Chiết xuất tế bào Jasminum Sambac như một chất tăng cường chống oxy hóa chống lão hóa da Phần 1

trừu tượng: Căng thẳng oxy hóa đóng một vai trò quan trọng trong quá trình lão hóa da thông qua việc sản xuất các loại oxy phản ứng và hình thành các sản phẩm cuối glycation (AGEs) tiên tiến. Do đó, các thành phần chống oxy hóa là cần thiết trong thị trường chăm sóc da và việc sử dụng các phân tử đến từ nuôi cấy tế bào thực vật mang đến một cơ hội duy nhất. Trong bài báo này, các tính năng của chiết xuất hydroethanol thu được từ các tế bào sambac Jasminum (JasHEx) đã được khám phá. Các đặc tính chống oxy hóa và chống TUỔI đã được nghiên cứu bằng phương pháp tiếp cận đa ngành kết hợp các thí nghiệm in vitro và ex vivo khối phổ và thông tin sinh học. JasHEx chứa các dẫn xuất axit phenolic, lignans và triterpenes và nó đã được phát hiện là làm giảm quá trình sản xuất các loại oxy phản ứng tế bào trong các tế bào sừng tiếp xúc với căng thẳng ngoại sinh. Nó cũng cho thấy khả năng giảm sự hình thành TUỔI và tăng sản xuất collagen loại I trong ma trận ngoại bào. Dữ liệu đã chứng minh rằng các đặc tính chống oxy hóa của JasHEx có liên quan đến các hoạt động thu hồi gốc tự do và thải sắt của nó cũng như kích hoạt con đường Nrf2/ARE. Điều này cũng có thể giải thích hoạt động chống viêm của JasHEx liên quan đến việc giảm nồng độ NO trong các đại thực bào được kích thích bằng LPS. Do đó, JasHEx có thể được coi là một chất tăng cường chống oxy hóa mạnh mẽ chống lại quá trình lão hóa da do stress oxy hóa.

Glycoside của cistanche cũng có thể làm tăng hoạt động của SOD trong các mô tim và gan, đồng thời làm giảm đáng kể hàm lượng lipofuscin và MDA trong mỗi mô, loại bỏ hiệu quả các gốc oxy phản ứng khác nhau (OH-, H₂O₂, v.v.) và bảo vệ chống lại tổn thương DNA gây ra bởi gốc OH. Cistanche phenylethanoid glycoside có khả năng loại bỏ gốc tự do mạnh mẽ, khả năng khử cao hơn vitamin C, cải thiện hoạt động của SOD trong huyền phù tinh trùng, giảm hàm lượng MDA và có tác dụng bảo vệ nhất định đối với chức năng màng tinh trùng. Cistanche polysacarit có thể tăng cường hoạt động của SOD và GSH-Px trong hồng cầu và mô phổi của chuột lão hóa thực nghiệm do D-galactose gây ra, cũng như làm giảm hàm lượng MDA và collagen trong phổi và huyết tương, đồng thời tăng hàm lượng elastin, có tác dụng nhặt rác tốt đối với DPPH, kéo dài thời gian thiếu oxy ở chuột già, cải thiện hoạt động của SOD trong huyết thanh và làm chậm quá trình thoái hóa sinh lý của phổi ở chuột già thực nghiệm. Với sự thoái hóa hình thái tế bào, các thí nghiệm đã chỉ ra rằng Cistanche có khả năng chống oxy hóa tốt và có tiềm năng trở thành dược phẩm ngăn ngừa và điều trị các bệnh lão hóa da. Đồng thời, echinacoside trong Cistanche có khả năng đáng kể trong việc loại bỏ các gốc tự do DPPH và có thể loại bỏ các loại oxy phản ứng, ngăn chặn sự thoái hóa collagen do gốc tự do gây ra và cũng có tác dụng sửa chữa tốt đối với tổn thương anion gốc tự do của thymine.

