Táo tàu Polysaccharides giảm nhẹ chứng thiếu máu ở chuột mắc bệnh thận mãn tính

Liên hệ: emily.li@wecistanche.com

Shiying Huang, et al

trừu tượng

Polysaccharides táo tàu (JP) là một trong những glycans có nguồn gốc thực phẩm tích cực trong trái cây ăn kiêng của Ziziphus jujuba, đã được coi là điều trị chứng thiếu máu. Trong nghiên cứu này, mộtmãn tínhquả thậndịch bệnhMô hình chuột (CKD) được sử dụng để đánh giá ảnh hưởng của JP và cơ chế của nó đối với bệnh thiếu máu liên quan đến CKD. Ở chuột CKD, điều trị JP cải thiện đáng kểquả thậnhàm số, quả thậnbệnh lývết thương, và các thông số huyết học, bao gồm tăng hồng cầu, hemoglobin, hematocrit và số lượng tiểu cầu. Hơn nữa, kết quả chuyển hóa nhắm mục tiêu LC-MS / MS cho thấy JP thúc đẩy giải phóng axit béo chuỗi ngắn (SCFAs) ở chuột mắc bệnh thận mạn. Bên cạnh đó, JP thay đổi mức độ erythropoietin huyết thanh (EPO), mRNA EPO ở thận vàquả thậnProtein EPO thông qua tín hiệu HIF-. Nói chung, những kết quả này cung cấp bằng chứng cho thấy tác dụng của JP đối với bệnh thiếu máu liên quan đến CKD có thể liên quan đến việc điều chỉnh quá trình giải phóng SCFA và sản xuất erythropoietin, hỗ trợ sự phát triển thêm của JP dưới dạng thực phẩm bổ sung trong điều trị thiếu máu liên quan đến CKD.

Từ khóa: Polysaccharides táo tàuMãn tínhquả thận dịch bệnhThiếu máu Erythropoietin Yếu tố gây thiếu oxy- Axit béo chuỗi ngắn

Bấm vào đây để biết thêm thông tin về Cistanche

1. Giới thiệu

Mãn tínhquả thận dịch bệnh(CKD) được định nghĩa là một hội chứng lâm sàng về các bất thường cấu trúc thận hoặc suy giảm chức năng và đang ngày càng trở thành gánh nặng sức khỏe cộng đồng trên toàn thế giới (Webster, Nagler, Morton, & Masson, 2017). Thiếu máu thận là một trong những biến chứng phổ biến nhất của CKD, góp phần làm tăng nguy cơ tử vong (Locatelli và cộng sự, 2019). Sản xuất erythropoietin (EPO) kém hiệu quả là một yếu tố chính dẫn đến thiếu máu ở người bệnh thận mạn (Pappa, Dounousi, Duni, & Katopodis, 2015). EPO được sản xuất trong gan vàquả thận, rất cần thiết cho quá trình sản xuất hồng cầu (Lappin & Lee, 2019). Trong điều kiện thiếu oxy, yếu tố gây thiếu oxy (HIF) có thể kích hoạt sự biểu hiện của EPO (Sch¨ odel & Ratcliffe, 2019). Do đó, nhắm mục tiêu HIF để tạo ra EPO đã được coi là một chiến lược điều trị mới để điều trị bệnh thiếu máu liên quan đến CKD.

Táo tàu là quả của Ziziphus jujuba Mill. (Rhamnaceae) hay còn gọi là chà là Trung Quốc. Táo tàu có một cách sử dụng truyền thống lâu đời kéo dài hàng nghìn năm như một loại dược liệu và thực phẩm bổ sung. Táo tàu được sử dụng như một chất bổ sung sức khỏe cho những người bị nhiễm trùng máu hoặc bị suy dinh dưỡng mãn tính. Jujube polysaccharides (JP), một thành phần hòa tan trong nước được kết hợp với các tỷ lệ monosaccharide và axit uronic khác nhau (Ji, Hou, Yan, Shi, & Liu, 2020), là một trong những thành phần hoạt tính trong táo tàu (Ji et al., 2017 ), đã được chấp nhận tốt để thể hiện tác dụng bảo vệ gan và hoạt động điều hòa miễn dịch và tăng cường chức năng hàng rào đường ruột (Liu và cộng sự, 2015, Yue và cộng sự, 2015). Thật vậy, JP cũng thường được coi là có tác dụng tiềm ẩn đối với bệnh thiếu máu. Tuy nhiên, cơ chế phân tử của JP trong điều trị bệnh thiếu máu vẫn còn ít được biết đến.

Trong những năm gần đây, các chất chuyển hóa đã được sử dụng rộng rãi để tìm hiểu các yếu tố tiềm ẩn góp phần vào sự tiến triển của bệnh. Các chất chuyển hóa mục tiêu đã được sử dụng rộng rãi trong việc xác định các dấu hiệu phân tử của các bệnh phức tạp ở người như CKD. Indoxyl sulfate (IS) và p-cresyl sulfate (PCS) đã được xác minh là dấu hiệu sinh học của sự tiến triển của bệnh thận mạn tính (Meijers & Evenepoel, 2011), và mức độ trimethylamine-N-oxide (TMAO) tăng lên có thể trực tiếp dẫn đến xơ hóa và rối loạn chức năng ống thận. (Tang và cộng sự, 2015). Các axit béo chuỗi ngắn (SCFAs), các chất chuyển hóa phụ thuộc vào vi sinh vật đường ruột, là chất nền năng lượng có khả năng ảnh hưởng đến các quá trình sinh lý khác nhau (LeBlanc và cộng sự, 2017), và việc giảm SCFAs đã được báo cáo là góp phần vào sự tiến triển của CKD (Koh, De Vader, Kovatcheva-Datchary, & B¨ ackhed, 2016, Wang và cộng sự, 2019). Hơn nữa, SCFAs có thể bảo vệ cấu trúc thận khỏi bị hư hại thông qua việc ức chế stress oxy hóa (Li, Ma, & Fu, 2017). Đồng thời, SCFAs đã được phát hiện có tác dụng hữu ích đối với sự hấp thụ sắt và điều chỉnh sự biểu hiện gen globin của phôi thai / thai nhi, tạo ra hồng cầu và điều chỉnh chứng thiếu máu (Tako, Glahn, Knez, & Stangoulis, 2014). Tuy nhiên, cơ chế của SCFAs trong thiếu máu thận vẫn cần được làm sáng tỏ.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng JP có thể điều chỉnh việc giải phóng các SCFA và kích thích sản xuất EPO qua trung gian HIF, kết quả của việc này là điều chỉnh tình trạng thiếu máu ở thận. Ở đây, chúng tôi sẽ khảo sát tác dụng của JP trong việc cải thiện tình trạng thiếu máu thận ở 5/6 con chuột suy thận do thận hư, bao gồm chức năng thận và các thông số huyết học. Phương pháp chuyển hóa có mục tiêu sử dụng LC-MS / MS được phát triển để xác định tám SCFA bao gồm axit axetic, axit propanoic, axit isobutyric, axit butyric, 2- axit metyl butyric, axit isovaleric, axit valeric và axit hexanoic trong phân và mẫu thận và mức độ SCFA được nhắm mục tiêu được đánh giá ở những con chuột khỏe mạnh và mắc bệnh suy thận. Ngoài ra, sự liên quan của tín hiệu HIF ở chuột được xử lý bằng JP cũng được tiết lộ.

Hình 1. Sắc ký GC – MS điển hình của JP. (A) Công thức cấu tạo của monosaccarit sau khi tạo dẫn xuất aldononitril axetat; (B) Các cấu hình sắc ký ion hỗn hợp GC – MS (MIC) đại diện của hỗn hợp monosaccarit chuẩn và monosaccarit thủy phân JP. Các pic trong cấu hình sắc ký tương ứng với chất đánh dấu hóa học được thể hiện trong (A): 1. rhamnose, 2. arabinose, 3. fucose, 4. xylose, 5. mannose, 6. glucose, 7. galactose, 8. inositol (ISTD ).

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Điều chế polysaccharide táo tàu

Thành quả của Z. jujuba được mua từ Công ty TNHH Dược phẩm Huahui Thâm Quyến. Nguyên liệu đã được chứng thực bởi Tiến sĩ Jianping Chen theo Dược điển của Cộng hòa Nhân dân Trung Hoa phiên bản 2015. Các mẫu chứng từ được lưu giữ tại Bệnh viện Y học Cổ truyền Trung Quốc Thâm Quyến với số 18100601.

JP thô được chiết xuất từ ​​táo tàu như đã mô tả trước đây, với những sửa đổi nhỏ (Ji và cộng sự, 2020). Một cách ngắn gọn, jujubes được ủ với 10 thể tích nước (v / w) trong nồi cách thủy ở 80 ◦C trong 3 giờ và chiết xuất 3 lần. Sau khi lọc, kết hợp các dịch lọc và cô đặc hỗn hợp này trong thiết bị cô quay dưới chân không có kiểm soát. Dung dịch cô đặc được kết tủa thêm bằng cách thêm bốn lần etanol (v / v) ở 4 ◦C trong 12 giờ. Kết tủa được thu bằng cách ly tâm và được làm khô dưới áp suất giảm đến khô để thu được JP thô. Độ tinh khiết của JP được xác định là 80% bằng cách sử dụng phương pháp đo nhiệt lượng.

