Trong sự kết hợp thuốc hiệp lực dựa trên màn hình dựa trên Silico từ thuốc thảo mộc: Một trường hợp sử dụng Cistanche Tubulosa-Ⅱ

Mô-đun bảo vệ thần kinh

Bảo vệ thần kinh là các cơ chế và chiến lược được sử dụng để bảo vệ chống lại tổn thương hoặc thoái hóa tế bào thần kinh trong hệ thần kinh trung ương sau các rối loạn cấp tính (ví dụ như đột quỵ hoặc chấn thương/chấn thương hệ thần kinh) hoặc do các bệnh thoái hóa thần kinh mãn tính (ví dụ như Parkinson, Alzheimer, Bệnh đa xơ cứng). Mục tiêu của bảo vệ thần kinh là hạn chế rối loạn chức năng thần kinh/tử vong sau chấn thương thần kinh trung ương và cố gắng duy trì trạng thái hoạt động tốt nhất

tính toàn vẹn có thể có của các tương tác tế bào trong não dẫn đến chức năng thần kinh không bị xáo trộn. Như có thể thấy trong Hình 4, một số mục tiêu trên con đường khớp thần kinh Serotonergic có liên quan đến chức năng bảo vệ thần kinh. Ví dụ, việc sản xuất prostaglandin thông qua PTGS1 và PTGS2 (còn được gọi là COX-1 và COX-2) là một chất trung gian cần thiết trong việc khơi dậy các cơ chế chống viêm và hỗ trợ phân giải mới56. Một nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng sự biểu hiện gen của ADCY5, một loại enzyme xúc tác quá trình tạo ra cAMP57, bị giảm đi do quá trình methyl hóa chất khởi đầu trong các dòng tế bào HCC ở người do COX{10}}gây ra58. Dựa trên phân tích ở trên, chúng tôi suy đoán rằng sự tích lũy COX{12}} có thể ảnh hưởng đến sự tiết sAPP, sự phân cắt của APP bị phân cắt bởi -secretase được điều chỉnh bởi cAMP và tiếp tục phát huy tác dụng bảo vệ thần kinh59,60. Kết quả của chúng tôi cho thấy bảo vệ thần kinh đóng vai trò quan trọng trong điều trị viêm thần kinh.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ PHÒNG NGỪA BỆNH PARKINSON CHỨC NĂNG PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Xác thực thử nghiệm

Khả năng tồn tại của các tế bào microglia BV2 được xử lý bằng hợp chất

Tế bào microglia BV2 (8×104 tế bào/ ml) được nuôi với nồng độ từ 37,5 đến 300 μM trên mỗi ml môi trường nuôi cấy không có huyết thanh của bốn hợp chất trong 24 giờ. Chúng tôi coi khả năng tồn tại của tế bào của nhóm đối chứng được nuôi cấy trong điều kiện không có huyết thanh có DMSO dưới 0,1% là 100% (Hình 5 (a – d)). Không có độc tính tế bào đáng kể được quan sát thấy ở liều lượng quy định của các nhóm.

Xác nhận sức mạnh tổng hợp của thuốc và tác dụng chống viêm tiềm tàng trong ống nghiệm

Để đánh giá thêm các kết quả thu được trong silico, bốn hợp chất bao gồm ba cặp tác dụng hiệp đồng là isoacteoside, 2′-acetylacteoside, echinacoside và verascoside, được chọn để kiểm tra tác dụng hiệp đồng thuốc và tác dụng chống viêm tiềm tàng của chúng bằng cách sử dụng tế bào BV2 được điều trị bằng LPS. Đặc biệt, chúng tôi tiến hành phân tích Western blot biểu hiện protein iNOS và COX{4}} để xác nhận tác dụng hiệp đồng và tác dụng chống viêm của các phối hợp thuốc được dự đoán.

