in the CAD group were defined as elevated serum creatinine greater than or equal to 141.46 mmol/L (1.6 mg/dl) for at least three months, and they were diagnosed by two independent pathology experts combined with biopsy results, laboratory indexes, and imaging features. Adjacent normal kidney tissues were obtained from regions outside the tumor margin (>5cm) ở những bệnh nhân phẫu thuật cắt thận triệt để. Mẫu máu được lấy sau khi bệnh nhân đã đồng ý. Bước cụ thể có thể được tham khảo trong các nghiên cứu trước đây của chúng tôi (5). Các đặc điểm cơ bản của bệnh nhân trong nhóm CAD và nhóm không CAD được thể hiện trong Bảng 1.
Mô hình chuột và động vật
Chuột đực F344 và Lewis đực trưởng thành (Trọng lượng 250 ± 10,3 g) được lấy từ Phòng thí nghiệm Charles River (Bắc Kinh, Trung Quốc) và tuân thủ các hướng dẫn của Ủy ban chăm sóc và sử dụng động vật có tổ chức tại Đại học Y Nam Kinh. Các con vật được xử lý theo các tiêu chuẩn của Đại học Y Nam Kinh và các hướng dẫn do Viện Y tế Quốc gia Hoa Kỳ công bố.
Tất cả những con vật này đều được ghép thận trái chỉnh hình. Chuột Lewis được sử dụng làm người nhận và cho đồng sinh (nhóm Syn), chuột F344 làm người cho đồng sinh (nhóm Allo). Thận phải được cắt bỏ đồng thời. Thời gian trung bình của thiếu máu cục bộ lạnh là dưới 20 phút và thiếu máu cục bộ ấm là dưới 35 phút. Cyclosporine A (5 mg / kg, QD, IP; Neoral, Novartis, Thụy Sĩ) được sử dụng trong 14 ngày để tránh thải ghép cấp tính,
Xử lý dược phẩm và thu hoạch mô
Thận ghép từ chuột được thu hoạch vào tuần thứ 4, 8, 12 và 16 sau khi phẫu thuật. Mẫu thử mô thận được nhúng paraf n-n-formalin-xed (10% formalin trung tính) được lấy để nhuộm mô học và IHC / IF. Thận còn lại được bảo quản ở - tủ lạnh 80 độ để phát hiện RNA và protein.
Thử nghiệm nhuộm màu HE và Masson Trichrome
Có thể tham khảo các giao thức xét nghiệm nhuộm trichrome HE và Masson trong các nghiên cứu trước đây của chúng tôi (5). Để xác định mức độ nghiêm trọng của CAD và mức độ lan rộng của vùng xơ, vùng phế quản thận được định lượng bằng phương pháp nhuộm Masson trichrome. Đối với mỗi lát cắt, các trường thị giác ngẫu nhiên dưới kính hiển vi × 400 đã được chọn. Hai nhà nghiên cứu bệnh học bị mù với thiết kế thử nghiệm đã đo diện tích dương tính với trichrome Masson bằng Image ‐ Pro Plus (Media Cybernetics, Rockville, MD).
Xét nghiệm nhuộm hóa mô miễn dịch
Các mô thận được tẩm formalin được cắt thành các đoạn paraf n dày 3 mm. Quá trình deparaf-nized, hydrat hóa và thu hồi kháng nguyên phù hợp với các nghiên cứu trước đây của chúng tôi (5). Các kháng thể [anti ‐ ATG16L (1: 1 0 0; Abcam, USA), anti ‐ a‐ SMA (1: 200; Abcam, USA), anti ‐ Fibronectin (1: 100; Abcam, USA) và anti ‐ CD31 (1: 100; CST, USA)] được ủ qua đêm ở 4 độ sau khi các phần được chặn bằng 10% huyết thanh lừa bình thường. Các bước tiếp theo cũng được thực hiện như đã mô tả trước đó với IgG chống chuột / thỏ được đánh dấu biotin (0,5 mg / mL;
Abcam) và chất nền 3- amino -9- ethyl carbazole hoặc 3,3 ′
diaminobenzidine (Phòng thí nghiệm Vector, Burlingame, CA). Các trang trình bày màu được chụp bằng kính hiển vi Nikon Eclipse 80i được trang bị máy ảnh kỹ thuật số (DS-Ri1, Nikon, Thượng Hải, Trung Quốc).
Xét nghiệm nhuộm nhuộm huỳnh quang miễn dịch gián tiếp
Sau khi xử lý với dung dịch 4% formaldehyde, các phần ống thận và lát cắt tế bào được thẩm thấu bằng 0. 1 phần trăm Triton X -100 trong 1 giờ, sau đó được chặn bằng huyết thanh dê 5 phần trăm trong 1 giờ. Sau đó, các phần và lát leo tế bào được ủ với chất chống NF-kB p65 (1: 200; Abcam, USA) ở 4 độ qua đêm. Điều kiện ủ bệnh của kháng thể thứ cấp Dapi có thể tham khảo các nghiên cứu trước đây của chúng tôi (5). Các trang trình bày được xem bằng kính hiển vi huỳnh quang Nikon Eclipse 80i (DS-Ri1, Nikon, Thượng Hải, Trung Quốc).
Phát hiện dòng chảy tự động
AAV-mRFP-GFP-LC3 (Hanbio, Thượng Hải, Trung Quốc) được tiêm lập thể vào thận trái của chuột Lewis (3 mL) 14 ngày trước khi cấy ghép. Thận được lấy ra vào 4, 8, 12, 16 tuần sau khi cấy ghép và được xử lý với 4% paraformaldehyde trong 24 giờ. Các trang trình bày (30 mm) được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang Nikon Eclipse 80i (DS-Ri1, Nikon, Thượng Hải, Trung Quốc). Các đốm màu vàng cho biết các thể thực quản và các đốm đỏ cho biết các thể tự tiêu. Khi tín hiệu màu đỏ mạnh hơn tín hiệu màu vàng thể hiện cơ chế tự thực chiến fl ux được kích hoạt. Khi nhiều tín hiệu màu vàng hơn tín hiệu màu đỏ thể hiện khả năng tự cảm biến fl ux bị suy giảm.
Kính hiển vi điện tử
Các mẫu được xử lý bằng glutaraldehyde lạnh đá (3% trong 0. 1 M đệm cacodylate, pH 7,4) và được xử lý thêm bởi Cơ sở cốt lõi (Service, Vũ Hán, Trung Quốc). Việc quan sát được thực hiện trên kính hiển vi điện tử truyền qua JEOL JEM -2100.