2.2. Đặc điểm của thành phần monosaccharide của polysaccharide táo tàu

Hệ thống Shimadzu GC – MS (Shimadzu GC – MS TQ8 0 4 0 được giao tiếp với Shimadzu GC 2010 plus) được trang bị nguồn EI, cột mao quản SH-Rxi -5 Sil MS (30 m × 0,25 mm ID, độ dày màng 0,25 µm, Shimadzu) được sử dụng để xác định monosaccharide thủy phân tạo dẫn xuất với tỷ lệ phân chia 10: 1. Nhiệt độ của tiêm, nguồn ion và bề mặt là 250 ◦C, 200 ◦C và 250 ◦C. Nhiệt độ ban đầu của cột được giữ ở 120 ◦C trong 1 phút, sau đó được nâng lên ở 15 ◦C / phút đến 160 ◦C và giữ trong 4 phút, 2 ◦C / phút đến 165 ◦C và giữ trong 2 phút, 20 ◦C /

tối thiểu đến 195 ◦C, 5 ◦C / phút đến 250 ◦C, và giữ trong 3 phút. Tốc độ dòng khí mang Heli được giữ ở 46 cm / s và 2 μL của mỗi mẫu được bơm vào thiết bị. Các chất phân tích được định lượng ở chế độ theo dõi ion (SIM) đã chọn, ion mục tiêu: rhamnose (m / z 129. 00), arabinose (m / z 115. 00), fucose (m / z 103. 00), xylose (m / z 115. 00), mannose (m / z 115. 00), glucose (m / z 115. 00 ), galactose (m / z 115. 00), inositol (m / z 126. 00). Các tiêu chuẩn monosaccharide được liệt kê như sau: L (cộng) -arabinose (1506–200202), fucose (112014–201902), D-xylose (111508–201605), D-glucose (110833–201908), rhamnose (111683–201502) ), galactose (100226–201807), D-mannose (140651–201805) được mua từ Viện Kiểm soát Thực phẩm và Dược phẩm Quốc gia. Inositol được lấy từ Sigma (I 7508-50 g).

JP chiết xuất (10 mg) được thủy phân thành monosaccharide với 10 mL axit trifluoroacetic (TFA) 2 mol / L ở 105 ◦C trong 3 giờ, và các monosaccharide thủy phân từ JP được cô đặc và rửa dưới áp suất giảm ở 60 ◦C đến loại bỏ TFA, và phần còn lại được hoàn nguyên bằng 2 mL nước. Thêm 250 µL dung dịch hydroxylamin hydroclorid / pyridin 20 mg / mL vào dung dịch monosaccharid thủy phân 100 µL và giữ trong nồi cách thủy 90 ◦C trong 45 phút. Và sau đó 250 µL anhydrit axetic được thêm vào và giữ trong nồi cách thủy 90 ◦C trong 45 phút nữa. Khi kết thúc phản ứng, hỗn hợp được chiết bằng 1 mL xyclohexan 5 lần, và lớp xyclohexan được cô đặc đến 1 mL. Tiêm 1 µL phần nổi phía trên vào GC – MS để phân tích (Li & Shi, 2013).

2.3. Loài vật

Tất cả các thí nghiệm đều được thực hiện với các quy trình đã được Ủy ban sử dụng dịch vụ chăm sóc động vật của Viện Đại học Trung y Quảng Châu phê duyệt. Chuột Sprague – Dawley, đực và cái, nặng 180–220 g, được lấy từ Trung tâm Động vật Phòng thí nghiệm Y tế Quảng Đông (Phật Sơn, Trung Quốc, Giấy phép số SCXK (Yue) 2008–0002) và được duy trì trong môi trường không có mầm bệnh cụ thể (SPF ) cơ sở động vật theo chu kỳ sáng-tối 12 giờ, với thức ăn và nước uống tự do.

Để gây ra suy thận, 5/6 ca cắt thận đã được thực hiện theo mô tả trước đó (Chen và cộng sự, 2019). Tất cả các hoạt động phẫu thuật được thực hiện dưới sự gây mê với 10% chloral hydrat. Nhóm phẫu thuật giả mạo (n=6) đã thực hiện các bước tương tự để mở khoang bụng và tiếp xúc với quả thận. 5/6 con chuột bị cắt thận được chia ngẫu nhiên thành hai nhóm. Chuột không được điều trị (nhóm CKD, n=6) và chuột nhận JP (CKD cộng với nhóm JP, n=6) ​​bằng đường miệng với liều 1,2 g / kg / ngày. Sau 90 ngày hoạt động, 90 ngày quản trị bắt đầu. Ngày thứ 90 là thời gian cuối cùng sử dụng JP cho chuột, và sau 24 giờ, các con vật được hiến tế bằng cách lấy máu từ động mạch chủ bụng, và các mẫu nước tiểu, phân, huyết thanh và thận được thu thập từ mỗi con chuột. Tất cả các mẫu được bảo quản ở - 80 ◦C trước khi phân tích thêm.

2.4. Phân tích sinh hóa

Theo hướng dẫn của nhà sản xuất, nitơ urê máu (BUN) và creatinin huyết thanh (Scr) được đo bằng bộ phát hiện huyết thanh creatinin và bộ phát hiện BUN (WAKO, Ginza, Nhật Bản), và protein trong nước tiểu được đo bằng bộ Elisa (Viện kỹ thuật sinh học Nam Kinh Jiancheng, Nam Kinh, Trung Quốc). Hồng cầu (RBC), hemoglobin (Hb), hematocrit (HCT) và số lượng tiểu cầu (PLT) được Hệ thống Huyết học (Siemens 2021i, Erlangen, Germany) phân tích theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

2.5. Kiểm tra mô học

Phương pháp nhuộm định kỳ acid-Schiff (PAS) và Masson được sử dụng để đánh giá tổn thương bệnh lý thận, trong số đó, phương pháp nhuộm PAS được sử dụng để phát hiện vùng teo ống thận và vùng cầu thận, và nhuộm Masson dành cho xơ hóa mô kẽ thận (Xie et al. , Năm 2020). Phương pháp phân tích định lượng được thực hiện theo các nghiên cứu trước đây (Chen và cộng sự, 2019). Tóm lại, điểm số teo ống trong phương pháp nhuộm PAS được xác định như sau: 1. ống teo đơn hiếm gặp; 2. một số cụm ống teo nhỏ; 3. teo đét. Diện tích cầu thận được đo bằng phần mềm ZEN 3.1 (Axio Scope A1, ZEISS, Jena, Đức). Diện tích xơ trong nhuộm Masson được đo bằng phần mềm Image J (NIH, Bethesda, MD, USA). Ít nhất mười trường vi mô (200 ×) của 6 con chuột mỗi nhóm được bắt ngẫu nhiên để đo điểm teo, diện tích cầu thận và vùng xơ, với ít nhất một cầu thận trong mỗi trường vi mô.

2.6. Phân tích hóa mô miễn dịch

Phần parafin ở thận (4 μm) từ mỗi mẫu được khử nước dần bởi xylen hai lần, và etanol giảm dần (1 0 0–95–90–80–70 phần trăm), kháng nguyên được lấy ra bằng dung dịch đệm axit xitric (pH 6,0 ) trong 30 phút, được chặn bằng 3% hydrogen peroxide trong 10 phút và huyết thanh dê trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Các phần mô được ủ riêng biệt bởi kháng thể chính HIF -1 (Bioss, bs -0737 R, 1: 500, Lot: BA01279129), HIF -2 (Bioss, bs -1447 R, 1: 500, Lô: BJ2044786) ở 4 ◦C trong 10 giờ và kháng thể thứ cấp chống thỏ liên hợp của dê với HRP (Abcam, ab6712, 1: 1000) ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, DAB (diaminobezid in) được sử dụng để phát hiện hoạt động của HRP, hạt nhân được chống lại bởi hematoxylin. các. Hóa mô miễn dịch được phân tích dưới vi trường 400 × từ mỗi nhóm và cố định vạch chia độ=20 μm bằng Axio Scope A1, ZEISS, Jena, Đức. Nhân có màu xanh lam nhuộm bởi hematoxylin và tính nhạy cảm miễn dịch của DAB là màu nâu, nhuộm DAB càng sâu nghĩa là dương tính với hóa mô miễn dịch càng mạnh.

2.7. Phát hiện EPO

Hàm lượng EPO trong huyết thanh được phát hiện bằng kit ELISA (Abcam, ab274398) và thí nghiệm đề cập đến giao thức kit ELISA. Như đã tóm tắt, thêm cocktail kháng thể EPO vào mẫu và ủ trong 1 giờ. Sau khi ủ, rửa sạch từng giếng bằng đệm rửa 3 lần, thêm TMB vào lần thứ hai ủ trong 15 phút và dừng phản ứng.