Nhấp vào Tôi có thể mua Cistanche ở đâu

【Để biết thêm thông tin:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

từ khóa: Lão hóa da; các loại oxy phản ứng (ROS); sản phẩm cuối glycation tiên tiến (AGEs); Chiết xuất hydroethanolic Jasminum sambac (JasHEx); khối phổ; trao đổi chất; Mạng phân tử xã hội sản phẩm tự nhiên toàn cầu (GNPS); yếu tố hạt nhân hồng cầu 2-yếu tố liên quan 2 (Nrf2)

1. Giới thiệu

Các yếu tố nội tại di truyền và các tác nhân bên ngoài như chiếu tia cực tím, chiếu tia hồng ngoại, xenobamel và các chất ô nhiễm môi trường gây ra việc sản xuất các loại oxy phản ứng (ROS). Chúng được tạo ra bằng cách kích hoạt chuỗi hô hấp của ty thể, cytochrom p450 và NADPH oxyase [1]. ROS bao gồm các gốc tự do (anion superoxide, gốc hydroperoxyl, gốc alkoxy và gốc hydroxyl) và các phân tử không gốc (hydro peroxide và oxy nhóm đơn) [2]. Khi các hệ thống chống oxy hóa bị quá tải, ROS sẽ tích tụ trong các tế bào và tạo ra cái gọi là stress oxy hóa, nguyên nhân chính gây lão hóa da [3].

Thật vậy, stress oxy hóa gây ra cả tổn thương DNA và quá trình oxy hóa lipid và protein cùng với việc kích hoạt con đường kinase protein được kích hoạt bằng mitogen (MAPK) (AKT, JNK, ERK và p38) [4]. Đổi lại, điều này thúc đẩy sự biểu hiện của các cytokine tiền viêm, các yếu tố tăng trưởng và các phân tử kết dính thông qua việc kích thích các yếu tố phiên mã AP-1 và NF-κB. Hơn nữa, kích hoạt con đường MAPK gây ra sự thay đổi ma trận da bằng cách giảm mức độ collagen. Nó tăng tốc độ phân hủy collagen bằng cách điều chỉnh sự biểu hiện của metallicoproteinase ma trận (MMP) và các TIMP ức chế mô của chúng và nó làm giảm quá trình tổng hợp collagen mới, bằng cách ngăn chặn tín hiệu Smad/thụ thể TGF-type II. Ngoài ra, stress oxy hóa làm thay đổi tình trạng da, phá vỡ gradient canxi của biểu bì, cần thiết cho tính toàn vẹn và chức năng của lớp vỏ sừng hóa, kích thích hoạt động của tuyến bã nhờn và gây thoái hóa tế bào hắc tố [5].

Song song đó, sự hình thành của các phân tử sinh học biến đổi được gọi là các sản phẩm cuối cùng của glycation tiên tiến (AGEs) thúc đẩy quá trình oxy hóa trong tế bào và mô [6]. Sự phát triển của các dấu ấn sinh học lão hóa này được gây ra bởi các yếu tố môi trường khác nhau như khói thuốc lá, chế độ ăn nhiều carbohydrate tinh chế và đơn giản, thực phẩm nấu chín ở nhiệt độ cao và lối sống ít vận động; AGEs là các sản phẩm ổn định và không thể đảo ngược có nguồn gốc từ phản ứng phi enzym giữa đường khử và protein, axit nucleic hoặc lipid, sau đó là sự sắp xếp lại [7]. Thật vậy, điểm khởi đầu của sự hình thành AGE là phản ứng Maillard trong đó các nhóm carbonyl của đường khử phản ứng thuận nghịch với các nhóm amino tự do của protein, axit nucleic hoặc aminophospholipid để tạo thành bazơ Schiff. Những chất bắt chước này tự sắp xếp lại thành ketamine ổn định hơn, được gọi là sản phẩm Amadori. Chúng tạo ra các dicarbonyl phản ứng (dưới dạng glyoxal hoặc methylglyoxal) phản ứng với các nhóm chức năng lysine và arginine của protein, tạo ra rất nhiều AGE [8,9]. Chúng được phân loại thành các nhóm khác nhau dựa trên khả năng phát huỳnh quang và hình thành các liên kết ngang.

