ISG15-Sự kích hoạt phụ thuộc của cảm biến MDA5 bị đối kháng bởi SARS-CoV-2 Protease giống Papain để trốn tránh khả năng miễn dịch bẩm sinh của vật chủ
Nov 08, 2023
Kích hoạt các thụ thể giống RIG-I, gen cảm ứng axit retinoic I (RIG-I) và protein liên quan đến biệt hóa khối u ác tính 5 (MDA5) thiết lập trạng thái kháng vi-rút bằng cách điều chỉnh tăng các gen được kích thích bằng interferon (IFN) (ISG). Trong số này có ISG15, vai trò cơ học của nó trong khả năng miễn dịch bẩm sinh vẫn còn bí ẩn. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi báo cáo rằng sự liên hợp ISG15 là điều cần thiết cho các phản ứng IFN kháng vi-rút qua trung gian cảm biến RNA vi-rút MDA5. ISGylation của miền kích hoạt và tuyển dụng caspase của MDA5 thúc đẩy quá trình oligome hóa của nó và do đó kích hoạt khả năng miễn dịch bẩm sinh chống lại một loạt vi-rút, bao gồm vi-rút corona, flavivirus và picornavirus. Quá trình kích hoạt phụ thuộc ISG{12}}của MDA5 bị đối kháng thông qua quá trình khử ISGylation trực tiếp qua trung gian là protease giống papain của SARS-CoV-2, một loại vi-rút Corona mới xuất hiện gần đây đã gây ra đại dịch COVID-19 . Công việc của chúng tôi chứng minh vai trò quan trọng của ISG15 trong phản ứng chống vi-rút qua trung gian MDA{20}}và cũng xác định cơ chế trốn tránh miễn dịch quan trọng của SARS-CoV-2, có thể được nhắm mục tiêu để phát triển các loại thuốc chống vi-rút và vắc-xin mới nhằm chống lại COVID-19.
cistanche tubulosa-cải thiện hệ thống miễn dịch
Nhấn vào đây để xem các sản phẩm Tăng cường miễn dịch Cistanche
【Hỏi thêm] Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Sự xáo trộn của virus trong cân bằng nội môi miễn dịch của vật chủ được theo dõi bởi hệ thống miễn dịch bẩm sinh, hệ thống này dựa vào các thụ thể cảm nhận các mẫu phân tử liên quan đến mầm bệnh hoặc nguy hiểm (PAMP)1–3. Các thụ thể giống RIG-I (RLR) RIG-I và MDA5 đóng vai trò then chốt trong việc phát hiện vi-rút bằng cách khảo sát tế bào chất để tìm các RNA kích thích miễn dịch có nguồn gốc từ vi-rút hoặc vật chủ4. Sự liên kết của RNA với miền đầu C (CTD) và helicase của RIG-I và MDA5 dẫn đến cấu trúc mồi tín hiệu của chúng cho phép thu hút một số enzyme5. Các enzyme này sửa đổi RLR ở nhiều miền và vị trí, đồng thời các sửa đổi sau dịch mã (PTM) được nghiên cứu đặc biệt kỹ lưỡng cho các miền tuyển dụng và kích hoạt caspase (CARD), các mô-đun báo hiệu. Protein phosphatase 1 (PP1) / khử phospho hóa CARD RIG-I và MDA56 . Trong trường hợp RIG-I, quá trình khử phospho thúc đẩy quá trình đa bào hóa liên kết Lys{22}}của CARD bằng TRIM25 (mô-đun ba bên chứa 25) và các dây chằng E3 khác7,8, giúp ổn định dạng oligomeric của RIG-I, từ đó cho phép kháng vi-rút ty thể - Liên kết protein tín hiệu (MAVS). So với RIG-I, các bước kích hoạt MDA5 riêng lẻ và các PTM quan trọng liên quan ít được hiểu rõ hơn. Kích hoạt RLR gây ra việc sản xuất IFN loại I và III, từ đó truyền tín hiệu chống vi-rút bằng cách điều chỉnh lại ISG9,10. Trong số đó có ISG15, một loại protein giống ubiquitin có thể liên hợp cộng hóa trị với các gốc lysine của protein mục tiêu, một quy trình PTM được gọi là ISGylation11. Mặc dù liên hợp ISG15 đã được công nhận rộng rãi là có tác dụng chống vi-rút12, nhưng các cơ chế ISGylation của protein chủ có thể giải thích hoạt động hạn chế vi-rút rộng rãi của ISG15 hiện vẫn chưa được biết. Tác nhân gây ra đại dịch COVID-19 đang diễn ra, hội chứng hô hấp cấp tính nặng do vi-rút Corona 2 (SCoV2), thuộc họ Coronaviridae có chứa một số mầm bệnh khác ở người. Vi-rút Corona có khả năng đặc biệt trong việc ngăn chặn các phản ứng kháng vi-rút qua trung gian IFN và khả năng sản xuất IFN thấp ở những bệnh nhân nhiễm SCoV{44}}có liên quan đến bệnh nặng13. Trong số các chất đối kháng IFN của virus corona có protease giống papain (PLpro) có hoạt tính khử phổ biến và khử ISGylating14,15. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi xác định vai trò thiết yếu của ISGylation trong việc kích hoạt MDA5. Chúng tôi còn chứng minh thêm rằng SCoV2 PLpro tương tác với MDA5 và đối kháng với việc kích hoạt MDA5 phụ thuộc ISG thông qua hoạt động khử ISGylation, tiết lộ rằng SCoV2 đã phát triển để thoát khỏi sự giám sát miễn dịch của MDA5.
Kết quả
MDA5, nhưng không phải RIG-I, tín hiệu yêu cầu ISG15.
Để xác định các PTM của THẺ MDA5 có thể điều chỉnh kích hoạt MDA5, chúng tôi đã sử dụng MDA5–2CARD đã được tinh chế bằng ái lực kết hợp với glutathione-S-transferase (GST–MDA5–2CARD) hoặc riêng GST, bằng phương pháp sắc ký lỏng kết hợp với phép đo khối phổ song song (LC –MS/MS), và nhận thấy rằng, cụ thể là, GST–MDA5–2CARD được đồng tinh chế với ISG15, xuất hiện dưới dạng hai dải di chuyển chậm hơn (~15 và 30 kDa) so với GST–MDA5– 2CARD (Dữ liệu mở rộng) chưa sửa đổi Hình 1a). Quá trình miễn dịch (IB) đã xác nhận rằng GST–MDA5–2CARD được sửa đổi bởi ISG15 (Hình dữ liệu mở rộng. 1b). Tiếp theo, chúng tôi xác định mức độ liên quan của ISG15 đối với tín hiệu do MDA{23}}gây ra. Trong khi biểu hiện FLAG–MDA5 trong nguyên bào sợi phôi chuột hoang dã (WT) (MEF) tạo ra RNA và protein thông tin IFN cũng như các bản phiên mã Ccl5 theo cách phụ thuộc vào liều lượng, thì biểu hiện FLAG–MDA5 trong Isg15-/− MEFs dẫn đến bị cắt bỏ. biểu hiện gen và protein kháng vi-rút (Hình 1a và Dữ liệu mở rộng Hình 1c). Tương tự như vậy, việc cảm ứng gen kháng vi-rút do giảm mạnh ở các tế bào HeLa (con người) loại bỏ ISG15 (KO) so với các tế bào kiểm soát WT (Hình 1b và Hình dữ liệu mở rộng. 1d), loại trừ hiệu ứng đặc trưng của loài. Ngược lại, FLAG–RIG-I tạo ra lượng protein IFN- được tiết ra tương đương cũng như các bản phiên mã Ifnb1 và Ccl5 trong Isg15-/− và WT MEF (Hình 1a và Hình dữ liệu mở rộng. 1c). Các bản phiên mã IFNB1 và CCL5 cũng như quá trình sản xuất protein IFN- của FLAG–RIG-I tương tự hoặc được tăng cường một chút trong các tế bào ISG15 KO HeLa so với các tế bào WT (Hình 1b và Hình dữ liệu mở rộng. 1d), phù hợp với các báo cáo trước đây rằng ISGylation tiêu cực tác động đến tín hiệu RIG-I16,17
Hình 1|ISGylation là cần thiết cho MDA5, nhưng không cần cho tín hiệu RIG-I. a, b, ELISA của IFN- từ các chất nổi trên bề mặt của MEFs (WT hoặc Isg15−/−) (a) và tế bào HeLa (WT hoặc ISG15 KO) (b) được chuyển hóa tạm thời với lượng MDA5 hoặc RIG-I được gắn thẻ FLAG ngày càng tăng cho 40 giờ. Các lysate toàn tế bào (WCL) đã được IB thử nghiệm với khả năng chống ISG15, chống FLAG và chống Actin (kiểm soát tải). c, ELISA của IFN- từ các chất nổi phía trên của WT hoặc Isg15-/− MEF được mô phỏng kích thích hoặc thay thế bằng EMCV RNA (0.1 hoặc 0.4 µg ml−1 ), HMW-poly (I: C) (0.5 µg ml−1 ) hoặc RABVLe (1 pmol ml−1 ), hoặc bị nhiễm SeV (10 đơn vị tan máu (HAU) ml−1 ) trong 24 h. d, Phân tích RT-qPCR của Ifnb1, Ccl5 và Tnf mRNA trong WT và Isg15-/− MEF được kích thích như trong c. e, Quá trình phosphoryl hóa IRF3 trong WCL của NHLF đã được thay thế bằng siRNA được chỉ định trong 30 giờ và sau đó được kích thích hoặc thay thế bằng EMCV RNA (0,4 µg ml−1 ) hoặc RABVLe (1 pmol ml−1 ) trong 6 giờ, được đánh giá bởi IB có kháng pSer396-IRF3 và kháng IRF3. f, ELISA của IFN- từ phần nổi của NHLF đã được chuyển nhiễm siRNA được chỉ định trong 30 giờ và sau đó được kích thích hoặc chuyển nhiễm bằng EMCV RNA (0,4 µg ml−1 ) hoặc RABVLe (1 pmol ml−1 ) hoặc bị nhiễm SeV (10 HAU ml-1 ) trong 16 giờ. g, ELISA của IFN- từ phần nổi phía trên của PBMC được tải nạp trong 40 giờ với các hạt lentivirus shRNA được chỉ định và sau đó bị nhiễm mutEMCV (MOI=10) hoặc SeV (200 HAU ml−1) trong 8 giờ. h, phân tích RT–qPCR của IFNA2 và IL-6 mRNA trong PBMC đã được tải nạp và bị nhiễm như trong g. Dữ liệu biểu thị ít nhất hai thử nghiệm độc lập có kết quả tương tự (trung bình ± sd của n= 3 lần sao chép sinh học trong a–d và f và giá trị trung bình của n= 2 lần sao chép sinh học tính bằng g và h). *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test). ND, not detected; NS, not significant.
