Phần 2: Điều hòa Hsa-miR ở thận -127-3 p góp phần vào việc kích hoạt quá mức của con đường truyền tín hiệu Interferon loại I trong thận của bệnh viêm thận do Lupus

Để biết thêm thông tin. tiếp xúctina.xiang@wecistanche.com

CácHệ thống miễn dịchlà “người bảo vệ” của cơ thể chúng ta và là vũ khí hữu hiệu nhất để chống lại sự xâm nhập của mầm bệnh. Những người có khả năng miễn dịch bẩm sinh thấp sẽ dễ mắc bệnh hơn. Kết quả thí nghiệm cho thấy các hoạt chất trong Cistanche có thể nâng cao khả năng miễn dịch của cơ thể.

Chúng ta hãy xem xét kỹ hơn.

1. Tổng số glycoside của Cistanchetubulosa

Tổng số glucoside của Cistanche tubulosa tăng cường đáng kể việc sản xuất kháng thể, số lượng tế bào lympho T ở máu ngoại vi, chức năng thực bào của đại thực bào màng bụng, và phản ứng quá mẫn kiểu chậm ở chuột bị thương Co -ray. Chỉ số, chỉ số lá lách và tỷ lệ sống sót cho thấy tổng số glucoside của Cistanchetubulosacó tác dụng bảo vệ mạnh mẽ chức năng miễn dịch của chuột bị thương do bức xạ.

2. Cistanche polysaccharides

Cistanchetubulosapolysaccharides trong Cistanche có thể làm giảm hàm lượng MDA trong não, tim và gan của các mô hình động vật bị suy giảm miễn dịch, tăng hoạt động của telomerase trong tim và mô não, chức năng thực bào của đại thực bào phúc mạc, tăng sinh tế bào lympho, tế bào lympho T ở lá lách Hàm lượng IL { {0}} và nồng độ của ion canxi trong tế bào tuyến giáp cho thấy rằng polysaccharide của Cistanche Desticola có thể nâng cao chức năng miễn dịch của cơ thể.

3. Verbascum

Các thành phần hoạt chất trong CistanchetubulosaTân Cương, gây ra D-galactose làm giảm đáng kể hàm lượng MDA trong tim, gan và mô não của chuột mô hình lão hóa bán cấp, và làm tăng đáng kể hoạt động của telomerase trong tim và mô não. Chức năng thực bào của các tế bào thực bào được tăng cường, và sự tăng sinh của các tế bào lympho và hàm lượng IL -2 trong máu ngoại vi đã tăng lên đáng kể. Nó được chỉ ra rằng Verbascum có thể tăng cường chức năng miễn dịch của cơ thể.

Tóm lại: Cho dù bạn có khả năng miễn dịch bẩm sinh thấp hoặc khả năng miễn dịch kém, bạn có thể ăn các loại thực phẩm liên quan đến cistanche để điều chỉnh khả năng miễn dịch của chính mình.