Phát hiện chức năng thận
Chúng tôi đã sử dụng Bộ xét nghiệm QuantiChrom Creatinine chuột và Bộ xét nghiệm Urea QuantiChrom (Jiancheng, Bắc Kinh, Trung Quốc) để phát hiện nồng độ creatinine trong máu chuột và nitơ urê theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Phát hiện protein uria
Các mẫu nước tiểu trong 24 giờ được thu thập bằng lồng trao đổi chất và sự bài tiết protein trong nước tiểu được kiểm tra với bộ dụng cụ thương mại (Mlbio, Thượng Hải, Trung Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Đánh giá PCR thời gian thực
Tóm lại, RNA tổng số đã được tinh chế từ HRGEC bằng cách sử dụng bộ dụng cụ chiết xuất RNA (TIANGEN, Bắc Kinh, Trung Quốc). cDNA (cDNA) được tổng hợp như đã mô tả trước đây (5). Sự biểu hiện gen được đo bằng xét nghiệm PCR thời gian thực (Vazyme) và Hệ thống DNA Engine Opticon 2 (Phòng thí nghiệm BioRad, Hercules, CA). Trình tự mồi được mô tả như sau:
IL -1 b: 5′‐ TTCCTGTTGTCTACACCAATGC ‐ 3 ′ (F) 5′ ‐ CGGGCTTTAAGTGAGTAGGAGA ‐ 3 ′ (R);
IL -6: 5′ ‐ TCTCTCCGCAAGAGACTTCCA ‐ 3 ′ (F)
5′‐ ATACTGGTCTGTTGTGGGTGG ‐ 3 ′ (R);
TNF-a: 5′‐ CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG ‐ 3 ′ (F) 5′‐ GAGGACCTGGGAGTAGATGAG ‐3 ′ (R);
Actin: 5′‐ TGACGTGGACATCCGCAAAG ‐ 3 ′ (F) 5′‐ CTGGAAGGTGGACAGCGAGG ‐ 3 ′ (R);
Thử nghiệm Western Blot và Elisa
Brie y, protein từ tế bào và mô được chiết xuất trong bộ đệm RIPA (Thermo Scienti fi cTM, Chelmsford, MA, USA) có chứa phosphatase và cocktail ức chế protease (Sigma, St Louis, MO, USA). Protein (20 mg) được chuyển sang màng PVDF (Millipore, IPVH00010, Massachusetts, Hoa Kỳ) theo SDS-PAGE. Các phiến kính được ủ trong dung dịch ngăn chặn (5% sữa không béo) trong 60 phút, và sau đó màng PVDF được ủ với kháng thể chính mà không cần rửa trong phòng lạnh qua đêm. Sau đó, quy trình rửa màng PVDF bằng dung dịch đệm muối-tween (TBST) tris, được ủ bởi kháng thể thứ cấp, tạo viên ECL, và tiếp xúc phù hợp với các nghiên cứu trước đây của chúng tôi (5). Các kháng thể chính được liệt kê như sau: anti ‐ GAPDH (1: 1000; CST, USA), anti ‐ CD31 (1: 1000; CST, USA), anti ‐ a ‐ SMA (1: 1000;
Abcam, Hoa Kỳ), anti‐ fi bronectin (1: 1000; BD Biosciences, Hoa Kỳ),
chống ‐ LC3 (1: 1000; CST, Hoa Kỳ), chống ‐ ATG16L (1: 1000; CST, Hoa Kỳ),
anti ‐ NF-kB p65 (1: 1000; CST, USA), anti‐ Phospho-NF-kB p65 (1: 1000; CST, USA). Định lượng lượng tử được thực hiện bằng cách đo cường độ của tín hiệu với sự hỗ trợ của phần mềm phân tích hình ảnh NIH. MAP1LC3 được phát hiện bằng kit ELISA (ml000829, Mlbio, Trung Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Nuôi cấy tế bào, điều trị và truyền shRNA
Tế bào nội mô cầu thận ở người (HRGECs) được nuôi cấy trong môi trường tế bào nội mô (ECM, Phòng thí nghiệm nghiên cứu ScienCell Carlsbad, CA, Hoa Kỳ) chứa 5% huyết thanh bò thai. Thiết lập Thiết bị Tủ ấm CO2 Nuôi cấy HRGECs trong môi trường ẩm ướt chứa 5% CO2 ở 37 độ. Tế bào nội mô được bảo quản trong môi trường không có huyết thanh qua đêm và sau đó được xử lý bằng IL -1 b, IL -6 và TNF ‐ a trong những giờ khác nhau hoặc nồng độ khác nhau.
HRGECs ổn định ATG16L-knockdown và ATG16L- biểu hiện quá mức được xây dựng bằng cách sử dụng vi-rút (Jikai, Thượng Hải, Trung Quốc). HRGEC lần đầu tiên được truyền bằng lipofectamine 2 0 0 0, sau đó được truyền bằng 1,5 mL vi rút ATG16L shRNA hoặc 2,0 mL ATG16L vi rút biểu hiện quá mức theo quy trình của nhà sản xuất. Sau đó, các tế bào nội mô được chuyển sang ECM chứa 2,0 mL polybrene và ủ thêm 6 giờ. Chúng tôi đã phát hiện tỷ lệ lây nhiễm vi rút bằng kính hiển vi huỳnh quang Nikon Eclipse 80i (DS-Ri1, Nikon, Thượng Hải, Trung Quốc). Puromycin (2 µg / mL; Gibco, Thermo Fisher Scienti fi c) được sử dụng để chọn các tế bào nhiễm virus ổn định. Sau đó, HRGECs được thu thập cho các thí nghiệm tiếp theo.
Phân tích thống kê
GraphPad Prism 5. 0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) đã được sử dụng để phân tích thống kê. Kết quả được biểu thị bằng giá trị trung bình ± SD (trung bình ± SD) từ ít nhất ba thí nghiệm độc lập. So sánh giữa và trong nhiều nhóm được thực hiện bằng cách sử dụng phân tích phương sai một chiều, sau đó là bài kiểm tra Student-Newman-Keuls. Giá trị P của<0.05 were="" considered="">
KẾT QUẢ
Những thay đổi về mô học và bệnh lý ở mô thận từ bệnh nhân không CAD và CAD
Trong nghiên cứu này, việc kiểm tra mô học với hematoxylin-eosin (HE) và nhuộm trichrome Masson cho thấy IF / TA phân bổ thận đáng kể trong các mô của bệnh nhân CAD (n=4) so với những bệnh nhân được ghép thận có chức năng thận ổn định từ trung tâm của chúng tôi ( nhóm không phải CAD, n =4) (Hình 1A, B). Bộ sưu tập mẫu vật liệu và phương pháp và Bảng 1 mô tả thông tin phân nhóm chi tiết cho các tính năng ban đầu. Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch (IHC) của các mẫu sinh thiết thận người cho thấy biểu hiện ‐ SMA và fi bronectin (FN) cao hơn, và biểu hiện CD31 ít hơn đáng kể trong nhóm CAD (Hình 1C – H). CD31 là một protein đánh dấu của các tế bào nội mô, và các tế bào nội mô bị mất đặc tính CD31 nhưng có được các đặc điểm của trung mô như ‐ SMA, FN khi EndMT xảy ra. Những kết quả này chỉ ra rằng biểu thức của các điểm đánh dấu EndMT cao hơn đáng kể trong nhóm CAD so với nhóm không CAD.