Hoạt động của AGE được trung gian bởi các thụ thể dành cho AGE (RAGE) là các protein xuyên màng thuộc siêu họ globulin miễn dịch của các phân tử bề mặt tế bào loại I, được biểu hiện ở các loại tế bào khác nhau bao gồm tế bào sừng, nguyên bào sợi và đại thực bào. Các AGEs/RAGEs liên kết làm tăng sản xuất ROS chủ yếu bằng cách kích hoạt NADPH oxidases (NOXes) và chuỗi hô hấp của ty thể, dẫn đến stress oxy hóa và tất cả các hậu quả được mô tả ở trên [6,8].

Hơn nữa, các protein ma trận ngoại bào (ECM), đặc biệt là collagen, rất nhạy cảm với quá trình glycation. Thật vậy, mức độ của cấu trúc AGE pentosidine, có nguồn gốc từ collagen, cao hơn đáng kể ở người già so với người trẻ [10]. Quá trình glycation collagen không chỉ thay đổi tính chất cơ học của bản thân collagen, vốn trở nên cứng hơn và giòn hơn [11] mà còn thay đổi tính chất cơ học của chất nền ngoại bào, ảnh hưởng đến hoạt động của các tế bào thường trú (tăng trưởng, biệt hóa, vận động, biểu hiện gen và phản ứng với cytokine) và tương tác tế bào ma trận [12].

Trong kịch bản này, các thành phần chống oxy hóa đang có nhu cầu lớn trong lĩnh vực mỹ phẩm để giảm sự hình thành TUỔI và dòng thác oxy hóa liên quan của chúng: các chiết xuất có nguồn gốc từ loài Jasminum sambac, thuộc họ Oleaceae, rất thú vị vì đặc tính chống oxy hóa và việc sử dụng chúng trong dân gian thuốc trị bệnh ngoài da [13]. Tuy nhiên, chiết xuất thực vật có một số nhược điểm như tính bền vững sinh học kém, khả năng nhiễm thuốc trừ sâu, phân bón hoặc mầm bệnh và sự thay đổi về thành phần định tính và định lượng của chúng, bị ảnh hưởng bởi các mùa và điều kiện môi trường. Một giải pháp thay thế hợp lý cho thực vật, như một nguồn thành phần mỹ phẩm có hoạt tính sinh học, được thể hiện bằng nuôi cấy tế bào thực vật mang lại một số ưu điểm: (i) tính bền vững cao của quy trình sản xuất, do không cần đất nông nghiệp; (ii) cung cấp liên tục các sản phẩm tự nhiên mà không phụ thuộc vào địa lý, mùa vụ và chu kỳ sinh sản của cây trồng; (iii) không có rủi ro ô nhiễm bởi mầm bệnh, chất gây ô nhiễm môi trường và dư lượng hóa chất nông nghiệp; (iv) các điều kiện canh tác được tiêu chuẩn hóa cho phép thu được tỷ lệ sinh khối và năng suất chất chuyển hóa cao hơn và có khả năng tái sản xuất cao hơn; (v) tính linh hoạt cao, do nồng độ của các hợp chất có thể được tối ưu hóa bằng cách thay đổi điều kiện nuôi cấy và (vi) quy trình chiết xuất dễ dàng hơn và ít tốn thời gian hơn, giảm nhu cầu sử dụng dung môi mạnh [14,15].

