Trong phân tích Silico của một Peptide nọc độc ký sinh Drosophila tiết lộ mức độ phổ biến của mô típ clip Cation–Polar–Cation trong Protein Knottin Phần 2

2.6. Một clip CPC cũng có trong Peptide kháng khuẩn Drosomycin

Không giống như LhKNOT, cấu trúc của Drosomycin chứa một nếp gấp khác với một chuỗi xoắn alpha và một tấm beta ba sợi xoắn, được ổn định bởi ba cầu nối disulfide [43]. Mô-đun cấu trúc này, được gọi là "mô-típ ổn định cysteine", cũng được tìm thấy trong các protein bảo vệ vật chủ khác như defensin A kháng khuẩn của côn trùng, độc tố bọ cạp, thionin thực vật và defensin thực vật chống nấm [43,44].

-helix là một polypeptide có hoạt tính sinh học cao, có thể kích hoạt hệ thống miễn dịch của con người và nâng cao khả năng miễn dịch của con người, từ đó ngăn ngừa và điều trị các bệnh khác nhau. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng -helix có tác dụng cải thiện chức năng miễn dịch, có thể cải thiện đáng kể khả năng thực bào của đại thực bào và hoạt động của tế bào T, tăng cường sức đề kháng của cơ thể đối với các vi sinh vật gây bệnh bên ngoài, giảm độ nhạy cảm của cơ thể với môi trường bất lợi và tăng cường sức khỏe.

Khả năng miễn dịch là rất quan trọng đối với sức khỏe con người. Nó có thể giúp chúng ta chống lại các loại bệnh tật, duy trì thể lực và tăng cường khả năng kháng bệnh. Tuy nhiên, con người sống trong môi trường tiếp xúc nhiều với mầm bệnh và ô nhiễm môi trường nên khả năng miễn dịch dễ bị ảnh hưởng. Vì vậy, tăng cường khả năng miễn dịch là rất cần thiết để duy trì sức khỏe con người.

Là một peptide hoạt động tự nhiên, -helix không chỉ có thể điều chỉnh hệ thống miễn dịch và cải thiện khả năng miễn dịch mà còn đóng vai trò tốt trong việc ngăn ngừa các bệnh tim mạch và rối loạn chuyển hóa, cải thiện chức năng gan, giảm lipid máu và lượng đường trong máu, nâng cao thể lực và chống -khả năng mệt mỏi. Do đó, -helix đã được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực y học, sản phẩm chăm sóc sức khỏe và mỹ phẩm, đạt được hiệu quả rõ rệt và được chào đón nồng nhiệt.

Tóm lại, -helix có quan hệ mật thiết với khả năng miễn dịch của con người, nó có thể kích thích khả năng miễn dịch của con người và đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo sức khỏe và tuổi thọ của con người. Trong cuộc sống và công việc sau này, chúng ta nên tích cực tăng cường khả năng miễn dịch, cải thiện thói quen sinh hoạt, tập thể dục và điều chỉnh chế độ ăn uống hợp lý, cân nhắc sử dụng -helix để nâng cao khả năng miễn dịch, đồng thời tích cực hơn trong việc đáp ứng những thách thức và cơ hội trong tương lai. Có thể thấy rằng chúng ta cần nâng cao khả năng miễn dịch. Cistanche có thể cải thiện đáng kể khả năng miễn dịch vì polysacarit trong Cistanche có thể điều chỉnh phản ứng miễn dịch của hệ thống miễn dịch của con người, cải thiện khả năng căng thẳng của tế bào miễn dịch và tăng cường tác dụng diệt khuẩn của tế bào miễn dịch.

Nhấp vào bổ sung cistanche Deserticola

Với chức năng kháng khuẩn đã biết của Drosomycin và "mô-típ ổn định cysteine" [43,44] có liên quan của nó, chúng tôi đã kiểm tra khả năng có cơ sở chung cho hoạt động kháng khuẩn và mối quan hệ chức năng cấu trúc chung với LhKNOT để hiểu rõ hơn về ý nghĩa tiềm năng của mô-típ này trong LhKNOT trong bối cảnh bảo vệ máy chủ.

Mặc dù có nếp gấp cấu trúc hơi khác, nhưng Drosomycin phủ bên trong RMSD là 2,2Å của cả LhKNOT và pB1 (Hình 5A). Khi phân tích clip CPC trước đây được mở rộng cho Drosomycin, kết quả cho thấy sự hiện diện của mô típ clip CPC trong Drosomycin. Mô-đun clip CPC trong Drosomycin (R6-S4-K38) nằm trong độ lệch 2Å của các tham số mô-đun (Hình 5B, Bảng bổ trợ S5).

Ngoài ra, tĩnh điện bề mặt của Drosomycin đã xác nhận sự hình thành túi liên kết cation của clip CPC giả định cũng như được quan sát đối với LhKNOT và các nút thắt khác (Hình 5C, Bảng bổ trợ S5).

Những kết quả này cho thấy rằng có thể có sự giống nhau trong phương thức hoạt động của Drosomycin và LhKNOT và hóa sinh được nhúng trong mô típ cấu trúc này có thể thúc đẩy chức năng kháng khuẩn ở cả hai peptide.

