Đánh giá in vitro các chủng Probiotic hoạt động mạnh nhất có khả năng cải thiện chức năng hàng rào đường ruột và ngăn ngừa các bệnh viêm nhiễm của hệ thống tiêu hóaⅡ
Nov 29, 2023
2. Vật liệu và phương pháp
2.1. Nuôi cấy tế bào
Tế bào ung thư biểu mô tuyến đại tràng Caco{{0}} ở người da trắng (ATCC® HTB-37™) và tế bào HT tiết chất nhầy biểu mô đại tràng người29-MTX (Sigma Aldrich) lần đầu tiên được nuôi cấy riêng biệt, cả hai đều sử dụng Môi trường DMEM (Gibco) được bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò (Gibco), penicillin 100 IU/mL, streptomycin 100 mg/mL (Gibco) và 2 mM glutamine (Gibco), ở 37 ◦C trong môi trường 5% CO2. Sau đó, các môi trường đồng nuôi cấy được thiết lập trong các tấm 12-wellTranswell® (có chèn polycarbonate 12 mm và các lỗ 0,4 µm) bằng cách mạ các tế bào trong ngăn cơ bản theo tỷ lệ 75:25 Caco-2:HT 29-MTX và được thực hiện trong 21 ngày, thay đổi phương tiện 2 ngày một lần.
Click để giảm táo bón nhanh chóng
2.2. Chủng vi khuẩn
Các chủng Lactobacillus, bao gồm Limosilactobacillus fermentum phân lập từ sữa trâu [32], Levilactobacillus brevis SP-48, Lacticaseibacillus rhamnosus IMC501, Limosilactobacillus reuteri LR92 và Lacticaseibacillus paracasei IMC502 do trưởng dự án Incube, R&D—IBSA Farmaceutici Italia, cung cấp, được nuôi cấy trong quá trình lên men lò phản ứng sinh học và đông khô để thu được bột dùng làm nguyên liệu ban đầu. Trước thí nghiệm, bột được tạo huyền phù lại và phát triển trong môi trường Man, Rogosa và Sharpe (MRS-Oxoid) ở 37 ◦C trong điều kiện vi hiếu khí trong 24 giờ.
2.3. Điều trị tế bào
Các tế bào đồng nuôi cấy được xử lý bằng các chủng Lactobacillus spp khác nhau. (108 CFU/mL) với bội số nhiễm trùng (MOI) là 100, riêng lẻ hoặc kết hợp với 20 µg/mL oflipopolysaccharide (LPS) của S. Typhimurium, trong 24 giờ ở 37 ◦C ở 5% CO2 trong DMEM không có kháng sinh.
2.4. PCR thời gian thực
Để đánh giá biểu hiện của các cytokine kháng viêm và kháng viêm, HBD-2 và TJ, các tế bào ở cuối quá trình điều trị được rửa ba lần bằng PBS vô trùng và RNA tổng số được chiết xuất bằng Bộ cách ly RNA có độ tinh khiết cao ( Roche Diagnostics). Tổng cộng có 2{{20}}0 ng RNA tế bào được phiên mã ngược (Expand Reverse Transcriptase, Roche) thành DNA bổ sung (cDNA) bằng cách sử dụng các đoạn mồi hexamer ngẫu nhiên (randomhexamers, Roche) tại 42 ◦C trong 45 phút, theo hướng dẫn của nhà sản xuất. PCR thời gian thực cho IL-6, IL-8, TNF- , IL-1 , TGF- , HBD-2, Occludin, Zonulin-1 và Claudin{{ 14}}được thực hiện với bộ LC Fast Start DNA Master SYBR Green (Roche Diagnostics) sử dụng 2 µL cDNA, tương ứng với 10 ng RNA tổng số trong thể tích cuối cùng 20 µL, 3 mMMgCl2 và 0,5 µM các mồi cảm giác và antisense ( Bảng 1). Sau khi khuếch đại, phân tích đường cong nóng chảy được thực hiện bằng cách gia nhiệt đến 95 ◦C trong 15 giây với tốc độ chuyển đổi nhiệt độ là 20 ◦C/s, làm lạnh đến 60 ◦C trong 15 giây với tốc độ chuyển đổi nhiệt độ là 20 ◦C/s, sau đó gia nhiệt mẫu ở 0,1 ◦C/s đến 95 ◦C. Sau đó, kết quả được phân tích bằng phần mềm LightCycler (Roche Diagnostics). Đường cong chuẩn của từng cặp mồi được thiết lập với các độ pha loãng nối tiếp của cDNA. Tất cả các PCR được chạy ba lần. Tính đặc hiệucủa các sản phẩm khuếch đại đã được xác minh bằng cách điện di trên gel agarose 2% và hiển thị bằng nhuộm ethidium bromide [6].