Tổng mRNA của thận được chiết xuất từ ​​mô thận đông lạnh bằng cách sử dụng Trizol và dịch mRNA thành cDNA. PCR thời gian thực được thực hiện với Maxima SYBR Green / ROX qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA, K0223) theo giao thức của nhà sản xuất. Tín hiệu xanh SYBR được thu nhận và đo bằng Hệ thống phát hiện trình tự ABI Prism 7300 (Hệ thống sinh học ứng dụng, Thành phố Foster, CA). Các mồi là: 5′-CCG TCC CAG ATA CCA AAG TC -3 ′ và 5′-ACC CGA AGC AGT GAA GTG -3 ′ cho chuột EPO (214 bps, NM _017001. 2); 5′- GTC GGT GTG AAC GGA TTT G -3 ′ và 5′-TCC CAT TCT CAG CCT TGA C - 3 ′ cho GAPDH (181 bps, NM _017008. 3), thị tộc quản lý nhà như một kiểm soát nội bộ trong mọi trường hợp. Và định lượng tương đối của biểu hiện gen được tính bằng phương pháp biểu hiện gen chuẩn hóa (2− ΔΔCT).

Một lượng protein tương đương của các chất phân giải vỏ thận được nạp vào và phân tách bằng gel SDS 10% và sau đó được chuyển đến màng nitrocellulose. Sau khi được ngăn trong sữa không béo 5% trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng, các màng được ủ với kháng thể chính ở 4 ◦C qua đêm. Sau đó, các màng này được ủ với HRP (peroxidase củ cải ngựa) IgG chống chuột liên hợp (Life Technologies) ở nhiệt độ phòng trong 45 phút. Hoạt động của HRP được hiển thị bằng cách sử dụng Chất nền ECL Clarity Western và được phân tích bởi hệ thống hình ảnh Tanon. Kháng thể chính sau đây đã được sử dụng trong nghiên cứu này: EPO đơn dòng (B - 4) từ chuột (Công nghệ sinh học Santa Cruz, sc -5290, độ pha loãng 1/500), đơn dòng -actin từ chuột (Công nghệ truyền tín hiệu tế bào, 8H10D10, độ pha loãng 1/1000).

2.8. Phân tích axit béo chuỗi ngắn

Hệ thống Shimadzu UHPLC-LCMS / MS (Shimadzu LC-MS 8045 giao tiếp với Shimadzu LC -20 AD) được trang bị nguồn ESI.

Sự phân tách sắc ký được thực hiện trên cột Shim-pack GIST C18 (2,1 × 1 0 0 mm, 2 μm), sử dụng {{1 0}}. 1 phần trăm axit formic trong nước ( dung môi A) và axetonitril (dung môi B) với tốc độ chảy 0,3 mL / phút bằng cách rửa giải gradient: 0-9 phút, 25–30 phần trăm B; 9–11 phút, 30–40 phần trăm B; 11–20 phút, 40–50 phần trăm B; 20–20,1 phút, 50–100 phần trăm B; 20,1–23 phút, 100 phần trăm B; 23,1 min – 25 phần trăm B để cân bằng lại. Nhiệt độ cột là 35 ◦C, và bộ lấy mẫu tự động được giữ ở 4 ◦C trong quá trình phân tích, 1 μL của mỗi mẫu được bơm vào thiết bị. Việc phát hiện chất phân tích được thực hiện ở chế độ giám sát đa phản ứng (MRM), hoạt động ở chế độ ion dương. Các thông số MS: Dòng khí phun sương: 3.0 L / phút; Khí sấy chảy: 10 L / phút; Sưởi ấm Khí chảy: 10 L / phút; Nhiệt độ DL: 250 ◦C; nhiệt độ giao diện: 300 ◦C; Khối gia nhiệt: 400 ◦C. Chuyển tiếp MRM và năng lượng va chạm (CE) đã được lựa chọn và tối ưu hóa bằng cách truyền trực tiếp từng dẫn xuất chuẩn. Số lượng chất phân tích chuyển tiếp MRM được tóm tắt trong Bảng S1.

SCFAs trong phân: Thêm 100 μL 50% acetonitril vào 3 mg phân đông khô và xoáy trong 2 phút. Sau đó, hỗn hợp được ly tâm ở 12000 vòng / phút trong 10 phút ở 4 ◦C và dùng pipet hút phần nổi phía trên.

SCFAs thận: Cân 100 mg mô thận và xoáy trên đá với nước muối gấp 4 lần bình thường (100 mg / 400 μL) để chuẩn bị đồng nhất mô. Thêm 3 lần metanol lạnh vào dung dịch đồng nhất mô 300 μL và quay xoáy trong 2 phút, sau đó hỗn hợp được ly tâm ở 12000 vòng / phút trong 10 phút ở 4 ◦C và dùng pipet hút phần nổi phía trên. Phần nổi phía trên được làm khô bằng N2 và hoàn nguyên bằng 100 μL 50% acetonitril.

Đã thêm 500 mmol / L N - (3- dimethyl aminopropyl) -Ń -etyl carbodiimide hydrochloride (EDC, Aladdin, Thượng Hải, Trung Quốc), 50 mmol / L 3H- [1,2,3] -Triazolo [4, 5- b] pyridine -3- ol (HOAT, Aladdin, Thượng Hải, Trung Quốc) và 50 mg / mL 12C-Dansylhydrazine (12C-DnsHz, J&K, Bắc Kinh, Trung Quốc) thành 20 μL chiết xuất mẫu ở dãy với cùng khối lượng. EDC và HOAT được điều chế bằng axit ethanesulfonic 500 mmol / L 2- (N-Morpholino) mới (MES, Macklin, Thượng Hải, Trung Quốc). Sau khi ủ ở 20 ◦C trong 90 phút, 20 μL 50 mmol / L CuCl2 (Macklin, Thượng Hải, Trung Quốc) được thêm vào hỗn hợp để dập tắt phản ứng tạo dẫn xuất ở 40 ◦C trong 30 phút (Zhao & Li, 2018). Vào cuối quá trình tạo dẫn xuất, hỗn hợp được pha loãng 10 lần bởi 25% acetonitril. Trước khi phân tích, 100 μL phần nổi phía trên được trộn với dung dịch chuẩn nội 100 μL. Nhãn 13C-DnsHz được sử dụng làm tiêu chuẩn nội bộ (ISTD 1-8) phù hợp với phản ứng tạo dẫn xuất tương tự. Tiêu chuẩn SCFAs: axit axetic (AA, A116173), axit propanoic (PA, P110446), axit isobutyric (IBA, I103524), axit butyric (BA, B110438), 2- axit metyl butyric (2- BA, M107377), axit isovaleric (IVA, I108280), axit valeric (VA, V108271), axit hexanoic (HA, H103632) được cung cấp từ Aladdin (Thượng Hải, Trung Quốc).

2.9. Phân tích thống kê

Dữ liệu của mỗi nhóm được biểu thị dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (SD). Ý nghĩa thống kê giữa các nhóm được thực hiện bằng ANOVA một chiều và phân tích hậu kỳ với bài kiểm tra Student-Newman-Keuls (SNK) hoặc bài kiểm tra T3 của Dunnett. Giá trị của P <0. 0="" 5="" được="" coi="" là="" có="" ý="" nghĩa="" thống="" kê.="" tất="" cả="" dữ="" liệu="" được="" thực="" hiện="" bằng="" phần="" mềm="" thống="" kê="" spss="" (phiên="" bản="" 22.0,="" spss="" inc.,="" chicago,="" il,="">

3. Kết quả

3.1. JP cải thiện chức năng thận của chuột CKD

Monosaccharide của JP đã được đặc trưng trước khi điều trị trên động vật. JP được sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm bảy monosaccharide, đó là, rhamnose (1,62 phần trăm), arabinose (15,79 phần trăm), fucose (0. 21 phần trăm), xylose (4,56 phần trăm), mannose (3. 00 phần trăm), glucose (73,44 phần trăm) và galactose (4,99 phần trăm) (Hình 1). Phương pháp phân tích của chúng tôi đã được xác nhận bởi độ tuyến tính, độ chính xác, độ lặp lại, độ ổn định và độ phục hồi (Bảng S2 – S3). Các chất phân tích được xác nhận là ổn định ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Sản lượng của JP phải cao hơn 8,63 phần trăm và độ tinh khiết không được dưới 77,16 phần trăm. Phân tích hóa học nói trên của JP phục vụ như một cách tiếp cận kiểm soát chất lượng để đảm bảo khả năng tái tạo của các nghiên cứu động vật dưới đây.