Hình 5. (A) Sự chồng chất của LhKNOT (xanh lam), peptide chữa lành vết thương của Pereskia bleo (tan; pB1; xương rồng; PDB: 5XBD) và Drosomycin (xanh lá cây; Drosomycin; bay; PDB: 1MYN). ( B ) Khoảng cách được đo bằng PyMOL giữa các tâm khối lượng của dư lượng tham gia (nguyên tử giả màu xám) trong tương tác heparin Drosomycin. Khoảng cách nằm trong phạm vi 2Å của phạm vi giá trị của mô-đun clip CPC. (C) Tĩnh điện bề mặt của Drosomycin (bay; PDB: 1MYN), cho thấy bề mặt liên kết tích điện dương được hình thành bởi clip CPC nơi heparin được gắn vào. Các điện thế tĩnh điện bề mặt được phân loại màu từ −4 kT/e (màu đỏ) đến cộng 4 kT/e (màu xanh lam).

3. Thảo luận và Suy đoán

Các chức năng sinh hóa của protein được hỗ trợ bởi cấu trúc tổng thể của chúng, được báo cáo là được bảo tồn tốt hơn gấp 3–10 lần so với cấu trúc chính của chúng [45]. Do đó, sự sắp xếp trình tự thường không đạt được trong việc điều tra tiềm năng chức năng của các protein như nút thắt, trong đó các cấu trúc chính khác nhau có thể che khuất các mối quan hệ chức năng cấu trúc được chia sẻ.

Trong các phương pháp silico tạo điều kiện phân tích rộng rãi các mối tương quan chức năng-cấu trúc tiềm năng cho các nếp gấp thú vị như vậy [46–50]. Phân tích chi tiết của chúng tôi về cấu trúc LhKNOT và các cấu trúc tương đồng của nó hỗ trợ cho ý tưởng rằng protein ký sinh trùng này có đặc điểm nổi bật của một peptit thắt nút có chức năng bảo vệ vật chủ: (a) các kết hợp gần nhất với LhKNOT là các peptit kháng khuẩn; ( b ) Chữ ký Pfam của LhKNOT mô tả nó là cysteine ​​​​được thắt nút "peptide chống nấm"; và (c) có clip CPC.

Phân tích đăng nhập peptide chữa lành vết thương thắt nút pB1 từ cây xương rồng lá Pereskia bleo ban đầu cho thấy sự hiện diện của clip CPC, một dấu hiệu cấu trúc được bảo tồn của các protein liên kết với heparin [42]. Nó có các chức năng liên quan đến miễn dịch và tín hiệu trong việc chữa lành vết thương và ung thư và được sử dụng như một chất chống đông máu [51].

GAGs hiện diện trên bề mặt tế bào động vật và ngày càng trở thành mục tiêu phổ biến của các nghiên cứu từ lâm sàng đến mỹ phẩm [52]. Mô-đun clip CPC của các protein liên kết với heparin được coi là mô-đun tối thiểu bắt buộc đối với ái lực liên kết với heparin và được xác định bởi các mối quan hệ không gian cụ thể giữa ba gốc, hai cation (Arg/Lys) và một cực (Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr).

Mô-đun clip CPC này được xác định bởi khoảng cách giữa cả hai nguyên tử cacbon của dư lượng liên quan cũng như khoảng cách giữa các tâm khối lượng của dư lượng liên quan. Các protein liên kết với heparin được biết là tương tác bừa bãi với các chất nền tích điện âm khác, đáng chú ý nhất là màng bề mặt của vi khuẩn [41].

Kết quả là, các protein gắn heparin có thể thể hiện hoạt tính kháng khuẩn ở các mức độ khác nhau [53]. Mặc dù các cơ chế chính xác của khả năng kháng khuẩn này chưa được xác định rõ ràng, nhưng người ta đã đưa ra giả thuyết rằng clip CPC có thể tạo điều kiện thuận lợi cho các tương tác giữa protein và vi khuẩn này [41]. Các vai trò tiềm năng mới của liên kết heparin đang nổi lên, chẳng hạn như trong các biện pháp can thiệp điều trị tiềm năng đối với quá trình tạo amyloidogen [54], vì vậy việc hiểu các yếu tố quyết định cấu trúc của clip CPC trong các protein khác nhau có thể là chìa khóa để mô tả cơ chế tương tác và sự gián đoạn của nó.

Manh mối về một cơ chế kháng khuẩn có thể có đối với LhKNOT xuất phát từ phát hiện của chúng tôi rằng nút thắt cysteine ​​ức chế của nó và của các nút thắt khác được kiểm tra ở đây có một clip CPC bên trong các nếp gấp của chúng (Bảng bổ trợ S5).

Người ta đã lưu ý rằng các yêu cầu về cấu trúc và sinh lý đối với khả năng tương tác với heparin của các protein gắn với heparin tương tự một cách đáng ngạc nhiên với các đặc điểm cấu trúc của nhiều AMP đã biết [53]. Do đó, mô típ clip CPC có thể phù hợp với tiêu chí cho cả hai yêu cầu này [41].

Phát hiện của chúng tôi về mô-đun clip CPC này không chỉ trong LhKNOT mà còn ở 75 protein nút thắt có liên quan hoặc không liên quan khác (Bảng bổ trợ S5) cho thấy rằng mô-đun clip CPC này có thể là một tính năng được bảo tồn cao của protein nút thắt.