ATG16L tăng cao sau khi cấy ghép thận, nhưng ATG16L đã bị kiểm soát ở bệnh nhân CAD so với bệnh nhân không CAD
RNA-seq và dữ liệu lâm sàng từ 25 mẫu CAD và 21 mẫu mô sinh thiết thận của bệnh nhân không CAD được tải xuống từ GSE9493. Thông tin của bệnh nhân trong cơ sở dữ liệu đã được đăng ký tại Viện Nghiên cứu Y sinh học Novartis, Thụy Sĩ, và được xử lý để làm mô bệnh học. Chẩn đoán mô học và phân loại sinh thiết dựa trên tiêu chí Banff '05. Dữ liệu nhân khẩu học và lâm sàng được cung cấp trong cơ sở dữ liệu GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc= GSE9493). Sơ đồ tổng thể của các phép phân tích được thể hiện trong Hình 2A. Đã có 1463 gen khác biệt đáng kể được chiết xuất với giá trị P<0.05. using="" the="" criteria="" for="" [log2="" fold="" change="" (log2fc)]=""> 1, we selected 92 up-regulated and 115 down-regulated differential genes from the CAD group compared to the non-CAD group (Figure 2B). Then we searched genes associated with autophagy in the GeneCards database. A total of 149 ARGs with a relevance score >7 người đã được chọn. Có 14 ARG được bao gồm trong ARG của bệnh nhân CAD và không phải CAD. Trong số đó, chúng tôi thấy rằng ATG16L có gen điểm mức độ liên quan cao nhất đã được điều chỉnh giảm trong các mẫu CAD (Hình 2C).
Để tránh hiệu ứng hàng loạt và sự khác biệt về dân số, chúng tôi đã thực hiện một loạt các thử nghiệm bằng cách sử dụng mẫu người từ trung tâm của chúng tôi để đưa ra kết quả cơ sở dữ liệu công khai. Trong tập đầu tiên, chúng tôi nhuộm các phần của mẫu thận bình thường, không CAD và CAD với kháng thể kháng ATG16L, và chứng minh rằng sự biểu hiện của ATG16L đã giảm đáng kể ở bệnh nhân CAD so với nhóm không CAD (Hình 2E) . Kết luận tương tự cũng được đưa ra bởi thử nghiệm Western blot (WB). Sự gia tăng của FN thể hiện mức độ suy thận trầm trọng hơn của thận ghép và là một trong những chỉ số của CAD. Xu hướng WB của ATG16L phù hợp với kết quả xác minh vết IHC của chúng tôi và phù hợp với kết quả trong GEO (Hình 2D). Những điều này cho thấy thay vào đó, biểu thức ATG16L đã giảm theo sự phát triển của CAD. Khi thực hiện phân tích tương quan của Pearson, chúng tôi nhận thấy rằng ATG16L có mối tương quan âm mạnh mẽ trong mô hình biểu hiện của các protein ‐ SMA, FN và tương quan thuận với biểu hiện CD31. 'r' đại diện cho giá trị tương quan Pearson và giá trị P biểu thị mức độ tương quan đáng kể (Hình 2F – I).
Autophagy được điều chỉnh giảm ở bệnh nhân CAD, và điều chỉnh giảm của MAP1LC3 Tiên lượng xấu được dự đoán ở bệnh nhân CAD
Trong thử nghiệm trước, một số ARG điều chỉnh autophagy đã được xác định từ cơ sở dữ liệu GEO. Trong số đó, ATG16L có liên quan đến bước đầu của autophagy, chúng tôi suy đoán về khả năng autophagy có thể tham gia vào CAD. Để kiểm tra mức độ autophagy trong các mô allograft thận của con người, đầu tiên chúng tôi tìm thấy ít không bào autophagic ở nhóm CAD thông qua kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), so với nhóm không CAD (Hình 3A, B). Bên cạnh tiêu chuẩn vàng TEM để theo dõi quá trình autophagy, mức độ giảm của SQSTM1 và sự gia tăng của biểu thức LC 3- II là nguyên nhân dẫn đến sự gia tăng của autophagy. Các xu hướng tương tự về mức độ biểu hiện protein của LC 3- I (không lipid hóa LC3), LC 3- II (lipid hóa LC3) và SQSTM1 trong nhóm CAD đã được xác minh bằng xét nghiệm của WB như được trình bày trong Hình 3C, D. P62 / SQSTM1 (SQSTM1) là một thụ thể autophagy có chọn lọc và bị phân hủy bởi autophagy. Thực quản có liên quan đến sự lipid hóa của dạng tế bào LC3 và hình thành LC 3- II. Do đó, kết quả của WB cũng cho thấy rằng autophagy xảy ra.
Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng có sự khác biệt của ARGs trong huyết thanh của bệnh nhân ghép thận; mức LC3 huyết thanh có lẽ là chỉ số tiên lượng tương quan với mức độ nghiêm trọng của bệnh (25, 26). Để khám phá thêm vai trò của autophagy trong quá trình CAD, chúng tôi đã kiểm tra nồng độ LC3 trong huyết thanh của 30 bệnh nhân không CAD và 30 bệnh nhân CAD bằng xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym (ELISA). Dữ liệu nhân khẩu học trình bày các đặc điểm cơ bản của bệnh nhân được nêu trong Bảng 1. Phân bố số trường hợp, giới tính bệnh nhân, tuổi bệnh nhân, kháng thể phản ứng bảng (PRA), chế độ ức chế miễn dịch, chức năng thận của nhóm không CAD và CAD được hiển thị trong Bảng 1. Giới tính, tuổi và PRA không có sự khác biệt lớn. Có sự khác biệt đáng kể về creatinine huyết thanh và nitơ urê máu (BUN) giữa hai nhóm. Sau đó, chúng tôi cố gắng xác định giá trị tiên lượng của autophagy ở bệnh nhân CAD. Qua kết quả ELISA huyết thanh, chúng tôi thấy rằng biểu hiện LC3 thấp hơn ở nhóm CAD. Cũng có một CAD tăng tiến và mức LC3 giảm đồng thời (Hình 3E). Ngoài ra, chúng tôi chia LC3 thành các nhóm biểu hiện cao và thấp dựa trên phân tích trung bình, tỷ lệ sống sót, kết quả cho thấy nhóm biểu hiện thấp LC3 có thời gian rối loạn chức năng allograft ngắn hơn (Hình 3F). Nhìn chung, chúng tôi suy đoán rằng hiệu quả của autophagy không có mối liên hệ đáng kể nào với sự phát triển của CAD.