Ở đây, một chiết xuất hydroethanol thu được từ nuôi cấy tế bào Jasminum sambac (JasHEx) đã được nghiên cứu. Mục đích nghiên cứu của chúng tôi là mô tả đặc tính sinh học và hóa học rộng rãi của JasHEx, đặc biệt là khám phá các đặc tính chống glycation và chống lão hóa của nó. Đầu tiên, các phương pháp tiếp cận dựa trên khối phổ tiên tiến đã được sử dụng để thu được đặc tính cấu trúc chi tiết của dịch chiết. Sau đó, các thí nghiệm in vitro và ex vivo đã được thực hiện để chứng minh hoạt tính sinh học của JasHEx như một chất chống oxy hóa.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Nuôi cấy mô thực vật và chuẩn bị chiết xuất

Hoa nhài Ả Rập được chứng nhận (Jasminum sambac) được lấy từ một vườn ươm địa phương ("Ladre di Piante", Pistoia, Vùng Toscana, Ý). Lá sambac hoa nhài được ngâm trong etanol 70 phần trăm (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, Hoa Kỳ) trong 1 phút và khử trùng bề mặt bằng 1 phần trăm (v/v) thuốc tẩy thương mại có bổ sung Tween 2{{ 9}} (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) trong 8 phút, sau đó rửa ba lần trong nước cất vô trùng. Sau đó, các lá được cắt thành các mảnh 0.5–1.0 cm và nuôi cấy trên môi trường MS nồng độ cao [16] chứa 3 phần trăm (w/v) sucrose, 0 .2 mg/L 2,4D, và 8 g/L phyto-agar. Các mẫu được cấy truyền hàng tháng trên môi trường mới trong ba tháng. Sau khi thu được mô sẹo màu vàng lục, bở và phát triển nhanh, các tế bào thực vật được chuyển sang môi trường MS lỏng, được bổ sung 3 phần trăm (w/v) sucrose và 0,2 mg/L 2,4D. Huyền phù được khuấy trong máy lắc hồi chuyển lúc 110 giờ tối và 27 ◦C trong phòng khí hậu tối. Các tế bào phát triển sẫm màu được tăng quy mô mỗi tuần từ bình quy mô nhỏ đến bình quy mô lớn cho đến khi đạt được môi trường nuôi cấy huyền phù lỏng khoảng 177 g/L. Việc điều chế dịch chiết hydro-ethanol nuôi cấy tế bào Jasminum sambac (JasHEx) được thực hiện bằng cách bổ sung 2000 mL dung dịch etanol/nước (90/10, v/v) vào 500 g tế bào. Đồng nhất hỗn hợp này trong 3 phút ở tốc độ 1500 vòng/phút và 6 phút ở tốc độ 3800 vòng/phút bằng máy nghiền dao Grindomix GM300 (Retsch GmbH, Haan, Đức). Huyền phù thu được được khuấy ở tốc độ 400 vòng/phút trong 2 giờ ở 25 ◦C, tránh tiếp xúc với ánh sáng. Huyền phù sau đó được ly tâm ở tốc độ 6300 vòng/phút trong 10 phút ở 4 ◦C. Phần nổi phía trên được loại bỏ, lọc và sau đó cô trong chân không trong thiết bị cô quay (IKA RV8, IKA-Werke GmbH & Co., Staufen, Đức) đặt ở 25 ◦C. Cuối cùng, độ pH được đưa về 7,0 bằng NaOH 10 N và sau đó đông khô cho đến khi thu được bột mịn.

2.2. Phân tích UPLC–MS/MS cho đặc tính hóa học của JasHEx

Quá trình chiết xuất butanol/nước hai pha đã đạt được. Phần butanol được làm khô và rã đông trong metanol (10 mg/mL) trước khi phân tích UPLC–MS/MS được thực hiện trên Máy quang phổ khối cổ điển Q-Exactive được trang bị hệ thống UPLC UltiMate™ 3000 (Thermo Science, Waltham, MA, USA ). Tất cả các lần chạy sắc ký đã được thực hiện như đã được mô tả bởi Ceccacci et al. [17].