Sự xuất hiện ngẫu nhiên của mô-đun clip CPC trong cấu trúc nút cysteine ​​​​trong các protein khác nhau cho thấy rằng chính mô-đun clip CPC có thể tạo ra chức năng kháng khuẩn. Tuy nhiên, vì mô-đun cấu trúc này cũng được xác định trong các nút thắt gây khó chịu (Bảng bổ trợ S5), nên nó cũng có thể đóng vai trò tổng quát hơn thông qua mô-đun tương tác clip CPC tổng quát hơn này.

Việc phát hiện ra mô-đun clip CPC giả định trong Drosomycin rất hấp dẫn, vì nó làm sáng tỏ cơ chế hoạt động có thể có của peptide kháng nấm này và hỗ trợ chức năng kháng khuẩn có thể có cho chính mô-đun clip CPC. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra tầm quan trọng của dư lượng R6 và K38 của Drosomycin, là một phần của mô típ clip CPC (R6-S4-K38), về khả năng kháng nấm của nó; sự thay đổi của các dư lượng này làm giảm hoạt tính kháng nấm [55]. Phân tích cấu trúc của chúng tôi về ong bắp cày LhKNOT và những điểm tương đồng của nó với Drosophila Drosomycin cung cấp những hiểu biết sâu sắc về khả năng của L. heterotoma trong việc ngăn chặn rộng rãi con đường TollNF-κB ở D. melanogaster và vẫn thành công trên các vật chủ bị suy giảm miễn dịch.

Trong trường hợp không có con đường miễn dịch Toll chức năng, và do đó, không sản xuất Drosomycin, ấu trùng Drosophila thường có thể không chống chọi được với mầm bệnh cơ hội [11,13,56]. Các hoạt động kháng khuẩn giả định của LhKNOT có thể bảo vệ vật chủ khỏi mầm bệnh vi khuẩn cơ hội ở ấu trùng vật chủ bị nhiễm ong bắp cày, bị suy giảm miễn dịch và nhộng đang phát triển. Ngoài ra, tương tự như Drosomycin, LhKNOT có thể gây ra quá trình chết theo chương trình của tế bào máu [57]. EV của L. heteroatom xâm nhập vào tế bào máu sau khi bị nhiễm bệnh [58] và các hoạt động của chúng trong EV làm ảnh hưởng đến quá trình đóng gói [19,21].

Clip CPC đã được chứng minh là có liên kết bừa bãi với GAGs [41], tuy nhiên, chúng vẫn phổ biến ở côn trùng bao gồm Drosophila [59]. Heparin sulfate GAGs ở ruồi đóng vai trò là thụ thể của yếu tố tăng trưởng và tham gia vào việc tạo ra và duy trì gradient hình thái [60]. Clip CPC cũng đã được chứng minh là có liên kết bừa bãi với lipopolysacarit (LPS) [41]. LPS vi khuẩn, là thành phần bề mặt chính của vi khuẩn gram âm, là tác nhân kích thích cực kỳ mạnh đối với phản ứng miễn dịch bẩm sinh ở các loài sinh vật nhân chuẩn khác nhau bao gồm cả côn trùng [61]. GAGs trong Drosophila cũng kiểm soát sự liên kết của protein C, một yếu tố quyết định độc lực của liên cầu khuẩn nhóm B [62].

Do đó, có thể một clip CPC chứa LhKNOT và Drosomycin (và có thể cả các AMP của ruồi khác, chẳng hạn như Defensin [63]) có thể điều chỉnh tín hiệu miễn dịch (và/hoặc liên kết với các protein độc lực của mầm bệnh), ảnh hưởng tương tự đến mầm bệnh/siêu động vật của vi khuẩn. kết quả ký sinh trùng. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng ba nút thắt tương đồng (Alo-1, 2, 3) từ bọ cánh cứng Acrocinus longimanus có hoạt tính chống lại nấm men, Candida glabrata [30]. Ngoài ra, một peptit có tính axit hình thành lỗ chân lông, Psacotheasin, tấn công Candida albicans [64]. Cuối cùng, một loại nấm gỉ sắt gây bệnh thực vật, Melampsora, phổ biến trong lời bài hát, tạo ra một peptit thắt nút làm tác nhân ứng cử viên của nó [65].

Phát hiện của chúng tôi rằng nhiều peptide thắt nút giả định có thể được tiết ra bởi ong bắp cày ký sinh Drosophila trưởng thành là điều bất ngờ và hấp dẫn. Mặc dù chức năng của chúng chưa được biết rõ, nhưng khả năng tồn tại của họ gen thắt nút cho thấy một số dư thừa trong chức năng của chúng có thể liên quan đến lịch sử đời sống ký sinh. Việc khám phá nếp gấp cấu trúc thắt nút trong các nút thắt không liên quan và chưa được khám phá sẽ chứng tỏ là có giá trị. Công việc của chúng tôi cung cấp một danh sách ngắn các dư lượng có ý nghĩa đối với hoạt động sinh lý được đề xuất cho cuộc điều tra protein của gia đình Knottin. Thông tin như vậy có thể được kết hợp vào việc khám phá và thiết kế thuốc hợp lý cho các bệnh truyền nhiễm và các liệu pháp liên quan.