Như được hiển thị trong Hình 5(e–g), mức protein iNOS và COX-2 trong bảng điều khiển các dòng tế bào BV2 được thử nghiệm đã được báo cáo. Chúng tôi quan sát thấy rằng trong phương pháp điều trị bằng isoacteoside hoặc 2′-acetylacteoside, các biểu hiện protein của iNOS và COX-2 trong tế bào BV2 đều giảm đáng kể ở các mức liều khác nhau. Tuy nhiên, điều trị bằng sự kết hợp isoacteoside và 2′-acetylacteoside gây ra sự gia tăng đáng kể các yếu tố gây viêm iNOS và COX-2 (Hình 5(e)). Hình 5(f) minh họa rằngđiều trị bằng echinacoside hoặc verascoside, với tư cách là một tác nhân duy nhất, sẽ làm giảm biểu thức iNOS và COX-2. Hơn nữa, như mong đợi, việc điều trị bằng echinacoside kết hợp với verascoside ở nồng độ 150 μM dẫn đến sự giảm rõ rệt hơn về tỷ lệ mắc bệnh.

mức độ biểu hiện protein (iNOS và COX-2), cho thấy tác dụng chống viêm tổng hợp của sự kết hợp thuốc này. Tương tự, như được chỉ ra trong Hình 5(g), sự kết hợp giữa echinacoside và 2′-acetylacteoside cho thấy tác dụng hiệp đồng đáng kể trong việc ức chế COX-2 ở nồng độ 75 μM hoặc 300 μM. Tuy nhiên, đối với iNOS, ở liều 300 μM, sự kết hợp này thể hiện sự ức chế rõ rệt của protein. Ngược lại, chúng tôi thấy rằng không có tác dụng ức chế rõ ràng đối với cả iNOS và COX-2 về sự kết hợp giữa isoacteoside và 2′-acetylacteoside hoặc echinacoside và verascoside ở nồng độ 75μM (Hình bổ sung 2), ngoài ra còn có tác dụng điều trị với các cặp khác cho thấy tác dụng yếu hơn nhiều so với các tác nhân đơn lẻ ở liều 150 hoặc 300μM có thể thấy trong Hình 5 (e-g).

Tóm lại, nghiên cứu trong ống nghiệm cung cấp thông tin bổ sung để sàng lọc các phối hợp thuốc có tác dụng chống viêm tiềm tàng và chứng minh độ tin cậy của chiến lược sàng lọc trong silico.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ ĐIỀU TRỊ VIÊM THẦN KINH PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Cuộc thảo luận

Viêm thần kinh có liên quan đến phần lớn các bệnh về thần kinh, tâm thần và phát triển thần kinh, đó không chỉ là hậu quả mà còn có thể là nguyên nhân gây ra bệnh lý. Tuy nhiên, các phương pháp điều trị viêm thần kinh hiện nay hầu hết là đơn trị liệu, bị hạn chế bởi các tác dụng phụ phổ biến như chúng ta đã biết, thuốc ức chế COX{1}} có thể dẫn đến các khuyết tật về tim mạch khi đáp ứng với điều trị lâu dài và điều trị nhắm mục tiêu TNF có thể gây nhiễm trùng thông qua ức chế miễn dịch. Các phương pháp điều trị kết hợp có thể là bắt buộc để cải thiện việc điều trị các bệnh phức tạp với các ưu điểm sau: độ mạnh của mạng đối kháng và bù trừ, tăng hiệu quả lâm sàng trong khi duy trì độc tính ở mức tối thiểu ở người và giảm liều lượng của từng hợp chất63. Tuy nhiên, việc khám phá sự kết hợp thuốc hiệp đồng giữa các hợp chất có nguồn gốc từ thuốc thảo dược dựa trên hệ thống dược lý bị hạn chế bởi lý do chính có thể là có một lượng lớn hợp chất.