2.5. Xét nghiệm ELISA
Sự hiện diện của IL-6, IL-8, IL-1 , TNF- , TGF- , HBD-2, Zonulin-1, Occludin vàClaudin{{7 }} trong dịch ly giải tế bào của Caco-2/HT29-Các môi trường đồng nuôi cấy MTX bị nhiễm các chủng lactobacilli khác nhau có hoặc không có LPS đã được phân tích bằng xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (ELISA; Invitrogen, IL{{12 }}, IL-8, IL-1 alpha, TNF alpha và TGF beta-1 Bộ công cụ HumanELISA; Phoenix Pharmaceuticals, Inc. Defensin 2, beta (Con người)—Bộ công cụ ELISA; Công nghệ sinh học Elabscience Inc. Human Zonulin, Human OCLN(Occludin) và Human CLDN1(Claudin 1) ELISA Kit).
2.6. Xét nghiệm độ bám dính và xâm lấn
Khả năng của L. brevis, L. reuteri và L. rhamnosus làm giảm khả năng bám dính và xâm lấn của S. Typhimurium và EIEC trong các kén nuôi cấy đường ruột đã được nghiên cứu ở ba loại thí nghiệm khác nhau: (i) xét nghiệm cạnh tranh, trong đó các tế bào biểu mô ruột được ủ đồng thời với lactobacilli (108 CFU/mL) và S. Typhimuriumor EIEC (108 CFU/mL) trong 2 giờ. (ii) Thử nghiệm ức chế, trong đó các tế bào được ủ trước bằng trực khuẩn lactobacilli (108 CFU/mL) trong 2 giờ, sau đó thêm S. Typhimurium hoặc EIEC (108 CFU/mL) vào và ủ thêm 2 giờ. (iii) Xét nghiệm dịch chuyển trong đó các tế bào được ủ trước bằng S. Typhimurium hoặc EIEC (108 CFU/mL) trong 2 giờ, sau đó thêm lactobacilli (108 CFU/mL) vào và ủ tiếp trong 2 giờ. Vào cuối thời gian này, các đơn lớp bị nhiễm bệnh được rửa rộng rãi trong PBS, sau đó được lọc bằng dung dịch 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) trong PBS trong 10 phút tại phòng nhiệt độ để đếm vi khuẩn nội hóa. Các phần dịch ly giải tế bào được pha loãng theo thứ tự và cấy trên môi trường thạch Hektoen (OXOID) và ủ ở 37 ◦C qua đêm để định lượng tổng số vi khuẩn liên quan đến tế bào có khả năng sống sót (CFU/mL). Đối với các thử nghiệm về khả năng xâm lấn, sau khi ủ với vi khuẩn, các lớp đơn bị nhiễm bệnh được rửa rộng rãi bằng PBS vô trùng và được ủ thêm 2 giờ trong môi trường DMEM, được bổ sung gentamiinsulfate (250 µg ml–1) (Sigma-Aldrich) để tiêu diệt vi khuẩn ngoại bào, sau đó các tế bào được ly giải và mạ như mô tả trước đây để định lượng tổng số vi khuẩn đã xâm nhập (CFU/mL).
