Bảo vệ đường ruột bằng Proanthocyanidins Liên quan đến các hoạt động chống oxy hóa và chống viêm kết hợp với việc cải thiện độ nhạy cảm với insulin, cân bằng nội môi lipid và glucose Phần 1

Xin vui lòng liên hệoscar.xiao@wecistanche.comđể biết thêm thông tin

Đường tiêu hóa (đường tiêu hóa là một hệ thống phức tạp đáp ứng các chức năng thiết yếu trong cơ thể con người -3. Nó đảm bảo tiêu hóa và hấp thụ các chất dinh dưỡng, góp phần nâng cao năng lực miễn dịch tổng thể bằng cách bảo vệ chống lại các mầm bệnh, sản xuất nhiều hormone peptid hoạt động trên một số mô và các con đường, và chứa đựng các cộng đồng vi sinh vật tương tác với vật chủ và ảnh hưởng đến sức khỏe trao đổi chất45. Ngoài ra, biểu mô ruột bảo vệ khỏi sự xâm nhập của mầm bệnh từ bên ngoài và đóng vai trò là tuyến phòng thủ đầu tiên, rất quan trọng để ngăn ngừa nhiều rối loạn6.

Đường tiêu hóa liên tục tiếp xúc với các kích thích có hại có thể gây ra stress oxy hóa (OCS), viêm và tổn thương. Các chất oxy hóa Intraluminalpro từ các chất dinh dưỡng ăn vào có chứa các nồng độ khác nhau của các sản phẩm oxy hóa lipid, chẳng hạn như các oxit cholesterol ', 8. Biểu mô ruột cũng chịu nhiều tác động của chất oxy hóa từ

Hình 1. Ảnh hưởng của PAC đến tính toàn vẹn của tế bào và khả năng tồn tại của các tế bào Caco2 / 15. Tính toàn vẹn của lớp đơn lớp Caco 2/15 được xác định bằng khả năng tồn tại của tế bào, sự biệt hóa và các xét nghiệm tiếp giáp chặt chẽ ở trạng thái hoàn toàn biệt hóa.

Proanthocyanidin (PAC, 250 ug / mL) được thêm vào ngăn tế bào đỉnh trong 24 giờ trước khi xử lý bằng Fe / Asc (200 uM / 2 mM) trong 6h ở 37C.bột chiết xuất cistanche(A) MTT được sử dụng để kiểm tra khả năng sống sót của tế bào, và (B) tính kháng xuyên biểu mô cũng được xác định. (C) Nhân vật phản diện, (D) Occludin, và (E) Claudin biểu hiện protein được đánh giá bằng Western blot. Kết quả thể hiện giá trị trung bình ± SEM của 3 thí nghiệm độc lập, mỗi thí nghiệm ba lần. Một Western blot đại diện được hiển thị, minh họa một thí nghiệm làm ba lần trên cùng một loại gel và ở cùng một mức tiếp xúc.

Vui lòng bấm vào đây để biết thêm

vi khuẩn âm tính với catalase, các tế bào bong tróc sản xuất oxydase (ví dụ: xanthine oxidase) và nước bọt có chứa axit vùng hạ vị, làm tăng các loại oxy phản ứng (ROS) trong lòng ruột. , và dẫn đến tăng cường tính thấm của ruột, chống viêm và giảm nội độc tố trong máu. Sự kết hợp của OCS và chứng viêm trong ruột làm ảnh hưởng đến các chức năng tiêu hóa, nội tiết và thần kinh miễn dịch. Đặc biệt, nó gây ra sự suy giảm độ nhạy insulin (IS), gây ra rối loạn trao đổi chấtl2,13.

Gần đây, ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy polyphenol và các dẫn xuất có khả năng ngăn ngừa và điều trị các bệnh mãn tính '4. Các chất chuyển hóa thứ cấp của thực vật này thể hiện các đặc điểm sinh học khác nhau và đang ngày càng được các nhà khoa học quan tâm. Chúng có khả năng làm giảm sự phát sinh ROS, vô hiệu hóa sự phát triển của OCS và chống lại chứng viêm5,16.cistanche genghis Khan,Tuy nhiên, các cơ chế hoạt động dẫn đến kết quả có lợi vẫn còn khó nắm bắt. Hơn nữa, do khả năng hấp thụ và sinh khả dụng hạn chế của chúng, các cuộc điều tra về chức năng sinh lý của chúng bị giới hạn ở quá trình vận chuyển polyphenol và sự dị hóa trong ruột.

