Trong ống nghiệm ức chế tiết OCT2 và MATE1 của thận bằng thuốc chống nôn
Mar 18, 2022
Blessy George1, Xia Wen1, Edgar A. Jaimes2, Melanie S. Joy3,4,5,†và Lauren M. Aleksunes
Trừu tượng:Chất vận chuyển cation hữu cơ 2 (OCT2) và protein đẩy ra đa độc tố và độc tố 1 (MATE1) làm trung gian cho quá trình bài tiết thuốc ở thận. Các nghiên cứu gần đây cho thấy ondansetron, một loại thuốc 5- đối kháng HT3 được sử dụng để ngăn ngừa buồn nôn và nôn, có thể ức chếOCT2- và vận chuyển qua trung gian MATE 1-. Mục đích của nghiên cứu này là để kiểm tra khả năng của năm loại thuốc đối kháng HT3 5- trong việc ức chếOCT2và người vận chuyển MATE1. Sự vận chuyển của đế thăm dò OCT2 / MATE1 ASP plus được đánh giá bằng cách sử dụng hai mô hình: (1) HEK293quả thậntế bào biểu hiện quá mức của con ngườiOCT2hoặc MATE1, và (2) tế bào MDCK được truyền sang ngườiOCT2and MATE1. In HEK293 cells, the inhibition ofASP+ uptake by OCT2 listed in order of potency was palonosetron (IC50: 2.6 µM) > ondansetron >granisetron > tropisetron > dolasetron (IC50: 85.4 µM) and the inhibition of ASP+ uptake by MATE1in order of potency was ondansetron (IC50: 0.1 µM) > palonosetron = tropisetron > granisetron >dolasetron (IC5 0: 27,4 µM). Ondansetron (0. 5–20 µM) ức chế sự vận chuyển xuyên tế bào từ đáy đến đỉnh của ASP cộng thêm tới 64 phần trăm. Nồng độ cao hơn (10 và 20 µM) của palonosetron, tropisetron và dolasetron tương tự làm giảm sự vận chuyển xuyên tế bào của ASP plus. Trong các tế bào OCT 2- MATE1 MDCK được truyền nhiễm kép, ondansetron ở nồng độ 0,5 và 2,5 µM gây ra sự tích tụ đáng kể trong tế bào của ASP plus. Tổng hợp lại, những dữ liệu này cho thấy rằng 5- thuốc đối kháng HT3 có thể ức chế sự bài tiết của thuốc dạng cation ở thận bằng cách can thiệp vào chức năng OCT2 và / hoặc MATE1.
Từ khóa:OCT2; MATE1; cation; 5- Chất đối kháng HT3;quả thận; bài tiết; vận chuyển
Tiếp xúc:joanna.jia@wecistanche.com
Cistanche tubulosa ngăn cảnquả thậnbệnh, bấm vào đây để lấy mẫu
1. Giới thiệu
Sự bài tiết của thận đạt được nhờ sự phối hợp hấp thu và vận chuyển thuốc qua biểu mô ống. Đối với các loại thuốc và chất độc là cation hữu cơ, sự vận chuyển xuyên biểu mô của chúng vào dịch lọc trước tiên được thực hiện bởi chất vận chuyển cation hữu cơ 2 (OCT2) trên bề mặt cơ bản và sau đó là chất vận chuyển đa lượng và đùn độc tố 1 (MATE1) trên đường viền bàn chải màng. Trước khi phát hiện ra các gen OCT2 / SLC22A1 và MATE1 / SLC47A1, người ta đã hiểu rõ rằng việc tiết các cation hữu cơ có thể bị ức chế về mặt dược lý [1]. Sử dụng nhiều phương pháp thực nghiệm trên các loài tiền lâm sàng khác nhau, người ta đã chứng minh rằng các cation hữu cơ trải qua quá trình vận chuyển tích cực và bài tiết qua thận [2–4]. Kể từ những quan sát ban đầu này, nghiên cứu đã tiến bộ để hiểu không chỉ cơ chế phân tử của sự bài tiết cation hữu cơ mà còn cả khả năng tương tác thuốc liên quan đến lâm sàng sau sự gián đoạn của OCT2 và MATE1 (được xem xét trong [5]).
Các chất đối kháng thụ thể serotonin 5- HT3 đã nổi lên như một loại thuốc quan trọng để kiểm soát chứng buồn nôn và nôn. Serotonin được giải phóng bởi các tế bào ruột non của ruột non. 5- Thuốc đối kháng HT3 ức chế kênh ion do phối tử tạo mạch trên dây thần kinh hướng tâm từ phế vị và ngăn phản xạ nôn [6]. Ondansetron là chất đối kháng HT3 5- đầu tiên được phê duyệt để ngăn ngừa buồn nôn và nôn do hóa trị liệu [7,8]. Kể từ thời điểm đó, các loại thuốc bổ sung trong nhóm này (bao gồm tropisetron, granisetron, dolasetron và palonosetron) đã được phát triển [9]. Mặc dù chỉ định điều trị chính của 5- chất đối kháng HT3 là ngăn ngừa nôn do hóa trị và bức xạ, chúng cũng được chấp thuận để kiểm soát chứng buồn nôn và nôn sau phẫu thuật và được sử dụng ngoài nhãn hiệu để điều trị chứng ốm nghén, chứng nôn mửa gravidarum , mê sảng sau phẫu thuật, và ngứa [10–14].