Tiếp theo, chúng tôi đã thử nghiệm tác động của việc xóa gen ISG15 đối với việc kích hoạt MDA5 và RIG-I nội sinh bằng các phối tử tương ứng của chúng. Sự sản xuất IFN- cũng như sự biểu hiện gen IFNB1, CCL5 và TNF gây ra bởi sự chuyển nhiễm RNA của virus viêm não cơ tim (EMCV) hoặc RNA trọng lượng phân tử cao (HMW)-poly(I: C), cả hai đều được cảm nhận chủ yếu bởi MDA5, đã bị suy giảm đáng kể trong các ô Isg15−/− MEF, ISG15 KO HeLa và ISG15 KO HAP-1 so với các ô điều khiển tương ứng của chúng (Hình 1c, d và Hình dữ liệu mở rộng. 1e cách g). Điều quan trọng là sự cắt bỏ cảm ứng gen kháng virus bằng EMCV RNA hoặc HMW-poly(I: C) trong tế bào ISG15 KO không phải do biểu hiện gen MDA5 bị loại bỏ; ngược lại, biểu hiện MDA5 mRNA đã được tăng cường trong các ô ISG15 KO so với các ô WT (Hình dữ liệu mở rộng. 1f, g). Ngược lại với việc kích thích bằng chất chủ vận MDA5, việc kích thích các tế bào Isg15-/− MEF và ISG15 KO HeLa bằng cách chuyển gen RNA (RABVLe) của virus dại hoặc nhiễm virus Sendai (SeV), là các kích thích RIG-I, dẫn đến sản xuất IFN- biểu hiện gen kháng vi-rút có thể so sánh với các tế bào WT (Hình 1c, d và Dữ liệu mở rộng Hình 1e). Để loại trừ các tác động vô tính tiềm ẩn có thể liên quan đến các tế bào bị xóa gen ISG15, chúng tôi đã thực hiện các thí nghiệm làm im lặng gen tạm thời trong các nguyên bào sợi phổi bình thường ban đầu ở người (NHLF). Sự im lặng của ISG15, tương tự như sự phân hủy MDA5, dẫn đến sự mất gần như hoàn toàn quá trình phosphoryl hóa yếu tố điều hòa IFN 3 (IRF3)—một dấu hiệu đặc trưng của việc kích hoạt tín hiệu RLR—sau khi kích thích bằng EMCV RNA nhưng không loại bỏ việc sản xuất IFN-RABVLe cũng như biểu hiện bản sao kháng vi-rút trong NHLF được thay thế bằng EMCV RNA, nhưng không có trong các tế bào được kích thích bằng RABVLe hoặc SeV (Hình 1f và Hình dữ liệu mở rộng. 1h). Sự im lặng qua trung gian RNA của kẹp tóc (sh) nhỏ của ISG15 hoặc MDA5 trong các tế bào đơn nhân máu ngoại vi nguyên phát ở người (PBMC) cũng làm giảm đáng kể biểu hiện protein và bản sao kháng virus sau khi bị nhiễm EMCV đột biến tái tổ hợp (mutEMCV) thiếu chất đối kháng MDA518,19, so với các PBMC bị nhiễm được tải nạp shRNA kiểm soát không nhắm mục tiêu (Hình 1g, h và Hình dữ liệu mở rộng. 1i). Ngược lại, sự suy giảm ISG15 hoặc MDA5 không ảnh hưởng đến phản ứng của cytokine trong PBMC sau khi bị nhiễm SeV (Hình 1g, h và Hình dữ liệu mở rộng. 1i). Những kết quả này cho thấy ISG15 cần thiết cho việc truyền tín hiệu miễn dịch bởi MDA5, chứ không phải RIG-I. THẺ MDA5 được ISGylat hóa ở Lys23 và Lys43.
lợi ích cistanche cho nam giới - tăng cường hệ thống miễn dịch
Để chứng thực phân tích MS của chúng tôi đã xác định ISGylation MDA5–2CARD, trước tiên chúng tôi đã kiểm tra xem MDA5 nội sinh có được sửa đổi bởi ISG15 hay không. MDA5 nội sinh được ISGylat hóa mạnh mẽ trong các tế bào được thay thế bằng HMW-poly (I: C) hoặc bị nhiễm vi rút sốt xuất huyết (DENV) hoặc Virus ZIKV) được MDA5 cảm nhận được (tham khảo 5) (Hình 2a). Đáng chú ý, MDA5 nội sinh cũng được ISGylat hóa trong các tế bào không bị nhiễm, mặc dù ở mức rất thấp (Hình dữ liệu mở rộng 2a), phù hợp với những phát hiện trước đó rằng nhiều protein chủ cũng được ISGylat hóa ở mức thấp trong điều kiện bình thường (không bị nhiễm)20. Trong các tế bào được xử lý bằng chất kháng IFNAR2 để ngăn chặn quá trình điều hòa ISG qua trung gian tín hiệu IFNAR, việc tắt tiếng ISG15 hoặc MDA5 đã dẫn đến giảm biểu hiện gen IFNB1 tương đương sau khi nhiễm mutEMCV (Dữ liệu mở rộng Hình 2b), cho thấy rằng sự phụ thuộc ISG{20}} Tín hiệu MDA5 xảy ra ngay cả khi không có tín hiệu IFNAR.
t MDA5Δ2CARD (chứa helicase và CTD), là vị trí chính của MDA5 ISGylation hiển thị hai dải nổi bật cho ISGylat 2CARD (Hình 2b). Sự tái tạo các tế bào ISG15 KO HeLa bằng WT ISG15 hoặc đột biến ISG15 không liên hợp trong đó hai glycine cần thiết cho quá trình liên hợp đã được thay thế bằng alanine (ISG15-AA)21, thể hiện liên hợp ISG15 cộng hóa trị (Hình 2c) . Sự đột biến của dư lượng lysine riêng lẻ trong GST–MDA5–2CARD thành arginine cho thấy đột biến tại một vị trí của Lys23 và Lys43 làm giảm đáng kể ISGylation (Hình dữ liệu mở rộng 2c), trong khi đột biến kết hợp của chúng (Lys23Arg/Lys43Arg) gần như đã loại bỏ ISGylation (Hình 2d). ). FLAG–MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg có độ dài đầy đủ cũng cho thấy ISGylation giảm rõ rệt (Hình 2e và Hình dữ liệu mở rộng. 2d); ISGylation còn sót lại được thấy trong FLAG–MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg có thể là do các vị trí nhỏ bổ sung trong 2CARD và/hoặc Δ2CARD. Đáng chú ý, đột biến Lys23Arg/Lys43Arg không ảnh hưởng đến MDA5–2CARD SUMOylation5 (Hình dữ liệu mở rộng 2e). Hơn nữa, trong khi RIG-I–2CARD được phổ biến khắp nơi một cách mạnh mẽ (đại diện cho sự phổ biến khắp nơi được liên kết cộng hóa trị Lys63-), cả MDA5–2CARD WT lẫn đột biến Lys23Arg/Lys43Arg đều không cho thấy mức độ phổ biến khắp nơi có thể phát hiện được (Dữ liệu mở rộng Hình 2f). Nói chung, các kết quả này chỉ ra rằng THẺ MDA5 trải qua quá trình ISGylation tại hai địa điểm chính là Lys23 và Lys43.
CARD ISGylation là cần thiết để kích hoạt MDA5.