2.3. Sản phẩm tự nhiên toàn cầu Phân tích mạng phân tử xã hội

Để nhận dạng chất chuyển hóa, Mạng phân tử xã hội các sản phẩm tự nhiên toàn cầu đã được sử dụng [18]. Tất cả các tín hiệu MS và MSMS không được chỉ định bởi GNPS đã được kiểm tra một cách khôn ngoan và được chỉ định phù hợp với tài liệu. Các tệp thô đã được chuyển đổi sang định dạng mzXML bằng phần mềm Giao diện người dùng chung của MS Converter, trước khi tìm kiếm thư viện quang phổ GNPS. Nó được thực hiện bằng cách sử dụng dung sai khối lượng ion tiền chất là 0.025 Da, dung sai khối lượng ion mảnh là 0.02 Da, đỉnh phù hợp tối thiểu là 2 và ngưỡng điểm là 0,7. Kết quả đã được xác nhận thủ công.

Tiền xử lý dữ liệu được thực hiện bởi Mzmine (Phiên bản 2.53, Softpedia, Bucharest, Romania) [19] và công việc Mạng phân tử dựa trên tính năng (FBMN) [20] đã được thực hiện theo báo cáo của Ceccacci et al. [17]. Các tệp mạng thu được đã được nhập vào Cytoscape (Phiên bản 3.9.1, Viện Khoa học Y khoa Tổng hợp Quốc gia Hoa Kỳ (NIGMS), Bethesda, MD, Hoa Kỳ) [21].

2.4. Phân tích định lượng Lignans và Triterpenes

Cài đặt UPLC giống như đã nêu cho các thí nghiệm định tính được sử dụng để phân tích định lượng lignan, trong khi đối với cài đặt của triterpen, chúng được cải tiến để tách hai cặp đồng phân, axit arjunolic/axit Asiatic và axit oleanolic/axit ursolic. Phân tích được thực hiện trên Máy quang phổ khối cổ điển Q-Exactive như đã xác định trước đó. Quá trình phân tách được thực hiện bởi Phenomenex Kinetex (Torrance, CA, USA) EVO C18 300 Å (150 × 2,1 mm, kích thước hạt 5 µm). Pha động bao gồm A (dung dịch nước amoni axetat 5 mM, pH 9.00 được điều chỉnh bằng amoni hydroxit) và B (1{{40}}0 phần trăm axetonitril) sử dụng rửa giải gradient 13–28 phần trăm B ở 0–20 phút, 28–65 phần trăm B ở 20–24 phút, 65–75 phần trăm B ở 24–28 phút, 75–95 phần trăm ở 28–28,5 phút, 95 phần trăm ở 28,5 –32 phút, 95–13 phần trăm ở 32–32,1 phút và 13 phần trăm ở 32,1–44 phút. Tốc độ dòng chảy là 0,450 mL/phút và thể tích tiêm là 5 µL. Đối với cả lignan và triterpen, dữ liệu được thu thập bằng phương pháp khối lượng được mô tả bởi Ceccacci et al. [17]. Chúng tôi đã mua nortachelogenin (#LCA52174) từ Biosynth Carbosynth, matairesinol (#80497) và axit maslinic (#83209) từ PhytoLab GmbH & Co.KG, secoisolariciresinol (#60372) và axit arjunolic (#SMB00119) từ Sigma-Aldrich (Saint Louis , MI, USA), axit Asiatic (#0027), axit oleanolic (#0041 S) và axit ursolic (#0037 S) từ Extrasynthèse (Genay, Pháp). Các đường chuẩn thu được bằng cách bơm các chất chuẩn ở nồng độ từ 0,05 đến 25 µM đối với lignan và 0,1 đến 25/250 µM đối với triterpen. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) đối với chất chuẩn được xác định dựa trên tỷ số tín hiệu trên tạp âm (S/N).