4. Phương pháp

4.1. Phân tích trình tự

Các bản quét ban đầu của cơ sở dữ liệu trình tự protein không dư thừa (nr) NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein; được truy cập vào ngày 4 tháng 4 năm 2018), cơ sở dữ liệu trình tự Transcriptome Shotgun Assembly (TSA) (https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/tsa; truy cập ngày 16 tháng 4 năm 2018) [66] và Ngân hàng Dữ liệu Protein (PDB; https://www.rcsb.org; truy cập ngày 5 tháng 7 năm 2018) [67] với trình tự axit amin có độ dài đầy đủ của peptide L. heteroatom knottin (GAJC01011813.1) sử dụng NCBI BLAST (BLASTp; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast. cgi; truy cập vào ngày 16 tháng 4 năm 2018) [68] đã được sử dụng để truy xuất các chuỗi protein liên quan ở các sinh vật khác. Các tương đồng từ xa đã được tìm kiếm bằng BLAST lặp lại theo vị trí cụ thể (PSI-BLAST; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi; truy cập vào ngày 4 tháng 4 năm 2022) [69] và Mô hình Markov ẩn (HMMER; https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer; truy cập ngày 6 tháng 4 năm 2022) [70,71]. Các tìm kiếm BLAST đã được điều chỉnh thành kích thước từ 2 và ma trận điểm BLOSUM45, trong khi các tham số mặc định được sử dụng cho HMMER.

Để xác định các đồng đẳng thắt nút trong Leptopilina và Ganaspis spp được chọn. không thể truy cập được trong cơ sở dữ liệu protein, các tìm kiếm được nhắm mục tiêu bằng cách sử dụng BLAST đã dịch dựa trên bộ dữ liệu bộ gen và phiên mã đã được sử dụng. Để xác định các nút thắt nguyên tử L. khác loại bổ sung, bộ phiên mã vùng bụng L. dị nguyên tử cái GAJC [72] và bộ phiên mã toàn bộ cơ thể từ Ground GHUQ (Gia nhập GenBank: GHUP00000000; TSA: chủng Leptopilina dị nguyên tử Lh14, khẩu súng ngắn phiên mã) và GHUP không gian (Gia nhập GenBank: GHUQ00000000; TSA: Chủng dị hợp tử Leptopilina Lh14, súng ngắn phiên mã) đã được tìm kiếm bằng cách sử dụng tblastn (ngưỡng giá trị điện tử được đặt thành 1, BLOSUM62, bật bộ lọc có độ phức tạp thấp, bộ lọc bao phủ truy vấn được đặt thành 20 phần trăm ) chống lại LhKNOT.

Các bộ phiên mã sau đây được tìm kiếm tương tự để xác định L. boulardi knottins: bộ phiên mã bụng L. boulardi cái GAJA [72] và bộ phiên mã toàn cơ thể từ Ground GITC (Gia nhập GenBank: GITC00000000; TSA: chủng Leptopilina boulardi Lb17, súng ngắn phiên mã), GISX không gian (Gia nhập GenBank: GISX00000000; TSA: Leptopilina boulardi chủng Lb17, súng ngắn phiên mã) và GGGI00000000 (bụng/đầu cái) [73]. Ngoài ra, các tìm kiếm được nhắm mục tiêu cho Ganaspis spp. tương đồng đã được thực hiện. Đối với G. hookeri, TSA GAIW00000000: Ganaspis spp.

Tập dữ liệu G1 [74] đã được tìm kiếm (tblastn, ngưỡng giá trị điện tử được đặt thành 1, BLOSUM45, bật bộ lọc có độ phức tạp thấp, bộ lọc bao phủ truy vấn được đặt thành 20 phần trăm) bằng cách sử dụng truy vấn LhKNOT. Công cụ Expasy (web.Exasy.org/translate/; được truy cập vào ngày 9 tháng 12 năm 2022) đã được sử dụng để dịch các trình tự TSA này [75]. Các chuỗi peptit dự đoán thu được được quản lý thủ công dựa trên sự hiện diện của mô típ cysteine. Đối với G. brasiliensis, dựa trên AUGUSTUS (http://bioinf.uni-greifswald.de/augustus; truy cập ngày 9 tháng 4 năm 2020) [76] dự đoán gen từ trình tự gen được lắp ráp một phần (Ngân hàng gen: GCA{{15} }.1) được thực hiện bằng cách sử dụng mô-đun huấn luyện bộ gen Nasonia vitripenis.

Các protein dự đoán kết quả đã được tìm kiếm bằng cách sử dụng blastp (ngưỡng giá trị điện tử được đặt thành 1, bật bộ lọc có độ phức tạp thấp, bộ lọc bao phủ truy vấn được đặt thành 20 phần trăm) so với LhKNOT. Việc căn chỉnh và trực quan hóa được thực hiện bằng cách sử dụng Clustal Omega của EBI (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo; truy cập vào ngày 9 tháng 12 năm 2022) [77] để xác nhận sự hiện diện của họa tiết thắt nút và để tiếp tục quản lý các trình tự.