Điều chỉnh giảm ATG16L Tự độnghagy giảm và Thúc đẩy sự tiến triển của EndMT
Để xác định xem ATG16L có liên quan đến sự thay đổi của autophagy hay không, trước tiên chúng tôi chuyển HRGECs với ATG16L RNA ghim tóc ngắn (shRNA). TEM đã được sử dụng để chứng minh trực tiếp sự hình thành không bào tự thực và chúng tôi nhận thấy rằng có ít không bào tự thực trong các tế bào được truyền ATG16L shRNA so với những tế bào được truyền với shNC xáo trộn (Hình 4A, B). Cả biểu hiện protein ATG16L và hoạt động autophagy cũng được điều chỉnh giảm trong việc hạ gục nhóm ATG16L so với nhóm shNC (Hình 4C).
Vai trò của autophagy phụ thuộc ATG16L trong sự tiến triển của EndMT sau đó đã được nghiên cứu. HRGEC được truyền với ATG16L shRNA hoặc shNC. Hình 4D cho thấy việc truyền shRNA ATG16L có thể tạo thuận lợi rõ rệt cho các biểu hiện FN và a-SMA và làm giảm biểu hiện CD31 so với các HRGEC được truyền shNC xáo trộn. Ngược lại, khi ATG16L được thể hiện quá mức trong HRGEC, sự tiến triển của EndMT thực sự không được thúc đẩy (Hình 4E). Kết quả nhuộm IHC cũng xác định xu hướng WB cho các biểu thức CD31 và a-SMA trong HRGECs (Hình 4F).
Những thay đổi của xơ hóa mô kẽ thận, protein nước tiểu, chức năng thận và sự gia tăng EndMT phụ thuộc vào thời gian trong mô hình chuột từ chối mãn tính
Tiếp theo, chúng tôi nghiên cứu những thay đổi trong dịch kẽ thận, protein nước tiểu, chức năng thận và EndMT in vivo. Mô hình ghép thận của chuột bị đào thải mãn tính được thiết lập bằng cách ghép thận từ chuột F344 sang chuột Lewis. Ghép thận được thực hiện ở tuần thứ 8, 12 và 16 sau khi ghép thận. Các xét nghiệm nhuộm HE và nhuộm Masson chỉ ra các mức độ khác nhau của tế bào điều hòa trong dịch lọc, xơ cứng cầu thận, teo ống thận, và giãn kẽ sau khi ghép thận. Kết quả nhuộm Masson cũng cho thấy một lượng lớn các sợi collagen nhuộm xanh trong cầu thận và kẽ thận ở tuần thứ 8, 12, 16 sau khi ghép thận, so với nhóm syn (Hình 5A – C). Để kiểm tra chức năng thận của chuột bằng phương pháp cấy ghép dị sinh, thận phải bản địa đã được cắt bỏ trong quá trình ghép thận. Bốn tuần sau khi cắt bỏ thận phải, protein trong nước tiểu 24 giờ và các chức năng thận bao gồm creatinine huyết thanh và BUN suy giảm dần ở tất cả các nhóm cho đến khi họ chết (Hình 5D). Kết quả của xét nghiệm IHC cho thấy biểu hiện FN và a-SMA cao trong khi biểu hiện CD31 giảm ở tất cả các nhóm sau 16 tuần (Hình 5E). Xét nghiệm Western blot xác định kết quả của xét nghiệm hóa mô miễn dịch và cho thấy rằng sự tiến triển của EndMT tăng dần khi kéo dài thời gian sau khi ghép thận (Hình 5F).
Cấy ghép thận Kích hoạt tự động hút máu nhưng suy giảm thông lượng tự động thực vật ở giai đoạn cuối của mô hình loài chuột từ chối mãn tính
LC3, được coi là chất đánh dấu de fi ned cho autophagy, rất quan trọng đối với sự hình thành autophagosome và kích hoạt autophagic fl ux. Virus liên quan đến Adeno (AAV) -mRFP-GFP- LC3 đã được tiêm vào cơ quan thận chuột in vivo theo phương pháp lập thể. Chúng tôi tạo mô hình mRFP-GFP-LC3 để theo dõi hoạt động tự thực trong ghép thận. AAV- mRFP-GFP-LC3 thường được sử dụng để theo dõi quá trình tự thực trên cơ thể sống. Tín hiệu GFP có độ nhạy cao hơn đối với các điều kiện axit của lòng lysosome hơn mRFP. Do đó, thực quản thể hiện huỳnh quang màu vàng vì vị trí đồng thời của GFP và mRFP chỉ ra huỳnh quang và thể tự tiêu biểu hiện huỳnh quang màu đỏ. Sự gia tăng của huỳnh quang màu đỏ cho thấy sự tích tụ của tự phân ly và kích hoạt quá trình tự động trong thận. Các vùng tích cực của dấu hiệu huỳnh quang màu đỏ không thể tăng lên ở tuần 4, 8,12 và 16 trong nhóm allo so với nhóm syn. Tuy nhiên, dấu chấm đỏ suy yếu nhanh chóng sau khi đạt đỉnh ở tuần thứ 8 và 12. Những thay đổi về mức độ tự động chủ yếu được quan sát thấy ở cầu thận và các mạch nhỏ ngoại vi, hơn là ở các ống lượn xa hoặc ống góp (Hình 6A, B). Những kết quả này cho thấy rằng autophagy đã được kích hoạt trong giai đoạn đầu của quá trình ghép thận nhưng không phải ở giai đoạn cuối và quá trình thanh thải autophagosome bị suy giảm sau khoảng 8 tuần. Xét nghiệm hóa mô miễn dịch chứng minh rằng sự biểu hiện của ATG16L trong 8 tuần cao hơn 16 tuần (Hình 6C). Kết quả Western blot cũng cho thấy mức LC 3- II và ATG16L đạt đỉnh vào 8 tuần, và sau đó giảm dần cho đến 16 tuần ở thận allograft của chuột sau khi cấy ghép (Hình 6D).