Trong nghiên cứu này, trước tiên chúng tôi thu được 63 hợp chất có hoạt tính sinh học tiềm năng từthảo dược Cistanche tubulosa, đáp ứng các tiêu chí (DL Lớn hơn hoặc bằng 0.18) để phân tích sâu hơn với sự hỗ trợ của dự đoán vốn không thể thiếu để sàng lọc các phân tử có triển vọng hơn với các đặc tính mong muốn. Sau khi ánh xạ 133 mục tiêu của 63 hợp chất hoạt tính sinh học tiềm năng vào cơ sở dữ liệu, chúng tôi nhận được 43 mục tiêu liên quan đến tình trạng viêm thần kinh và sau đó phân tích phân cụm GOBP của các mục tiêu dự đoán có thể góp phần điều trị tình trạng viêm thần kinh. Kết quả phân tích của mạng CT hiển thị mức độ trung bình trên mỗi hợp chất lần lượt là 11,209 và 7,651 trên mỗi mục tiêu và 38 trong số đó đã điều chỉnh hơn 7 mục tiêu (lớn hơn mức trung bình). Ví dụ, echinacoside (mol41) dự đoán với 7 mục tiêu, verascoside (mol33), với 9 mục tiêu, hoặc tableside B (mol57), với 8 mục tiêu có thể đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ thần kinh phù hợp với tài liệu ngày càng tăng.

Chúng tôi đạt được các mục tiêu điều trị trực tiếp như APP, MAPT (còn được gọi là Tau), PPARG70, MMP9, MMP2 và HTR2A (còn được gọi là 5-HT2A), GRIN2B (thụ thể ionotropic glutamate loại tiểu đơn vị NMDA 2B) và GRIA1 (tiểu đơn vị thụ thể ionotropic glutamate loại AMPA 1) hoặc các mục tiêu tiềm năng ở hạ lưu như PTGS274 hoặc NOS275 có liên quan đến chứng viêm thần kinh hoặc các bệnh khác nhau của hệ thần kinh.

Phân tích mạng lưới Đường dẫn Hợp chất-Mục tiêu hiển thị 12 hợp chất từ ​​10 cặp thuốc hàng đầu thông qua thuật toán PEA, được kết nối với 43 mục tiêu tiềm năng và các đường dẫn liên kết với tình trạng viêm thần kinh, ví dụ: đường dẫn tín hiệu Canxi, tương tác thụ thể phối tử hoạt động thần kinh hoặc Đường dẫn tín hiệu TNF, v.v. Trong hệ thống, các hợp chất được dự đoán này có thể tác động lên không chỉ các protein ở dòng ngược dòng mà còn cả các con đường xuôi dòng liên quan đến tình trạng viêm thần kinh và các dấu ấn sinh học gây viêm, đặc biệt. Hơn nữa, thông tin bổ sung để sàng lọc các phối hợp thuốc có tác dụng chống viêm tiềm tàng được cung cấp và độ tin cậy của chiến lược sàng lọc trong silico được xác minh bằng xác thực thử nghiệm. Con đường viêm thần kinh bao gồm con đường bệnh Alzheimer, con đường truyền tín hiệu Canxi, con đường truyền tín hiệu GnRH, con đường truyền tín hiệu VEGF và khớp thần kinh Serotonergic. Các kết quả phân tích đã giải thích rõ ràng cho chúng tôi rằng các mô-đun chết tế bào, viêm và bảo vệ thần kinh được minh họa để giải mã cơ chế hoạt động của tế bào.Cistanche tubulosa dùng để viêm thần kinh.

Viêm thần kinh đi kèm với các bệnh thoái hóa thần kinh khác nhau, có thể không chỉ là hậu quả mà còn là nguyên nhân gây ra bệnh lý, do đó, các liệu pháp chống viêm được đề xuất là một phương pháp điều trị đầy hứa hẹn. Thật thất vọng, mặc dù chúng tôi đã nhận ra những hạn chế của đơn trị liệu, việc đánh giá và cơ chế cơ bản của các liệu pháp kết hợp vẫn là những thách thức lớn trong việc phát triển chiến lược thay thế mới. Do đó, công việc này có thể mang lại cơ hội điều trị mới cho chứng viêm thần kinh và có thể mở ra một con đường mới để khám phá sự kết hợp thuốc từ các sản phẩm tự nhiên.