Khi so sánh khả năng truyền tín hiệu của chúng, các thể đột biến tại một vị trí MDA5–2CARD Lys23Arg và Lys43Arg cho thấy hoạt động của trình khởi động IFN-giảm một phần so với WT MDA5–2CARD, trong khi đột biến Lys23Arg/Lys43Arg có hoạt động truyền tín hiệu giảm đáng kể, hoạt động này gần như mạnh mẽ. giống như của các đột biến khiếm khuyết tín hiệu Ser88Glu và Ser88Asp6 (Hình dữ liệu mở rộng. 2g). Ngược lại, một thể đột biến trong đó Lys68, là gốc lysine gần nhất với Lys43 và Lys23, được thay thế bằng arginine (Lys68Arg) cho thấy khả năng liên hợp ISG15 và khả năng báo hiệu tương đương với WT 2CARD (Hình dữ liệu mở rộng 2c, g). MDA5–2CARD Lys23Arg/Lys43Arg, trái ngược với WT MDA5–2CARD, cũng không thể tạo ra sự thu nhỏ IRF3 (Hình dữ liệu mở rộng 2h). FLAG–MDA5 Lys23Arg, Lys43Arg hoặc Lys23Arg/Lys43Arg cũng cho thấy khả năng kích hoạt IFN-promer bị giảm hoặc gần như bị bãi bỏ, so với FLAG–MDA5 WT (Hình 2f). MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg cho thấy khiếm khuyết tín hiệu sâu sắc ngay cả khi được biểu hiện ở mức cao, trong khi WT MDA5 tạo ra các bản phiên mã kháng vi-rút theo cách phụ thuộc vào liều (Hình 2g). Theo thỏa thuận, quá trình phosphoryl hóa STAT1, một dấu hiệu đặc trưng của tín hiệu IFNAR, cũng như biểu hiện protein ISG được tạo ra rất nhiều bởi MDA5 WT, nhưng không phải Lys23Arg/Lys43Arg (Hình 2h). Việc bổ sung các tế bào hình sao ở người được chỉnh sửa gen MDA5-(SVGA) bằng MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg hoặc Ser88Glu đã dẫn đến các bản phiên mã IFNB1, CCL5 và ISG giảm đáng kể so với các tế bào biểu thị WT MDA5 (Hình 2i và Dữ liệu mở rộng Hình 2i) . Những kết quả này chứng minh rằng ISGylation ở Lys23 và Lys43 là cần thiết cho phản ứng cytokine qua trung gian MDA{64}}.
lợi ích cistanche cho nam giới - tăng cường hệ thống miễn dịch
Quá trình khử phospho bằng PP1 điều chỉnh MDA5 ISGylation.
Tương tự như RIG-I, MDA5 bị phosphoryl hóa trong CARD ở các tế bào chưa bị nhiễm bệnh, điều này ngăn cản quá trình tự động kích hoạt; Quá trình khử phospho của RIG-I và MDA5 bằng PP1 / là rất quan trọng để giải phóng RLR khỏi trạng thái bị ức chế tín hiệu6,22–24. Quá trình khử phospho của RIG-I cho phép sự phổ biến liên kết Lys{10}}của CARD, giúp thúc đẩy quá trình đa phân hóa và truyền tín hiệu RIG-I5. Các chi tiết về cách quá trình khử phospho CARD (tại Ser88) kích hoạt kích hoạt MDA5 vẫn khó nắm bắt và do đó chúng tôi đã kiểm tra xem liệu quá trình khử phospho có điều chỉnh MDA5 ISGylation hay không. Im lặng của PP1 / ISGylation MDA5–2CARD giảm mạnh (Hình dữ liệu mở rộng 3a). Hơn nữa, các đột biến phosphomimetic Ser88Glu và Ser88Asp đã làm giảm ISGylation, trong khi đột biến phospho-null Ser88Ala cho thấy ISGylation mạnh hơn WT MDA5–2CARD (Hình dữ liệu mở rộng 3b). Ngược lại, MDA5 WT và Lys23Arg/Lys43Arg có mức độ phosphoryl hóa Ser88 tương đương (Hình dữ liệu mở rộng 3c). Cùng với nhau, những dữ liệu này cho thấy quá trình khử phospho MDA5 tại Ser88 diễn ra trước CARD ISGylation. Tiếp theo, chúng tôi đã sử dụng protein V của virus sởi (MeV-V), chất này đối kháng với quá trình khử phospho MDA5 Ser88 thông qua PP1 / đối kháng25. Biểu hiện MeV-V đã tăng cường quá trình phosphoryl hóa Ser88 (biểu thị quá trình khử phospho bị loại bỏ) của GST–MDA5–2CARD hoặc FLAG–MDA5 theo cách phụ thuộc vào liều, như đã trình bày trước đây25. Quá trình phosphoryl hóa được tăng cường bởi MeV-V tương quan với sự suy giảm ISGylation (Hình dữ liệu mở rộng 3d, e). Ngược lại với WT MeV-V, một MeV-V đột biến đã loại bỏ sự liên kết PP1-và sự đối kháng khử phospho MDA5-(MeV-VΔtail)25, cho thấy ít ảnh hưởng đến MDA5–2CARD ISGylation (Dữ liệu mở rộng Hình 3f), tăng cường sự ức chế ISGylation chủ yếu là do ức chế PP1 chứ không phải do tác dụng đối kháng khác của MeV-V. Các protein V từ virus Nipah và Hendra (NiV-V và HeV-V) cũng tăng cường quá trình phosphoryl hóa MDA5 Ser88 và tương ứng, làm giảm MDA5 ISGylation (Hình dữ liệu mở rộng 3g, h), cho thấy rằng một số protein V paramyxovirus ức chế MDA5 ISGylation thông qua thao tác của quá trình phosphoryl hóa Ser88, mặc dù các cơ chế chính xác cho từng protein V vẫn chưa được xác định. Kết hợp lại với nhau, những dữ liệu này cho thấy ISGylation THẺ MDA5 phụ thuộc vào quá trình khử phospho tại Ser88.
ISGylation thúc đẩy các tổ hợp MDA5 bậc cao hơn.
Kích hoạt RLR yêu cầu liên kết RNA, oligome hóa RLR và chuyển vị trí của chúng từ cytosol sang ty thể để tương tác với MAVS5. Để làm sáng tỏ cơ chế mà ISGylation tác động đến hoạt động MDA5, trước tiên chúng tôi đã kiểm tra xem ISGylation có ảnh hưởng đến liên kết RNA hay không. MDA5 nội sinh được tinh chế từ WT hoặc Isg15−/− MEF tương tác tốt như nhau với HMW-poly(I: C) trong ống nghiệm (Hình dữ liệu mở rộng 4a). MDA5 WT và Lys23Arg/Lys43Arg cho thấy khả năng liên kết tương đương với HMW-poly(I: C), cho thấy ISGylation không ảnh hưởng đến khả năng liên kết RNA của MDA5 (Hình dữ liệu mở rộng 4b). Khi chúng tôi theo dõi quá trình chuyển vị của MDA5 từ cytosol sang ty thể sau khi kích thích RNA EMCV, chúng tôi thấy rằng ISG15 im lặng, nhưng không chuyển đổi so.C, đã bãi bỏ chuyển vị MDA5 (Hình 3a). Ngược lại, chuyển vị RIG-I sau khi chuyển đổi RABVLe lại hiệu quả ở cả ISG{18}}đã cạn kiệt và si. Các tế bào được chuyển hóa C (Hình 3b). Những dữ liệu này chỉ ra rằng ISGylation điều chỉnh chuyển vị MDA5 hoặc một bước ngược dòng của nó. Vì quá trình chuyển vị từ cytosol sang ty thể của MDA5 đòi hỏi phải có sự tương tác với 14-3-3η26, nên chúng tôi đã so sánh liên kết 14-3-3η của WT và MDA5 đột biến. Khả năng của MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg liên kết 14-3-3η tương tự như khả năng của WT MDA5 hoặc đột biến Lys68Arg (Hình dữ liệu mở rộng 4c). Tuy nhiên, trong khi sự kích thích RNA EMCV tạo ra quá trình oligome hóa MDA5 một cách hiệu quả trong các MEF WT, thì sự hình thành các oligome MDA5 đã bị loại bỏ trong các MEF thiếu ISG{38}} (Hình 3c). Sự phân hủy ISG15 trong các tế bào 293T cũng xóa bỏ quá trình oligome hóa FLAG–MDA5–2CARD (Hình 3d). Ngược lại, sự phối hợp của các thành phần máy móc ISGylation, Ube1L và UbcH8, đã tăng cường mạnh mẽ quá trình oligome hóa MDA5–2CARD trong si. Các tế bào được chuyển hóa C, nhưng không có trong các tế bào đã cạn kiệt ISG{51}}(Hình 3d), cho thấy rằng ISGylation là cần thiết để hình thành oligome MDA5. Để hỗ trợ cho khái niệm này, FLAG–MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg cho thấy quá trình oligome hóa gần như bị bãi bỏ, trong khi WT MDA5 được oligome hóa một cách hiệu quả (Hình 3e). Chúng tôi cũng so sánh tác động của đột biến Lys23 Arg/Lys43Arg với đột biến gây rối loạn oligome hóa định vị vào giao diện giữa các monome MDA5 và cản trở quá trình tạo sợi MDA5 qua trung gian gắn với RNA (Ile841Arg/Glu842Arg và Asp848Ala/Phe849Ala)27,28, hoặc vào CARD (Gly74Ala/Trp75Ala) và phá vỡ quá trình oligome hóa 2CARD27. Không giống như WT MDA5, đột biến Lys23Arg/Lys43Arg, tương tự như MDA5 Gly74Ala/Trp75Ala, cho thấy thiếu hụt quá trình oligome hóa và phù hợp với điều này, đã loại bỏ khả năng kích hoạt IFN-promer (Hình 3f, g). Việc giới thiệu Lys23Arg/Lys43Arg vào nền Ile841Arg/Glu842Arg hoặc Asp848Ala/Phe849Ala, cả hai đều làm giảm quá trình oligome hóa và truyền tín hiệu MDA5, đồng thời loại bỏ sự hình thành oligome MDA5 và cảm ứng IFN- (Hình 3f, g). Vì LGP2 tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tạo mầm MDA5 trên RNA chuỗi kép và do đó quá trình oligome hóa MDA529,30, chúng tôi đã so sánh liên kết LGP2 của MDA5 WT và Lys23Arg/Lys43Arg. MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg tương tác với LGP2 hiệu quả như WT MDA5 (Hình dữ liệu mở rộng 4d), củng cố đề xuất rằng CARD ISGylation thúc đẩy quá trình oligome hóa MDA5 độc lập với dây tóc qua trung gian gắn RNA. Nói chung, các kết quả này chứng minh rằng ISGylation tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình oligome hóa CARD và các tổ hợp MDA5 bậc cao hơn.