NF-kB Pathway đã được kích hoạt và thúc đẩy EndMT sau khi Knockdown của ATG16L Expression
Dựa trên mối liên hệ giữa điều hòa giảm ATG16L và EndMT trong mô hình chuột thải loại mãn tính và bệnh CAD, chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng việc mất ATG16L có thể trực tiếp dẫn đến sự tiến triển của EndMT. Để khám phá thêm về cơ chế tiềm năng mà sự tiến triển này xảy ra, trước tiên chúng tôi thực hiện giải trình tự tổng số phiên mã (RNA-seq) trong HRGEC với ShNC hoặc ShATG16L. Có tổng cộng 453 gen khác biệt (DEG) giữa hai nhóm. Trong số đó, 358 DEG được điều chỉnh cao và 95 được điều chỉnh thấp (Hình 7A). Sau đó, 20 con đường đã được lựa chọn đáng kể bằng phương pháp làm giàu KEGG. Chúng tôi nhận thấy rằng con đường NF-kB là một trong những con đường đã được kích hoạt rõ ràng (Hình 7B). Việc điều chỉnh các gen theo con đường NF-kB cũng được xác định bằng phân tích làm giàu bộ gen (GSEA) (Hình 7C).
NF-kB là một trong những yếu tố phiên mã quan trọng đối với các con đường truyền tín hiệu viêm, và NF-kB sẽ chuyển vị trí từ tế bào chất sang nhân khi nó được kích hoạt. Để xác định sự hoạt hóa NF-kB và chuyển vị hạt nhân, chúng tôi thực hiện xét nghiệm nhuộm huỳnh quang miễn dịch sử dụng kháng thể kháng p65 và tìm thấy p65 và thuốc nhuộm hạt nhân được nhuộm màu cho thấy sự chuyển vị hạt nhân (Hình 7D). Ngoài ra, chúng tôi phát hiện ra rằng QNZ, một chất ức chế con đường truyền tín hiệu NF-kB, ức chế đáng kể sự biểu hiện của NF-kB trong nhân, và đảo ngược các biểu hiện của các protein liên quan đến EndMT do ATG16L hạ gục (Hình 7E).
Thử nghiệm của WB cũng được thực hiện để xác minh cơ chế cụ thể của việc kích hoạt con đường NF-kB. Chúng tôi đã phát hiện lượng tử hóa của p65 (tổng NF-kB) và p-p65 (NF-kB được phosphoryl hóa) trong HRGEC. Kết quả của WB cho thấy mức p65 được tăng lên trong nhóm ShATG16L so với nhóm ShNC, trong khi p-p65 theo xu hướng tăng tương tự (Hình 7F). Sự gia tăng mức p-p65 trong HRGEC sau khi hạ gục ATG16L đi kèm với sự gia tăng biểu hiện tổng số protein p65, điều này có khả năng gây ra tác động bổ sung lên sự biểu hiện p65 trong HRGEC. Để phát hiện sự ổn định của NF-kB là do giảm thoái hóa hay tăng tổng hợp, chất ức chế tổng hợp protein cycloheximide (CHX) đã được thêm vào tế bào để ức chế tổng hợp protein và mức protein NF-kB đã được phân tích. Kết quả Western blot cho thấy có sự biểu hiện liên tục của protein p65 với sự hiện diện của CHX (Hình 7G). Trong khi đó, mức mRNA NF-kB không bị thay đổi đáng kể bởi ShATG16L. Dữ liệu định lượng cho các mức NF-kB mRNA được biểu thị bằng đồ thị trong Hình 7H. Điều này cho thấy rằng sự chuyển vị hạt nhân NF-kB là do sự suy giảm giảm sút, không phải tăng tổng hợp sau khi hạ gục ATG16L trong HRGEC. Để xác định rõ hơn sự biểu hiện của NF-kB trong mô người, chúng tôi đã thực hiện xét nghiệm nhuộm huỳnh quang miễn dịch trên các mô thận của người đã đạt được và nhận thấy mức độ biểu hiện p65 không thể tăng đáng kể trong phân bổ thận của bệnh nhân CAD (Hình 7I, J).
Kích hoạt lộ trình NF-kB Tiết ra các cytokine, trong số chúng IL -1 b, IL -6 và TNF ‐ a có thể kích thích sự tiến triển của EndMT trong HRGECs
Tín hiệu NF-kB là bộ điều chỉnh chính của phản ứng viêm. Sau đó, chúng tôi khám phá các yếu tố hòa tan gây ra EndMT do shATG16L gây ra bằng RT-PCR. Trong số một số cytokine có liên quan đến các khuyết tật tự động và trong phản ứng điều hòa, IL -1 b, IL -6 và TNF-a, yếu tố hạ nguồn điển hình trong các yếu tố điều hòa gây ra bởi con đường NF-kB, hầu như không có tăng khi so sánh với HRGEC được truyền shNC trong quá trình suy giảm hoạt động autophagy (Hình 8A). Điều này phù hợp với những kết luận trước đây của chúng tôi về các yếu tố gây rối loạn như TNF-một sự gia tăng huyết thanh chuột với sự đào thải mãn tính (27).
Để điều tra cơ chế bệnh sinh của EndMT được kích thích bởi IL {{0}} b, IL -6 và TNF-a, chúng tôi đã xử lý HRGEC với các nồng độ IL -1 b ({{ 7}} ~ 20 ng / mL), IL -6 (0 ~ 200 ng / mL) và
TNF ‐ a ({{0}} ~ 20 ng / mL) trong 24 giờ. Tất cả IL -1 b, IL -6 và TNF-a có thể điều chỉnh mức protein của FN và ‐ SMA với sự suy giảm đồng thời phụ thuộc vào liều lượng của các dấu hiệu tế bào nội mô CD31. Những tác động này đạt đến đỉnh điểm khi HRGECs được xử lý với 10 ng / mL IL -1 b, 200 ng / mL IL -6, hoặc 10 ng / mL TNF ‐ a, tương ứng (Hình 8B). Các thử nghiệm phụ thuộc thời gian cũng được thực hiện để xác nhận các biểu thức liên quan của EndMT. Như thể hiện trong Hình 8B, việc xử lý IL -1 b, IL -6 hoặc TNF-a trong 0 ~ 48 giờ có thể gây ra đáng kể các biểu thức FN và a- SMA và dẫn đến mất CD31 trong HRGECs vì thời gian kích thích tăng lên. Để kiểm tra tác động của IL -1 b, IL -6 và TNF-a trên EndMT, Anakinra, Tocilizumab và In fl iximab điều trị được bắt đầu khi hạ gục ATG16L. Anakinra là chất đối kháng với thụ thể interleukin -1 (IL -1 R). Tocilizumab là kháng thể trung hòa IL -6 R ngăn chặn IL -6 liên kết với IL -6 R. Infliximab là một kháng thể IgG1 đơn dòng liên kết cụ thể với TNF-a và là một chất ức chế TNF-a đã được sử dụng thành công trong điều trị bệnh viêm ruột. Kết quả của WB cho thấy Anakinra và In fl iximab có thể làm giảm EndMT rõ rệt hơn (Hình 8C). Những kết quả này cho thấy rằng việc mất ATG16L không chỉ làm giảm hoạt động autophagy mà còn thúc đẩy sự tiết các cytokine trong cơ thể IL -1 b, IL -6 và TNF-a bằng cách ngăn chặn sự phân hủy p65 để kích hoạt NF- đường dẫn kB (Hình 8D).