Nguyên liệu và phương pháp

Bộ sưu tập hợp chất

Tổng cộng có 66 thành phần hóa học của Cistanche tubulosa được thu thập thủ công từ TCMSP (http://lsp.nwu.edu.cn/)76, bao gồm 26 phenylethanoid glycoside, 22 iridoids, 4 lignan, 7 monoterpene glycoside, 2 chất nitơ, 3 đường benzen acryloyl, 1 sterol, 1 ketol. Cho rằngglycoside trong Cistanche tubulosathường bị thủy phân để giải phóng aglycone, sau đó được hấp thụ ở niêm mạc ruột, do đó, chúng tôi xem xét các phân tử không có glycolic và được gắn thẻ là _qt. Điều này dẫn đến việc tạo ra 103 hợp chất. Các phân tử này được cung cấp trong Bảng bổ trợ S1.

Đánh giá độ giống thuốc

Để thu được các hợp chất hoạt tính sinh học tiềm năng từ Cistanche tubulosa, chúng tôi đánh giá độ giống thuốc của các thành phần này bằng cách tính toán độ tương tự Tanimoto giữa các hợp chất thảo dược và tính chất phân tử trung bình của tất cả các hóa chất trong cơ sở dữ liệu của Drugbank. Và, mô hình dự đoán DL đã được áp dụng thành công trong nhiều nghiên cứu để lựa chọn các hợp chất có hoạt tính sinh học. Trong công việc, chỉ số DL Lớn hơn hoặc bằng 0.18 của các ứng cử viên được xác định là giá trị ngưỡng để phù hợp hơn với phân tích tiếp theo.

Dự đoán mục tiêu thuốc

Việc xác định các mục tiêu hiệu quả của các hợp chất hàng đầu vẫn là một bước quan trọng để đưa các hợp chất này vào phát triển thuốc. Ở đây, hai công cụ nội bộ: SysDT và WES được thực hiện để lấy thông tin mục tiêu phân tử cho việc vận chuyển ma túy. SysDT là một mô hình độc lập được thực hiện với sự kết hợp của thông tin hóa học, gen và dược lý dựa trên hai công cụ toán học mạnh mẽ: Rừng ngẫu nhiên (RF) và Máy vectơ hỗ trợ (SVM) để giải quyết vấn đề xác định mục tiêu một cách hiệu quả. Mô hình thu được đóng vai trò là nền tảng có giá trị để dự đoán tương tác thuốc-mục tiêu với độ chính xác tổng thể là 97,3%, độ chính xác dự đoán được kích hoạt là 87,7% và độ chính xác dự đoán bị ức chế là 99,8%. Để nắm bắt được nhiều thành phần hứa hẹn hơn, tiêu chí lọc được xác định là giá trị RF Lớn hơn hoặc bằng 0.7 hoặc SVM Lớn hơn hoặc bằng 0.8 trong nghiên cứu này.

Tương tự tổng thể có trọng số (WES) là một mô hình tính toán mạnh mẽ mới để xác định mục tiêu trực tiếp của thuốc đối với các thành phần hoạt tính sinh học thực tế. Là một công cụ mới, mô hình thu được hoạt động tốt trong việc dự đoán liên kết với độ nhạy trung bình là 85% (SEN) và các mẫu không liên kết với 71% (SPE) với diện tích trung bình dưới đường cong vận hành máy thu (ROC, AUC) là 85,2% và độ phù hợp trung bình là 77,5%. Các mục tiêu thu được sẽ được ánh xạ thêm tới Uniprot để bình thường hóa tên và tổ chức của chúng sau đó. Ở đây, chúng tôi chỉ chọn mục tiêu là Homo sapiens để phân tích sâu hơn. Các mục tiêu ứng viên của các hợp chất đã chọn được ánh xạ tới cơ sở dữ liệu CTD để tìm ra các bệnh liên quan và cuối cùng chúng tôi sàng lọc các mục tiêu tiềm năng liên quan đến viêm thần kinh.