2.7. Phân tích thống kê
Sự khác biệt đáng kể giữa các nhóm được đánh giá thông qua ANOVA hai chiều bằng cách sử dụng GraphPad Prism 8.0 và sự so sánh giữa các giá trị trung bình được tính toán bằng phép thử t của aStudent. Dữ liệu được biểu thị dưới dạng phương tiện ± độ lệch chuẩn (SD) của ba thí nghiệm độc lập.
Thuốc thảo dược tự nhiên để giảm táo bón-Cistanche
Cistanche là một chi thực vật ký sinh thuộc họ Orobanchaceae. Những loại cây này được biết đến với đặc tính chữa bệnh và đã được sử dụng trong Y học cổ truyền Trung Quốc (TCM) trong nhiều thế kỷ. Các loài Cistanche chủ yếu được tìm thấy ở các vùng khô cằn và sa mạc ở Trung Quốc, Mông Cổ và các khu vực khác ở Trung Á. Cây Cistanche có đặc điểm là thân màu vàng, nhiều thịt và được đánh giá cao vì lợi ích sức khỏe tiềm tàng của chúng. Trong TCM, Cistanche được cho là có đặc tính bổ và thường được sử dụng để nuôi dưỡng thận, tăng cường sinh lực và hỗ trợ chức năng tình dục. Nó cũng được sử dụng để giải quyết các vấn đề liên quan đến lão hóa, mệt mỏi và sức khỏe tổng thể. Trong khi Cistanche có lịch sử sử dụng lâu dài trong y học cổ truyền, nghiên cứu khoa học về hiệu quả và độ an toàn của nó vẫn đang được tiến hành và còn hạn chế. Tuy nhiên, nó được biết là có chứa nhiều hợp chất hoạt tính sinh học khác nhau như phenylethanoid glycoside, iridoids, lignans và polysaccharides, có thể góp phần vào tác dụng chữa bệnh của nó.
Wecistanche'sbột cistanche, viên cistanche, viên nang cistanchevà các sản phẩm khác được phát triển bằng cách sử dụngsa mạcbể chứa nướclàm nguyên liệu đều có tác dụng tốt trong việc giảm táo bón. Cơ chế cụ thể như sau: Cistanche được cho là có lợi ích tiềm năng trong việc giảm táo bón dựa trên cách sử dụng truyền thống và một số hợp chất nhất định mà nó chứa. Mặc dù nghiên cứu khoa học cụ thể về tác dụng của Cistanche đối với táo bón còn hạn chế, nhưng nó được cho là có nhiều cơ chế có thể góp phần tạo nên tiềm năng giảm táo bón. Tác dụng nhuận tràng:Cistanchetừ lâu đã được sử dụng trong Y học cổ truyền Trung Quốc như một phương thuốc chữa táo bón. Nó được cho là có tác dụng nhuận tràng nhẹ, có thể giúp thúc đẩy nhu động ruột và gây táo bón. Tác dụng này có thể là do các hợp chất khác nhau được tìm thấy trong Cistanche, chẳng hạn như glycoside phenylethanoid và polysacarit. Làm ẩm đường ruột: Dựa trên cách sử dụng truyền thống, Cistanche được coi là có đặc tính giữ ẩm, đặc biệt nhắm vào đường ruột. Thúc đẩy quá trình hydrat hóa và bôi trơn ruột có thể giúp làm mềm các công cụ và tạo điều kiện cho việc đi lại dễ dàng hơn, từ đó làm giảm táo bón. Tác dụng chống viêm: Táo bón đôi khi có thể liên quan đến tình trạng viêm ở đường tiêu hóa. Cistanche chứa một số hợp chất nhất định, bao gồm phenylethanoid glycoside và lignan, được cho là có đặc tính chống viêm. Bằng cách giảm viêm trong ruột, nó có thể giúp cải thiện nhu động ruột đều đặn và giảm táo bón.