Hình 2|Kích hoạt MDA5 yêu cầu ISGylation tại Lys23 và Lys43. ISGylation MDA5 nội sinh trong NHLF đã được xử lý giả, được thay thế bằng HMW-poly(I: C) (0.1 µg ml−1 ) trong 40 giờ (trái) hoặc bị nhiễm DENV hoặc ZIKV (MOI {{ 10}} cho mỗi loại) trong 48 giờ (phải), được xác định bằng IP có kháng thể kháng MDA5 (hoặc biện pháp kiểm soát kiểu mẫu IgG) và IB có kháng thể kháng ISG15. b, ISGylation của MDA5–2CARD và MDA5Δ2CARD được gắn thẻ FLAG trong các tế bào HEK293T được chuyển hóa tạm thời cũng biểu thị V5–ISG15, HA–Ube1L và FLAG–UbcH8, được FLAG PD và IB đánh giá với khả năng chống V5 sau 40 giờ sau khi truyền. c, MDA5 ISGylation nội sinh trong các tế bào ISG15 KO HeLa được hoàn nguyên ổn định bằng vectơ, WT ISG15 hoặc ISG15-AA và được đồng thay thế bằng HA–Ube1L và FLAG–UbcH8 sau khi xử lý bằng IFN- (1,000 U ml−1 ) trong 24 giờ, được xác định bằng IP có anti-MDA5 và IB có anti-ISG15. d, ISGylation của GST–MDA5–2CARD WT và Lys23Arg/ Lys43Arg trong các tế bào HEK293T đã được đồng bộ hóa với V5–ISG15, HA–Ube1L và FLAG–UbcH8 trong 24 giờ, được xác định bởi GST PD và IB với chất chống V5. e, ISGylation của FLAG–MDA5 WT và Lys23Arg/Lys43Arg trong các tế bào HEK293T đã được đồng bộ hóa với V5–ISG15, HA–Ube1L và FLAG–UbcH8, được xác định bởi FLAG PD và IB với chất chống V5. f, Hoạt động của trình báo cáo IFN-luciferase trong các tế bào HEK293T được truyền trong 40 giờ bằng vectơ, FLAG–MDA5 WT hoặc các thể đột biến. Các giá trị Luciferase được trình bày dưới dạng cảm ứng gấp so với các giá trị cho các ô được truyền vectơ, được đặt thành 1. WCL đã được IB thăm dò bằng chất chống FLAG và chống Actin. g, Phân tích RT–qPCR của IFNB1 và CCL5 mRNA trong các tế bào HEK293T được chuyển hóa tạm thời bằng vectơ hoặc tăng số lượng FLAG–MDA5 WT hoặc Lys23Arg/Lys43Arg. h, sự phosphoryl hóa STAT1 và sự phong phú protein ISG (IFIT1 và -2) trong WCL của các tế bào HEK293T được chuyển hóa tạm thời bằng vectơ hoặc FLAG–MDA5 WT hoặc Lys23Arg/Lys43Arg, được xác định bởi IB. I, phân tích RT-qPCR của các gen kháng vi-rút được chỉ định trong MDA5 KO SVGA được hoàn nguyên tạm thời bằng vectơ trống hoặc MDA5 WT, Lys23Arg/Lys43Arg hoặc Ser88Glu được gắn thẻ FLAG. Dữ liệu đại diện cho ít nhất hai thử nghiệm độc lập có kết quả tương tự (trung bình ± sd của n= 3 lần sao chép sinh học trong f, g và i). *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).
Hình 3|CARD ISGylation thúc đẩy sự hình thành các tổ hợp MDA5 bậc cao hơn. a,b, Phân đoạn Cytosol–ty thể của WCL từ NHLF đã được truyền trong 30 giờ với siRNA kiểm soát không nhắm mục tiêu (si. C) hoặc siRNA cụ thể ISG15- (si.ISG15) và sau đó được xử lý mô phỏng hoặc được chuyển nhiễm bằng EMCV RNA (0.4 µg ml−1 ) (a) hoặc RABVLe (1 pmol ml−1 ) (b) trong 16 giờ. IB được thực hiện với thuốc chống MDA5 (a), thuốc chống RIG-I (b), thuốc chống ISG15 và thuốc chống Actin (a và b). -Tubulin và MAVS đóng vai trò là chất đánh dấu độ tinh khiết cho phần tế bào và ty thể tương ứng (a và b). c, Quá trình oligome hóa MDA5 nội sinh trong WT và Isg15-/− MEF đã được thay thế bằng EMCV RNA (0,5 µg ml-1 ) trong 16 giờ và được đánh giá bằng SDD–AGE và IB với chất chống MDA5. WCL đã được phân tích sâu hơn bằng TRANG WEB SDS và được IB thăm dò bằng chất chống MDA5 và chất chống Actin. d, Quá trình oligome hóa FLAG–MDA5–2CARD trong các tế bào HEK293T đã được thay thế bằng các siRNA được chỉ định, có hoặc không có HA–Ube1L và FLAG–UbcH8 trong 48 giờ, được xác định bởi NativePAGE và IB với tính năng chống FLAG. WCL đã được phân tích sâu hơn bằng TRANG WEB SDS và được IB thăm dò với chất chống FLAG, chống HA, chống ISG15 và chống Actin. e, Quá trình oligome hóa FLAG–MDA5 WT và Lys23Arg/Lys43Arg trong các tế bào MDA5 KO HEK293 được chuyển hóa tạm thời, được đánh giá bởi SDD–AGE và IB với khả năng chống FLAG. WCL được phân tích sâu hơn bằng TRANG WEB SDS và IB với tính năng chống FLAG và chống Actin. f, Quá trình oligome hóa MDA5 WT được gắn thẻ FLAG và các đột biến trong các tế bào MDA5 KO HEK293 được chuyển hóa tạm thời, được đánh giá bởi NativePAGE và IB bằng chất chống MDA5. WCL đã được phân tích sâu hơn bằng TRANG WEB SDS và được IB thăm dò bằng chất chống MDA5 và chất chống Actin. g, Hoạt động của trình báo cáo IFN-luciferase trong các tế bào MDA5 KO HEK293 được truyền trong 24 giờ với vectơ trống hoặc MDA5 WT được gắn thẻ FLAG hoặc các đột biến. Hoạt động của Luciferase được trình bày dưới dạng cảm ứng gấp so với các giá trị của các ô được truyền vectơ, được đặt thành 1. Dữ liệu biểu thị ít nhất hai thử nghiệm độc lập có kết quả tương tự (trung bình ± sd của n= 3 lần sao chép sinh học tính bằng g). ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).
Tín hiệu MDA5 phụ thuộc ISGylation hạn chế sự nhân lên của virus.
Tiếp theo chúng tôi đã đánh giá xem liệu ISGylation của MDA5 có cần thiết cho khả năng hạn chế sự nhân lên của virus hay không. FLAG–MDA5 WT, nhưng không phải Lys23Arg/Lys43Arg, có khả năng ức chế sao chép EMCV (Hình 4a). Tương tự, các tế bào MDA5 KO HEK293 được hoàn nguyên bằng WT MDA5, nhưng không phải các tế bào được bổ sung đột biến Lys23Arg/Lys43Arg, hạn chế sao chép DENV một cách hiệu quả (Hình 4b). Chúng tôi cũng tái tạo SVGA tế bào hình sao MDA5 KO, một loại tế bào có liên quan về mặt sinh lý đối với nhiễm ZIKV, bằng vectơ hoặc MDA5 WT hoặc Lys23Arg/Lys43Arg, sau đó đánh giá sự sao chép ZIKV trong khoảng thời gian 40-h. Sự sao chép ZIKV bị suy giảm ~100-gấp trong các ô được hoàn nguyên bằng WT MDA5 so với các ô biểu thị vectơ. Ngược lại, các ô được bổ sung MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg không hạn chế ZIKV, tương tự như các ô biểu thị MDA5 Ser88Glu (Hình 4c). WT MDA5, chứ không phải Lys23Arg/Lys43Arg, cũng hạn chế sự sao chép của SCoV2, mặc dù ở mức độ thấp hơn so với các loại virus khác được thử nghiệm (Hình 4d).