Với bản chất cation của 5- chất đối kháng HT3 (Hình 1), chúng đã nổi lên như chất nền và chất ức chế các chất vận chuyển OCT và MATE. Các nghiên cứu in vitro cho thấy ondansetron và tropisetron là chất nền và chất ức chế OCT1 và OCT2 [15–20]. Hơn nữa, các cá thể có các biến thể mất chức năng trong gen OCT1 / SLC22A1 đã được chứng minh là đã thay đổi dược động học của tropisetron và cải thiện khả năng lâm sàng [16]. Tương tự như vậy, ondansetron có thể ức chế chất vận chuyển MATE, dẫn đến sự tích tụ ở thận của thuốc trị đái tháo đường metformin, cũng như tăng độc tính trên thận của thuốc chống ung thư cisplatin [19]. Ở người, ondansetron làm giảm độ thanh thải metformin ở thận, có lẽ là do ức chế MATE1 ef fl ux [21]. Cùng với nhau, những dữ liệu này chỉ ra tiềm năng đối với 5- chất đối kháng HT3 để ức chế sự bài tiết qua biểu mô của thuốc qua OCT2 và MATE1. Do đó, chúng tôi đã tìm cách so sánh một cách có hệ thống các chất đối kháng HT3 về 5- khả năng ức chế sự vận chuyển qua trung gian OCT2 và MATE 1- của con người đối với chất nền cation của mẫu dò bằng cách sử dụng truyền nhiễm đơn và képquả thậntế bào. Lưu ý, nghiên cứu hiện tại chủ yếu tập trung vào MATE1, vì mức độ protein MATE 2- K trong cơ thể ngườiquả thậnvỏ não trước đây đã được chứng minh là nằm dưới giới hạn dưới của định lượng bằng phương pháp khối phổ [22].
2. Kết quả
2.1. Đặc tính của ASP plus như một chất nền huỳnh quang trong các tế bào HEK293 Biểu hiện quá mức OCT2 và MATE1
Các nghiên cứu ban đầu mô tả sự hấp thụ ASP plus vào các tế bào biểu hiện quá mức một vectơ trống (EV), OCT2 hoặc MATE1 (Hình 2). ASP cộng với sự hấp thu phụ thuộc vào thời gian hiển thị (Hình 2A) và phụ thuộc vào nồng độ (Hình 2B) trong cả tế bào biểu hiện OCT 2- và MATE 1- và động học bão hòa thể hiện (OCT2: Vmax 8,1 nmol / mg / phút , Km 2,9 uM, R 2 0. 95; MATE1: Vmax 3,4 nmol / mg / phút, Km 8,2 uM, R 2 0. 96). Tế bào EV thể hiện sự tích tụ tối thiểu của ASP plus (Vmax 1,9 nmol / mg / phút, Km 37,3 uM, R 2 0. 92). Dựa trên các liên kết này, hấp thu ASP cộng với lượng tử hóa sau 1 phút (phạm vi tuyến tính đối với vận chuyển OCT2 và MATE1) ở nồng độ 10 uM, cung cấp độ nhạy phù hợp để phát hiện huỳnh quang và sàng lọc 5- chất đối kháng HT3 làm chất ức chế.
Để đảm bảo các điều kiện này tái tạo được sự vận chuyển tích cực của từng chất vận chuyển, các giá trị IC5 {{1 0}} của cimetidine, một chất ức chế OCT2 và MATE1 đã được thiết lập tốt, đã được xác định (Hình 3 và Bảng 1). IC5 0 đối với cimetidine là 24,5 土 4,0 uM trong tế bào biểu hiện OCT 2- và 0,23 土 0,2 uM trong tế bào biểu hiện MATE 1-, phù hợp với dữ liệu đã xuất bản cho thấy sự ức chế MATE1 ở nồng độ thấp hơn [18,20]. Cimetidine không có tác dụng trên ASP cộng với sự hấp thu trong tế bào EV.
2.2. Ức chế sự vận chuyển qua trung gian OCT 2- và MATE 1- bằng thuốc chống nôn trong tế bào HEK293
Năm chất đối kháng 5- HT3 khác nhau (ondansetron, palonosetron, granisetron, tropisetron và dolasetron) đã được đánh giá về khả năng ức chế vận chuyển OCT2 và MATE1 trong tế bào HEK293 bằng cách sử dụng ASP cộng làm chất nền (Hình 3). Sự giảm ASP phụ thuộc vào nồng độ cộng với sự hấp thu đã được quan sát thấy ở các tế bào biểu hiện OCT 2- và MATE 1- khi có mặt tất cả các chất đối kháng HT3 được thử nghiệm trên một loạt các nồng độ. Giá trị IC50 đối với sự ức chế ASP cộng với sự tích tụ của 5- chất đối kháng HT3 sử dụng các khoảng nồng độ đã thử nghiệm được trình bày trong Bảng 1. Ngoại trừ granisetron, 5- chất đối kháng HT3 khác ức chế MATE1 mạnh hơn chúng OCT2. Vận chuyển qua trung gian OCT 2- bị ức chế đến ~ 90 phần trăm trong khi vận chuyển qua trung gian MATE 1- bị ức chế đến ~ 70 phần trăm ở các nồng độ được thử nghiệm.
Nói chung, sự hấp thu ASP của các tế bào EV không bị thay đổi ở mức độ lớn bởi các chất đối kháng 5- HT3. Tuy nhiên, lưu ý rằng palonosetron và tropisetron kích thích sự hấp thu bổ sung của ASP cộng với sự hấp thu trong tế bào EV và nồng độ granisetron cao nhất gây ra sự giảm nhỏ trong tích lũy ASP cộng với.
2.3. Đặc điểm của quá trình vận chuyển xuyên tế bào và tích lũy nội bào của ASP cộng trong OCT2 / MATE 1- Biểu hiện tế bào MDCK
Để khảo sát sự đóng góp kết hợp của OCT2 và MATE1 trong sự bài tiết xuyên biểu mô, các thí nghiệm tiếp theo được thực hiện trên các tế bào MDCK phân cực với bề mặt đáy (OCT2) và đỉnh (MATE1). Sự biểu hiện của protein OCT2 và MATE1 được xác định trong các tế bào MDCK được chuyển nạp kép bằng phương pháp Western blotting (Hình 4A). Sự vận chuyển xuyên tế bào của chất nền đầu dò cation ASP plus (25 uM) đã được thử nghiệm trong các tế bào này bằng cách sử dụng chèn Transwell. Sự vận chuyển từ bên đến đỉnh (B-to-A) của ASP plus lớn hơn nhiều (lên đến 2. 8- lần ở 120 phút) so với vận chuyển từ đỉnh đến ba bên (A-to-B) trong các tế bào được truyền kép OCT2 / MATE1 (Hình 4B). Tỷ lệ B-to-A / A-to-B ef fl ux ở 120 phút được ước tính là 2,7 đối với các tế bào OCT2 / MATE1 hỗ trợ bài tiết tích cực của ASP plus. Ngược lại, các tế bào kiểm soát thể hiện ASP cộng với vận chuyển theo cả hai hướng thấp hơn nhiều so với các tế bào OCT2 / MATE1. Vận chuyển B-to-A của ASP plus chỉ cao hơn đáng kể so với vận chuyển A-đến-B trong các ô điều khiển ở 90 (1. 3- lần) và 120 phút (1. 7- lần ). Tất cả các thử nghiệm ức chế tiếp theo được thực hiện theo hướng B-to-A.