THẢO LUẬN
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chỉ ra rằng việc ghép thận làm suy yếu hệ thống autophagic, có liên quan đến sự gia tăng đáp ứng điều hòa, EndMT, và mức độ nghiêm trọng của xơ hóa mô kẽ thận allografts. Mặc dù hoạt động autophagic tạm thời tăng lên ở giai đoạn đầu của quá trình cấy ghép allograft, nhưng nó giảm dần do mất ATG16L. Chế độ tự động hít thở phụ thuộc ATG16L, như là một quá trình bảo vệ tế bào, có thể làm giảm chứng thoái hóa mô kẽ thận được cấy ghép thông qua cơ chế điều chỉnh EndMT do IL -1 b, IL -6 và TNF-a gây ra. Theo hiểu biết tốt nhất của chúng tôi, đây là nghiên cứu đầu tiên làm sáng tỏ vai trò và sự thay đổi động lực của thông lượng tự thực trong ghép thận. Trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng đã tìm hiểu các chi tiết sinh lý bệnh phân tử cơ bản về cách thức mà suy giảm chức năng tự phối hợp gây ra EndMT và xơ hóa mô kẽ thận.
Mặc dù nhiều loại nghiên cứu đã báo cáo rằng autophagy có liên quan đến sự hình thành và tiến triển của bệnh lý mô kẽ thận, ARGs vẫn chưa được phân tích toàn diện để khám phá giá trị lâm sàng của chúng trong sự tiến triển của thải ghép thận mạn tính. Hàng trăm loại protein có liên quan đến quá trình autophagy. Với tầm quan trọng của autophagy trong ghép thận, có thể suy đoán rằng ARG có nhiều hứa hẹn trong dự đoán tiên lượng và mục tiêu điều trị. Để khám phá các yếu tố di truyền bệnh ban đầu của CAD, chúng tôi đã dẫn đầu các biểu hiện mRNA của 149 ARG trong nhóm GSE9493 và phân tích rõ ràng 14 ARG, có liên quan nhiều nhất đến quá trình autophagy giữa bệnh nhân CAD và không CAD. Trong số các ARG điều chỉnh giảm trong nhóm CAD, các gen điều hòa âm tính tự động, chẳng hạn như Raptor và MAPK3 (28, 29), được điều chỉnh giảm trong nhóm CAD. Mặt khác, ATG16L với tư cách là một ARG được điều chỉnh lên là một giá đỡ cho quá trình lipid hóa LC3 bằng cách tự động định vị các màng nguồn giả định và thúc đẩy sự hình thành không bào tự thực (30). Tuy nhiên, một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng ATG16L không cần thiết để kéo dài màng cách ly (23). Do đó, mối liên hệ giữa vai trò phụ thuộc vào autophagy không phụ thuộc vào autophagy của ATG16L và EndMT đã được nghiên cứu.
Để điều tra mối liên quan giữa ATG16L, autophagy và EndMT trong thận được cấy ghép, chúng tôi đã loại bỏ ATG16L bằng shRNA trong HRGECs. Kết quả của chúng tôi tiết lộ rằng shATG16L có thể làm giảm mức độ autophagy và tạo ra EndMT. Tương tự, nghiên cứu in vivo và các mẫu lâm sàng cũng cho thấy rằng sự kích hoạt ATG16L và autophagic fl ux trong giai đoạn đầu của quá trình ghép thận, autophagic fl ux giảm trong một phạm vi động khi thay đổi fi brotic tăng lên. Có thể kết luận rằng lý do của sự tiến triển EndMT có lẽ là do giảm tác dụng phụ autophagic, và autophagy phụ thuộc ATG16L đóng vai trò bảo vệ trong sự tiến triển của EndMT và xơ hóa mô kẽ thận. Tuy nhiên, một số kết luận cho thấy rằng quá trình tự động gây ra bởi rapamycin dẫn đến việc kích hoạt EndMT trong HCAECs trong điều kiện thiếu oxy (22). Những điều này dường như khác biệt với kết quả của chúng tôi. Chúng tôi cho rằng vai trò của autophagy có thể khác nhau ở các loại tế bào khác nhau. Nó có thể là bối cảnh tế bào- và các yếu tố điều tiết ngược dòng- phụ thuộc. Do tính năng autophagy phụ thuộc ATG16L là một phương tiện tự bảo vệ khi EndMT xảy ra trong CAD, nên việc xác định cơ chế cụ thể của EndMT do shATG16L gây ra là có ý nghĩa.
Chúng tôi đã thực hiện trình tự thế hệ tiếp theo từ nhóm kiểm soát và hạ gục ATG16L trong HRGECs. Các con đường KEGG và phân tích GSEA tiết lộ rằng con đường NF-kB là một trong những con đường làm giàu đáng kể nhất. NF-kB thường liên kết với IkB, giúp ổn định NF-kB trong tế bào chất. Khi con đường NF-kB được kích hoạt, NF-kB heterodimer p65 chuyển vị trí vào hạt nhân và liên kết với promoter cụ thể của nó (31). Một trong những con đường chính tắc (cổ điển) để chuyển vị hạt nhân NF-kB là quá trình phosphoryl hóa p65. Tuy nhiên, sự gia tăng số lượng các con đường không chuẩn đã được báo cáo trong các bệnh khác nhau. Nó cũng đã được báo cáo rằng tự độnghagy có chọn lọc qua trung gian p62 / SQSTM {13}} bị ức chế có thể làm giảm sự suy thoái lysosome theo con đường NF-kB (32), khiếm khuyết của autophagy cũng dẫn đến kích hoạt NF-kB vì biểu hiện SQSTM1 duy trì, do đó thúc đẩy khối u trong mô hình chuột (33). Trong nghiên cứu của mình, chúng tôi quan sát thấy sự gia tăng mức protein p65 và p-p65 trong khi mức mRNA không thay đổi. Khi có chất ức chế tổng hợp protein CHX, sự tích tụ của protein p65 vẫn tiếp tục so với khi không có chất ức chế. Do đó, chúng tôi suy đoán rằng sự kích hoạt NF-kB được gây ra bởi ATG16L bị hạ gục là kết quả của việc giảm sự phân hủy protein và quá trình này có thể là sự ức chế sự suy thoái phụ thuộc vào hệ autophagic.