2.5. Cấy và cấy tế bào da

Keratinocytes người bất tử (HaCaT), được mua từ Addexbio Technologies (San Diego, CA, Hoa Kỳ), được bảo quản trong Môi trường đại bàng sửa đổi của Dulbecco (DMEM; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, Hoa Kỳ) được bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò (FBS; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) trong 95% không khí, 5% CO2 và không khí ẩm ở 37 ◦C. Nguyên bào sợi ở da người (HDF) được bảo quản trong môi trường Modified Eagle Medium của Dulbecco (DMEM; Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, USA) được bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò (FBS; Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, USA ) trong 95 phần trăm không khí, 5 phần trăm CO2 và không khí được làm ẩm ở 37 ◦C. Mẫu da, thu được từ da của những người hiến tặng là phụ nữ khỏe mạnh (31 và 40 tuổi) tại trung tâm phẫu thuật Villa Cinzia (Naples, Ý), được nuôi cấy trong 24-tấm transwell trong DMEM/FBS cùng với thuốc kháng sinh trong điều kiện lỏng-không khí ở 37 ◦C trong không khí được làm ẩm bằng 5% CO2. Theo Tuyên bố Helsinki, tất cả những người hiến tặng đã đồng ý bằng văn bản về việc sử dụng các mô da.

2.6. Xét nghiệm ROS tế bào trong H2O2-Các tế bào HaCaT bị căng thẳng

Đối với quy trình này, 1,8 × 104 HaCaT được cấy vào 96-các đĩa giếng và phát triển trong 20 giờ. Sau đó, các tế bào này được xử lý trong 2 giờ với các nồng độ khác nhau của JasHEx (0.0006% , 0,002% và 0,006% p/v) hoặc với 500 µM axit ascorbic, được sử dụng làm đối chứng dương tính. Sau đó, chúng được rửa trong PBS (dung dịch muối đệm phốt phát) và ủ ở 37 ◦C với 100 µL/giếng dung dịch chứa: 10 mM Hepes, 1,3 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 5 mM glucose và 5 µM CM-H2DCFDA (5-(và-6)-chloromethyl-20,70 -dichlorodihydrofluorescein diacetate, Invitrogen). Sau 45 phút, quá trình rửa PBS được thực hiện và cường độ huỳnh quang cơ bản của các tế bào được đo ở bước sóng 535nm (kích thích 485nm), sử dụng thiết bị EnVision (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). Sau đó, ứng suất oxy hóa được tạo ra bằng cách thêm 450 µM H2O2, và huỳnh quang của các mẫu được đo sau 30 phút.

2.7. Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (ELISA) để phát hiện TUỔI trong các tế bào Nguyên bào sợi ở da người (HDF) chịu áp lực Glyoxal

Đối với bước này, 1,5 × 104 HDF được gieo vào 96-các đĩa giếng và phát triển trong 2 ngày. Sau khi rửa bằng PBS, các tế bào được cố định trong 1{{10}} phút với 100 µL formaldehyde 4% trong PBS. Sau đó, chúng được xử lý bằng JasHEx (0,0006% và 0,002% p/v) hoặc đối chứng dương tính với 1 µM Aminoguanidine với sự hiện diện của 0,5% glyoxal ở 50 ◦C trong 1 tuần. Sau khi ủ, chúng được xử lý để xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (ELISA) bằng cách sử dụng một kháng thể đặc hiệu chống lại AGE (Abcam ab23722).