Bấm để biết về cistanche tubulosa và mua cistanche ở đâu

KẾT QUẢ

Hsa-miR -127-3 p là Bộ điều chỉnh Phủ định của Đường dẫn Tín hiệu IFN-I

Trong nỗ lực trước đây của chúng tôi để nghiên cứu các miRNA của thận trong LN, chúng tôi đã so sánh các cấu hình miRNA củaquả thậnsinh thiết từ bệnh nhân LN và một nhóm chứng bình thường (được mô tả trong VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU). Có một kiểu biểu hiện miRNA riêng biệt trong các mô thận của bệnh nhân LN (Hình S1). Trong số các miRNA được biểu hiện khác biệt, chúng tôi chọn 9 miRNA đã được điều chỉnh giảm (ít nhất 50%) và được bảo tồn (giữa người và chuột) và kiểm tra vai trò của chúng trong lộ trình tín hiệu IFN-I bằng thử nghiệm của phóng viên ISRE-luciferase. Xem xét nguồn tế bào thận sơ cấp của con người hạn chế và chúng có khả năng tăng sinh trong ống nghiệm hạn chế, chúng tôi đã sàng lọc và xác minh chức năng điều hòa của miRNA và nghiên cứu các cơ chế phân tử liên quan bằng cách sử dụng tế bào Hela. So với 8 miRNA khác, sự biểu hiện quá mức của hsa-miR -127-3 p đã ức chế đáng kể cảm ứng hoạt động luciferase qua trung gian ISRE trong tế bào Hela được kích thích bởi IFN- (Hình 1A và Hình S2). Do đó, chúng tôi đã chọn nghiên cứu sâu hơn về hsa-miR -127-3 p. Ngoài IFN-, IFN- (một thành viên khác của IFN-I) được kích thích cảm ứng hoạt động ISRE-luciferase cũng có thể bị ức chế bởi hsa-miR -127-3 p (Hình S3) .IFN-I cũng có thể gây ra biểu hiện gen qua trung gian của phần tử KHÍ (3). Đúng như dự đoán, sự biểu hiện quá mức của hsa-miR -127-3 p đã ức chế cảm ứng hoạt động luciferase qua trung gian GAS được kích thích bởi IFN- (Hình 1A). Vì miRNA nhận ra mục tiêu của chúng bằng cách ghép nối cơ sở bổ sung của trình tự hạt của chúng với vị trí đích trên mRNA đích (6). Chức năng ức chế này của hsa-miR -127-3 p trên con đường tín hiệu IFN-I đã bị loại bỏ do đột biến trình tự hạt của nó (Hình 1A). Phù hợp với những kết quả này, sự biểu hiện quá mức của hsa-miR -127-3 p đã ức chế sự phosphoryl hóa do IFN kích thích của STATl và STAT2, với tác dụng mạnh hơn nhiều trên STAT2, trong tế bào Hela (Hình 1B và S4). Để chứng minh rằng tác dụng ức chế này của hsa-miR -127-3 p không bị hạn chế đối với tế bào Hela, chúng tôi xác minh thêm rằng sự biểu hiện quá mức của hsa-miR -127-3 p đã ức chế sự phosphoryl hóa STAT2 do IFN kích thích ở hai loại tế bào khác (Hình S5).

Tovalidatehsa-miR -127-3 p có chức năng như một chất điều hòa âm tính nội tại tế bào của lộ trình tín hiệu IFN-I trong các tế bào cư trú ở thận, chúng tôi đã thực hiện các thử nghiệm báo cáo ISRE-và GAS-luciferase bằng cách sử dụng HRMC chính, có thể đáp ứng với các kích thích miễn dịch bẩm sinh và tham gia vào cơ chế bệnh sinh của LN như được chỉ ra trong các nghiên cứu trước đây (12-15). Chúng tôi nhận thấy hsa-miR -127-3 p antagomir tăng cường ISREorGAS cảm ứng hoạt động luciferase qua trung gian được kích thích bởi IFN- trong HRMC sơ cấp (Hình 1C). Hơn nữa, hsa-miR -127-3 p antagomir tăng cường quá trình phosphoryl hóa STAT2 được kích thích bởi IFN- trong HRMC chính (Hình 1D và S6).

Tiếp theo, chúng tôi thực hiện microarray để phân tích tác dụng ức chế của hsa-miR -127-3 p đối với sự biểu hiện của các gen bằng cách sử dụng các mẫu RNA

từ các tế bào Hela được xử lý IFN đã được chuyển nhiễm trước đó bằng hsa-miR -127-3 p hoặc các đối chứng khác nhau (chuyển nạp giả, bắt chước đối chứng âm tính, bắt chước đột biến hsa-miR -127-3 p). Chúng tôi đã tính toán các gen biểu hiện khác biệt chồng chéo trong các tế bào Hela được xử lý IFN-o (điều hòa tăng hoặc điều chỉnh giảm 1. 5- lần) giữa các cặp so sánh khác nhau (hsa-miR -127-3 p bắt chước so với mô phỏng, hsa-miR { {11}} p bắt chước so với bắt chước đối chứng tiêu cực và bắt chước đột biến hsa-miR -127-3 p so với hsa-miR -127-3 p), truy xuất tất cả các gen bị ức chế bởi hsa-miR {{17 }} p và thực hiện một phân tích để xác định các mô-típ điều hòa cis phong phú của các gen bị ức chế hsa-miR -127-3 p bằng cách sử dụng plugin iRegulon trên nền tảng Cytoscape (10). Chúng tôi nhận thấy rằng mô-típ quy định cis được sử dụng bởi các TF hạ nguồn củaIFN-I (chẳng hạn như STAT -1, STAT -2 và IRFprotein) thống trị các mô-típ được làm giàu hàng đầu (9 trong số 10 mô-típ hàng đầu) (Hình 2A). Điều này càng chứng tỏ rằng hsa-miR -127-3 p chủ yếu ức chế tín hiệu xuôi dòng IFN-I. Ngoài ra, từ dữ liệu microarray, chúng tôi nhận thấy sự biểu hiện quá mức của hsa-miR -127-3 p đã ức chế sự cảm ứng của nhiều ISG, bao gồm cả những ISG tạo thành chữ ký IFN gen 21- được sử dụng để đánh giá hiệu quả của anifrolumab trong việc chặn IFN -Tôi ra hiệu (8) (Hình 2B). Phù hợp với các kết quả trước đó, bắt chước đột biến hsa-miR -127-3 p không thể ức chế các ISG đó (Hình 2B). Chúng tôi đã xác minh sự ức chế hsa-miR -127-3 p trên hai ISG đại diện (IFIT3 và CXCL10) bằng các thí nghiệm độc lập bổ sung (Hình 2C). Trong khi hsa-miR -127-3 p antagomir tăng cường cảm ứng IFIT3 và CXCL10 bởi IFN- trong HRMC chính (Hình 2D). Do đó, hsa-miR -127-3 p hoạt động như một bộ điều chỉnh âm của lộ trình báo hiệu IFN-I.