Các cơ quan được kết nối chặt chẽ với nhau với những hậu quả quan trọng của việc cấy ghép thận ở cấp độ lâm sàng và điều trị (34). NF-kB p65 là yếu tố phiên mã quan trọng nhất trong việc điều hòa các yếu tố điều hòa trong tế bào. Trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng nhận thấy việc hạ gục ATG16L làm tăng cytokine IL -1 b, IL -6 và TNF-a thông qua con đường NF-kB. Điều này và các kết luận khác đồng ý với nhiều nghiên cứu khác, chẳng hạn như các nghiên cứu kết luận rằng mất ATG16L tăng cường sản xuất nội độc tố do IL {10}} b gây ra (35) và TNFAIP3 / A20 liên kết ATG16L1 để kiểm soát phản ứng tự thực, NF-kB kích hoạt (36). Hơn nữa, vai trò của các cytokine kích thích trên EndMT đã được báo cáo trong một số nghiên cứu trước đó. Tuy nhiên, có thể những cytokine này trong các cytokine bắt đầu đóng một vai trò đa dạng tùy thuộc vào bệnh lý cơ bản và mức độ môi trường xung quanh của nó. Trong mô hình chuột béo phì do chế độ ăn uống gây ra, endMT phụ thuộc vào IL {19}} nội mô gây ra. Trong bệnh vôi hóa mạch máu, IL -1 b và TNF-a gây ra EndMT trong tế bào nội mô động mạch chủ sơ cấp của người (38). Kết quả của chúng tôi đã sàng lọc và xác định IL -1 b, IL -6 và TNF-a là chất thúc đẩy EndMT trong các cytokine bắt đầu trong môi trường bệnh lý của CAD. Bằng cách này, các mối quan hệ tương hỗ giữa mất ATG16L và trong các cytokine kích thích đã được nghiên cứu để nhấn mạnh các mục tiêu điều trị có thể có để kiểm soát mất ATG16L trong tiến triển CAD.
Nghiên cứu của chúng tôi có một số hạn chế. Việc xác nhận hiện tại về tác động của ATG16L đối với quá trình tiến triển EndMT và fi brosis chỉ được tiến hành trong mô hình dòng tế bào loại bỏ, sự phức tạp của các thay đổi autophagy in vivo và trong quá trình phát triển CAD khó có thể bị bắt chước và nhấn mạnh sự cần thiết của những con chuột loại trực tiếp có điều kiện ATG16L nội mô . Chúng tôi sẽ thiết lập mô hình ghép thận chuột loại trực tiếp ATG16L để nghiên cứu thêm về cơ chế. Kết quả của chúng tôi cho thấy việc mất ATG16L và autophagy thúc đẩy EndMT, QNZ ức chế kích hoạt NF-kB và IL -1 b, TNF-một kháng thể đơn dòng đối kháng với các thụ thể cụ thể do đó làm chậm quá trình nuôi cấy allograft, nhưng nó không thể hoàn toàn đảo ngược kết quả này. Cho dù các cơ chế khác có đóng một vai trò tương tự hay không vẫn chưa được biết. Ngoài ra, bên cạnh các tế bào nội mô, nguồn nguyên bào nuôi myo bao gồm nhiều loại tế bào, bao gồm biểu mô, nguyên bào nuôi và tế bào màng ngoài tim (39). Việc mất ATG16L và hiệu quả tự động có ảnh hưởng đến các tế bào này hay không vẫn chưa thể kết luận được.
Kết luận, các nghiên cứu hiện tại đã chứng minh rằng việc hạ gục ATG16L là rất quan trọng đối với sự suy giảm chức năng tự thực và sự hình thành EndMT do IL -1 b, IL -6 và TNF ‐ a gây ra trong quá trình tiến triển của bệnh lý mô kẽ thận được cấy ghép . Chức năng này được thực hiện nhờ NF-kB làm giảm sự suy thoái và kích hoạt đường dẫn. Tóm lại, kết quả nghiên cứu của chúng tôi cung cấp cái nhìn sâu sắc mới về mối quan hệ động lực học của bệnh tự thực và EndMT. Ngăn ngừa mất ATG16L và ức chế autophagy ux có thể là một lựa chọn mới để điều trị và ngăn ngừa sự tiến triển của bệnh giãn mô kẽ thận và CAD ở những người được ghép thận.
Cistanche stem ngăn ngừa bệnh thận, bấm vào đây để lấy mẫu
BÁO CÁO KHẢ NĂNG SN SÀNG CỦA DỮ LIỆU
Các dữ liệu thô hỗ trợ cho các kết luận của bài báo này sẽ được các tác giả cung cấp mà không cần bảo lưu quá mức.
CHUẨN MỰC ĐẠO ĐỨC
Các nghiên cứu liên quan đến người tham gia đã được xem xét và phê duyệt bởi ủy ban đạo đức địa phương của Bệnh viện liên quan đến đầu tiên của Đại học Y Nam Kinh. Các bệnh nhân / người tham gia đã cung cấp sự đồng ý bằng văn bản của họ để tham gia vào nghiên cứu này. Nghiên cứu trên động vật đã được xem xét và phê duyệt bởi ủy ban đạo đức địa phương của Bệnh viện đầu tiên ở Đại học Y Nam Kinh. Đã nhận được sự đồng ý bằng văn bản của chủ sở hữu đối với sự tham gia của động vật của họ trong nghiên cứu này.
SỰ ĐÓNG GÓP CỦA TÁC GIẢ
RT và MG đã giám sát và hình thành dự án. ZG, CS và ZW đã thiết kế và thực hiện hầu hết các thử nghiệm. MZ và SF đã thu thập các mẫu chuột. LS, HC, ZH, JT, XJ và HY đã phân tích dữ liệu. ZG và ZW đã thực hiện các thiết bị đo lường. ZG và RT đã soạn thảo và sửa đổi bài báo. Tất cả các tác giả đã đóng góp cho bài báo và chấp thuận phiên bản đã gửi.
KINH PHÍ
Công việc này đã được hỗ trợ bởi Quỹ Khoa học Tự nhiên Quốc gia Trung Quốc [số tài trợ 82070769, 81870512, 81770751, 81570676, 81470981, 81100532].