Khả năng của hóa chất ức chế ASP cộng với fl ux và tích tụ trong các tế bào nhiễm đôi OCT2 / MATE1 ở các điều kiện thử nghiệm cụ thể được đánh giá bằng cách sử dụng ba chất ức chế đối chứng dương tính (cimetidine 5 và 50 uM, pyrimethamine 1 uM, và olanzapine 20 uM) (Hình 4C). Cimetidine là một chất ức chế OCT2 và MATE1 đã biết, có hiệu lực lớn hơn đối với MATE1 (Bảng 1) [18]. Pyrimethamine là một chất ức chế MATE1 cụ thể [23], trong khi olanzapine được tìm thấy để ức chế OCT2 mạnh hơn (Hình bổ sung S1) [18,20]. Cả ba hóa chất đều ức chế sự chuyển dịch tế bào của ASP plus (18 phần trăm cimetidine 5 uM, 40 phần trăm cimetidine 50 uM, 36 phần trăm pyrimethamine 1 uM và 28 phần trăm olanzapine 20 uM ở 120 phút).
Sự tích tụ của ASP cộng với nội bào cũng được định lượng hóa trong dịch ly giải ở 120 phút. Cimetidine và pyrimethamine làm tăng sự tích tụ nội bào của ASP cộng thêm 1. 8- lần và 1. 3- lần (do ức chế chủ yếu MATE1), trong khi olanzapine làm giảm sự tích tụ nội bào của ASP cộng thêm 51 phần trăm (do sự ức chế của OCT2). Trong các ô đối chứng, không có sự ức chế đáng kể nào đối với sự vận chuyển B-to-A của ASP plus được quan sát thấy tại bất kỳ thời điểm nào. Trong các tế bào đối chứng, cũng không có thay đổi đáng kể nào về sự tích tụ nội bào của ASP plus so với các tế bào điều khiển phương tiện, ngoại trừ sự giảm nhẹ ASP cộng với sự tích tụ khi có olanzapine 20 uM.
2.4. Ức chế sự vận chuyển xuyên tế bào của ASP cộng với 5- Chất đối kháng HT3 trong OCT2 / MATE 1- Biểu hiện tế bào MDCK
Năm 5- chất đối kháng HT3 (ondansetron, palonosetron, granisetron, tropisetron và dolasetron) đã được đánh giá về khả năng ảnh hưởng đến sự vận chuyển xuyên tế bào và sự tích tụ nội bào của ASP plus trong các tế bào truyền kép OCT2 / MATE1 (Hình 5 và 6). Cimetidine (50 uM) được đưa vào mỗi thử nghiệm trong một bộ Transwells song song như một đối chứng tích cực. Điều thú vị là tất cả 5- chất đối kháng HT3 đều thể hiện mức độ ức chế khác nhau đối với sự vận chuyển B-to-A xuyên tế bào của ASP plus (Hình 5). So với các tế bào được xử lý bằng phương tiện, ondansetron ức chế sự vận chuyển B-to-A của ASP cộng theo cách phụ thuộc vào nồng độ, với 36% ức chế ở 120 phút ở nồng độ cao nhất được thử nghiệm (20 uM). Palonosetron và tropisetron cũng cho thấy sự ức chế phụ thuộc vào nồng độ của ASP cộng với sự tiết ASP, có thể đáng kể ở 10 và 20 uM cho mọi thời điểm. Sự ức chế tiết ASP cộng với palonosetron và tropisetron ở 20 uM. Dolasetron ở 10 và 20 uM chỉ ức chế vận chuyển ASP cộng với 120 phút. Cuối cùng, granisetron không làm thay đổi quá trình vận chuyển B-to-A của ASP cộng với bất kỳ nồng độ nào được thử nghiệm. Các tế bào kiểm soát cho thấy không có sự ức chế đáng kể nào trong việc vận chuyển B-to-A của ASP cộng với bất kỳ chất đối kháng HT3 5- nào (dữ liệu không được hiển thị).
2.5. ASP cộng với tích lũy nội bào trong OCT2 / MATE 1- Biểu hiện sau các tế bào MDCK
Điều trị bằng 5- Thuốc đối kháng HT3
Nồng độ thấp (0. 5 và 2,5 uM) của ondansetron dẫn đến tăng 1. {5}} ASP nội bào cộng với sự tích tụ trong các tế bào biểu hiện OCT2 / MATE 1-, trong khi không có sự khác biệt so với xe ở nồng độ cao hơn (10 và 20 uM) (Hình 6). Tuy nhiên, trong các tế bào đối chứng, đã có sự giảm (40%) trong sự tích tụ của ASP cộng với nồng độ ondansetron cao. Trong các tế bào OCT2 / MATE1, tropisetron và granisetron làm tăng ASP cộng với sự tích tụ (tương ứng là 1,5 và 1. 3- lần) ở nồng độ cao nhất (20 uM). Không có thay đổi đáng kể nào trong ASP cộng với sự tích tụ được quan sát thấy với palonosetron hoặc dolasetron.