JAK1 là một gen mục tiêu Bona Fide của Hsa-miR -127-3 p

Vì hsa-miR -127-3 p ức chế quá trình phosphoryl hóa tyrosine của STAT1 và STAT2 và sự cảm ứng của hầu hết các ISG được kích thích bởi IFN-I, chúng tôi đã giả thuyết rằng hsa-miR -127-3 p có thể nhắm mục tiêu các phân tử truyền tín hiệu ngược dòng chính của Lộ trình báo hiệu IFN-I, chẳng hạn như JAK1 và TYK2. Do đó, chúng tôi đã kiểm tra mức độ protein của JAK1 và TYK2 trong các tế bào được truyền hsa-miR -127-3 p hoặc kiểm soát bắt chước. Chúng tôi nhận thấy sự biểu hiện quá mức của hsa-miR -127-3 p làm giảm biểu hiện JAK1 ở cả mức protein và mức mRNA, nhưng không làm giảm TYK2 (Hình 3A và S7, S8). Do đó, chúng tôi quyết định kiểm tra xem JAK1 có phải là mục tiêu của hsa-miR -127-3 p hay không.

Bằng 2 biệt danh khác nhau (16,17), chúng tôi đã dự đoán 3 vị trí liên kết hsa-miR -127-3 tiềm năng trên mRNA củaJAK1, với một vị trí liên kết trong 3'UTR và hai vị trí còn lại trong trình tự mã hóa (CDS) (Hình S9) . Mặc dù yếu, các chất bắt chước hsa-miR -127-3 p đã ức chế sự biểu hiện của gen luciferase được hợp nhất với kiểu dại JAK13'UTR, trong khi đột biến của trình tự đích trong JAK 1 3 'UTR đã loại bỏ sự ức chế (Hình 3B). Ngoài ra, chúng tôi đã sao chép vùng mã hóa JAK1 bị cắt ngắn có chứa 2 trang đích hsa-miR -127-3 p vào vectơ pCDNA3.1. Sau đó, chúng tôi tạo ra một dạng đột biến của plasmid biểu hiện cắt ngắn JAK1 bằng cách phá vỡ các trang web đích 2 hsa-miR -127-3 p. Chúng tôi nhận thấy rằng hsa-miR -127-3 p cũng có thể ức chế sự biểu hiện của JAK1 bị cắt ngắn từ plasmid kiểu dại nhưng không phải là gen đột biến (Hình 3C và S10). Xem xét tác dụng ức chế độc lập của hsa-miR -127-3 p onJAK 1-3 'UTRor JAK 1- CDS là yếu, chúng tôi đề xuất rằng hsa-miR -127-3 p tác động lên các vị trí liên kết này cùng nhau để đạt được sự ức chế đáng kể sự biểu hiện của JAK1. Để xác minh thêm mối quan hệ nhắm mục tiêu này giữa hsa-miR -127-3 p vàJAK1, chúng tôi cho thấy rằng mRNA JAK1 đã được làm giàu trong phức hợp Ago2 trong các ô nơi hsa-miR -127-3 p được biểu hiện quá mức, nhưng không phải trong các ô biểu hiện quá mức dạng đột biến của hsa-miR -127-3 p (Hình 3D).

Hơn nữa, chúng tôi nhận thấy rằng nồng độ hsa-miR -127-3 p trong sinh thiết thận từ bệnh nhân LN thấp hơn đáng kể so với nhóm chứng bình thường (Hình 4A), trong khi mức độ JAK1 và IFIT3 trong sinh thiết thận từ bệnh nhân LN cao hơn đáng kể so với đối chứng bình thường (Hình 4B, C). Ngoài ra, có mối tương quan nghịch giữa mức hsa-miR -127-3 p và JAK1 (hoặc IFIT3) trong sinh thiết thận của bệnh nhân LN (Hình 4D, E). Do đó, JAK1 là một gen đích thực của hsa-miR -127-3 p.