Scr, BUN, và protein trong nước tiểu đại diện cho các chức năng của thận. Mức độ Scr, BUN và protein trong nước tiểu ở chuột CKD cao hơn đáng kể so với nhóm giả tạo (P <{0}}. 01).="" sau="" 90="" ngày="" điều="" trị="" với="" jp,="" nồng="" độ="" scr,="" bun="" và="" protein="" niệu="" đều="" giảm="" so="" với="" nhóm="" ckd="" (p=""><0,01) (hình="" 2a="" –="">

3.2. JP cải thiện tổn thương bệnh lý thận ở chuột mắc bệnh thận mạn

Trọng lượng của toàn bộ quả thận phải đối với nhóm giả và thận phải còn lại đối với nhóm CKD và CKD cộng với JP được sử dụng để đánh giá hình thái thận theo trọng lượng thận (KW) và trọng lượng thận / trọng lượng cơ thể (KW / BW). Vào cuối các thử nghiệm, KW và KW / BW của nhóm CKD đã tăng lên so với nhóm giả tạo (tất cả P ​​<{{0}}. 0="" 5).="" trong="" mô="" hình="" ckd="" do="" cắt="" thận="" 5/6,="" sự="" giảm="" hoạt="" động="" của="" proteinase="" ở="" thận="" gây="" ra="" sự="" tăng="" trưởng="" bù="" trừ="" của="" thận,="" các="" công="" ty="" bị="" phì="" đại="" thận="" (morton="" &="" griffiths,="" 1985),="" và="" chúng="" tôi="" đã="" xác="" nhận="" tuyên="" bố="" này.="" sau="" khi="" điều="" trị="" jp,="" kw="" đã="" giảm="" đáng="" kể="" (p=""><0. 05)="" và="" đóng="" vào="" nhóm="" giả="" tạo="" (p="" ˃="" 0,05);="" trong="" khi="" kw="" bw="" giảm="" nhẹ="" (p="" ˃="" 0,05).="" (hình="" 2d="" –="">

Hình 2. JP bảo vệ chức năng thận ở chuột mắc bệnh suy thận. Mức độ Scr (A), BUN (B) và protein niệu (C) ở các nhóm khác nhau. (D) trọng lượng thận, (E) KW / BW. Dữ liệu được trình bày dưới dạng phương tiện ± SD, n=6 cho mỗi nhóm (** P <0. 0="" 1="" so="" với="" nhóm="" giả;="" #p=""><0. 05="" ,="" ##="" p=""><0,01 so="" với="" nhóm="">

Ở nhóm suy thận, ống thận bị teo lớn so với nhóm giả (P <{{0}}. 0="" 1),="" diện="" tích="" cầu="" thận="" và="" xơ="" hóa="" mô="" kẽ="" thận="" gần="" gấp="" đôi="" so="" với="" của="" nhóm="" giả="" mạo="" trong="" phân="" tích="" định="" lượng="" (p=""><0. 0="" 1).="" sau="" khi="" điều="" trị="" bằng="" jp,="" điểm="" số="" teo="" ống="" thận="" giảm="" gần="" hai="" lần="" (p=""><0,01), diện="" tích="" cầu="" thận="" gần="" như="" được="" phục="" hồi="" về="" nhóm="" giả="" (p=""><0,01), và="" xơ="" hóa="" mô="" kẽ="" thận="" giảm="" 1/3="" (p=""><0,01) khi="" so="" với="" nhóm="" ckd="" (hình="">

Hình 3. JP bảo vệ cấu trúc thận ở chuột bị suy thận. (A) nhuộm PAS. (B) Nhuộm Masson. (C) Điểm teo ống. (D) Vùng cầu thận (E) Vùng xơ. Tất cả hình ảnh được hiển thị ở độ phóng đại giống hệt nhau, 2 0 0 ×, thanh tỷ lệ=100 μm. Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± SD, n=6 trên mỗi nhóm (** P <0. 01="" so="" với="" nhóm="" giả;="" #p=""><0,05, ##="" p=""><0,01 so="" với="" nhóm="" ckd="">

3.3. JP đã điều chỉnh các thông số huyết học ở chuột CKD

Đối với phân tích sinh hóa các thông số huyết học, RBC, Hb, HCT và PLT được đo. Ở chuột CKD, mức RBC đã giảm từ 9. 0 6 xuống 7,2 0 × 1012 / L, Hb từ 15,28 xuống 13,22 g / dL, HCT từ 47,1 đến 40,4 phần trăm và PLT tăng lên từ 1012 đến 1526 × 109 / L so với nhóm giả (P <0,01), chỉ="" ra="" rằng="" các="" dấu="" hiệu="" thiếu="" máu="" đã="" được="" quan="" sát="" thấy="" ở="" chuột="" mắc="" bệnh="" suy="" thận.="" mức="" giảm="" rbc,="" hb,="" hct="" và="" plt="" ở="" chuột="" ckd="" được="" điều="" trị="" bằng="" jps="" đã="" được="" phục="" hồi="" (p=""><0,01) (hình="">

Hình 4. JP phục hồi các thông số huyết học ở chuột CKD. Mức độ PLT (A), RBC (B), Hb (C), HCT (D). Dữ liệu được trình bày dưới dạng phương tiện ± SD, n=6 cho mỗi nhóm (** P <0. 0="" 1="" so="" với="" nhóm="" giả;="" #p=""><0. 05="" ,="" ##="" p=""><0,01 so="" với="" nhóm="">

3.4. JP kích thích biểu hiện EPO

So với nhóm giả, mức EPO huyết thanh và lượng mRNA EPO ở thận đã giảm đáng kể ở chuột thiếu máu CKD (P <0. 0="" 1).="" phân="" tích="" western="" blotting="" cho="" thấy="" mức="" độ="" protein="" epo="" giảm="" nhẹ="" ở="" nhóm="" ckd="" mà="" không="" có="" sự="" khác="" biệt="" đáng="" kể.="" sau="" khi="" điều="" trị="" bằng="" jp,="" mức="" epo="" huyết="" thanh,="" mrna="" epo="" thận="" và="" protein="" đã="" được="" nâng="" cấp="" đáng="" kể="" so="" với="" nhóm="" ckd="" (p=""><0. 01="" hoặc="" p=""><0,05) (hình="" 5a="" –="">

Trong vỏ thận, HIF -1 chủ yếu được sản xuất bởi các tế bào biểu mô ống thận, HIF -2 chủ yếu được biểu hiện trong các tế bào nội mô và nguyên bào sợi mô kẽ thận (Sch¨ odel & Ratcliffe, 2019). Phân tích hóa học miễn dịch cho thấy rằng, đối với HIF -1, ở chuột mắc bệnh thận mạn, các tubular bị nhuộm màu mạnh hơn so với nhóm giả. Sau khi điều trị bằng JP, ống thận bắt màu mạnh hơn và diện tích lớn hơn so với nhóm CKD như mũi tên màu đỏ được chỉ ra trong Hình 5E. HIF -2 cho thấy hóa mô miễn dịch tương đối yếu dương tính tại mô kẽ thận ở nhóm Sham. Ở nhóm CKD, HIF -2 cho thấy hóa mô miễn dịch dương tính. Sau khi điều trị JP, HIF -2 cho thấy hóa mô miễn dịch mạnh hơn so với nhóm CKD (Hình 5F).

Hình 5. JP kích thích biểu thức EPO. (A) Hàm lượng EPO huyết thanh. (B)Quả thậnMRNA tương đối của EPO. GAPDH được coi là gen giữ nhà. (C) Các hình ảnh đốm phía tây đại diện cho sự biểu hiện của protein EPO. (D) Phân tích tỷ trọng của EPO. (E) Hóa mô miễn dịch của HIF {{0}}. (F) Hóa mô miễn dịch của hàm lượng HIF - 2 chuẩn hóa thành -actin. Hình ảnh hóa mô miễn dịch được trình bày ở độ phóng đại giống hệt nhau, 4 0 0 ×, vạch chia độ=20 μm. Nhân có màu xanh lam nhuộm bởi hematoxylin và tính nhạy cảm miễn dịch của DAB là màu nâu, nhuộm DAB càng sâu nghĩa là dương tính với hóa mô miễn dịch càng mạnh. Mũi tên màu đỏ chỉ cho kết quả dương tính với hóa mô miễn dịch. Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± SD, n=6 trên mỗi nhóm (* P <0,05 so="" với="" nhóm="" giả;="" #p=""><0,05, ##="" p=""><0,01 so="" với="" nhóm="">

3.5. JP đã gây ra việc phát hành SCFAs

Một phương pháp tiếp cận chuyển hóa có mục tiêu dựa trên LC-MS đã được phát triển để định lượng việc giải phóng tám SCFA trong mẫu phân. Phương pháp đã thiết lập đã được xác nhận bằng cách đánh giá độ tuyến tính, độ nhạy, độ chụm, hiệu ứng ma trận, độ chính xác và độ ổn định. Các mẫu kiểm tra chất lượng nồng độ thấp, trung bình và cao (LQC, QMC, HQC) để xác nhận độ nhạy, độ chụm, độ chính xác và độ ổn định, được chọn theo các điểm nồng độ thấp nhất, trung bình và cao nhất của đường chuẩn ma trận và kết quả được hiển thị trong Bảng S4 – S6. Các chất phân tích được xác nhận là ổn định ở 4 ◦C trong 48 giờ. Sắc ký đồ LC-MS / MS của SCFAs được thể hiện trong Hình 6.