3. Thảo luận
OCT2 và MATE1 là những chất vận chuyển chính điều phối quá trình bài tiết cation hữu cơ của thận. Chúng chia sẻ một số cơ chất chồng lên nhau bao gồm metformin, cisplatin, lamivudine và entecavir, cũng như chọn lọc 5- thuốc đối kháng HT3 [15–2 0, 24]. Các nghiên cứu trước đây đã gợi ý rằng 5- chất đối kháng HT3 cũng có thể ức chế sự vận chuyển của OCT2 và MATE1. Đáng chú ý nhất, ondansetron đã được chứng minh là làm giảm sự vận chuyển của cisplatin và metformin bởi MATE1 [19]. Nghiên cứu hiện tại nhằm mục đích mở rộng nghiên cứu trước đây để so sánh 5- các chất đối kháng HT3 về khả năng ức chế OCT2 và MATE1 riêng lẻ khi biểu hiện quá mức trong các tế bào HEK293 và khi cùng biểu hiện trong các tế bào MDCK và phát triển trên các miếng chèn Transwell. Ondansetron và palonosetron có thể ức chế sự hấp thu hóa chất cation của đầu dò, ASP plus, vào các tế bào HEK293 biểu hiện OCT2 hoặc MATE1, đáng chú ý nhất là ở nồng độ thấp đến 0. 1 - 0. 5 uM . Tương tự, granisetron, tropisetron và dolasetron cũng có thể ức chế từng chất vận chuyển (tuy nhiên, ở nồng độ cao hơn). Sử dụng các tế bào MDCK thể truyền kép OCT2 / MATE1, ondansetron ức chế sự bài tiết ASP từ đáy đến đỉnh ở tất cả các nồng độ được thử nghiệm (0,5–20 uM), chỉ quan sát được ở nồng độ cao hơn đối với palonosetron, tropisetron và dolasetron. Những dữ liệu này thu được bằng cách sử dụng chất nền huỳnh quang cho đầu dò, cho thấy khả năng xảy ra tương tác thuốc qua trung gian OCT 2- và MATE 1- với 5- chất đối kháng HT3.
Dữ liệu được tạo ra trong các ô được truyền kép OCT2 / MATE1 phần lớn đồng ý với dữ liệu HEK293, ngoại trừ granisetron. Ondansetron, palonosetron và tropisetron thể hiện sự ức chế phụ thuộc nồng độ đối với sự vận chuyển B-to-A của ASP cộng với thứ tự các hiệu lực được quan sát thấy với sự ức chế MATE1 được thấy trong các tế bào HEK293. Đáng ngạc nhiên là granisetron không thể hiện bất kỳ sự ức chế đáng kể nào trong các tế bào MDCK OCT2 / MATE1, ngay cả ở nồng độ cao hơn nồng độ IC50 được quan sát thấy trong các tế bào HEK293 biểu hiện OCT2 hoặc MATE1. Bởi vì các tế bào MDCK giống với các tế bào hình ống tự nhiên ở mức độ lớn hơn so với các tế bào HEK293, nên có khả năng sự sắp xếp của granisetron bị thay đổi do sự biểu hiện của các orthologs vận chuyển nội sinh của OCT2 hoặc MATE1, hoặc các chất vận chuyển tiềm năng khác. Ví dụ, các tế bào MDCK biểu hiện cao chất vận chuyển P-glycoprotein ở chó [25], có thể dẫn đến granisetron ef fl ux. Hỗ trợ cho suy đoán này là thực tế là đa hình nucleotide đơn trong chất vận chuyển MDR1 / ABCB1 ở người đã cải thiện khả năng lâm sàng của granisetron để điều trị nôn [26]. Những dữ liệu này gợi ý rằng granisetron có thể là chất nền cho P-glycoprotein của chó, gây ra sự thay đổi nồng độ nội bào khi tiếp xúc với chất vận chuyển MATE1.
Mặc dù có nhiều sự chồng chéo giữa chất nền và chất ức chế của chất vận chuyển OCT và MATE, nhưng vẫn tồn tại sự khác biệt. Tương tác thuốc-thuốc dựa trên chất vận chuyển thường có thể phụ thuộc vào danh tính của chất nền nạn nhân được đánh giá, như đã được chứng minh đối với OCT2 [27–29]. Đối với OCT2, việc lựa chọn cơ chất cation có cả tác động định lượng và định tính đến mức độ và kiểu ức chế [27,28]. Ngược lại, hằng số Michaelis biểu kiến của chất nền được vận chuyển và giá trị IC50 đối với sự ức chế MATE1 trên bốn chất nền khác nhau là tương tự nhau [30]. Những dữ liệu này sẽ gợi ý rằng có một vị trí liên kết được chia sẻ cho sự tương tác của chất nền và chất ức chế trên bề mặt bên ngoài của hMATE1. Do đó, tương tác của 5- thuốc đối kháng HT3 với OCT2 và MATE1 có thể xảy ra thông qua các cơ chế khác nhau, mặc dù chúng có chung bản chất cation. Các nghiên cứu trong tương lai là cần thiết để thúc đẩy nghiên cứu hiện tại sử dụng chất nền thăm dò và đánh giá tương tác với chất nền thuốc cụ thể như cimetidine, metformin và cisplatin.
Các nhóm thuốc bổ sung ngoài 5- chất đối kháng HT3 cũng được sử dụng để ngăn ngừa buồn nôn và nôn. Trong các nghiên cứu sơ bộ, chúng tôi đã đánh giá khả năng của các loại thuốc chống nôn khác trong việc ức chế sự vận chuyển qua trung gian OCT2 và MATE 1- của ASP plus trong tế bào HEK293. Điều thú vị là olanzapine, prochlorperazine và metoclopramide ức chế hoạt động của OCT2 ở một số nồng độ (Hình S1 bổ sung). Không có loại thuốc nào trong số này ức chế hoạt động của MATE1 ở nồng độ 10 uM (dữ liệu không được hiển thị). Các thuốc chống nôn khác, bao gồm aprepitant và dexamethasone, không có tác động đến ASP cộng với sự hấp thu ở các ô OCT 2- hoặc MATE 1- biểu hiện HEK293 (dữ liệu không được hiển thị). Do đó, có thể có khả năng các thuốc chống nôn khác (olanzapine, prochlorperazine và metoclopramide) dùng chung với 5- thuốc đối kháng HT3 cũng tác động đến sự bài tiết cation ở thận, đáng chú ý nhất là thông qua khả năng ức chế hấp thu OCT2 của chúng.