Tập hợp các trình tự đã xác định được căn chỉnh theo LhKNOT để tạo sự căn chỉnh nhiều trình tự bằng T-COFFEE (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee; truy cập vào ngày 9 tháng 12 năm 2022) [78] và được hiển thị trực quan bằng cách sử dụng ESPript3 (https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php; truy cập vào ngày 9 tháng 12 năm 2022) [79] để xác định bất kỳ dư lượng và/hoặc (các) họa tiết được bảo tồn nào trong các trình tự đã căn chỉnh.

4.2. LhKNOT Phân tích cấu trúc chính

Trình tự LhKNOT cũng được phân tích bởi cơ sở dữ liệu phát hiện miền/mô-đun Cơ sở dữ liệu miền được bảo tồn (CDD; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd. shtml; được truy cập vào ngày 6 tháng 4 năm 2018) và Pfam ( pfam.xfam.org; được truy cập vào ngày 6 tháng 4 năm 2018) để xác định bất kỳ tên miền hoặc chữ ký trình tự nào [80,81].

Trình tự được phân tích sâu hơn bằng cách sử dụng phần mềm dự đoán trình tự tín hiệu SignalP{{0}}.0 (https://services.healthtech.dtu. dk/service.php?SignalP-5 .0; truy cập ngày 6 tháng 4 năm 2018) [82] và Phobius (https://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/phobias; truy cập ngày 6 tháng 4 năm 2018) [83] để xác định vị trí của chuỗi tín hiệu và cho phép mô tả đặc tính chính xác hơn của peptide. Peptide trưởng thành gồm 36 axit amin (với trình tự tín hiệu dự đoán, dư lượng 1–24, đã loại bỏ) đã được sử dụng để phân tích thêm.

Cấu trúc thứ cấp của peptit đã được dự đoán bằng siêu máy chủ Sympred (https://www.ibi.vu.nl/programs/sympredwww; truy cập ngày 6 tháng 4 năm 2018) [84] và được phân tích để xác nhận sự tương ứng của nó với cấu trúc thứ cấp dự kiến. cấu trúc cho nếp gấp thắt nút: một đoạn xoắn ốc alpha ban đầu (chuỗi tín hiệu dự đoán) theo sau là ba sợi beta đối song song.

4.3. Dự đoán và đánh giá cấu trúc bậc ba của LhKNOT và các tương đồng của nó

Các chương trình I-Tasser (https://zhanggroup.org/I-TASSER; truy cập ngày 16 tháng 4 năm 2018) [85], Modeller (https://salilab.org/modeller; truy cập ngày 16 tháng 4 năm 2018) [{{7 }}] và HHPred (https://toolkit.tuebingen.mpg.de/tools/hhpred; truy cập ngày 6 tháng 4 năm 2018) [37] đã được sử dụng để lập mô hình cấu trúc bậc ba của LhKNOT. Ba cấu trúc tương đồng với nếp gấp giống như nút thắt Alo-3 (PDB: 1Q3J) [30], omega-agatoxin-IVA (PDB: 1IVA) [28] và PAFP-S (PDB: 1DKC) [25] đã được xác định là ứng cử viên hàng đầu và được sử dụng làm mẫu trong các chương trình xây dựng mô hình.

Mô hình dự đoán cho LhKNOT đã được đánh giá bởi Verify3D (https://www.doe-mbi.ucla.edu/verify3d; truy cập vào ngày 18 tháng 4 năm 2018) [39], VoroMQA (https://bioinformatics.lt/wtsam/voromqa; truy cập ngày 18 tháng 4 năm 2018) [40] và Prosaweb (https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php; truy cập ngày 18 tháng 4 năm 2018) [38]. Đánh giá các peptide nhỏ bằng các công cụ đánh giá tiêu chuẩn có thể có những hạn chế.

Do đó, điểm số từ các cấu trúc bậc ba đã được giải quyết của NMR và các peptide có nguồn gốc từ tinh thể học có kích thước và hình dạng tương tự (PDB: 1Q3J, 1IVA và 1DKC) đã được sử dụng để diễn giải điểm đánh giá của các mô hình LhKNOT của chúng tôi. Mô hình xếp hạng cao nhất được tạo bằng HHPred [37], một chương trình lập mô hình sử dụng chương trình xây dựng mô hình cơ bản, Modeller [86] bằng cách sử dụng phương pháp lập mô hình so sánh dựa trên hạn chế. Ngoài ra, công cụ KNOTER3D của cơ sở dữ liệu KNOTTIN (https://www.dsimb.inserm.fr/KNOTTIN/knoter3d.php; được truy cập vào ngày 15 tháng 5 năm 2020) [36] đã được sử dụng để đánh giá cấu trúc bậc ba của mô hình, xác nhận việc LhKNOT áp dụng công cụ thắt nút. Tất cả các tương đồng được xác định không có cấu trúc đã biết đã được mô hình hóa bằng cách sử dụng mẫu hàng đầu được xác định trong HHPred [37].