Hình 6. Sắc ký UHPLC-MS / MS của SCFAs. (A) Phần trên là phương trình hóa học tạo dẫn xuất SCFAs; dưới là công thức cấu trúc SCFAs sau khi tạo dẫn xuất dansylhydrazine; (B) Sắc ký đồ UHPLC / MRM-MS của hỗn hợp chất chuẩn và mẫu phân, các pic sắc ký trong (B) được phản ứng với chất đánh dấu hóa học nêu trong (A): 1. 12C-axit axetic; 2. Axit axetic 13C (ISTD1); 3. Axit 12C-propanoic; 4. Axit 13C-propanoic (ISTD2); 5. Axit butyric 12C-iso; 6. Axit 12C-butyric; 7. Axit 13C-isobutyric (ISTD3); 8. Axit 13C-butyric (ISTD4); 9. 12C -2- axit metylbutyric; 10. Axit 12C-isovaleric; 11. Axit valeric 12C; 12. 13C -2- axit metylbutyric (ISTD5); 13. Axit 13C-isovaleric (ISTD6); 14. Axit 13C-valeric (ISTD7); 15. Axit 12C-hexanoic; 16. Axit 13C-hexanoic (ISTD8).

Đối với mẫu phân, ở nhóm CKD, mức AA và PA giảm rõ rệt gần 4 lần và 5 lần so với nhóm giả (P <0. 0="" 1);="" trong="" khi="" sau="" khi="" xử="" lý="" jp,="" lượng="" aa="" và="" pa="" được="" khôi="" phục="" trở="" lại="" 4/5="" nhóm="" giả="" (p=""><{{1 0}}.="" 0="" 1).="" tương="" tự,="" mức="" độ="" ba="" và="" va="" đã="" giảm="" mạnh="" gần="" 3="" 0="" lần="" và="" 4="" lần="" ở="" nhóm="" ckd="" so="" với="" nhóm="" giả="" tạo="" (p=""><0. 01).="" xử="" lý="" jp="" cho="" thấy="" một="" xu="" hướng="" gia="" tăng="" nhưng="" không="" phải="" là="" một="" cải="" thiện="" đáng="" kể.="" nội="" dung="" của="" iba,="" iva="" và="" 2-="" ba="" không="" cho="" thấy="" sự="" thay="" đổi="" đáng="" chú="" ý="" giữa="" ckd="" và="" nhóm="" giả.="" sau="" khi="" điều="" trị="" bằng="" jp,="" mức="" iba,="" iva="" và="" 2-="" ba="" đã="" được="" tăng="" lên="" (p=""><0,01). tuy="" nhiên,="" ha="" không="" cho="" thấy="" sự="" thay="" đổi="" rõ="" ràng="" giữa="" ba="" nhóm="" (hình="" 7a).="" hơn="" nữa,="" đối="" với="" mô="" thận,="" ở="" nhóm="" ckd,="" số="" lượng="" của="" tám="" scfas="" đều="" giảm="" đáng="" kể="" (p=""><0,01), trong="" khi="" sau="" khi="" điều="" trị="" jp,="" mức="" độ="" scfa="" đã="" tăng="" lên="" ngoại="" trừ="" ba="" và="" ha="" (p=""><0,01 hoặc="" p="">< 0,5).="" ba="" tăng="" nhẹ="" nhưng="" không="" đáng="" kể,="" và="" ha="" không="" cho="" thấy="" sự="" thay="" đổi="" sau="" khi="" điều="" trị="" bằng="" jp="" (hình="">

Hình 7. Nội dung SCFAs trong các nhóm khác nhau. (A) SCFA trong phân. (B) SCFAs thận. Dữ liệu được trình bày dưới dạng phương tiện ± SD, n=6 cho mỗi nhóm (** P <0. 0="" 1="" so="" với="" nhóm="" giả;="" ##="" p=""><0. 01,="" #p=""><0,05 so="" với="" nhóm="">

4. Thảo luận

Trong mô hình chuột CKD cắt thận 5/6 hiện tại,quả thậnhàm sốcác chỉ số (Scr, BUN, và protein nước tiểu) đều tăng lên rõ rệt, xuất hiện các phì đại thận còn sót lại và tổn thương bệnh lý thận, kèm theo các chỉ số huyết học thay đổi. Những dữ liệu này phù hợp với các nghiên cứu trước đây (Garrido và cộng sự, 2015, Morton & Griffiths, 1985). Các chỉ số trên cho thấy chuột thiếu máu CKD gây ra bởi 5/6 cắt thận đã được thiết lập thành công và có thể được xác minh về tác dụng có lợi của JP trong điều trị chuột thiếu máu CKD. Vớiquả thậnhàm sốngày càng xấu đi, thiếu máu đã được công nhận là một biến chứng CKD cơ hội, tác động tiêu cực đến chất lượng cuộc sống của bệnh nhân (Locatelli, Fishbane, Block, & Macdougall, 2017). Hiểu được các yếu tố nguy cơ liên quan đến sự tiến triển của thiếu máu thận sẽ giúp đưa ra các phương pháp điều trị. Ngày nay, mối liên hệ giữa bệnh tật và sự trao đổi chất của hệ vi sinh vật đường ruột ngày càng được chú ý, trong khi mối quan hệ giữa SCFAs và thiếu máu thận vẫn còn ít được biết đến. SCFAs, được chuyển hóa chủ yếu bởi Clostridium, Coprococcus và Bacteroides (Koh và cộng sự, 2016), đang nhắm mục tiêu vào các thụ thể liên kết màng cụ thể, đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cân bằng môi trường ruột và sức khỏe toàn bộ cơ thể. SCFAs đã được chứng minh là có mối quan hệ không thể tách rời với CKD, và mức độ axit axetic, axit propionic, axit butyric đã được giảm trong CKD (Wang và cộng sự, 2019). Ở những con chuột CKD do adenine gây ra, sự phong phú và đa dạng của hệ vi sinh vật đường ruột đã thay đổi đáng kể, các công ty giảm mức độ axit propanoic, axit butyric và axit valeric (Lakshmanan, Al, Ali, & Terranegra, 2021). Dựa trên nghiên cứu trước đây của chúng tôi, giải trình tự 16S rDNA cho thấy rằng rối loạn vi sinh vật đường ruột được hiển thị ở 5/6 con chuột CKD do thận hư so với nhóm giả. Một số SCFA sản xuất các chi đặc biệt là axit butyric từ Clostridium, Coprococcus đã thực hiện sự khác biệt ở chuột CKD (Zheng và cộng sự, 2020). Phù hợp với điều này, kết quả của chúng tôi cho thấy rằng lượng axit axetic, axit propionic, axit butyric, axit valeric đã giảm khoảng 60%, 80%, 85% và 60% ở chuột mắc bệnh thận mạn. với sự mất cân bằng môi trường ruột. Đáng lưu ý, rối loạn môi trường ruột do CKD gây ra sự chuyển hóa bất thường của hệ vi sinh vật đường ruột (Feng et al., 2019). Ngoài ra, chúng tôi phát hiện ra rằng, ở chuột thiếu máu CKD, tám loại SCFAs đã giảm mức độ. Ví dụ, sự bất thường của các sản phẩm cuối cùng của quá trình trao đổi chất, tức là SCFA có thể là kết quả của tiến triển CKD.

Polysaccharides, một trong những thành phần hoạt tính đã được tìm thấy trong các loại thảo mộc khác nhau, chẳng hạn như Dioscoreae Rhizoma, Schisandra Chinensis, Astragali Radix, và Jujubae Fructus. Polysaccharid có thể bị lên men và phân huỷ bởi hệ vi sinh vật đường ruột. Kết quả là, polysaccharid được thể hiện như một chất nền cho hệ vi sinh vật đường ruột chuyển hóa thành SCFAs hoặc được coi là có tác dụng giống như prebiotic để cải thiện thành phần của hệ vi sinh vật đường ruột để tạo điều kiện thuận lợi cho việc sản xuất SCFAs (Cai et al., 2019). Trong nghiên cứu này, phát hiện của chúng tôi cho thấy polysaccharide từ táo tàu kích thích hệ vi sinh vật đường ruột giải phóng SCFAs, chẳng hạn như axit axetic, axit propanoic, axit isobutyric, 2- axit metyl butyric ở chuột mắc bệnh CKD. Hơn nữa, sau khi điều trị bằng JP, mức SCFAs trong thận chuột thiếu máu CKD đã được cải thiện và xu hướng thay đổi phù hợp với mẫu phân. Dựa trên nghiên cứu hiện có, mối quan hệ giữa SCFAs và CKD đã dần trở nên rõ ràng. Ví dụ, axit axetic đã được báo cáo để điều chỉnh hệ thống miễn dịch và cải thiện tình trạng cấp tínhquả thậnvết thươngby inhibiting NADPH oxidase signaling in T cells (Al-Harbi et al., 2018). Propanoic acid has been proved to prevent the progression of adenine-induced CKD via free fatty acid receptor 2 (FFA2) and FFA3 (Mikami et al., 2020). Therefore, we inferred that the regaining kidney SCFA level was beneficial for a diseased kidney. It has been reported that JP increased gut microbiota diversity and increase SCFAs active microbiota (Bacteroides) relative abundance in colorectal cancer mice (Ji et al., 2020). Besides, JP increased the concentration of total SCFAs in fecal samples (Ji et al., 2019). Therefore, we inferred that JP could stimulate SCFAs production to achieve the purpose of retarding CKD progression. JP might also be a metabolism substrate for SCFAs dominant microbiota to stimulate the SCFAs production in CKD, or a prebiotic-like component to restore the gut environment, especially the diversity of SCFAs dominant microbiota, and further promote the release of SCFAs, so as to prevent the CKD progression.