Điều quan trọng là phải xem xét các mô hình in vitro tổng hợp các tính năng của vận chuyển nội sinh ở người tốt như thế nàothận. Mức protein OCT2 và MATE1 của người trước đây đã được định lượng trong các tế bào MDCK được chuyển nạp kép bởi LC-MS / MS (hOCT2 và hMATE1 lần lượt là 28,6 và 6,9 fmol / ug protein màng) [31]. Bằng cách so sánh, các nghiên cứu xác định biểu hiện protein trong vỏ thận người và màng thận người cho thấy sự khác biệt khiêm tốn hơn về biểu hiện giữa hai chất vận chuyển hoặc thậm chí còn lớn hơn biểu hiện MATE1 (OCT 2 7. 4 pmol / mg, MATE {{14 }}. 1 pmol / mg) [22] và (OCT 2 5 fmol / ug, MATE 1 10 fmol / ug) [32]. Những khác biệt này giữa các mô hình in vitro và sự biểu hiện nội sinh của con người của OCT2 và MATE1 nên được xem xét và đưa vào sự phát triển của các mô hình dược động học dựa trên sinh lý học đối với các tương tác thuốc dạng cation tiềm ẩn trong thận.
Nghiên cứu hiện tại tập trung phần lớn vào sự bài tiết của các thuốc cation ở thận. Tuy nhiên, điều quan trọng là phải nhận ra rằng gan cũng biểu hiện OCT1 và MATE1, cho phép sự thanh thải của mật đối với các hóa chất cation. Điều này rất quan trọng vì các chất đối kháng 5- HT3 khác nhau về cấu trúc, chuyển hóa, liên kết với protein và đường thanh thải. Về mặt cấu trúc, chất đối kháng thụ thể 5- HT3 chứa amin cơ bản, hệ thống vòng thơm hoặc dị thơm, và cacbonyl (hoặc cấu trúc tương tự) là đồng phẳng với vùng thơm (Hình 1) [33]. Đáng chú ý, cấu trúc của gốc amin khác nhau đối với ondansetron và bao gồm imidazole, trong khi 6- vòng thành viên được kết hợp trong 5- chất đối kháng HT3 khác. Sự liên quan của những khác biệt về cấu trúc này đối với sự tương tác với OCT2 và / hoặc MATE1 cần được nghiên cứu thêm nhưng có thể giải thích những tác động đáng kể hơn của ondansetron ở nồng độ thấp hơn. Ngoài ra, một số 5- chất đối kháng HT3 được xóa rộng rãi bởithậnnhư cha mẹ hoặc chất chuyển hóa (chẳng hạn như palonosetron và tropisetron). Nhiều chất đối kháng 5- HT3 (bao gồm ondansetron, tropisetron, palonosetron và granisetron) được chuyển hóa nhiều (48–95 phần trăm) bởi các enzym cytochrom P450 trong gan. Gần đây, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chất chuyển hóa có thể đóng một vai trò lớn hơn trong tương tác thuốc - thuốc hơn người ta vẫn nghĩ trước đây [34]. Kiểm tra thêm về sự vận chuyển OCT2 và MATE1 với các chất chuyển hóa chính của 5- chất đối kháng HT3 vượt quá 25 phần trăm mức độ phơi nhiễm toàn thân của phụ huynh được đảm bảo. Tương tự như vậy, trong nhóm hóa học, có những loại thuốc có thời gian bán hủy ngắn (< 6="" h,="" ondansetron,="" and="" tropisetron),="" moderate="" half-lives="" (8–9="" h,="" granisetron,="" and="" dolasetron),="" and="" a="" long="" half-life="" (40="" h,="" palonosetron).="" these="" factors="" should="" be="" considered="" when="" evaluating="" potential="" drug-drug="" interactions="" using="" in="" vitro="" transporter="">
Dựa trên 2 {5}} 20 Hướng dẫn của FDA về Nghiên cứu Tương tác Thuốc-Thuốc qua trung gian chuyển hóa và trao đổi chất trong ống nghiệm [35], một loại thuốc có khả năng ức chế chất vận chuyển in vivo nếu: giá trị Cmax (không liên kết) / IC50 là Lớn hơn hoặc bằng 0,1. Dựa trên các hướng dẫn này, các giá trị MATE1 Cmax / IC50 đối với ondansetron cho thấy các tương tác thuốc in vivo có thể xảy ra khi sử dụng ASP plus làm chất nền thăm dò. So sánh giá trị IC50 đối với 5- chất đối kháng HT3 khác với giá trị Cmax của chúng (phạm vi từ nano cực cao đến micromolar thấp) sẽ không gợi ý nguy cơ tương tác thuốc, ít nhất là với ASP plus làm chất nền cho nạn nhân. Tương tự như vậy, chúng tôi hiện không biết nồng độ trong tuyến thượng thận của 5- chất đối kháng HT3, điều này rất quan trọng để đánh giá các tương tác thuốc MATE1 tiềm ẩn. Có rất ít dữ liệu lâm sàng đánh giá các tương tác thuốc liên quan đến ondansetron với chất nền OCT / MATE. Ví dụ, nồng độ creatinin và metformin tăng ở người khỏe mạnh bởi ondansetron do ức chế chất vận chuyển qua thận [21,36]. Điều thú vị là ondansetron không chỉ làm giảm thanh thải metformin qua thận mà còn cải thiện các biện pháp dung nạp glucose [21]. Trong các nghiên cứu lâm sàng khác, ondansetron đã được báo cáo là làm tăng độc tính trên thận của một loại thuốc cơ chất bằng cách thay đổi khả năng bài tiết qua trung gian vận chuyển trongquả thận[37–39]. Cùng với nhau, những dữ liệu này đảm bảo điều tra thêm về các tương tác thuốc ondansetron thông qua việc ức chế các chất vận chuyển OCT và MATE.