THẢO LUẬN

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiếp tục nỗ lực trước đó để khám phá các chức năng của các miRNA thận bị rối loạn điều hòa trong LN. Ở đây, chúng tôi tập trung vào các miRNA điều chỉnh thấp trong sinh thiết thận của bệnh nhân LN. Chúng tôi chọn 9 trong số chúng để phân tích dựa trên 2 tiêu chí: bảo tồn và mức độ điều hòa (chi tiết trong KẾT QUẢ). Vì IFN-I rất quan trọng đối với sự phát triển của SLE vàLN (3), chúng tôi đã sàng lọc 9 miRNA cho các bộ điều chỉnh tiềm năng của lộ trình tín hiệu IFN-I. Chúng tôi đã xác định hsa-miR -127-3 p là chất điều hòa âm tính của lộ trình tín hiệu IFN-I bằng cách cho thấy nó có thể ức chế sự phosphoryl hóa của các protein STAT và cảm ứng biểu hiện gen qua trung gian ISRE (hoặc GAS) được kích thích bởi IFN-. Chúng tôi nhận thấy tác dụng ức chế này tồn tại ở nhiều loại tế bào khác nhau. Hơn nữa, sự biểu hiện quá mức của hsa-miR -127-3 p có thể làm giảm đáng kể sự cảm ứng của ISG. Hơn nữa, có sự trùng lặp đáng kể giữa các ISG bị ức chế hsa-miR -127-3 p và chữ ký IFN bị ức chế anifrolumab — 17 trong số 21 gen chữ ký IFN có thể bị ức chế bởi hsa-miR -127-3 p — được sử dụng để đánh giá hiệu quả ức chế của anifrolumab (18). Đáng lưu ý, một thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 3 gần đây cho thấy việc sử dụng nivolumab hàng tháng có lợi cho bệnh nhân SLE so với giả dược (2). Do đó, phát hiện của chúng tôi chỉ ra rằng hsa-miR -127-3 p có thể đóng vai trò như một bệnh phong tỏa IFN-I (20). Điều này càng củng cố tiềm năng điều trị của hsa-miR -127-3 p trong điều trị các bệnh tự miễn dịch.

Có những câu hỏi chưa được giải đáp cho các nghiên cứu trong tương lai. Một là chúng ta vẫn chưa biết chính xác cơ chế điều hòa hsa-miR -127-3 p trong thận của LN, điều này sẽ giúp chúng ta hiểu cơ chế bệnh sinh của LN. Dữ liệu sơ bộ chưa được công bố của chúng tôi chỉ ra rằng việc kích hoạt lâu dài lộ trình báo hiệu IFN-I đã ngăn chặn biểu thức hsa-miR -127-3 p. Do đó, có thể có một vòng lặp chuyển tiếp được hình thành do IFN-I quá mức và giảm hsa-miR -127-3 p nội bào, làm khuếch đại tín hiệu IFN-I. Vấn đề còn lại là, cho đến nay, chúng tôi không thể kiểm tra tác dụng ức chế in vivo của hsa-miR -127-3 p trên JAK1 vì trình tự liên kết hsa-miR -127-3 p của gen JAK1 ở người không tồn tại ở chuột . Trong tương lai, những con chuột được thiết kế biểu hiện gen JAK1 của con người có thể giúp làm rõ hiệu quả in vivo của hsa-miR -127-3 p trong việc ức chế JAK1 và tín hiệu cytokine liên quan của nó.

Tóm lại, chúng tôi chỉ ra rằng JAK1 là mục tiêu chính xác của hsa-miR -127-3 p và sự điều hòa giảm bất thường của hsa-miR ở thận -127-3 p góp phần vào cơ chế bệnh sinh LN bằng cách tăng cường sự biểu hiện của JAK1 và sự kích hoạt sau đó của con đường tín hiệu IFN-I trong thận. Vì các con đường truyền tín hiệu cytokine gây viêm liên quan đến JAK 1- là rất quan trọng đối với sự phát triển của nhiều bệnh tự miễn dịch (4), các nghiên cứu trong tương lai được bảo đảm để khám phá tác dụng điều trị của hsa-miR -127-3 p đối với LN hoặc các bệnh liên quan đến tự miễn dịch khác tổn thương cơ quan với sự điều chỉnh bất thường của JAK1.