Hình 4|ISGylation là cần thiết để hạn chế virus bằng MDA5. Hiệu giá EMCV trong phần nổi phía trên của các tế bào HEK293T đã được truyền trong 40 giờ bằng vectơ hoặc FLAG–MDA5 WT hoặc Lys23Arg/Lys43Arg, sau đó bị nhiễm EMCV (MOI=0.001) trong 24 h, được xác định bằng xét nghiệm TCID50. b, Tỷ lệ tế bào MDA5 KO HEK293 bị nhiễm DENV được truyền trong 24 giờ bằng vectơ hoặc FLAG–MDA5 WT hoặc Lys23Arg/Lys43Arg, sau đó mô phỏng đã được xử lý hoặc bị nhiễm DENV (MOI=5) trong 48 giờ , được FACS đánh giá bằng cách sử dụng thuốc chống flavivirus E (4G2). SSC, phân tán bên. c, Chuẩn độ ZIKV trong phần nổi phía trên của MDA5 KO SVGA đã được truyền trong 30 giờ bằng MDA5 WT, Lys23Arg/Lys43Arg hoặc Ser88Glu và sau đó bị nhiễm ZIKV (MOI=0.1) trong thời gian được chỉ định , được xác định bằng xét nghiệm mảng bám. pfu, đơn vị hình thành mảng bám; hpi, vài giờ sau khi nhiễm bệnh. d, Hiệu giá SCoV2 trong phần nổi phía trên của các tế bào HEK293T–hACE2 đã được truyền trong 24 giờ với vectơ trống hoặc FLAG–MDA5 WT hoặc Lys23Arg/Lys43Arg, sau đó bị nhiễm SCoV2 (MOI=0.5) trong 24 giờ h, được xác định bằng xét nghiệm mảng bám. e, Sơ đồ phương pháp tiếp cận thử nghiệm để 'tách' vai trò của ISG15 trong cảm ứng IFN qua trung gian MDA{46}} khỏi vai trò của nó trong việc làm giảm tín hiệu IFNAR. Sup., nổi phía trên. f, các tế bào 'người hiến tặng' NHLF đã được truyền các siRNA được chỉ định trong 40 giờ và sau đó bị nhiễm mutEMCV (MOI=0.1) trong 16 giờ. Chất nổi trên bề mặt tế bào bị bất hoạt bằng tia cực tím và được chuyển vào tế bào 'người nhận' Vero. Sau 24 giờ, các tế bào bị nhiễm ZIKV (MOI=0.002–2) trong 72 giờ và các tế bào dương tính với ZIKV được xác định bằng cách tạo màu miễn dịch bằng chất chống flavivirus E (4G2) và TrueBlue peroxidase. g, các tế bào 'nhà tài trợ' RIG-I KO HEK293 đã được thay thế bằng si. C hoặc si.ISG15 cùng với vectơ hoặc FLAG–MDA5 WT hoặc Lys23Arg/Lys43Arg, trong 24 giờ, sau đó là nhiễm EMCV (MOI=0.001) trong 16 giờ. Chất nổi trên bề mặt tế bào bị bất hoạt bằng tia cực tím được chuyển vào tế bào 'người nhận' Vero trong 24 giờ, sau đó bị nhiễm EMCV (MOI=0.001–0.1) trong 40 giờ. Hiệu ứng tế bào học do EMCV gây ra được hình dung bằng nhuộm màu Coomassie Blue. Dữ liệu đại diện cho ít nhất hai thử nghiệm độc lập có kết quả tương tự (trung bình ± sd của n= 3 lần sao chép sinh học trong a–d). *P< 0.05, **P< 0.01 (two-tailed, unpaired Student's t-test).
Tiếp theo, chúng tôi xác định ảnh hưởng của việc tắt tiếng ISG15 đến khả năng ức chế sự nhân lên của vi rút của MDA5. Mặc dù MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg không thể ngăn chặn việc sao chép EMCV bất kể chế độ im lặng của ISG15, nhưng WT MDA5 đã hạn chế sao chép EMCV một cách hiệu quả trong si. Các ô được chuyển mã C và thật bất ngờ, cả trong các ô đã cạn kiệt ISG{8}}(Dữ liệu mở rộng Hình 5a). Khi khám phá cơ chế cơ bản của những kết quả không mong đợi này, chúng tôi đã phát hiện ra rằng các tế bào bị nhiễm EMCV biểu hiện WT MDA5 đã tăng cường rõ rệt mức độ biểu hiện protein ISG khi ISG15 ở trạng thái im lặng so với các tế bào bị nhiễm được thay thế bằng WT MDA5 và si. C (Dữ liệu mở rộng Hình 5b). Tương tự, người ta cũng quan sát thấy bản phiên mã ISG và biểu hiện protein tăng cao trong các tế bào thiếu ISG{15}}được truyền EMCV RNA hoặc bị nhiễm mutEMCV, mặc dù đã loại bỏ cảm ứng IFN (Dữ liệu mở rộng Hình 5c, d). Ngược lại, việc hạ gục MDA5 đã loại bỏ cả biểu hiện protein IFN- và ISG, như mong đợi (Hình dữ liệu mở rộng 5d). Chúng tôi nhận thấy rằng lượng protein dồi dào của USP18, một loại enzyme khử phổ biến điều chỉnh tiêu cực tín hiệu IFNAR31, đã giảm đáng kể ở các tế bào bị suy giảm ISG{23}}sau khi nhiễm EMCV so với các tế bào bị nhiễm được truyền si. C hoặc siRNA cụ thể MDA{24}}(Dữ liệu mở rộng Hình 5b,d), phù hợp với vai trò được báo cáo của ISG15 trong việc ngăn chặn sự xuống cấp của USP1832. Cùng với nhau, những dữ liệu này cho thấy rằng trong cài đặt thử nghiệm nhắm mục tiêu gen ISG{29}}(tức là làm im lặng hoặc KO), tác dụng kháng vi-rút của MDA5 ISGylation bị che lấp bởi sự điều hòa ISG bất thường do sự cắt bỏ tác dụng ức chế của ISG15 đối với tín hiệu IFNAR.
Hình 5|SCoV2 PLpro liên kết và khử ISGylate MDA5–2CARD. một biểu diễn Ribbon về cấu trúc tinh thể của phức hợp SCoV2 PLpro: ISG15 (Ngân hàng dữ liệu protein, số đăng nhập 6YVA). Dư lượng chính làm trung gian cho tương tác trang 1 (Asn156 và Arg166 / Glam167) hoặc tương tác trang 2 (Phe69) trong PLpro, cũng như trang hoạt động xúc tác của nó (Cys111), được chỉ định. b, ISGylation của GST–MDA5–2CARD trong các ô HEK293T đã được đồng thay thế trong 20 giờ với vectơ hoặc V5-được gắn thẻ SCoV2 PLpro WT hoặc các thể đột biến, cùng với FLAG–ISG15, HA–Ube1L và FLAG–UbcH8, được xác định bằng GST PD và IB có anti-FLAG và anti-GST. WCL đã được IB thăm dò với chất chống V5, chống HA, chống FLAG và chống Actin. c, Liên kết MDA5 hoặc RIG-I được gắn thẻ HA với V5-được gắn thẻ SCoV2– PLpro hoặc MeV-V được gắn thẻ FLAG (kiểm soát dương tính) trong các tế bào HEK293T được chuyển nhiễm tạm thời, được xác định bởi HA PD và IB có kháng thể V5 hoặc chống FLAG và chống HA. WCL đã được IB thăm dò với chất chống V5 và chống FLAG. d, Quá trình oligome hóa FLAG–MDA5–2CARD trong các ô HEK293T được đồng thay thế bằng vectơ hoặc V5-được gắn thẻ SCoV2 PLpro WT hoặc Cys111Ala trong 24 giờ, được đánh giá bởi NativePAGE và IB bằng tính năng chống FLAG. WCL được phân tích sâu hơn bằng TRANG WEB SDS và được IB thăm dò với chất chống FLAG, chống V5 và chống Actin. e, ISGylation của GST–MDA5–2CARD trong các tế bào HEK293T cũng biểu thị FLAG–ISG15, HA–Ube1L và FLAG–UbcH8 và được đồng chuyển nhiễm trong 40 giờ với vectơ hoặc PLpro virus corona được gắn thẻ V{68}} được chỉ định protein, được xác định bởi GST PD và IB với anti-FLAG, anti-V5 và anti-GST. Dữ liệu đại diện cho ít nhất hai thí nghiệm độc lập có kết quả tương tự.
Tiếp theo, chúng tôi đã sử dụng một thử nghiệm bảo vệ vi rút để tách thử nghiệm tín hiệu MDA5 trong các tế bào bị nhiễm vi rút khỏi tín hiệu IFNAR xuôi dòng trong cùng các tế bào (Hình 4e). Chất nổi trên bề mặt từ các tế bào 'cho' bị nhiễm đột biếnEMCV hoặc là si. C được truyền hoặc bị cạn kiệt ISG15 hoặc MDA5, bị tia cực tím (UV) bất hoạt và sau đó được chuyển sang các tế bào 'nhận' không bị nhiễm. Sau đó, các tế bào nhận 'được mồi' đã bị nhiễm ZIKV để theo dõi trực tiếp tác dụng kháng vi-rút của quá trình sản xuất IFN qua trung gian MDA{6}} của các tế bào hiến tặng. Trong khi đó các chất nổi phía trên từ si. Các tế bào 'người hiến tặng' được truyền C có khả năng ức chế sự sao chép ZIKV và các chất nổi trên bề mặt từ các tế bào phân hủy ISG15 hoặc MDA5 hạn chế tối thiểu việc nhiễm ZIKV (Hình 4f). Tương tự, các chất nổi trên bề mặt nuôi cấy từ các tế bào hiến tặng bị nhiễm EMCV được truyền WT MDA5 cùng với si. C dẫn đến sự bảo vệ tốt hơn các tế bào nhận khỏi thách thức virus so với các tế bào biểu hiện WT MDA5 và cạn kiệt ISG15 (Hình 4g). Nói chung, những dữ liệu này chứng minh rằng ISGylation đóng vai trò quan trọng trong việc hạn chế{16}}qua trung gian MDA đối với nhiều loại vi-rút RNA.