Tóm lại, những dữ liệu in vitro này chỉ ra rằng nhiều chất đối kháng 5- HT3 có hiệu lực lớn hơn đối với sự ức chế MATE1, làm tăng khả năng tăng nồng độ thuốc cation trong ống thận. Hơn nữa, ondansetron đủ mạnh để tăng nồng độ nội bào của chất nền thăm dò, ASP cộng với nồng độ gần với Cmax có liên quan về mặt lâm sàng. Những dữ liệu này phù hợp với các nghiên cứu in vivo trước đây trên chuột nơi tăng độc tính trên thận qua trung gian cisplatin khi sử dụng đồng thời ondansetron [19]. Dựa trên các tiêu chí hiện tại để đánh giá khả năng tương tác thuốc-thuốc trên lâm sàng, 5- thuốc đối kháng HT3 khác, cũng như các thuốc chống nôn đã được thử nghiệm trong nghiên cứu của chúng tôi, có thể ít gây ra nguy cơ tương tác thuốc trên lâm sàng hơn do điều trị thấp hơn nhiều nồng độ trong huyết tương và hằng số ức chế cao hơn.
4. Vật liệu và Phương pháp
4.1. Hóa chất
4- (4- (Dimethylamino) styryl) -N-metyl pyridinium iodide (ASP plus) đã được mua từ Life Technologies (Grand Island, NY, Hoa Kỳ). Tropisetron được mua từ Abcam (Cambridge, MA, USA). Tất cả các hóa chất khác là của Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Hoa Kỳ).
4.2. Dòng tế bào và nuôi cấy tế bào
Kiểm soát Vector trống (EV) (pcDNA 5- được chuyển giao) và Flp-In thận phôi người (HEK) 293 dòng tế bào biểu hiện ổn định các chất vận chuyển MATE1 và OCT2 ở người đã được cung cấp bởi Tiến sĩ Kathy Giacomini tại Đại học California, San Francisco. Tế bào HEK293 được nuôi cấy trong môi trường Modi fi ed Eagle (DMEM) của Dulbecco có bổ sung 10% huyết thanh bò thai, 2 mM L-glutamine, 100 U / mL penicilin, 100 ug / mL streptomycin và 200 ug / mL hygromycin B. Vector (pcDNA3). 1 plus và pcDNA3.1 / Hygro (plus)) và các dòng tế bào Madin-Darby chuyển đôi OCT2 / MATE1 ở người (MDCK) được cung cấp bởi Tiến sĩ Joanne Wang tại Đại học Washington, Seattle, WA. Tế bào MDCK được duy trì trong môi trường thiết yếu tối thiểu (MEM) được bổ sung 10% huyết thanh bò thai, 500 ug / mL G418, và 200 ug / mL hygromycin B. Tất cả các dòng tế bào được nuôi cấy trong tủ ấm ẩm ở 37oC với 5% CO2.
4.3. Các xét nghiệm về sự ức chế hấp thụ và Ef fl ux trong các tế bào HEK293
Tế bào OCT 2- và MATE 1- biểu hiện quá mức HEK293 được gieo hạt trong các đĩa giếng 24- phủ poly-D-lysine trong suốt (Fisher Scienti fi c, Hanover Park, IL, Hoa Kỳ) và được nuôi trong 24 giờ cho đến khi đạt được khoảng 90%. Sau khi rửa một lần bằng dung dịch nước muối đệm Hank's Buffered (HBSS) đã được làm ấm trước, các tế bào được ủ trước trong 30 phút ở 37oC với các chất đối kháng 5- HT3 khác nhau đối với tế bào OCT2 hoặc trong dung dịch 30 mM NH4Cl trong HBSS ở pH 6,5 đối với tế bào MATE1 đối với tế bào axiti fi cation. Sự xâm nhập vào các tế bào OCT2 được bắt đầu thông qua việc tiếp xúc với 10 uM chất nền huỳnh quang ASP cộng với trực tiếp trong môi trường ủ. Sự xâm nhập vào tế bào MATE1 được bắt đầu bằng cách áp dụng HBSS ở pH 7,4 có chứa 5- chất đối kháng HT3 và 10 uM chất nền huỳnh quang ASP cộng. Sau khi ủ trong 1 phút ở 37oC trên máy lắc, sự hấp thu chất nền được dừng lại bằng cách thêm HBSS lạnh đá có chứa 500 uM cimetidine. Phương tiện được lấy ra và rửa bốn lần bằng HBSS lạnh đá. Tế bào được ly giải với 1 phần trăm Triton X -100. Sự phát huỳnh quang được phát hiện bằng cách sử dụng máy đọc Spectramax Microplate (Thiết bị phân tử, Sunnyvale, CA, Hoa Kỳ) ở các bước sóng sau (Kích thích 485 nm / Phát xạ 495 nm). Sự phát huỳnh quang nội bào được chuẩn hóa cho tổng nồng độ protein của dịch ly giải tế bào từ mỗi giếng bằng cách sử dụng xét nghiệm axit bicinchoninic (BCA) (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Các thí nghiệm được lặp lại ba lần riêng biệt, với ba đến bốn lần lặp lại trong mỗi thí nghiệm.
4.4. Nghiên cứu Transwell trong Tế bào MDCK-OCT2 / MATE1
Control and OCT2/MATE1-expressing MDCK cells were evaluated for protein expression of OCT2 and MATE1 using SDS-PAGE and western blotting with specific primary antibodies (OCT2, sc292622 1:500 and MATE1, sc133390 1:250, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), followed by an antirabbit HRP-conjugated secondary antibody (1:1000, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) and Super Signal Western Dura Extended Duration Substrate (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Detection was performed with a FluorChem imager (ProteinSimple, Santa Clara, CA, USA). Both MDCK cell lines were seeded on 0.4 um transwell inserts (VWR, Radnor, PA, USA) at a density of 2 × 105 cells/cm2. Transport experiments were performed 3 to 5 days after seeding. The integrity of MDCK monolayers was verified by measuring transepithelial electrical resistance (TEER) >150 o * cm2 sử dụng ohm kế vôn biểu mô, EVOM2 (World Precision Instruments, Sarasota, FL). Sự hình thành thích hợp của các điểm nối chặt chẽ cũng được xác minh bằng phép đo độ thấm thụ động của lucifer màu vàng theo hướng từ đáy đến đỉnh (B-to-A). Lucifer màu vàng (20 uM) được áp dụng cho khoang đáy trong 1 giờ, và môi trường được thu thập từ khoang đỉnh. Lục giác huỳnh quang màu vàng được đọc ở bước sóng kích thích là 430 nm và bước sóng phát xạ là 538 nm. Giá trị độ thấm thụ động (Papp) trung bình là 7 × 10-7 cm / s, phù hợp với các giá trị tài liệu [40].