4.4. Xác định Motif Clip CPC

Sự chồng chất của mô hình cấu trúc của LhKNOT với các cấu trúc đã biết của clip CPC chứa peptit thắt nút từ cây xương rồng Pereskia bleo (PDB: 5XBD) [26] bằng cách sử dụng chương trình Superpose (http://superpose.wishartlab.com; truy cập vào ngày 12 tháng 9, 2{101}{101} {11}}18) [87] và MultiProt (http://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/MultiProt; được truy cập vào ngày 12 tháng 9 năm 2018) [88] đề xuất sự hiện diện của mô típ clip CPC gắn heparin. Để xác nhận sự hiện diện của clip CPC trong LhKNOT, phân tích kết nối bằng chương trình, ClusPro 2.0 (cung cấp các thông số cụ thể cho heparin dưới dạng phối tử; https://cluspro.org; được truy cập vào ngày 2 tháng 3 năm 2019) [89] và phân tích tiếp theo về các kịch bản lắp ghép được dự đoán trong chương trình trực quan hóa, PyMOL (https://pymol.org; truy cập vào ngày 10 tháng 3 năm 2019) [90] đã được thực hiện.

Tất cả các tình huống lắp ghép tiềm năng đã được phân tích để xác định dư lượng hình thành mô típ clip CPC giả định bằng cách sử dụng các bước sau. Tất cả các tương tác cực giữa LhKNOT và heparin đã được hiển thị trong PyMOL và danh sách các dư lượng tham gia đã được tổng hợp. Các dự đoán có chứa các tương tác Cation–Polar–Cation cần thiết sau đó được xem xét kỹ lưỡng hơn để tuân thủ tham số họa tiết clip CPC bằng cách đo khoảng cách giữa các nguyên tử cacbon alpha của các dư lượng tham gia cũng như khoảng cách giữa tâm khối lượng của các dư lượng tham gia. Công cụ Thuật sĩ "Đo lường" của PyMOL đã được sử dụng để đo khoảng cách giữa -cacbon của dư lượng tham gia.

Để đánh giá khoảng cách giữa các tâm khối lượng, tập lệnh do người dùng tạo có sẵn trên trang web Pymolwiki (Henschel, https://pymolwiki.org/index.php/Center_of_mass; được truy cập trên ngày 15 tháng 3 năm 2019) đã được sử dụng để tạo ra các nguyên tử giả tại tâm khối lượng sidechain được tính toán. Plugin tĩnh điện APBS của PyMOL [91] đã được sử dụng để hiển thị tĩnh điện bề mặt cho LhKNOT được mô hình hóa. Các bước tương tự đã được thực hiện để xác định mô-đun clip CPC trong từng protein thắt nút còn lại trong Bảng bổ trợ S5.

4.5. Liên kết LhKNOT với các GAG khác

Để đánh giá xem clip CPC có hỗ trợ liên kết với các GAG bổ sung hay không, quá trình ghép nối tiếp được thực hiện với axit hyaluronic (PDB: 1HYA) và keratan sulfat (PDB: 1KES). Trong trường hợp của axit hyaluronic, các nguyên tử ngoại lai (O, Na) đã được loại bỏ khỏi không gian xung quanh phân tử. Mô hình của Keratan sulfat đã được sử dụng như hiện tại. Việc ghép nối được thực hiện bằng AutoDock (https://autodock.scripps.edu; được truy cập vào ngày 7 tháng 4 năm 2020) [92] và kết quả được hiển thị trong PyMOL. Sau đó, kết quả được nhập vào PDBSum (http://www.ebi.ac. uk/thornton-srv/databases/pdbsum/Generate.html; truy cập ngày 10 tháng 4 năm 2020) [93] để tạo Ligplot nhằm xác nhận ràng buộc clip GAG-CPC .

4.6. Phân tích kết nối Protein-Heparin cho Clip CPC đột biến trong LhKNOT

Để điều tra tầm quan trọng của clip CPC trong liên kết heparin, các mô hình LhKNOT đột biến đã được tạo bằng cách sử dụng công cụ gây đột biến của PyMOL, thay thế dư lượng clip CPC bằng alanine. Các mô hình được tạo ra từng phần, đầu tiên chỉ thay thế R14, sau đó là R1 và R14, cuối cùng là R14, R1 và S3. Việc ghép nối heparin của tất cả các mô hình đã được thực hiện bằng ClusPro và phân tích được thực hiện như mô tả trước đây.

4.7. Phân tích kết nối protein-Heparin trong cấu trúc tương đồng và Drosomycin

Để đánh giá thêm sự hiện diện của mô-đun clip CPC trong họ peptide knottin, các phương pháp trước đây đã được mở rộng hơn nữa thành (a) cấu trúc tương đồng của LhKNOT (PDB: 5XBD, 1Q3J, 1IVA và 1DKC) [25,26,28,30 ]; (b) Drosophila Drosomycin (PDB: 1MYN) [43], một peptit có hoạt tính kháng nấm đã biết; ( c ) các protein nút thắt tương đồng được mô hình hóa và ( d ) các nút thắt đại diện từ các loại khác nhau trong cơ sở dữ liệu KNOTTIN. Các kết quả được coi là tuân thủ mô-đun nếu các phép đo nằm trong phạm vi 3Å so với thông số clip CPC, để cho phép sự linh hoạt của vòng lặp protein.