Cistanche có thể cải thiện khả năng miễn dịch

Mục tiêu chính của nghiên cứu là xác định sự điều hòa của OxS và chứng viêm bởi proanthocyanidins (PACs), là những chất flavan -3- dồi dào trong trái cây, rau, quả hạch và ngũ cốc. Vì OCS và viêm là hai quá trình quan trọng thúc đẩy IS, tín hiệu insulin được đánh giá để phản ứng với PAC. Tác động của các polyphenol này cũng được đánh giá đối với quá trình oxy hóa axit béo (FA) và quá trình tạo mỡ,cistanche trong quần của bạnđiều này sẽ cho phép ước tính cân bằng nội môi lipid. Các cơ chế đằng sau ảnh hưởng của PAC được đánh giá bằng cách tập trung vào các yếu tố phiên mã trung tâm. Để đạt được mục đích này, chúng tôi đã sử dụng dòng tế bào Caco -2 / 15 bất tử có nguồn gốc từ con người được thiết lập tốt. Các tế bào ruột này được biết là trải qua quá trình biệt hóa tế bào tự phát dẫn đến sự hình thành đơn lớp tế bào biểu hiện một số đặc điểm hình thái và chức năng của tế bào ruột trưởng thành ở người 7-19.

Kết quả

Tính toàn vẹn của tế bào Caco 2/15 sau các phương pháp điều trị khác nhau. Trước khi đánh giá tác động của polyphenol đối với các quá trình khác nhau, chúng tôi muốn đảm bảo rằng các tế bào Caco -2 / 15 duy trì tính toàn vẹn của chúng để đáp ứng với việc xử lý sắt / ascorbate (Fe / Asc) và PAC. Khả năng tồn tại của tế bào không bị ảnh hưởng như được quan sát thấy từ thử nghiệm 3- (4, 5- dimethyldiazol -2- yl) -2, 5 diphenyl Tetrazolium Bromide (MTT) bất biến (Hình. 1A) . Xác nhận bảo toàn tính toàn vẹn đã được thu được sau khi phân tích bằng loại trừ màu xanh trypan (dữ liệu không được hiển thị). Hơn nữa, phép đo điện trở xuyên biểu mô không tiết lộ bất kỳ sửa đổi đáng kể nào về tính toàn vẹn của rào cản

Hình 2. Ảnh hưởng của PAC đối với quá trình peroxy hóa lipid, chất chống oxy hóa nội sinh và các yếu tố phiên mã chính do stress oxy hóa trong tế bào Caco -2 / 15. Proanthocyanidins （PAC, 250 ug / mL） được thêm vào ngăn tế bào đỉnh trong 24 giờ trước khi xử lý với Fe / Asc （200μM / 2 mM） trong 6h ở 37 độ C. Quá trình peroxy hóa lipid được xác định bằng cách đo mức (A) MDA bởi HPLC. Sự biểu hiện protein của (B) SOD2, (C) GPx, (D) NRF2 và (E) Keep 1 được xác định bằng Western blot. (F) Tỷ lệ NRF2 / Keapl đã được tính toán. Kết quả thể hiện giá trị trung bình ± SEM của 3 thí nghiệm độc lập, mỗi thí nghiệm ba lần. Một Western blot đại diện được hiển thị, minh họa một thử nghiệm làm ba lần trên cùng một loại gel và với cùng một mức tiếp xúc. * P<><0.001 ys="" untreated=""><><><0.001 vs="" fe/asc-treated="" cell.mda="" malondialdehyde,="" sod2="" superoxide="" dismutase="" 2,="" gpx="" glutathione="" peroxidase,="" nrf2="" nuclear="" factor="" erythroid="" 2-related="" factor="" 2,="" keap1="" kelch-like="" ech-associated="">

Ảnh hưởng của PAC đến OCS do Fe / Asc gây ra.cistanche gần tôiSau đó, chúng tôi ước tính sự cảm ứng của OCS sau khi sử dụng Fe / Asc. Đánh giá bằng HPLC của malondialdehyde (MDA), như một dấu ấn sinh học của quá trình peroxy hóa lipid, cho thấy hàm lượng MDA cao hơn so với Caco đối chứng -2 / 15 ô (Hình 2A). Đồng thời, biểu hiện protein của các enzym chống oxy hóa superoxide dismutase 2 (SOD2) và glutathione peroxidase (GPx) đã bị giảm bởi Fe / Asc so với các tế bào không được xử lý (Hình 2B, C). Tuy nhiên, sự hiện diện của PAC chống lại quá trình peroxy hóa lipid qua trung gian Fe / Asc bằng chứng là giảm MDA cũng như tăng SOD2 và GPx. Vì yếu tố nhân yếu tố phiên mã erythroid -2- liên quan đến yếu tố 2 (NRF2) rất quan trọng đối với việc điều hòa các chất chống oxy hóa nội sinh, chúng tôi đã đánh giá sự biểu hiện protein của nó (Hình 2D). Không có thay đổi nào trong NRF2 được phát hiện trong các tế bào Caco -2 / 15 được xử lý bằng Fe / Asc và PAC, nhưng biểu hiện protein của chất điều hòa âm tính Kelch-giống như protein liên kết với ECH 1 (Keap1), một cảm biến sinh học cho quá trình oxy hóa và electrophin ứng suất, được điều chỉnh tăng bởi Fe / Asc và điều chỉnh giảm bởi PAC (Hình 2E). Đặc biệt, tỷ lệ quan trọng của NRF2 / Keap1, là một chỉ số kích hoạt phiên mã của NRF2, cũng theo xu hướng tương tự (Hình 2F). Nhìn chung, PAC có hiệu quả trong việc chống lại OCS qua trung gian Fe / Asc.