2.8. Thử nghiệm miễn dịch mô huỳnh quang trên các mẫu da bị căng thẳng Methyl-Glyoxal để phát hiện Fibrillin-1

Các mẫu da được lấy từ hai bệnh nhân, 31 và 40 tuổi. Từ mỗi sinh thiết da, ba cú đấm được tạo ra cho mỗi lần điều trị xảy ra ở giao diện không khí-lỏng. Vào ngày đầu tiên, các cú đấm được xử lý bằng JasHEx (0.002 phần trăm và 0,006 phần trăm p/v) hoặc đối chứng dương tính (1 mM Aminoguanidine) và sau 24 giờ, 500 µM methyl- glyoxal đã được thêm vào. Các phương pháp điều trị được làm mới hai ngày một lần trong tổng số bảy ngày. Vào cuối giai đoạn này, các chày được xử lý để phân tích mô học, cố định trong 4% PFA, ủ trong 15% sucrose, sau đó trong 30% sucrose và bảo quản lạnh trong hợp chất OCT (Nhiệt độ cắt tối ưu) ở -80 ◦C . Phẫu thuật lạnh 5 Pha thu được bằng máy lạnh CM1520 Leica (Leica Biosystems, Buffalo, IL, USA). Các phiến kính có mặt cắt lạnh được ngậm nước trong 30 phút trong PBS và được đặt trong dung dịch "ngăn chặn" (6% BSA, 5% huyết thanh, 20 mM MgCl2, 0,2% Tween) trong 1 giờ. Sau đó, chúng được ủ với kháng thể kháng Fibrillin 1 chính (MA5-12770, Thermo Science, Waltham, MA, USA). trong 16 giờ ở 4 ◦C. Các phiến kính được rửa bằng PBS trong 30 phút và sau đó được ủ với kháng thể thứ cấp Alexa-Fluor 546 chống thỏ (A11035, Thermo Science, Waltham, MA, USA) trong 1 giờ. Nhân được nhuộm bằng DAPI (40, 6-5 diamidino-2-phenylindole) 1 g/mL trong PBS trong 10 phút. Các hình ảnh được thu được bằng kính hiển vi huỳnh quang và được phân tích bằng phần mềm ImageJ (Phiên bản 1.53a, Viện Y tế Quốc gia, Hoa Kỳ).

2.9. Xét nghiệm AlphaLISA để đo nội dung Procollagen Type I C-Peptide (PIP)

Trong bước này, 8 × 103 HDF được gieo vào đĩa giếng 96-và được xử lý trong 24 giờ bằng JasHEx (0.0006% , 0,002% , và 0,006 phần trăm p/v) hoặc với TGF- (2,5 ng/mL). Sau khi xử lý, các tế bào được xử lý theo hướng dẫn của nhà cung cấp bộ collagen alpha LISA hPIP (AL353HV, (PerkinElmer, Waltham, MA, USA)).

2.10. Xét nghiệm kích hoạt phiên mã dựa trên Nrf2 Luciferase

Ở đây, 6 × 103 tế bào HaCaT trong đĩa giếng 96-đã được cấy và phát triển trong 16 giờ. Sau đó, họ được thử nghiệm kích hoạt phiên mã dựa trên luciferase dựa trên Nrf2, sử dụng bộ báo cáo ARE BPS Bioscience (San Diego, CA, USA, #60514). Vectơ báo cáo IS luciferase sẵn sàng cho quá trình chuyển đổi (chứa gen luciferase của đom đóm dưới sự kiểm soát của các yếu tố đáp ứng IS nằm ở thượng nguồn của một trình khởi động tối thiểu) cùng với một biện pháp kiểm soát bên trong (vec tơ Renilla luciferase biểu hiện cấu thành) được chuyển hóa tạm thời vào các tế bào HaCaT bằng cách sử dụng Thuốc thử biến đổi DNA HP gen X-TREME (Roche, Basilea, Thụy Sĩ, #6366244001). Sau khi tải nạp trong 24 giờ, các tế bào được xử lý trong 2 giờ bằng dịch chiết (0,0006% , 0,002% và 0,006% p/v) hoặc Resveratrol đối chứng dương tính (50 µM). Sau đó, họ được xét nghiệm luciferase bằng Hệ thống xét nghiệm Dual-Glo Luciferase (Promega, Rome, Italy #E2920). Tóm lại, các tế bào được ủ với chất nền luciferase của đom đóm trong 10 phút trước khi đo độ phát quang trong 96-máy đọc đĩa giếng (Victor Nivo, Waltham, MA, USA). Tỷ lệ phát quang từ đom đóm và Renilla đã được tính toán để chuẩn hóa và so sánh hoạt động phiên mã Nrf2.