Nói chung, SCFAs (không có cacbon hơn 6) có trọng lượng phân tử nhỏ và độ phân cực hóa học cao rất khó được phân tích trực tiếp bằng các phương pháp sắc ký. Việc tạo dẫn xuất hóa học được gắn nhãn đồng vị của chiến lược SCFAs có thể cải thiện độ nhạy của thiết bị và giảm sai số phân tích, điều này cung cấp một chiến lược hữu ích để xác định SCFA trong phân tích LC-MS / MS (Higashi & Ogawa, 2016). Gần đây, các phương pháp tiếp cận được dán nhãn dansyl hydrazine đã được sử dụng một cách thỏa đáng để phát hiện các chất chuyển hóa trong huyết tương của con người mục tiêu có chứa axit cacboxylic (Chen & Zhang, 2020). Để hỗ trợ điều này, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phát triển thêm quá trình tạo dẫn xuất hóa học dựa trên phương pháp tiếp cận LC-MS / MS để xác định 8 SCFA trong phân chuột. SCFA được tạo ra bởi hệ vi sinh vật đường ruột, và gần 10% SCFA được bài tiết qua phân (Boets et al., 2015). Do đó, phân tích mẫu phân của SCFAs có thể phản ánh trực tiếp những thay đổi trong môi trường ruột và mang tính tham khảo nhiều hơn trong phân tích đa tạp giữa SCFA và hệ vi sinh vật đường ruột. Đáng chú ý, xác nhận tính không ổn định, chúng tôi nhận thấy rằng các SCFA có nhãn dansyl hydrazine không ổn định ở nhiệt độ phòng và cường độ của chúng trên phổ khối lượng cho thấy xu hướng giảm theo thời gian, nhưng nó có thể duy trì ổn định trong 48 giờ ở 4 ◦C. Do đó, sau khi tạo dẫn xuất SCFAs, các chất phân tích nên được giữ ở 4 ◦C trước khi phân tích.

Trong giai đoạn CKD nâng cao 4–5, sự thiếu hụt sản xuất EPO hạn chế quá trình tạo hồng cầu, góp phần vào yếu tố quan trọng nhất trong sự phát triển của bệnh thiếu máu thận (Sakashita, Tanaka, & Nangaku, 2019). Điều trị thường quy bằng thuốc kích thích tạo hồng cầu (ESA) cho bệnh thiếu máu được đề xuất bởi các hướng dẫn thực hành lâm sàng. Tuy nhiên, sự an toàn của ESA có liên quan đến việc tăng nguy cơ tử vong và các biến cố tim mạch phải được quan tâm (Thavarajah & Choi, 2019). Ở những bệnh nhân thiếu máu thận, biểu hiện EPO nhất quán hoặc tăng lên so với những người khỏe mạnh (Babitt & Lin, 2012). Ở giai đoạn đầu, mức EPO thể hiện xu hướng nâng cấp, trong khi ở giai đoạn cuối, mức EPO cho thấy xu hướng giảm so với giai đoạn đầu, thậm chí còn thấp hơn bình thường (Panjeta, Tahirovi´c, Sofi's, ´ Cori's, & Derviˇsevi ´c, 2017). Tương ứng với các thí nghiệm trước đây (Chen và cộng sự, 2019; Wang và cộng sự, 2020), kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng mức EPO huyết thanh đã giảm ở chuột thiếu máu CKD. Chúng tôi lần lượt phát hiện mRNA EPO thận và mức độ protein ở chuột CKD, và mức protein EPO trong thận giảm nhẹ so với nhóm giả trong khi lượng mRNA EPO ở thận bị suy giảm và mức độ của nó lớn hơn mức EPO huyết thanh. Thận là nguồn tổng hợp EPO chính ở người lớn và bệnh nhân ERSD 'thậnvẫn giữ được khả năng sản xuất erythropoietin (Bernhardt và cộng sự, 2010). Để điều chỉnh nồng độ EPO huyết thanh nội sinh và thích ứng với tình trạng thiếu máu ở thận, sản xuất EPO ở thận đã được kích hoạt, mặc dùquả thậnvết thươnggiảm biểu hiện mRNA của EPO (Sch¨ odel & Ratcliffe, 2019). Sau khi điều trị bằng JP, mức EPO huyết thanh đã tăng lên, cũng như mức mRNA và protein EPO ở thận đều được nâng cấp. Trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi, JP có thể kích thích hoạt động phiên mã HRE và tăng cường gen EPO (Chen và cộng sự, 2014). Do đó, chúng tôi suy đoán rằng JP có thể phục hồi mức EPO huyết thanh chuột CKD để điều chỉnh thiếu máu thận, điều này có thể được đóng góp bởi sự biểu hiện gen EPO ở thận được kích thích ở mức mRNA.

Trong vỏ não, HIF -1 được tìm thấy chủ yếu trong ống thận và HIF -2 ở kẽ thận. Vì EPO chủ yếu được sản xuất bởi các nguyên bào sợi trong đó HIF -2 nằm cùng vị trí, điều này hỗ trợ rằng HIF -2 có thể được giải thích để điều chỉnh sản xuất EPO (Maxwell, 2003). Trong nghiên cứu của mình, chúng tôi nhận thấy rằng HIF -1 và HIF -2 có thể được kích hoạt bởi CKD và điều trị bằng JP có thể kích thích hoạt động HIF -1 và HIF -2 so với chuột CKD . Người ta đã chứng minh rằng HIF -2 có vai trò chính trong việc điều hòa sản xuất EPO (Kapitsinou và cộng sự, 2010), trong khi việc điều chỉnh HIF -1 có thể đóng vai trò bảo vệ thận ở thận (Jiang et al., 2020), gián tiếp cải thiện sản xuất EPO. Việc sản xuất EPO ở thận trước hết được điều chỉnh ở mức mRNA, trong điều kiện thiếu máu hoặc thiếu oxy, sự biểu hiện EPO mRNA có thể được tăng lên bằng cách kích thích protein HIF. Trước đây, nghiên cứu dược lý cho thấy táo tàu kích thích sự biểu hiện EPO thông qua việc điều chỉnh mức protein HIF trong mô hình tế bào (Chen và cộng sự, 2014, Lam và cộng sự, 2016). Do đó, chúng tôi suy ra rằng JP có thể điều chỉnh sự biểu hiện mRNA của EPO thông qua protein HIF- để đạt được mục đích làm giảm bớt tình trạng thiếu máu ở thận.

Hơn nữa, dựa trên kết quả hiện tại, chúng tôi suy đoán rằng việc giảm SCFAs có thể có vai trò quan trọng trong việc biểu hiện EPO qua trung gian HIF, góp phần gây ra thiếu máu CKD. Không phù hợp với điều này, người ta đã minh họa rằng mức axit axetic tăng lên có lợi cho quá trình acetyl hóa HIF -2 và tạo phức hợp protein-HIF 2 liên kết CREB, và gây ra biểu hiện EPO hơn nữa (Xu và cộng sự, 2014). Axit propionic làm giảm sự gián đoạn ty thể, quá trình apoptosis ở hồi hải mã và thiếu hụt thần kinh thông qua con đường HIF -1 / ERK (Cheng và cộng sự, 2019). Ngoài ra, axit butyric được tìm thấy để ổn định HIF -1, các gen mục tiêu HIF hoạt động trên tế bào ruột kết và giảm nhẹ phản ứng viêm ruột kết (Kelly và cộng sự, 2015). Trong nghiên cứu của chúng tôi, chúng tôi phát hiện ra rằng mức độ axit axetic, axit propanoic và axit butyric đã giảm đáng kể đi kèm với chuột CKD biểu hiện bất thường protein HIF, điều này cho thấy rằng sự ổn định của HIF- có thể liên quan đến SCFAs giảm và SCFAs có thể có tác dụng của việc ổn định HIF để điều chỉnh sự biểu hiện của EPO.