NGƯỜI GIỚI THIỆU
1. Carney EF. Cấy ghép: Khả năng sống sót sau khi nhận một quả thận hiến tặng đã qua đời của bệnh nhân tiểu đường. Nat Rev Nephrol (2017) 13 (8): 444. DOI: 10.1038 / nrneph.2017.88
2. El-Husseini A, Aghil A, Ramirez J, Sawaya B, Rajagopalan N, Baz M, et al. Kết quả của việc ghép thận trong ca ghép thận nguyên phát, lặp lại và ghép thận sau khi không phải thận: phân tích 15- năm của cơ sở dữ liệu UNOS gần đây. Cấy ghép Clin (2017) 31 (11). DOI: 10.1111 / ctr.13108
3. Schinstock CA, Stegall M, Cosio F. Những hiểu biết mới về sự đào thải mãn tính qua trung gian kháng thể và sự tiến triển của nó đối với bệnh cầu thận cấy ghép. Curr Opin Nephrol Hypertens (2014) 23 (6): 611–8. doi: 10.1097 / MNH. 0000000000000070
4. Goldberg RJ, Weng FL, Kandula P. Rối loạn chức năng Allograft cấp tính và mãn tính ở người nhận ghép thận. Med Clin North Am (2016) 100 (3): 487–503. doi: 10.1016 / j.mcna.2016.01.002
5. Wang Z, Han Z, Tao J, Wang J, Liu X, Zhou W, et al. Vai trò của chuyển đổi nội mô-trung mô do TGF-beta1 gây ra trong bệnh lý mô kẽ thận ghép. J Cell Mol Med (2017) 21 (10): 2359–69. doi: 10.1111 / jump.13157
6. An C, Jia L, Wen J, Wang Y. Nhắm mục tiêu nguyên bào sợi có nguồn gốc từ tủy xương để điều trị xơ hóa thận. Adv Exp Med Biol (2019) 1165: 305–22. doi: 10.1007 / 978-981- 13-8871-2_14
7. Cruz-Solbes AS, Youker K. Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT) và Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT): Vai trò và Ý nghĩa trong bệnh xơ hóa thận. Kết quả Probl Cell Differ (2017) 60: 345–72. doi: 10.1007 / 978- 3-319-51436-9_13
8. Yang J, Antin P, Berx G, Blanpain C, Brabletz T, Bronner M, et al. Hướng dẫn và định nghĩa cho nghiên cứu về chuyển tiếp biểu mô-trung mô. Nat Rev Mol Cell Biol (2020) 21 (6): 341–52. doi: 10.1038 / s 41580-020-0237-9
9. Zeisberg EM, Potenta SE, Sugimoto H, Zeisberg M, Kalluri R. Nguyên bào sợi trong thận xuất hiện qua quá trình chuyển đổi nội mô-trung mô. J Am Soc Nephrol (2008) 19 (12): 2282–7. doi: 10.1681 / ASN.2008050513
10. Di Gregorio J, Robuffo I, Spalletta S, Giambuzzi G, De Iuliis V, Toniato E, et al. Sự chuyển đổi từ biểu mô sang trung mô như một mục tiêu điều trị có thể có trong các bệnh rối loạn xơ sợi. Front Cell Dev Biol (2020) 8: 607483. doi: 10.3389 / fall.2020.607483
11.Cardinal H, Dieude M, Hebert MJ. Rối loạn nội mô trong cấy ghép thận. Immunol phía trước (2018) 9: 1130. DOI: 10.3389 / fi mmu.2018. 01130
12. Zhao Y, Cooper DKC, Wang H, Chen P, He C, Cai Z, et al. Vai trò bệnh lý tiềm ẩn của các cytokine hỗ trợ điều hòa (IL -6, TNF-alpha và IL -17) trong quá trình cấy ghép tế bào. Xenotransplantation (2019) 26 (3): e12502. doi: 10.1111 / Xen.12502
13. Zhao C, Xu Z, Wang Z, Suo C, Tao J, Han Z, et al. Vai trò của yếu tố hoại tử khối u-alpha trong quá trình chuyển đổi biểu mô sang trung mô trong các tế bào thận được cấy ghép ở những người nhận bị rối loạn chức năng allograft mãn tính. Sáng thế ký (2018) 642: 483–90. DOI: 10.1016 / j.gene.2017.11.059
14. Zhang B, Niu W, Dong HY, Liu ML, Luo Y, Li ZC. Tình trạng thiếu oxy gây ra chuyển đổi nội mô trung mô trong quá trình tái tạo mạch máu phổi. Int J Mol Med (2018) 42 (1): 270–8. doi: 10.3892 / ijmm.2018.3584
15. Li J, Zhang Q, Ren C, Wu X, Zhang Y, Bai X, et al. Siêu âm xung cường độ thấp Ngăn chặn quá trình chuyển đổi nội mô-trung mô gây ra stress oxy hóa trong các tế bào nội mô động mạch chủ của con người. Cell Physiol Biochem (2018) 45 (4): 1350–65. doi: 10.1159 / 000487561
16. Guan Q, Nguan CY, Du C. Biểu hiện của yếu tố tăng trưởng chuyển hóa-beta1 hạn chế tổn thương do thiếu máu cục bộ ở thận-tái tưới máu. Cấy ghép (2 0 10) 89 (11): 1320– 7. doi: 10.1097 / TP.0b013e3181d8e9dc
17. Levine B, Kroemer G. Chức năng sinh học của gen Autophagy: Quan điểm về bệnh tật. Ô (2019) 176 (1-2): 11–42. DOI: 10.1016 / j.cell.2018.09.048
18.De Rechter S, Decuypere JP, Ivanova E, van den Heuvel LP, De Smedt H,
Levtchenko E và cộng sự. Autophagy trong các bệnh thận. Nephrol nhi (2016) 31 (5): 737–52. doi: 10.1007 / s 00467-015-3134-2
19. Li H, Peng X, Wang Y, Cao S, Xiong L, Fan J, et al. Atg 5- cơ chế tự động qua trung gian trong ống lượn gần thúc đẩy quá trình bắt giữ G2 / M của chu kỳ tế bào và quá trình ứ đọng ở thận. Autophagy (2016) 12 (9): 1472 - 86. doi: 10.1080 / 15548627.2016.1190071
Baisantry A, Bhayana S, Rong S, Ermeling E, Wrede C, Hermann J, et al. Autophagy gây ra các thay đổi về tuyến tiền liệt trong các đoạn gần ống dẫn S3. J Am Soc Nephrol (2016) 27 (6): 1609–16. doi: 10.1681 / ASN.2014111059