Sau khi rửa các tế bào một lần bằng Dung dịch muối đệm Hank (HBSS) pH 7.4, các nghiên cứu vận chuyển được bắt đầu sau khi hút dịch đệm rửa từ cả khoang đỉnh và khoang đáy. Tế bào được ủ với 5- chất đối kháng HT3 trong buồng đỉnh ở HBSS pH 6. 0 và 5- chất đối kháng HT3 với ASP cộng (25 uM) trong buồng đáy ở HBSS pH 7,4 và được ủ ở 37 oC trong 120 phút. Để đo sự vận chuyển xuyên tế bào phụ thuộc vào thời gian, một lượng môi trường ủ (100 uL) từ buồng đỉnh (buồng nhận) được thu thập ở 40, 60, 90 và 120 phút và được thay thế bằng một thể tích đệm mới tương đương có chứa {{ 19}} Chất đối kháng HT3 hoặc hóa chất đối chứng tích cực ở nồng độ ban đầu. Sau 120 phút, môi trường xử lý được loại bỏ và Transwells được rửa ba lần bằng HBSS lạnh đá. Tế bào được ly giải với 1 phần trăm Triton X -100. Sự phát huỳnh quang được phát hiện bằng cách sử dụng Spectramax Microplate Reader ở các bước sóng sau (Kích thích 485 nm / Phát xạ 495 nm). Sự phát huỳnh quang nội bào được bình thường hóa thành tổng nồng độ protein của dịch ly giải tế bào từ mỗi dịch chuyển bằng cách sử dụng xét nghiệm BCA. Các thử nghiệm được thực hiện trong ba phụ trang Transwell riêng lẻ.
4.5. Phân tích thống kê
GraphPad Prism v6 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) được sử dụng để phân tích thống kê. Km và Vmax được tính toán bằng cách sử dụng hồi quy phi tuyến (phương trình động học enzyme Michaelis – Menten, (Y=Vmax × X / (Km cộng với X), phù hợp với bình phương nhỏ nhất). Dữ liệu với hai biến được phân tích bằng cách sử dụng hai cách ANOVA theo sau bởi ANOVA một chiều và / hoặc kiểm tra posthoc của Dunnett để so sánh nhiều lần. Các giá trị IC5 0 được tính toán thông qua hồi quy phi tuyến tính thành fi t bình phương nhỏ nhất. Sự khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê ở p <>
Nguyên liệu bổ sung:Thông tin sau có sẵn trực tuyến tại https://www.mdpi.com/article/10 .3390 / ijms22126439 / s1.
Sự đóng góp của tác giả:Khái niệm hóa, BG, MSJ, LMA; phương pháp luận, BG, XW; phân tích chính thức, BG, LMA; tài nguyên, LMA; viết — chuẩn bị bản thảo ban đầu, BG, LMA; viết— đánh giá và chỉnh sửa, MSJ, LMA; quản trị dự án, LMA; mua lại tài trợ, MSJ, EAJ, LMA Tất cả các tác giả đã đọc và đồng ý với phiên bản xuất bản của bản thảo.
Kinh phí:Nghiên cứu này được tài trợ bởi Viện Khoa học Y tế Tổng quát Quốc gia (Grant GM123330) và Viện Khoa học Sức khỏe Môi trường Quốc gia (tài trợ ES005022, ES007148), Viện Ung thư Quốc gia (Grants CA072720, CA046934, CA008748), và Viện Quốc gia về Bệnh tiểu đường và Các bệnh về Tiêu hóa và Thận (Grant DK093903), các thành phần của Viện Y tế Quốc gia.
Tuyên bố của Ban Đánh giá Thể chế: Không áp dụng.
Tuyên bố đồng ý được thông báo:Không áp dụng.
Tuyên bố về tính sẵn có của dữ liệu:Không áp dụng.
Sự nhìn nhận:Chúng tôi đánh giá rất cao các dòng tế bào vận chuyển HEK293 hào phóng từ Kathy Giacomini và các dòng tế bào MDCK được chuyển giao từ Joanne Wang.
Xung đột lợi ích:Các tác giả tuyên bố không có xung đột lợi ích.
Người giới thiệu
1. Acara, M.; Rennick, B. Ảnh hưởng hai pha của các cation hữu cơ đối với sự bài tiết của các cation hữu cơ khác. J. Pharmacol. Hết hạn. Họ. Năm 1976, 199, 32–40. [PubMed]
2. Holohan, PD; Ross, CR Các cơ chế vận chuyển cation hữu cơ trong túi màng sinh chất ở thận: 1. Nghiên cứu phản vận chuyển. J. Pharmacol. Hết hạn. Họ. 1980, 215, 191–197.
3. Kinsella, JL; Holohan, PD; Pessah, NI; Ross, CR Vận chuyển các ion hữu cơ trong túi thận và màng trước thận. J. Pharmacol. Hết hạn. Họ. Năm 1979, 209, 443–450.