5. Kết Luận

Kết luận, chúng tôi đã chứng minh rằng JP đã cải thiện CKD và bệnh thiếu máu liên quan của nó, cơ chế liên quan đến quy định giải phóng SCFAs và sản xuất EPO. Và JP có thể là thành phần hoạt tính sinh học của táo tàu để điều trị bệnh thiếu máu. Những phát hiện này có thể cung cấp bằng chứng cho sự phát triển hơn nữa của JP như là thực phẩm bổ sung để điều trị bệnh thiếu máu liên quan đến CKD.

Tuyên bố đạo đức

Tất cả các thí nghiệm trên động vật trong nghiên cứu của chúng tôi đều được tiến hành theo các quy trình đã được Ủy ban Đạo đức của Đại học Trung y Quảng Châu phê duyệt và tuân theo Hướng dẫn của Viện Y tế Quốc gia về việc chăm sóc và sử dụng động vật thí nghiệm (NIH Publications No. 80-23, sửa đổi năm 1996). Không có vi phạm các hướng dẫn trên trong nghiên cứu của chúng tôi.

Sự nhìn nhận

Công trình này được hỗ trợ bởi Quỹ Khoa học Tự nhiên tỉnh Quảng Đông (2018A030313305), Quỹ Khoa học Tự nhiên Trung Quốc (81804052, 81973577 và 82004248), Dự án Kế hoạch Khoa học và Công nghệ Thâm Quyến (JSGG20191129102216637 và ZDSYS201606081515458), Cục Y học Cổ truyền Trung Quốc tỉnh Quảng Đông ( 20201320).

Người giới thiệu

Al-Harbi, NO, Nadeem, A., Ahmad, SF, Alotaibi, MR, AlAsmari, AF, Alanazi, WA,… Ibrahim, KE (2018). Axit béo chuỗi ngắn, axetat cải thiện tình trạng nhiễm trùng huyết cấp tính gây raquả thậnvết thươngbằng cách ức chế tín hiệu NADPH oxidase trong tế bào T. International Immunopharmacology, 58, 24–31.
Babitt, JL, & Lin, HY (2012). Cơ chế thiếu máu ở bệnh thận mạn. Tạp chí của Hiệp hội Thận học Hoa Kỳ, 23 (10), 1631–1634.
Bernhardt, WM, Wiesener, MS, Scigalla, P., Chou, J., Schmieder, RE, Günzler, V.,… Eckardt, KU (2010). Việc ức chế prolyl hydroxylase làm tăng sản xuất erythropoietin trong ESRD. Tạp chí của Hiệp hội Thận học Hoa Kỳ, 21 (12),
2151–2156.
Boets, E., Deroover, L., Houben, E., Vermeulen, K., Gomand, SV, Delcour, JA,… Verbeke, K. (2015). Định lượng sản xuất axit béo chuỗi ngắn ở ruột già in vivo từ inulin. Chất dinh dưỡng, 7 (11), 8916–8929.

Cai, Y., Liu, W., Lin, Y., Zhang, S., Zou, B., Xiao, D.,… Xie, Z. (2019). Hợp chất polysaccharides cải thiện tình trạng viêm đại tràng thực nghiệm bằng cách điều chỉnh thành phần và chức năng của hệ vi sinh vật đường ruột. Tạp chí Tiêu hóa và Gan mật, 34 (9),1554–1562.

Chen, G., & Zhang, Q. (2020). Định lượng đồng thời các axit béo tự do và acylcarnitine trong mẫu huyết tương bằng cách sử dụng ghi nhãn dansylhydrazine và sắc ký lỏng - khối phổ ba cực bốn cực. Phân tích và phân tích sinh họcHóa học, 412 (12), 2841–2849.

Chen, J., Lam, CT, Kong, AY, Zhang, WL, Zhan, JY, Bi, CW,… Tsim, KW (2014). Chiết xuất từ ​​quả Ziziphus jujuba (táo tàu) gây ra sự biểu hiện của erythropoietin thông qua yếu tố gây thiếu oxy -1 trong các tế bào Hep3B được nuôi cấy. PlantaMedica, 80 (17), 1622–1627.

Chen, J., Wang, F., Huang, S., Liu, X., Li, Z., Qi, A.,… Li, S. (2019). Nước sắc Jian-Pi-Yi-Shen làm giảm chứng thiếu máu ở thận ở 5/6 con chuột bị thận hư: Sản xuất erythropoietin thông qua tín hiệu yếu tố cảm ứng giảm oxy. Thuốc thay thế và bổ sung dựa trên bằng chứng, 2019, 1–8.
Cheng, Y., Mai, Q., Zeng, X., Wang, H., Xiao, Y., Tang, L.,… Ding, H. (2019). Propionate làm giảm co giật do pentylenetetrazol gây ra, hậu quả là gián đoạn ty thể, hoại tử tế bào thần kinh và suy giảm thần kinh ở chuột. Dược lý sinh hóa, 169, Điều 113607.
Feng, YL, Cao, G., Chen, DQ, Vaziri, ND, Chen, L., Zhang, J.,… Zhao, YY (2019). Hệ thống chuyển hóa microbiome cho thấy hệ vi sinh vật đường ruột liên quan đến các chất chuyển hóa liên hợp glycine và chuyển hóa polyamine trong bệnh thận mãn tính. Khoa học Sự sống Tế bào và Phân tử, 76 (24), 4961–4978.
Garrido, P., Ribeiro, S., Fernandes, J., Vala, H., Bronze-da-Rocha, E., Rocha-Pereira, P.,… Reis, F. (2015). Rối loạn chuyển hóa Sắt-Hepcidin, thiếu máu và thiếu oxy ở thận, viêm và xơ hóa trên mô hình thận chuột còn sót lại. PLoS ONE, 10 (4), Điều e124048.
Higashi, T., & Ogawa, S. (2016). Thuốc thử tạo dẫn xuất tăng cường ESI được mã hóa đồng vị để phân tích khác biệt, định lượng và lập hồ sơ các chất chuyển hóa trong các mẫu sinh học bằng LC / MS: A review. Tạp chí Phân tích Dược phẩm và Y sinh, 130, 181–193.
Ji, X., Hou, C., Gao, Y., Xue, Y., Yan, Y., & Guo, X. (2020). Phân tích di truyền về tác dụng điều biến hệ vi sinh vật đường ruột của polysaccharides táo tàu (Ziziphus jujuba Mill.) Trên mô hình chuột bị ung thư đại trực tràng. Thực phẩm & Chức năng, 11 (1), 163–173.
Ji, X., Hou, C., Yan, Y., Shi, M., & Liu, Y. (2020). So sánh đặc điểm cấu trúc và hoạt tính chống oxy hóa của polysaccharid từ quả táo tàu (Ziziphus jujuba Mill.). Tạp chí Quốc tế về Đại phân tử Sinh học, 149, 1008–1018.

Ji, X., Hou, C., Zhang, X., Han, L., Yin, S., Peng, Q.,… Wang, M. (2019). Phân tích chuyển hóa vi sinh về tác động của Zizyphus jujuba cv. Tiêu thụ polysaccharides Muzao trên chuột bị ung thư đại trực tràng Hệ vi sinh vật trong phân và các chất chuyển hóa.Tạp chí Quốc tế về Đại phân tử Sinh học, 131, 1067–1076.