Các tác động và cơ chế hoạt động của PAC đối với quá trình viêm. Các cytokine chống viêm được kích hoạt trong các tế bào biểu mô ruột trong điều kiện OCS. Các thí nghiệm của chúng tôi đã xác nhận quan sát này bằng cách chứng minh cảm ứng yếu tố hoại tử khối u qua trung gian Fe / Asc-alpha (TNF) (Hình 3). Phù hợp với những dữ liệu này, sự biểu hiện protein của cyclooxygenase -2 (COX2), một loại enzyme có vai trò nhiều mặt trong việc thúc đẩy và kéo dài quá trình viêm, đã tăng lên bởi chất pro-oxy hóa Fe / Asc. Tuy nhiên,cistanche para que serveQuản lý PAC bù đắp mức protein TNF và COX2 do Fe / Asc tạo ra (Hình 3A, B). Vì yếu tố hạt nhân kappa-B (NF-KB) đại diện cho một chất trung gian mạnh mẽ của các phản ứng viêm, chúng tôi đã kiểm tra ý nghĩa của nó trong quá trình phiên mã của các thành phần gây viêm nói trên (Hình 3C). Trong khi các tế bào Caco -2 / 15 bị Fe / Asc thách thức thể hiện tín hiệu NF-KB cao có thể thông qua việc kích hoạt tỷ lệ NF-KB / IkB (Hình 3E) và phosphoryl hóa chất ức chế của nó

Hình 3. Ảnh hưởng của PAC đối với các dấu hiệu viêm và yếu tố phiên mã chính NF-kB trong quá trình viêm do Fe / Asc ở tế bào Caco -2 / 15. Proanthocyanidin (PAC, 250 ug / mL) được thêm vào ngăn tế bào đỉnh trong 24 giờ trước khi xử lý bằng Fe / Asc (200 uM / 2 mM) trong 6 giờ ở 37 độ. Các biểu hiện protein của (A) COX2 và (B) TNFa, (C) NF-kB, (D) IkB, và (F) dạng phosphoryl hóa (pike) của nó được xác định bằng Western blot. Các tỷ lệ (E) NF-kB / IkB và (G) plan / IkB đã được tính toán. Kết quả thể hiện giá trị trung bình ± SEM của 3 thí nghiệm độc lập, mỗi thí nghiệm ba lần. Một Western blot đại diện được hiển thị, minh họa một thử nghiệm làm ba lần trên cùng một loại gel và với cùng một mức tiếp xúc. * P<><0.01 vs="" untreated=""><><0.01 vs="" fe/asc="" treated="" cells.="" cox2="" cyclooxygenase-2,="" tnfα="" tumor="" necrosis="" factor-alpha,="" nf-xb="" nuclear="" transcription="" factor-kappa="" b,="" ikb="" inhibitor="" of="" kappa="">