Nguyên liệu bổ sung:

Có thể tải xuống thông tin hỗ trợ sau đây tại https:// www.mdpi.com/article/10.3390/pathogens12010143/s1. Bảng S1. Các tương đồng được xác định của LhKNOT bằng cách sử dụng các phương pháp tiếp cận dựa trên trình tự khác nhau. Bảng S2. Giả định L. heterotoma tương đồng của LhKNOT. Các trình tự đã được xác định thông qua tblastn từ ba bộ dữ liệu phiên mã Lh14 (xem Phương pháp để biết các số gia nhập).

Các bản phiên mã được nhóm bởi các ô được tô bóng mã hóa các peptit thắt nút giống hệt nhau. Các số gia nhập phiên mã được in đậm mã hóa hai peptide riêng biệt. Kết quả được lấy từ Bảng mô tả có sẵn từ kết quả vụ nổ NCBI. Bảng S3. L. boulardi knottin tương đồng giả định của LhKNOT. Các trình tự đã được xác định thông qua tblastn từ bốn bộ dữ liệu phiên mã L. boulardi (xem Phương pháp để biết các số gia nhập). Các peptide thắt nút giống hệt nhau có nguồn gốc từ các bản phiên mã khác nhau được nhóm lại theo màu sắc. Kết quả được lấy từ Bảng mô tả từ kết quả vụ nổ NCBI. Bảng S4.

Trình tự thắt nút giả định từ Ganaspis spp., tương đồng với LhKNOT. Các trình tự của G. hookeri được xác định bằng tblastn, trong khi các trình tự của G. brasiliensis được xác định bằng một vụ nổ. Các kết quả về G. hookeri và G. brasiliensis được lấy từ Bảng Mô tả có sẵn từ các kết quả tìm kiếm của NCBI. Trình tự bóng mờ mã hóa các peptide giống hệt nhau. Bảng S5.

Một danh sách các dư lượng axit amin trong các clip CPC của nút thắt đã biết đã được kiểm tra, peptide nút thắt được mô hình hóa và Drosomycin. Các phép đo khoảng cách (Å) của alpha-carbon và tâm khối lượng sidechain (thông qua nguyên tử giả) của dư lượng tham gia của các họa tiết clip CPC đã xác định được hiển thị. Khóa: cộng với Các nút thắt gây khó chịu đã biết (độc tố), Φ trong mô hình silico, * nếp gấp không thắt nút, ±peptide giả định thay thế, được đánh dấu bằng màu xanh lá cây và màu vàng để phân định các peptide phát sinh từ cùng một bản phiên mã. Hình S1: (A) Hồ sơ đánh giá Prosa-web. Điểm Z của mô hình được biểu thị dưới dạng một chấm đen trên phông nền điểm Z của các cấu trúc đã biết từ PDB (trái) và trực quan hóa mô hình ba chiều LhKNOT với các dư lượng được tô màu từ xanh lam sang đỏ theo thứ tự tăng dần năng lượng dư (phải). (B) Xác minh hồ sơ đánh giá. Biểu đồ hiển thị điểm 1D-3D trung bình và thô cho LhKNOT và bảng ở trên cùng liệt kê tỷ lệ phần trăm dư lượng đạt điểm trung bình 0.2 trở lên.

Một mô hình vượt qua có ít nhất 80 phần trăm số dư của nó đạt điểm trên 0,2. (C) Hồ sơ đánh giá VoroMQA. Điểm toàn cầu của VoroMQA trong bối cảnh điểm cấu trúc tia X chất lượng cao (trái) và đồ thị của điểm cục bộ và điểm tổng thể cho LhKNOT (phải). Hình S2. Ligplot hiển thị các tương tác của LhKNOT với keratan sulfat (PDB: 1KES) bao gồm dư lượng clip CPC (R1-S3-R14). Các đường đứt nét màu xanh lá cây mô tả các tương tác liên kết hydro. Hình S3. Ligplot hiển thị các tương tác của LhKNOT với axit hyaluronic (PDB: 1HYA) bao gồm dư lượng clip CPC (R1-S3-R14).

Các đường đứt nét màu xanh lá cây mô tả các tương tác liên kết hydro. Hình S4. (A) Ligplot hiển thị các tương tác của LhKNOT kiểu hoang dại tương tác với heparin qua clip CPC chính (R1-S3-R14). (B) Ligplot hiển thị các tương tác của R14A LhKNOT đột biến tương tác với heparin qua clip CPC phụ (R1-S3-R30). Các đường đứt nét màu xanh lá cây mô tả các tương tác liên kết hydro. Tài liệu tham khảo [94–111] được trích dẫn trong Tài liệu bổ sung.

Sự đóng góp của tác giả:

Khái niệm hóa, SS, SG và JA; phương pháp, JA và SS; xác thực, SS, SG, JA, JL và LVC; phân tích chính thức, JA, JL và LVC; điều tra, JA, JL và LVC; tài nguyên, SS và SG; quản lý dữ liệu, JA, JL và LVC; viết—chuẩn bị bản thảo gốc, JA; viết—đánh giá và chỉnh sửa, SS, SG, JA, JL và LVC; trực quan hóa, JA và JL; giám sát, SS và SG; quản lý dự án, SS và SG Tất cả các tác giả đã đọc và đồng ý với phiên bản đã xuất bản của bản thảo.