Ji, X., Peng, Q., Yuan, Y., Shen, J., Xie, X., & Wang, M. (2017). Sự cô lập, cấu trúc và hoạt tính sinh học của polysaccharid từ quả táo tàu (Ziziphus jujuba Mill.): Một đánh giá. Hóa thực phẩm, 227, 349–357.
Jiang, N., Zhao, H., Han, Y., Li, L., Xiong, S., Zeng, L.,… Sun, L. (2020). HIF -1 cải thiện tình trạng tổn thương ống thận trong bệnh thận do tiểu đường thông qua kiểm soát qua trung gian HO -1- đối với động lực học ty thể. Tăng sinh tế bào, 53 (11), Điều e12909.
Kapitsinou, PP, Liu, Q., Unger, TL, Rha, J., Davidoff, O., Keith, B.,… Haase, VH (2010). HIF gan -2 điều chỉnh phản ứng tạo hồng cầu đối với tình trạng thiếu oxy trong bệnh thiếu máu thận. Máu, 116 (16), 3039–3048.
Kelly, CJ, Zheng, L., Campbell, EL, Saeedi, B., Scholz, CC, Bayless, AJ,… Colgan, SP (2015). Sự xuyên âm giữa các axit béo chuỗi ngắn có nguồn gốc từ vi sinh vật và HIF biểu mô ruột làm tăng chức năng hàng rào mô. Vật chủ & Vi khuẩn tế bào, 17 (5), 662–671.
Koh, A., De Vadder, F., Kovatcheva-Datchary, P., & B¨ ackhed, F. (2016). Từ chất xơ đến sinh lý vật chủ: Các axit béo chuỗi ngắn là chất chuyển hóa quan trọng của vi khuẩn. Ô, 165 (6), 1332–1345.
Lakshmanan, AP, Al, ZM, Ali, BH và Terranegra, A. (2021). Ảnh hưởng của keo keo prebiotic lên thành phần hệ vi sinh vật đường ruột ở chuột mắc bệnh thận mãn tính thực nghiệm. Y sinh & Dược trị liệu, 133, Bài báo
110992.
Lam, C., Chan, PH, Lee, P., Lau, KM, Kong, A., Gong, A.,… Tsim, K. (2016). Đánh giá hóa học và sinh học đối với nước sắc từ thảo dược chứa táo tàu (Ziziphus jujuba): Cảm ứng biểu hiện erythropoietin trong môi trường nuôi cấy. Tạp chí Sắc ký BA Công nghệ phân tích trong Y sinh và Khoa học Đời sống, 1026, 254–262.
Lappin, TR & Lee, FS (2019). Cập nhật các đột biến trong con đường HIF: EPO và vai trò của chúng trong quá trình tạo hồng cầu. Nhận xét máu, 37, Điều 100590.
LeBlanc, JG, Chain, F., Martín, R., Bermúdez-Humaran, ´ LG, Courau, S., & Langella, P. (2017). Tác động có lợi đến quá trình chuyển hóa năng lượng của vật chủ đối với các axit béo chuỗi ngắn và vitamin do vi khuẩn commensal và probiotic tạo ra. Các nhà máy tế bào vi sinh vật, 16 (1), 79.
Li, L., Ma, L., & Fu, P. (2017). Các axit béo chuỗi ngắn có nguồn gốc từ hệ vi sinh vật đường ruột và các bệnh về thận. Phát triển Thiết kế Thuốc và Liệu pháp, 11, 3531–3542.
Li, L., & Shi, JY (2013). Phân tích thành phần polysaccharide và lipid của vỏ quế bằng GC-MS. Zhong Yao Cai, 36 tuổi (4), 578–580.
Liu, G., Liu, X., Zhang, Y., Zhang, F., Wei, T., Yang, M.,… Zhao, Z. (2015). Tác dụng bảo vệ gan của polysaccharid chiết xuất từ ​​táo tàu Zizyphus cv. Huanghetanzao. Tạp chí Quốc tế về Đại phân tử Sinh học, 76, 169–175.

Locatelli, F., Fishbane, S., Block, GA, & Macdougall, IC (2017). Nhắm mục tiêu Hạ oxy: Các yếu tố khả thi để điều trị thiếu máu ở bệnh nhân bệnh thận mãn tính. Tạp chí Thận học Hoa Kỳ, 45 (3), 187–199.

Locatelli, F., Hannedouche, T., Fishbane, S., Morgan, Z., Oguey, D., & White, WB (2019). An toàn tim mạch và tử vong do mọi nguyên nhân của metoxy polyetylen

Glycol-Epoetin beta và các tác nhân kích thích Erythropoiesis khác trong bệnh thiếu máu do CKD: Một thử nghiệm ngẫu nhiên không thua kém. Tạp chí lâm sàng của Hiệp hội Thận học Hoa Kỳ: CJASN, 14 (12), 1701–1710.
Maxwell, P. (2003). HIF -1: Hệ thống phản ứng oxy có liên quan đặc biệt đến thận. Tạp chí của Hiệp hội Thận học Hoa Kỳ, 14 (11), 2712–2722.
Meijers, BK, & Evenepoel, P. (2011). Trục ruột-thận: Indoxyl sulfate, p-cresyl sulfate và tiến triển CKD. Cấy ghép Lọc máu Thận học, 26 (3), 759–761.
Mikami, D., Kobayashi, M., Uwada, J., Yazawa, T., Kamiyama, K., Nishimori, K.,… Iwano, M. (2020). Axit béo chuỗi ngắn làm giảm nhẹ bệnh thận mãn tính do adenin gây ra thông qua con đường FFA2 và FFA3. Biochimica Biophysica Acta-Lipit sinh học phân tử và tế bào, 1865 (6), Điều 158666.
Morton, DB, & Griffiths, PH (1985). Hướng dẫn về việc ghi nhận cảm giác đau đớn, đau khổ và khó chịu ở động vật thí nghiệm và một giả thuyết để đánh giá. Hồ sơ Thú y, 116 (16), 431–436.
Panjeta, M., Tahirovi´c, I., Sofi´c, E., Cori ´ ´c, J., & Derviˇsevi´c, A. (2017). Giải thích mức độ erythropoietin và hemoglobin ở bệnh nhân mắc các giai đoạn khác nhau của bệnh thận mãn tính. Tạp chí Hóa sinh Y học, 36 (2), 145–152.
Pappa, M., Dounousi, E., Duni, A., & Katopodis, K. (2015). Cơ chế sinh lý bệnh ít được biết đến của thiếu máu ở bệnh nhân bệnh thận do đái tháo đường. Quốc tế Tiết niệu và Thận học, 47 (8), 1365–1372.
Sakashita, M., Tanaka, T., & Nangaku, M. (2019). Thuốc ức chế miền Hypoxia-Inducible Factor-Prolyl hydroxylase để điều trị thiếu máu trong bệnh thận mãn tính. Đóng góp cho Thận học, 198, 112–123. https://doi.org/10.1159/000496531.
Schodel, ¨ J., & Ratcliffe, PJ (2019). Cơ chế báo hiệu tình trạng thiếu oxy: Những tác động mới đối với thận học. Nature Reviews Nephrology, 15 (10), 641–659.
Tako, E., Glahn, RP, Knez, M., & Stangoulis, JC (2014). Ảnh hưởng của prebiotics lúa mì lên quần thể vi khuẩn đường ruột và tình trạng thiếu sắt của gà thịt thiếu sắt. Tạp chí Dinh dưỡng, 13, 58.
Tang, WH, Wang, Z., Kennedy, DJ, Wu, Y., Buffa, JA, Agatisa-Boyle, B.,… Hazen, SL (2015). Con đường trimethylamine N-oxide (TMAO) phụ thuộc vào hệ vi sinh vật đường ruột góp phần vào cả sự phát triển của suy thận và nguy cơ tử vong ở bệnh thận mãn tính. Nghiên cứu Lưu hành, 116 (3), 448–455.
Thavarajah, S., & Choi, MJ (2019). Việc sử dụng các chất kích thích Erythropoiesis ở bệnh nhân CKD và ung thư: Một cách tiếp cận lâm sàng. Tạp chí Bệnh thận Hoa Kỳ, 74 (5), 667–674.
Wang, F., Yu, H., Huang, S., Zheng, L., Zheng, P., Zhang, S.,… Chen, J. (2020). Jian-PiYi-Shen điều chỉnh các biểu hiện protein tái chế EPO và sắt ở những con chuột thiếu máu bị bệnh thận mãn tính: Tích tụ yếu tố cảm ứng thiếu oxy -2 thông qua tín hiệu ERK. Thuốc thay thế và bổ sung dựa trên bằng chứng, 2020, 8894257.
Wang, S., Lv, D., Jiang, S., Jiang, J., Liang, M., Hou, F.,… Chen, Y. (2019). Giảm định lượng các axit béo chuỗi ngắn, đặc biệt là butyrate, góp phần vào sự tiến triển của bệnh thận mãn tính. Khoa học lâm sàng, 133 (17), 1857–1870.
Webster, AC, Nagler, EV, Morton, RL và Masson, P. (2017). Bệnh thận mãn tính. Lancet (London, Anh), 389 (10075), 1238–1252.
Xie, X., Yang, X., Wu, J., Ma, J., Wei, W., Fei, X.,… Wang, M. (2020). Trib1 góp phần phục hồi sau chấn thương thận cấp do Thiếu máu cục bộ / Tái tưới máu bằng cách điều chỉnh sự phân cực của đại thực bào thận. Biên giới trong Miễn dịch học, 11, 473.
Xu, M., Nagati, JS, Xie, J., Li, J., Walters, H., Moon, YA,… Garcia, JA (2014). Công tắc acetate điều chỉnh quá trình tạo hồng cầu do căng thẳng. Nature Medicine, 20 (9), 1018–1026.
Yue, Y., Wu, S., Li, Z., Li, J., Li, X., Xiang, J.,… Ding, H. (2015). Polysaccharides trong táo tàu hoang dã bảo vệ chống lại bệnh viêm ruột thực nghiệm bằng cách cho phép tăng cường chức năng hàng rào của ruột. Thực phẩm & Chức năng, 6 (8), 2568–2577.

Zhao, S., & Li, L. (2018). Ghi nhãn đồng vị Dansylhydrazine LC-MS để định hình toàn diện tiểu chuyển hóa axit cacboxylic. Hóa học phân tích, 90 (22), 13514–13522.

Zheng, L., Chen, S., Wang, F., Huang, S., Liu, X., Yang, X.,… Chen, J. (2020). Các phản ứng riêng biệt của hệ vi sinh vật đường ruột đối với nước sắc Jian-Pi-Yi-Shen có liên quan đến kết quả lâm sàng được cải thiện ở 5/6 con chuột bị thận hư. Biên giới trong Dược học, 11, 604.