Điều hòa chuyển hóa lipid nội bào bằng PAC. Bước tiếp theo là đánh giá tác động của PAC đối với cân bằng nội môi lipid bằng cách tập trung vào các protein quan trọng, điều chỉnh quá trình oxy hóa FA và tạo mỡ. Đầu tiên chúng tôi kiểm tra sự biểu hiện của carnitine palmitoyltransferase I (CPT-la) vì protein này là enzyme kiểm soát tốc độ của con đường oxy hóa FA. Mức độ biểu hiện protein thấp hơn đặc trưng cho CPT-l phản ứng với xử lý Fe / Asc, trong khi ủ trước với PAC ngăn chặn sự suy giảm của nó so với các tế bào không được xử lý (Hình 4A). Những phát hiện này đã thúc đẩy chúng tôi xác định các cơ chế hoạt động tiềm năng bằng cách xem xét kỹ lưỡng khối lượng protein của thụ thể alpha (PPARa) được kích hoạt bởi peroxisome và thụ thể được kích hoạt bởi peroxisome-gamma coactivator 1- alpha (PGC-la) vì chúng đại diện cho hai các yếu tố phiên mã cần thiết cho sự biểu hiện mức độ cao của quá trình oxy hóa FA ti thể. Phân tích Western blot cho thấy PPARa điều hòa giảm nhẹ mà không thay đổi PGC -1 a (Hình 4B, C). Tuy nhiên, sự hiện diện của PAC đã ngăn cản sự suy giảm PGC qua trung gian Fe / Asc -1 a và PPAR-. Sau đó, chúng tôi chuyển hướng sang các enzym điều chỉnh kiểm soát quá trình tạo lipogenesis. Như được thể hiện trong Hình 4, một sự sụt giảm quan trọng của acetyl CoA-carboxylase được phosphoryl hóa (ICC) và sự gia tăng rõ rệt của tổng hợp axit béo (FAS) đã được nhận thấy sau khi sử dụng Fe / Asc, cho thấy sự kích hoạt của lipo-genesis (Hình 4D, E). Những thay đổi này có thể là do sự cảm ứng của các yếu tố phiên mã PPARy và protein liên kết yếu tố điều hòa sterol lc (SREBP1c) trong (aco -2 / 15 tế bào (Hình, 4EG) Sự hiện diện của PAC có lợi vì nó đảo ngược tác dụng tăng sinh lipogenesis của Fe / Asc. Vì protein kinase alpha (AMPKa) được kích hoạt AMP đại diện cho cơ quan điều hòa trung tâm của quá trình oxy hóa FA và tạo lipid, chúng tôi đã nghiên cứu biểu hiện protein của nó, được phát hiện là tăng cao để đáp ứng với Fe / Asc trong khi bình thường hóa phản ứng với PAC. Nhìn chung, hầu hết những phát hiện này đều duy trì vai trò bảo vệ của PAC trong cân bằng nội môi lipid (Hình 5).

Tác động của PAC đối với chuyển hóa glucose nội bào và kháng insulin. Quá trình tạo gluconeogenesis được kiểm soát chặt chẽ bởi hoạt động của các enzym giới hạn tốc độ như phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) và glucose -6- phosphatase (G6Pase). Chúng tôi đã khám phá tình trạng của các enzym này bằng cách phân tích pro-

Hình 4. Ảnh hưởng của PAC đối với quá trình oxy hóa FA và tạo lipid trong Caco -2 / 15 tế bào. Proanthocyanidins (PAC, 250ug / mL）,dương vật cistancheđược thêm vào ngăn tế bào đỉnh trong 24 giờ trước khi xử lý với Fe / Asc （200 μM / 2 mM） trong 6 giờ ở 37 độ C. Biểu hiện protein của các dấu hiệu cụ thể của FA-oxy hóa: ((A) CPTla, ( B) PPARa, và (C) PGCl cũng như của quá trình tạo mỡ: (D) ACCphosphorylation, (E) FAS, (F) PPARy và (G) SREBP1) đã được đánh giá bởi Western-blot. Kết quả đại diện cho giá trị trung bình ± SEM của 3 thí nghiệm độc lập, mỗi thí nghiệm trong ba lần. Một Western blot đại diện được hiển thị, minh họa một thử nghiệm làm ba lần trên cùng một loại gel và ở cùng một mức tiếp xúc. * P<><0.01 vs="" untreated="" cells=""><><0.01 vs="" fe/asc="" treated="" cells.="" cpt="" carnitine="" palmitoyltransferase="" alpha,="" ppar="" peroxisome="" proliferator-activated="" receptor,="" pgcia="" peroxisome="" proliferator-activated="" receptor="" gamma="" coactivator="" 1-alpha,="" accacetyl-coa="" carboxylase,="" fas="" fatty="" acid="" synthase,="" srebp1-c="" sterol="" regulatory="" element-binding="">

Hình 5. Ảnh hưởng của PAC đến protein kinase alpha (AMPKa) hoạt hóa AMP điều chỉnh quá trình oxy hóa axit béo và tạo mỡ trong tế bào Caco -2 / 15. Proanthocyanidins (PAC, 250 ug / mL) được thêm vào tế bào đỉnh

ngăn trong 24h trước khi xử lý với Fe / Asc （200 μM / 2 mM） trong 6h ở 37 độ C. Sự biểu hiện protein của AMPKa được đánh giá bằng Western Blot. Kết quả thể hiện giá trị trung bình ± SEM của 3 thí nghiệm độc lập, mỗi thí nghiệm ba lần. Một Western blot đại diện được hiển thị, minh họa một thử nghiệm làm ba lần trên cùng một loại gel và với cùng một mức tiếp xúc. * P<0.05 vs="" untreated="" cells(ctrl).=""><><0.01 vs="" fe/asc="" treated="">

Bài báo này được trích từ Báo cáo Scientifc|(Năm 2021) 11: 3878|https://doi.org/10.1038/s41598-020-80587-5