Kinh phí:

Nghiên cứu này không nhận được tài trợ.

Tuyên bố của Ủy ban Đánh giá Thể chế:

Không áp dụng.

Tuyên bố đồng ý có hiểu biết:

Không áp dụng.

Tuyên bố về tính khả dụng của dữ liệu:

Dữ liệu được trình bày trong nghiên cứu này có sẵn trong bài báo và Tài liệu bổ sung.

Sự nhìn nhận:

Chúng tôi rất biết ơn Brian Wey vì sự giúp đỡ của họ trong việc dự đoán gen của G. brasiliensis và SA Tasnim Ahmed vì sự giúp đỡ của ông trong việc định dạng các số liệu.

Xung đột lợi ích:

Các tác giả tuyên bố không có xung đột lợi ích.

Người giới thiệu

1. Penczykowski, RM; Laine, AL; Koskella, B. Tìm hiểu hệ sinh thái và sự tiến hóa của các tương tác vật chủ-ký sinh trùng trên các quy mô. tiến hóa. ứng dụng 2015, 9, 37–52. [CrossRef] [PubMed]

2. Lambrechts, L.; Cảm ơn, S.; Koella, JC Tương tác đồng tiến hóa giữa kiểu gen của vật chủ và ký sinh trùng. Xu hướng Ký sinh trùng. 2006, 22, 12–16. [Tham khảo chéo]

3. Quicke, DL Ong bắp cày ký sinh; Springer: Dordrecht, Hà Lan, 1997.

4. Poirié, M.; Colinet, D.; Gatti, J. Hiểu biết sâu sắc về chức năng và sự tiến hóa của nọc ong bắp cày ký sinh. Curr. ý kiến. Khoa học côn trùng 2014, 6, 52–60. [CrossRef] [PubMed]

5. Kraaijeveld, AR; Godfray, HCJ Sự tiến hóa của tính kháng của vật chủ và tính kháng của ký sinh trùng. quảng cáo Ký sinh trùng. 2009, 70, 257–280. [CrossRef] [PubMed]

6. Burke, GR; Strand, MR Phân tích có hệ thống kho vũ khí ký sinh ong bắp cày. mol. sinh thái. 2014, 23, 890–901. [CrossRef] [PubMed]

7. Yên, Z.; Phương, Q.; Vương, L.; Lưu, J.; Chu, Y.; Vương, F.; Lý, F.; Warren, JH; Ye, G. Hiểu rõ hơn về thành phần nọc độc và sự tiến hóa của ong bắp cày nội ký sinh bằng cách kết hợp các phân tích proteomic và phiên mã. Khoa học. Dân biểu 2016, 6, 19604. [CrossRef]

8. Lue, C.; Driskell, AC; Leips, J.; Buffington, ML Đánh giá về chi Leptopilina (Hymenoptera, Cynipoidea, Figitidae, Eucoilinae) từ miền Đông Hoa Kỳ, bao gồm ba loài mới được mô tả. J. Bộ cánh màng. độ phân giải 2016, 53, 35–76. [Tham khảo chéo]

9. Trời, TÔI; Hudgins, AD; Rajwani, R.; Tinh thần, J.; Govind, S. Khai thác mô hình Drosophila-parasitoid tự nhiên để tích hợp khả năng miễn dịch của côn trùng với bộ gen chức năng. Curr. ý kiến. Khoa học côn trùng 2014, 6, 61–67. [Tham khảo chéo]

10. Lee, MJ; Kalamarz, TÔI; Paddibhatla, I.; Nhỏ, C.; Rajwani, R.; Govind, S. Các yếu tố độc lực và chiến lược của Leptopilina spp.: Phản ứng chọn lọc ở vật chủ Drosophila. quảng cáo Ký sinh trùng. 2009, 70, 123–145. [Tham khảo chéo]

11. Hội trưởng, N.; Người bạc, N.; Cherry, S. Miễn dịch ở Drosophila melanogaster—Từ nhận dạng vi sinh vật đến sinh lý toàn bộ sinh vật. tự nhiên Mục sư Immunol. 2014, 14, 796–810. [Tham khảo chéo]

12. Govind, S. Miễn dịch bẩm sinh ở Drosophila: Mầm bệnh và con đường. Khoa học côn trùng 2008, 15, 29–43. [Tham khảo chéo]

13. Kounatidis, I.; Ligoxygakis, P. Drosophila như một hệ thống mô hình để làm sáng tỏ các lớp miễn dịch bẩm sinh đối với nhiễm trùng. Mở Biol. 2012, 2, 120075. [CrossRef]

14. Schlenke, hỗ trợ kỹ thuật; Tinh thần, J.; Govind, S.; Clark, AG Các chiến lược lây nhiễm trái ngược nhau trong ký sinh trùng ong bắp cày nói chung và chuyên gia của Drosophila melanogaster. PLoS Pathog. 2007, 3, 1486–1501. [Tham khảo chéo]

15. Qiu, P.; Chảo, PC; Govind, S. Vai trò của con đường Drosophila Toll/Cactus trong quá trình tạo máu ở ấu trùng. Phát triển 1998, 125, 1909–1920. [Tham khảo chéo]

For more information:1950477648nn@gmail.com