Hình 6|SCoV2 PLpro ức chế tín hiệu MDA5 qua trung gian ISG{2}} thông qua hoạt động khử ISGylase của nó. a, Phân tích RT–qPCR của các bản phiên mã IFNB1, IFNL1, ISG15, MDA5 và RIG-I trong NHLF đã được thay thế bằng các siRNA được chỉ định trong 40 giờ và sau đó được thay thế bằng RNA giả hoặc RNA SCoV2 (0,4 µg ml −1 ) trong 24 giờ. b, Liên kết SCoV2 Nsp3 với MDA5 nội sinh trong các tế bào A549–hACE2 bị nhiễm SCoV2 (MOI=0.5) trong 24 giờ, được xác định bằng IP có kháng-MDA5 (hoặc kiểm soát kiểu mẫu IgG), sau đó là IB với kháng thể Nsp3 và kháng MDA5. WCL đã được IB thăm dò với chất chống Nsp3 và chất chống Actin. c, MDA5 ISGylation nội sinh trong các tế bào A549–hACE2 bị nhiễm giả hoặc bị nhiễm SCoV2 (MOI=0.5) trong 40 giờ với sự hiện diện của chất ức chế PLpro (GRL-0617; 50 µM) hoặc phương tiện đối chứng (dimethylsulfoxide), được xác định bằng IP có kháng-MDA5 (hoặc đối chứng kiểu mẫu IgG), tiếp theo là IB có kháng-ISG15 và kháng-MDA5. Sự phong phú về protein của IFIT1, RSAD2, ISG15 và Actin trong WCL đã được IB thăm dò. Sự sao chép virus hiệu quả đã được IB xác minh bằng anti-Nsp3 và anti-Spike (S). d, Phân tích RT–qPCR của các bản phiên mã IFNB1, CCL5 và IFIT1 cũng như RNA bộ gen EMCV (gRNA), trong các tế bào HeLa được chuyển nhiễm tạm thời trong 24 giờ bằng vectơ, hoặc V5–SCoV2 PLpro WT hoặc các đột biến, sau đó bị nhiễm mutEMCV (MOI=0.5) trong 12 giờ. e, Chuẩn độ EMCV trong phần nổi phía trên của các tế bào RIG-I KO HEK293 được chuyển hóa tạm thời trong 24 giờ bằng vectơ hoặc FLAG–MDA5, cùng với SCoV2 PLpro WT, Cys111Ala hoặc Arg166Ser/Glu167Arg được gắn thẻ V5-, sau đó bị nhiễm bệnh với EMCV (MOI=0.001) trong 16 giờ, được xác định bằng xét nghiệm mảng bám. f, Sự phong phú về protein của các ISG được chỉ định trong WCL từ thí nghiệm ở e, được xác định bởi IB với các kháng thể được chỉ định. Dữ liệu đại diện cho ít nhất hai thử nghiệm độc lập có kết quả tương tự (trung bình ± sd của n{76}} lần sao chép sinh học trong a, d và e). *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).
SCoV2 PLpro nhắm mục tiêu MDA5 để khử ISGylation.
Các loại virus Corona như SARS-CoV (SCoV), MERS–CoV và SCoV2 mới xuất hiện gần đây mã hóa một PLpro làm trung gian cho sự phân cắt polyprotein của virus33. Ngoài ra, PLpro còn có các hoạt động khử phổ biến và khử ISGylating. SCoV2 PLpro gần đây đã được chứng minh là có khả năng điều chỉnh các phản ứng chống vi-rút chủ yếu thông qua hoạt động khử ISGylase của nó15. Vì MDA5 được biết đến là cảm biến chính để phát hiện vi-rút Corona34,35 và vì dữ liệu của chúng tôi cho thấy rằng ISGylation là cần thiết để hạn chế vi-rút qua trung gian MDA{10}}nên chúng tôi đã kiểm tra xem liệu SCoV2 PLpro có loại bỏ MDA5 ISGylation bằng enzyme để đối kháng với khả năng miễn dịch bẩm sinh hay không. SCoV2 PLpro WT, nhưng không phải là đột biến không hoạt động xúc tác (PLpro Cys111Ala)15, đã bãi bỏ ISGylation của GST–MDA5–2CARD và FLAG–MDA5 (Hình 5a, b và Hình dữ liệu mở rộng 6a). Các đột biến PLpro Asn156Glu và Arg166Ser/Glu167Arg, bị suy yếu nhẹ và nghiêm trọng trong liên kết ISG15 ở giao diện 'trang 1', tương ứng14,36, có ảnh hưởng nhẹ hoặc không ảnh hưởng đến ISGylation. Ngược lại, PLpro Phe69Ala, trong đó giao diện 'trang 2' ưu tiên xác định liên kết với ubiquitin, chứ không phải ISG15, bị gián đoạn14,36, làm giảm MDA5 ISGylation mạnh mẽ như WT PLpro (Hình 5a, b và Dữ liệu mở rộng Hình 6a ). Tuy nhiên, SCoV2 PLpro đã không ngăn chặn sự phổ biến của RIG-I–2CARD (Dữ liệu mở rộng Hình 6b). Chúng tôi nhận thấy rằng PLpro tương tác cụ thể với MDA5, chứ không phải RIG-I, cũng như MeV-V liên kết với MDA5 và đóng vai trò như một chất điều khiển37 (Hình 5c). Lượng tín hiệu PLpro bị ức chế thấp bởi MDA5, nhưng không phải RIG-I, trong khi đó lượng PLpro ức chế tín hiệu kháng vi-rút cao hơn bởi cả hai RLR (Dữ liệu mở rộng Hình 6c). Điều này củng cố việc MDA5 trở thành mục tiêu trực tiếp của PLpro. Khử ISGylation của IRF3 có thể giải thích cho tác dụng ức chế mà PLpro liều cao hơn gây ra đối với tín hiệu RLR15,38. Khi kiểm tra tác dụng của PLpro đối với quá trình oligome hóa MDA5–2CARD, PLpro WT chứ không phải Cys111Ala đã ngăn chặn hiệu quả quá trình oligome hóa MDA5–2CARD (Hình 5d), cho thấy rằng SCoV2 PLpro ức chế sự hình thành oligome MDA5 phụ thuộc ISGylation thông qua hoạt động enzyme của nó. Các enzyme PLpro của -coronaviruses, SCoV, MERS–CoV và virus viêm gan chuột (MHV), cũng như của -coronavirus HCoV-NL63 (NL63) cũng liên kết và giảm MDA5–2CARD ISGylation một cách hiệu quả (Hình 5e) , cho thấy rằng khả năng đối kháng MDA5 của PLpro có thể được bảo tồn rộng rãi ở các loại coronavirus.
cistanche thực vật tăng cường hệ thống miễn dịch
SCoV2 PLpro đối kháng tín hiệu MDA5 phụ thuộc ISG.
Tiếp theo, chúng tôi xác định mức độ liên quan của tín hiệu MDA5 phụ thuộc ISG{0}} đối với việc cảm ứng cytokine kháng virus do SCoV2 tạo ra. Vì nhiễm SCoV2 được biết là có khả năng tạo ra IFN loại I ở mức tối thiểu do khả năng đối kháng virus hiệu quả39, nên chúng tôi đã phân lập tổng số RNA từ các tế bào bị nhiễm SCoV2- và sau đó tái truyền nó vào tế bào để kích thích tín hiệu miễn dịch bẩm sinh. RNA SCoV2, nhưng không phải RNA từ các tế bào được xử lý mô phỏng, các bản phiên mã IFN được tạo ra mạnh mẽ; tuy nhiên, cảm ứng này đã giảm đi rõ rệt khi ISG15 hoặc MDA5 ở chế độ im lặng (Hình 6a). Việc hạ gục RIG-I không ảnh hưởng xấu đến biểu hiện gen kháng vi-rút do SCoV2 RNA gợi ra, cho thấy rằng SCoV2 RNA–PAMP chủ yếu được cảm nhận bởi trục ISG15–MDA5 (Hình 6a).