4. Wold, JS; Miller, BL Ức chế ef fl ux của các ion hữu cơ từ các lát cắt vỏ thận. Experientia 1978, 34, 630–631. [CrossRef] [PubMed]
5. Gessner, A.; König, J. .; Fromm, MF Các khía cạnh lâm sàng của Tương tác Thuốc-Thuốc qua trung gian vận chuyển. Clin. Pharmacol. Họ. 2019, 105, 1386–1394. [CrossRef]
6. Smith, HS; Cox, LR; Smith, EJ 5- Thuốc đối kháng thụ thể HT3 để điều trị buồn nôn / nôn. Ann. Palliat. Med. 2012, 1, 115–120. [CrossRef] [PubMed]
7. Costall, B.; Gunning, SJ; Naylor, RJ; Tyers, MB Tác dụng của GR38032F, chất đối kháng thụ thể 5- HT 3- mới trên việc làm rỗng dạ dày ở chuột lang. Br. J. Pharmacol. 1987, 91, 263–264. [CrossRef]
8. Kris, MG; Gralla, RJ; Clark, RA; Tyson, LB Đánh giá về liều lượng của chất đối kháng serotonin GR-C507 / 75 (GR38032F) khi được sử dụng làm thuốc chống nôn ở bệnh nhân đang hóa trị liệu chống ung thư. J. Clin. Oncol. Năm 1988, 6, 659–662. [CrossRef]
9. Tricco, AC; Blondal, E.; Veronika, AA; Soobiah, C.; Vafaei, A. .; Ngà voi, J .; Stri fl er, L.; Cardoso, R .; Reynen, E.; Nincic, V .; et al. So sánh độ an toàn và hiệu quả của các thuốc đối kháng thụ thể serotonin ở bệnh nhân đang hóa trị liệu: Một đánh giá hệ thống và phân tích tổng hợp mạng lưới. BMC Med. 2016, 14, 216. [CrossRef]
10. Boelig, RC; Barton, SJ; Saccone, G.; Kelly, AJ; Edwards, SJ; Berghella, V. Các biện pháp can thiệp để điều trị chứng đái ra máu: Một tổng quan hệ thống và phân tích tổng hợp của Cochrane. J. Matern. Thai nhi Sơ sinh Med. 2018, 31, 2492–2505. [CrossRef]
11. Haque, N.; Naqvi, RM; Dasgupta, M. Ef cacy của Ondansetron trong việc Phòng ngừa hoặc Điều trị Mê sảng sau phẫu thuật-Một Đánh giá có Hệ thống. Có thể. Lão sư. J. 2019, 22, 1–6. [CrossRef] [PubMed]
12. McParlin, C.; O'Donnell, A. .; Robson, SC; Beyer, F.; Moloney, E.; Bryant, A. .; Bradley, J.; Muirhead, CR; Nelson-Piercy, C.; Newbury-Birch, D.; et al. Phương pháp điều trị Gravidarum Hyperemesis và Buồn nôn và Nôn mửa trong thai kỳ: Một đánh giá có hệ thống. JAMA 2016, 316, 1392–1401. [CrossRef] [PubMed]
13. Vương, W .; Zhou, L.; Sun, L. Ondansetron trị ngứa do morphin thần kinh: Một phân tích tổng hợp các thử nghiệm ngẫu nhiên có đối chứng. J. Clin. Dược phẩm. Họ. 2017, 42, 383–393. [CrossRef]
14. Yokoi, A.; Mihara, T.; Ka, K.; Goto, T. Hiệu quả so sánh của ramosetron và ondansetron trong việc ngăn ngừa buồn nôn và nôn sau phẫu thuật: Một đánh giá hệ thống được cập nhật và phân tích tổng hợp với phân tích tuần tự thử nghiệm. PLoS ONE 2017, 12, e0186006. [CrossRef]
15. Morse, BL; Kolur, A. .; Hudson, LR; Hogan, AT; Chen, LH; Brackman, RM; Sawada, GA; Fallon, JK; Smith, PC; Hillgren, KM Dược động học của Chất vận chuyển Cation hữu cơ 1 (OCT1) trong tháng 1/2 Knockout Chuột và các loài Sự khác biệt trong OCT ở gan 1- Sự hấp thụ qua trung gian. Metab ma túy. Thùng rác. 2020, 48, 93–105. [CrossRef] [PubMed]
16. Tzvetkov, MV; Saadatmand, AR; Bokelmann, K .; Meineke, tôi; Kaiser, R .; Brockmoller, J. Ảnh hưởng của đa hình OCT1 lên sự hấp thu của tế bào, nồng độ trong huyết tương và khả năng hấp thụ của các chất đối kháng 5- HT (3) tropisetron và ondansetron. Dược lý học. J. 2012, 12, 22–29. [CrossRef] [PubMed]
17. Zhu, P.; Ye, Z .; Guo, D.; Xiong, Z .; Huang, S.; Guo, J .; Zhang, W .; Polli, JE; Chu, H.; Li, Q.; et al. Irinotecan Làm thay đổi việc bố trí Morphine qua sự ức chế chất vận chuyển Cation hữu cơ 1 (OCT1) và 2 (OCT2). Dược phẩm. Res. 2018, 35, 243. [CrossRef]
18. Kido, Y .; Matsson, P.; Giacomini, KM Pro fi ling của một thư viện thuốc kê đơn cho các tương tác thuốc-thuốc tiềm năng trên thận do chất vận chuyển cation hữu cơ trung gian 2. J. Med. Chèm. 2011, 54, 4548–4558. [CrossRef] [PubMed]
19. Li, Q.; Guo, D.; Đồng, Z; Zhang, W .; Zhang, L. .; Hoàng, SM; Polli, JE; Shu, Y. Ondansetron có thể tăng cường độc tính trên thận do cisplatin gây ra thông qua việc ức chế nhiều chất độc và protein đùn (MATE). Toxicol. Appl. Pharmacol. 2013, 273, 100–109. [CrossRef]
20. Wittwer, MB; Zur, AA; Khuri, N.; Kido, Y .; Kosaka, A.; Zhang, X. .; Morrissey, KM; Sali, A.; Hoàng, Y .; Giacomini, KM Phát hiện ra các chất ức chế đa thuốc và đẩy độc tố mạnh, có chọn lọc 1 (MATE1, SLC47A1) thông qua thuốc theo toa và mô hình tính toán. J. Med. Chèm. 2013, 56, 781–795. [CrossRef] [PubMed]