2.11. Phân tích biểu hiện của các gen SOD-1(NM_000454.5) và OH-1(NM_002133.3) trong tế bào HaCaT

Đối với quy trình này, 1,5 × 105 tế bào HaCaT trên mỗi giếng được nuôi cấy trong 6-các đĩa giếng trong 16 giờ và ủ trong 6 giờ với dịch chiết (00,002 phần trăm và 0,006 phần trăm p/v) hoặc 50 µM Resveratrol làm đối chứng dương tính. Khi kết thúc quá trình ủ, RNA tổng số được chiết xuất bằng cách sử dụng bộ "GenElute™ Total RNA Purifying" (từ Sigma-Aldrich (Saint Louis, MI, USA) và được xử lý bằng DNase I (Thermo Science, Waltham, MA, USA) ở 37 ◦C trong 30 phút, để loại bỏ chất gây ô nhiễm DNA bộ gen. 500 ng RNA tổng số được phiên mã ngược bằng cách sử dụng enzyme Reverse transcriptase (Thermo Science, Waltham, MA, USA). RT-PCR bán định lượng được tiến hành bằng cách sử dụng cặp phổ mồi/đối thủ cạnh tranh 18S (Invitrogen-Thermo Science, Waltham, MA, USA) làm chuẩn nội.Các sản phẩm PCR được phân tách trên gel agarose 1,5% và được quan sát bằng thiết bị iBright (Invitrogen Thermo Science, Waltham, MA, USA). Trình tự của đoạn mồi được sử dụng để khuếch đại như sau: HsSOD1Fw: GAAAGTAATGGACCAGTGAAGG; HsSOD1Rv: ATTGGGCGATCCCAATTACACC; OH-1Fw GAACTTTCAGAAGGGTCAGG; OH-1Rv GCTCAATGTTGAGCAGGAA.

2.12. Xét nghiệm Nitric Oxide trong RAW 264.7 được kích thích bằng LPS

Nồng độ NO được xác định trong đại thực bào RAW 264,7 ở chuột, được gieo hạt ở nồng độ 1,5 × 105 tế bào/giếng trong các đĩa giếng 96-trong 24 giờ và được xử lý trước bằng dịch chiết ({{1 0}}}.0006 phần trăm , 0,002 phần trăm và 0,006 phần trăm p/v) hoặc với 10 µM TPCK (kiểm soát dương tính) trong 2 giờ, trước khi ủ với 2 µg/mL LPS trong 18 giờ. Lượng NO, được chuyển đổi thành nitrit, được tính toán bằng cách thêm thuốc thử Griess (dung dịch N-(1-naphthyl)ethylenediamine và axit sulfanilic, Invitrogen- Thermo Science, Waltham, MA, USA) và sau 30 phút, độ hấp thụ được đo ở bước sóng 540nm bằng đầu đọc nhiều tấm (EnVision, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)

3. Kết quả

3.1. Phân tích định tính và định lượng Chiết xuất Hydro-Ethanol nuôi cấy tế bào Jasminum sambac (JasHEx)

Phân tích UPLC–MS/MS của JasHEx đã được thực hiện và dữ liệu quang phổ có độ phân giải cao được phân tích bằng Mạng phân tử xã hội các sản phẩm tự nhiên toàn cầu (GNPS), một hệ thống khối phổ dựa trên web hỗ trợ chú thích các sản phẩm tự nhiên (NP) [18] . Cụ thể, một thư viện quang phổ GNPS đã được thực hiện để đạt được sự hủy bỏ trực tuyến. Các loài hóa học không được xác định bởi GNPS đã được chỉ định phù hợp với tài liệu. Như thể hiện trong Hình 1 và 2 và Bảng 1, hơn 50 hợp chất thuộc một số loại chất chuyển hóa thứ cấp, chủ yếu là polyphenol và terpen, đã được xác định. Thật vậy, chiết xuất JasHEx có chứa các dẫn xuất axit phenolic, lignans (secoisolariciresinol, nortrachelogenin và matairesinol) và triterpenoids (axit arjunolic, axit aspartic, axit maslinic, axit oleanolic và axit ursolic).

【Để biết thêm thông tin:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】