Chúng tôi phát hiện ra rằng protein phi cấu trúc SCoV2 3 (Nsp3), trong đó PLpro nằm, dễ dàng tương tác với MDA5 nội sinh trong quá trình nhiễm SCoV2 đích thực (Hình 6b). Không thể phát hiện được MDA5 ISGylation nội sinh trong các tế bào bị nhiễm SCoV2-, mặc dù vi rút đã kích hoạt biểu hiện ISG15; tuy nhiên, trong các tế bào bị nhiễm được điều trị bằng chất ức chế PLpro cụ thể15, MDA5 ISGylation và cảm ứng ISG xuôi dòng đã được tăng cường mạnh mẽ (Hình 6c), ủng hộ đề xuất rằng PLpro ngăn chặn hiệu quả MDA5 ISGylation và truyền tín hiệu trong quá trình nhiễm SCoV2 trực tiếp. Tiếp theo chúng tôi đã kiểm tra tác động của WT và PLpro đột biến đối với việc kích hoạt MDA5 nội sinh trong quá trình nhiễm mutEMCV. Phù hợp với tác dụng của chúng đối với MDA5 ISGylation (Hình 5b và Hình dữ liệu mở rộng 6a), SCoV2 PLpro WT và Phe69Ala đã ngăn chặn việc cảm ứng phiên mã kháng vi-rút, trong khi MDA5 Arg166Ser/Glu167Arg, tương tự như đột biến Cys111Ala, không ảnh hưởng đến biểu hiện gen kháng vi-rút (Hình 2). 6d). Đồng ý với điều này, quá trình sao chép mutEMCV đã được tăng cường trong các ô biểu thị PLpro WT hoặc Phe69Ala, nhưng không được tăng cường trong các ô biểu thị PLpro Cys111Ala hoặc Arg166Ser/Glu167Arg (Hình 6d). Tương tự, WT PLpro, nhưng không phải đột biến Arg166Ser/Glu167Arg hoặc Cys111Ala, đã chặn hạn chế EMCV bởi FLAG–MDA5 (Hình 6e); ảnh hưởng đến sự nhân lên của virus tương quan với các protein ISG cảm ứng (Hình 6f). Nói chung, điều này thiết lập SCoV2 PLpro như một chất đối kháng IFN có tác dụng khử ISGylates MDA5 một cách tích cực.
Cuộc thảo luận
Sự liên hợp ISG15 được biết là mang lại hoạt động chống vi-rút cho vô số loại vi-rút; tuy nhiên, chỉ có một số chất nền chính hãng được xác định12. Mặt khác, ISG15 ở dạng không liên hợp hoạt động tạm thời bằng cách củng cố sự ức chế tín hiệu IFNAR qua trung gian USP18-31,32,40. Nghiên cứu hiện tại xác định vai trò chính của ISGylation trong quá trình cảm ứng IFN qua trung gian MDA{8}}. Công việc của chúng tôi cũng nhấn mạnh tầm quan trọng của thiết kế thử nghiệm trong đó việc tách rời vai trò của ISG15 trong việc kích hoạt MDA5 khỏi vai trò làm giảm tín hiệu IFNAR là điều cần thiết để tiết lộ hoạt động chống vi rút mạnh mẽ của ISG15. Trong một sinh vật bị nhiễm bệnh, có thể là tổng hợp của nhiều sự kiện ISGylation (ảnh hưởng đến cả protein vật chủ và protein của virus) quyết định kết quả của nhiễm trùng và sinh bệnh học, có thể phụ thuộc vào bối cảnh12.
Lợi ích của cistanche tubulosa-tăng cường hệ thống miễn dịch
Phát hiện của chúng tôi chỉ ra rằng ISGylation MDA5 hoạt động tương tự như quá trình phổ biến liên kết Lys63-của RIG-I5: cả hai PTM (1) đều được điều chỉnh bởi quá trình khử phospho do PP1- gây ra và (2) thúc đẩy quá trình oligome hóa CARD và RLR cao hơn -đặt hàng các tập hợp. Tuy nhiên, trong khi ubiquitin có nhiều ở cả tế bào không bị nhiễm và tế bào bị nhiễm, biểu hiện ISG15 lại tăng mạnh khi kích thích IFN. Tuy nhiên, ngay cả ở mức cơ bản, ISG15 vẫn được liên hợp với nhiều protein chủ20, bao gồm cả MDA5 như nghiên cứu của chúng tôi đã chỉ ra, có thể đủ để kích hoạt MDA5 ban đầu. Trong quá trình lây nhiễm vi-rút được cảm nhận bởi nhiều PRR, MDA5 ISGylation có thể là một cơ chế 'mồi', nhờ đó ISG15 được điều chỉnh lại bằng cảm biến bẩm sinh ngay lập tức (ví dụ: RIG-I)41 kích thích MDA5 chuyển sang chế độ 'khởi động'. Vì ISG15 điều chỉnh tiêu cực RIG-I16,17, ISGylation có thể kích hoạt 'chuyển đổi cảm biến' trong đó kích hoạt MDA5 được thúc đẩy khi mức ISG15 tăng lên, trong khi hoạt động RIG-I đang bị giảm bớt. Chúng tôi đã xác định rằng SCoV2 PLpro đối kháng MDA5 ISGylation thông qua hoạt động enzyme của nó sau khi liên kết với cảm biến; chiến lược này có lẽ được bảo tồn ở các loại virus Corona, điều này cần được điều tra thêm. Các phân tích bằng kính hiển vi điện tử lạnh cho thấy rằng Nsp3 của virus corona là một phần của phức hợp lỗ chân lông trải dài qua các túi màng đôi có nguồn gốc từ lưới nội chất và xuất ra RNA42 của virus mới được tổng hợp. Do đó, MDA5 có thể tự định vị ở gần vị trí xuất RNA của virus để tạo điều kiện phát hiện PAMP; tuy nhiên, miền PLpro của Nsp3 (nằm ở phía tế bào chất) chặn tín hiệu MDA5 thông qua quá trình khử ISGylation trực tiếp. Một số vi-rút cũng có thể ức chế MDA5 ISGylation thông qua rối loạn điều hòa quá trình phosphoryl hóa MDA5, như được thể hiện đối với MeV-V. Tóm lại, nghiên cứu của chúng tôi phát hiện ra vai trò nổi bật của ISGylation trong việc kích hoạt khả năng miễn dịch qua trung gian MDA{40}}cũng như sự ức chế của nó bằng SCoV2, tiết lộ mục tiêu phân tử tiềm năng để thiết kế phương pháp trị liệu chống lại COVID{42}}.
Người giới thiệu
1. Liu, G. & Gack, MU Chức năng riêng biệt và phối hợp của các cảm biến RNA bẩm sinh. Miễn dịch 53, 26–42 (2020).
2. Wu, J. & Chen, ZJ Cảm giác miễn dịch bẩm sinh và tín hiệu của axit nucleic tế bào. Annu. Linh mục Miễn dịch. 32, 461–488 (2014).
3. Chow, KT, Gale, M.Jr & Loo, YM RIG-I và các cảm biến RNA khác trong khả năng miễn dịch chống vi-rút. Annu. Linh mục Miễn dịch. 36, 667–694 (2018).
4. Schlee, M. Master cảm biến các thụ thể RNA gây bệnh—RIG-I thích. Sinh học miễn dịch 218, 1322–1335 (2013).
5. Các thụ thể giống Rehwinkel, J. & Gack, MU RIG-I: sự điều hòa và vai trò của chúng trong việc cảm nhận RNA. Nat. Linh mục Miễn dịch. 20, 537–551 (2020).
6. Wies, E. và cộng sự. Quá trình khử phospho của các cảm biến RNA RIG-I và MDA5 bằng phosphatase PP1 là điều cần thiết cho tín hiệu miễn dịch bẩm sinh. Miễn dịch 38, 437–449 (2013).
7. Gack, MU và cộng sự. TRIM25 RING-finger E3 ubiquitin ligase rất cần thiết cho hoạt động chống vi-rút qua trung gian RIG-I. Thiên nhiên 446, 916–920 (2007).
8. Chiang, C. & Gack, MU Kiểm soát hậu dịch mã đối với các con đường cảm nhận mầm bệnh nội bào. Xu hướng miễn dịch. 38, 39–52 (2017).
9. Lazear, HM, Scoggins, JW & Diamond, MS Các chức năng chung và riêng biệt của interferon loại I và loại III. Miễn dịch 50, 907–923 (2019).
10. Schoggins, JW Các gen được kích thích bằng Interferon: chúng có tác dụng gì? Annu. Mục sư Virol. 6, 567–584 (2019).
11. Zhang, D. & Zhang, DE gen kích thích Interferon 15 và hệ thống ISGylation protein. J. Interferon Cytokine Res. 31, 119–130 (2011).
12. Perng, YC & Lenschow, DJ ISG15 về khả năng miễn dịch chống vi-rút và hơn thế nữa. Nat. Mục sư Vi sinh. 16, 423–439 (2018). 13. Hadjadj, J. và cộng sự. Hoạt động của interferon loại I bị suy giảm và phản ứng viêm ở bệnh nhân COVID-19 nặng. Khoa học 369, 718–724 (2020).
14. Klemm, T. và cộng sự. Cơ chế và sự ức chế protease giống papain, PLpro, của SARS-CoV-2. EMBO J. 39, e106275 (2020).
15. Shin, D. và cộng sự. Protease giống Papain điều chỉnh sự lây lan của virus SARS-CoV-2 và khả năng miễn dịch bẩm sinh. Thiên nhiên 587, 657–662 (2020).
16. Kim, MJ, Hwang, SY, Imaizumi, T. & Yoo, JY Quy định phản hồi tiêu cực đối với tín hiệu kháng vi-rút qua trung gian RIG-I bằng cách liên hợp ISG15 do interferon gây ra. J. Virus. 82, 1474–1483 (2008).
17. Du, Y. và cộng sự. LRRC25 ức chế tín hiệu IFN loại I bằng cách nhắm mục tiêu ISG15-liên quan đến RIG-I để làm suy giảm khả năng tự động. EMBO J. 37, 351–366 (2018).