Làm giàu và phân tích GO cho các mục tiêu

Để thăm dò các quá trình sinh học liên quan của các mục tiêu thu được, chúng tôi ánh xạ các mục tiêu tới DAVID và các thuật ngữ có giá trị P nhỏ hơn 0.05 được chọn trong phần này.

Phân tích kết hợp thuốc

Trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi, khung dược lý hệ thống đã được khai thác để dự đoán sự kết hợp thuốc trên một mô hình được thiết kế mới, được gọi là Phương pháp tiếp cận tập hợp xác suất (PEA) để phân tích hiệu quả lâm sàng và tác dụng phụ của sự kết hợp thuốc. Cụ thể, mạng Bayesian tích hợp với thuật toán tương tự đã được phát triển để mô hình hóa sự kết hợp từ các tác dụng dược lý và phân tử hợp chất. Sau đó, đánh giá tổng hợp bao gồm hiệu quả lâm sàng và tác dụng phụ đối với các cặp dự đoán đã được trình bày. Tóm lại, nó cho thấy PEA có thể dự đoán hiệu quả của các cặp có độ đặc hiệu và độ nhạy cao (AUC=0.90) trong công việc của chúng tôi. Trong công việc này, chúng tôi chọn ra mười sự kết hợp thuốc hàng đầu dựa trên xác suất tác dụng hiệp lực của chúng, thể hiện khả năng tạo ra tác dụng hiệp lực giữa hai hợp chất.

Xây dựng và phân tích mạng/đường dẫn

Để nghiên cứu mối quan hệ giữa các thành phần hoạt động và các bệnh viêm nhiễm, mạng mục tiêu hỗn hợp (CT) và mạng đường dẫn mục tiêu hỗn hợp (CTP) được tạo ra bởi Cytoscape 2.8.1, một gói tin sinh học phổ biến để trực quan hóa mạng sinh học và tích hợp dữ liệu. Các thuộc tính định lượng của mạng được phân tích bằng hai plugin sau Network Phân tích và CentiScaPe 1.2. Trong mạng đồ họa, các nút biểu thị hợp chất, mục tiêu hoặc con đường trong khi các cạnh mã hóa tương tác thuốc-đích. Để khám phá thêm các tác động sinh học về cách thức hoạt động của các mục tiêu tế bào thông qua việc điều chỉnh nhiều con đường trao đổi chất, một "con đường" kết hợp được tập hợp bởi thông tin cập nhật về bệnh lý viêm thần kinh. Đầu tiên, bằng cách ánh xạ chúng vào cơ sở dữ liệu KEGG, các cấu hình mục tiêu đạt được sẽ được tổng hợp thành nhiều lộ trình. Sau đó, sau khi bỏ qua các phần gián tiếp, một lộ trình tương đối tổng hợp sẽ được tích hợp thủ công dựa trên dữ liệu bệnh lý và lâm sàng.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ ĐIỀU TRỊ BỆNH PARKINSON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Xác thực thử nghiệm

Chuẩn bị mẫu

Echinacoside, verascoside, isoacteoside và 2′-acetylacteosideđược mua từ Công ty TNHH Công nghệ sinh học Nam Kinh Zelang (Nam Kinh, Giang Tô, Trung Quốc). Các mẫu thử nghiệm được hòa tan trong dimethyl sulfoxide (DMSO) (Sigma, Hoa Kỳ) để thu được 100 mM, dưới dạng dung dịch gốc và sau đó được bảo quản ở 4 độ . Độ pha loãng cuối cùng của DMSO được thêm vào môi trường nuôi cấy không bao giờ vượt quá 0,1%, đảm bảo không ảnh hưởng đến khả năng sống của tế bào.