18. Hato, SV và cộng sự. Protein lãnh đạo Te mengovirus ngăn chặn quá trình phiên mã gen interferon-alpha/beta và ức chế sự kích hoạt yếu tố điều hòa interferon 3. Microbiol tế bào. 9, 2921–2930 (2007).
19. Deddouche, S. và cộng sự. Xác định chất chủ vận MDA5 liên quan đến LGP2- trong các tế bào bị nhiễm picornavirus. eLife 3, e01535 (2014).
20. Hệ thống liên hợp Durfee, LA, Lyon, N., Seo, K. & Huibregtse, JM Te ISG15 nhắm mục tiêu rộng rãi vào các protein mới được tổng hợp: hàm ý đối với chức năng chống vi-rút của ISG15. Mol. Ô 38, 722–732 (2010).
21. Lenschow, DJ và cộng sự. Xác định gen 15 được kích thích bằng interferon là phân tử kháng vi-rút trong quá trình nhiễm vi-rút Sindbis in vivo. J. Virus. 79, 13974–13983 (2005).
22. Gack, MU, Nistal-Villan, E., Inn, KS, Garcia-Sastre, A. & Jung, JU Điều chỉnh tiêu cực qua trung gian Phosphoryl hóa đối với hoạt động chống vi rút RIG-I. J. Virus. 84, 3220–3229 (2010).
23. Nistal-Villan, E. và cộng sự. Vai trò tiêu cực của quá trình phosphoryl hóa RIG-I serine 8 trong việc điều hòa sản xuất interferon-beta. J. Biol. Chem. 285, 20252–20261 (2010).
24. Maharaj, NP, Wies, E., Stoll, A. & Gack, MU Protein kinase C-alpha (PKC-alpha) và PKC-beta điều chỉnh tiêu cực việc truyền tín hiệu kháng virus RIG-I. J. Virus. 86, 1358–1371 (2012).
25. Davis, ME và cộng sự. Sự đối kháng của phosphatase PP1 bởi protein V của virus sởi là cần thiết để thoát khỏi miễn dịch bẩm sinh của MDA5. Vi khuẩn chủ tế bào 16, 19–30 (2014).
26. Lin, JP, Fan, YK & Liu, HM Te 14-3-3protein meta chaperone thúc đẩy khả năng miễn dịch bẩm sinh chống vi-rút thông qua việc tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình oligome hóa MDA5 và tái phân phối nội bào. PLoS Pathog. 15, e1007582 (2019).
27. Wu, B. và cộng sự. Cơ sở cấu trúc để nhận dạng DSRNA, hình thành sợi và kích hoạt tín hiệu chống vi-rút bằng MDA5. Ô 152, 276–289 (2013).
28. Cấu trúc Yu, Q., Qu, K. & Modis, Y. Cryo-EM của các sợi MDA5-dsRNA ở các giai đoạn thủy phân ATP khác nhau. Mol. Ô 72, 999–1012 (2018).
29. Cảm biến miễn dịch bẩm sinh Bruns, AM, Leser, GP, Lamb, RA & Horvath, CM Te LGP2 kích hoạt tín hiệu chống vi-rút bằng cách điều chỉnh sự tương tác và lắp ráp sợi MDA5-RNA. Mol. Ô 55, 771–781 (2014).
30. Uchikawa, E. và cộng sự. Phân tích cấu trúc của DSRNA liên kết với các thụ thể nhận dạng mẫu chống vi-rút LGP2 và MDA5. Mol. Ô 62, 586–602 (2016).
31. Malakhova, OA và cộng sự. UBP43 là một bộ điều chỉnh mới về tín hiệu interferon độc lập với hoạt động isopeptidase ISG15 của nó. EMBO J. 25, 2358–2367 (2006).
32. Zhang, X. và cộng sự. ISG15 nội bào của con người ngăn ngừa sự khuếch đại quá mức interferon-alpha/beta và tình trạng tự viêm. Thiên nhiên 517, 89–93 (2015).
33. Harcourt, BH và cộng sự. Xác định các sản phẩm sao chép virus Corona gây hội chứng hô hấp cấp tính nặng và mô tả hoạt động của protease giống papain. J. Virus. 78, 13600–13612 (2004).
34. Virus viêm gan chuột Roth-Cross, JK, Bender, SJ & Weiss, SR Murine coronavirus được MDA5 công nhận và gây ra interferon loại I trong đại thực bào/microglia não. J. Virus. 82, 9829–9838 (2008).
35. Menachery, VD và cộng sự. Suy giảm và phục hồi đột biến do virus Corona gây hội chứng hô hấp cấp tính nặng thiếu hoạt động 2′-O-methyltransferase. J. Virus. 88, 4251–4264 (2014).
36. Bekes, M. và cộng sự. Công nhận hoạt động khử phổ biến của di-ubiquitin và liên kết Lys48-của protease giống papain của virus Corona SARS. Mol. Ô 62, 572–585 (2016).
37. Trẻ em, K. và cộng sự. mda-5, chứ không phải RIG-I, là mục tiêu phổ biến của protein paramyxovirus V. Virus học 359, 190–200 (2007).
38. Shi, HX và cộng sự. Điều chỉnh tích cực việc kích hoạt yếu tố điều hòa interferon 3 bằng Herc5 thông qua sửa đổi ISG15. Mol. Tế bào sinh học. 30, 2424–2436 (2010).
39. Blanco-Melo, D. và cộng sự. Phản ứng mất cân bằng của vật chủ đối với SARS-CoV-2 thúc đẩy sự phát triển của COVID-19. Ô 181, 1036–1045 (2020).
40. Speer, SD và cộng sự. Thiếu ISG15 và tăng sức đề kháng của virus ở người nhưng không phải ở chuột. Nat. Cộng đồng. 7, 11496 (2016).
41. Errett, JS, Suthar, MS, McMillan, A., Diamond, MS & Gale, M. Jr. Vai trò thiết yếu, không cần thiết của RIG-I và MDA5 trong việc phát hiện và kiểm soát nhiễm vi rút West Nile. J. Virus. 87, 11416–11425 (2013).
42. Wolf, G. và cộng sự. Một lỗ phân tử trải dài qua màng kép của cơ quan sao chép virus Corona. Khoa học 369, 1395–1398 (2020).
43. Thiếu tá, EO và cộng sự. Thiết lập một dòng tế bào thần kinh đệm của bào thai con người hỗ trợ nhân lên của virus JC. Proc. Học viện Natl. Khoa học. Hoa Kỳ 82, 1257–1261 (1985).
44. Hertzog, J. và cộng sự. Việc nhiễm một chủng virus Zika phân lập ở Brazil tạo ra RNA kích thích RIG-I và protein NS5 của virus ngăn chặn sự cảm ứng và truyền tín hiệu IFN loại I. Euro. J. Miễn dịch. 48, 1120–1136 (2018).
45. Cerikan, B. và cộng sự. Sự thích ứng nội tại của tế bào phát sinh từ sự cắt bỏ mãn tính của bộ điều chỉnh rho GTPase chính. Dev. Ô 39, 28–43 (2016).
46. Chan, YK & Gack, MU Một cơ chế dựa trên phosphomimetic của virus sốt xuất huyết để đối kháng khả năng miễn dịch bẩm sinh. Nat. Miễn dịch. 17, 523–530 (2016).
47. Riedl, W. và cộng sự. Virus zika NS3 bắt chước mô típ liên kết 14-3-3-của tế bào để đối kháng khả năng miễn dịch bẩm sinh qua trung gian RIG-I- và MDA5-. Vi khuẩn chủ tế bào 26, 493–503 (2019).
48. Sự phổ biến và suy thoái của Ulane, CM, Rodriguez, JJ, Parisien, JP & Horvath, CM STAT3 do virus quai bị ngăn chặn tín hiệu cytokine và oncogene. J. Virus. 77, 6385–6393 (2003).
49. Oudshoorn, D. và cộng sự. HERC6 là ligase E3 chính cho liên hợp ISG15 toàn cầu trong tế bào chuột. XIN VUI LÒNG MỘT 7, e29870 (2012).
50. Kim, DK và cộng sự. Một bộ sưu tập toàn diện, linh hoạt về các vùng mã hóa SARS-CoV-2. G3 (Bethesda) 10, 3399–3402 (2020).
51. Tưởng, C. và cộng sự. Oncoprotein papillomavirus E6 ở người nhắm mục tiêu USP15 và TRIM25 để ngăn chặn tín hiệu miễn dịch bẩm sinh qua trung gian RIG-I. J. Virus. 92, e01737-17 (2018).
52. Gack, MU và cộng sự. Vai trò của biến thể CARD song song đầu cuối N RIG-I và biến thể mối nối trong quá trình truyền tín hiệu kháng virus qua trung gian TRIM25-. Proc. Học viện Natl. Khoa học. Hoa Kỳ 105, 16743–16748 (2008).
53. Tưởng, JJ và cộng sự. Việc vạch mặt virus của bản phiên mã gen giả 5S rRNA của tế bào gây ra khả năng miễn dịch qua trung gian RIG-I. Nat. Miễn dịch. 19, 53–62 (2018).
54. Sparer, KMJ và cộng sự. TRIM23 làm trung gian cho quá trình tự thực bào do virus gây ra thông qua kích hoạt TBK1. Nat. Vi sinh vật. 2, 1543–1557 (2017).