Nuôi cấy tế bào

Tế bào microglia chuột BV2 ban đầu được phát triển bởi ngân hàng tế bào Thượng Hải của Viện Khoa học Trung Quốc và được nuôi cấy trong các nhiệm vụ 25 hoặc 75 cm2 với môi trường Eagle sửa đổi của Dulbecco (DMEM/25mM HEPES) (Gibco BRL, Hoa Kỳ) được bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò (FBS) (Gibco BRL, USA), penicillin G (100 đơn vị/mL) và streptomycin (100 mg/mL) trong tủ ấm tạo ẩm với 5% CO2/95% O2 ở 37 độ.

Xét nghiệm khả năng sống của tế bào

Các tế bào microglia BV2 được gieo vào một đĩa giếng 96-với mật độ 1×105 tế bào/ml, sau khi ủ trong 18 giờ, các tế bào được xử lý với 100 ul môi trường tươi có hoặc không có nồng độ mẫu thử nghiệm được chỉ định khác nhau cho thêm 24h nữa. Xét nghiệm CCK-8 (BestBio, Thượng Hải, Trung Quốc) là một phương pháp thuận tiện, đáng tin cậy để xác định khả năng tồn tại của tế bào. Để loại bỏ nền của các mẫu thử nghiệm, chúng tôi loại bỏ toàn bộ môi trường nuôi cấy, sau đó thêm 100 ul/giếng môi trường tươi chứa dung dịch 10% CCK{10}} vào. Các giá trị OD ở bước sóng 450 nm được đọc trên máy đọc vi đĩa (Molecular Devices, California, USA) sau 3 giờ ủ ở 37 độ và 5% CO2.

Phân tích Western Blot

Protein tế bào được chiết xuất từ ​​​​các dòng tế bào bằng cách sử dụng Bộ chuẩn bị protein động vật có vú Qproteome™ (Qiagen, Đức) sau các quy trình được chỉ định theo giao thức của nhà sản xuất. Quick Stari Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad, USA) được ứng dụng để định lượng protein. Lượng protein tương đương (50ug) bị biến tính bằng cách đun sôi ở 100 độ trong 10 phút với dung dịch đệm nạp mẫu 2*laemmli (Bio-Rad, Hoa Kỳ) cộng với 5% -mercaptoetanol theo tỷ lệ 1:1 và được tải trên mỗi làn lên 12% SDS-PAGE (natri dodecyl sulfate polyacrylamide minigel), được truyền điện trên màng polyvinylidene fuoride 0, 45 μm (PDVF) (Millipore, Bedford, MA, USA) trong 150 phút ở 200 mA. Sau đó, các màng này được chặn trong albumin huyết thanh bò (BSA) 3% ở nhiệt độ phòng và được ủ với các kháng thể chính iNOS và COX-2 (Abcam) ở 4 độ qua đêm. Sau ba lần rửa kỹ trong Tris-buffered Saline-Tween (TBST) mỗi lần trong 5 phút, các màng được thử nghiệm với kháng thể thứ cấp liên hợp peroxidase (HRP) cải ngựa (pha loãng 1: 10000; Abcam) trong 1,5 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó, các dải phản ứng miễn dịch được hiển thị bằng cách sử dụng bộ phát hiện phát quang hóa ECL (Phòng thí nghiệm Bio-Rad, Richmond, California, Hoa Kỳ) sau khi rửa hai lần trong TBST và một lần trong TBS, mỗi lần trong 5 phút. Các giá trị mật độ được chuẩn hóa bằng cách sử dụng -actin làm chất kiểm soát nội bộ.

Phân tích thống kê

Dữ liệu được trình bày dưới dạng phương tiện ± sai số chuẩn và phân tích Western blot được lặp lại trong ba thí nghiệm độc lập có cùng kết quả. Phân tích phương sai một chiều được sử dụng để so sánh sự khác biệt về giá trị trung bình của ba nhóm trở lên, ý nghĩa thống kê được phân tích bằng bài kiểm tra t của Học sinh giữa hai nhóm.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ ĐIỀU TRỊ BỆNH PARKINSON VÀ BỆNH ALZHEIMER PHGS75% ECH 30% ACT 12%