PHẦN Ⅱ: Điều hòa trước và điều hòa sau bằng Metformin để giảm chấn thương do tái tưới máu do thiếu máu cục bộ trong mô hình tưới máu bằng máy định mức nhiệt cho chuột và heo
Mar 26, 2022
Tiếp xúc:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Tobias M.Huink, Leonie H.Venemal, Rene A.Posma, Nynke J.de Vries, Andrie C.Westerkampl và cộng sự.
GIỚI THIỆU
Ghép thận là phương pháp điều trị được lựa chọn cho những bệnh nhân mắc bệnh thận giai đoạn cuối. Thật không may, nhu cầu cao hơn so với sự sẵn có của các cơ quan.2 Sự thiếu hụt này đã dẫn đến việc tăng cường sử dụng các cơ quan chất lượng dưới mức tối ưu từ những người hiến tặng sau khi chết tuần hoàn (DCD ).5 Thận của những người hiến tặng DCD dễ bị tổn thương do thiếu máu cục bộ tái tưới máu (IRl), có liên quan đến tỷ lệ mắc chậm chức năng ghép cao hơn đáng kể, ảnh hưởng đến cả kết quả ngắn hạn và dài hạn.45 IRI được gây ra bởi sự suy giảm lưu lượng máu và quá trình tái ôxy hóa tiếp theo, dẫn đến việc tạo ra các loại ôxy phản ứng (ROS), bắt đầu một loạt các phản ứng có hại của tế bào.67 Mức độ nghiêm trọng của thiếu máu cục bộ tương quan chặt chẽ với suy thận ghép sớm sau ghép thận và góp phần làm tăng tỷ lệ mắc bệnh. Do đó, thời gian thiếu máu cục bộ ấm (W) trong quá trình lấy và cấy ghép nội tạng, và thời gian thiếu máu cục bộ lạnh trong quá trình bảo quản, tương ứng nên được giữ ở mức tối thiểu. Các chiến lược tưới máu bằng máy có thể đóng một vai trò quan trọng trong việc giảm IRI bằng cách cung cấp oxy trong giai đoạn thiếu máu cục bộ trong quá trình hiến tặng nội tạng. Hơn nữa, nó cung cấp một nền tảng để bổ sung các chất bảo vệ có thể có trước khi tái tưới máu (điều hòa trước) hoặc trong quá trình tái tưới máu (sau điều hòa) và là một phương pháp phù hợp để đánh giá chức năng thận và tổn thương ngắn hạn. 9-11
Biguanidemetforminlà loại thuốc hạ đường huyết dạng uống được sử dụng nhiều nhất để điều trị cho bệnh nhân tiểu đường tuýp 2. Cơ chế hoạt động và tác động toàn thân củametforminchủ yếu là do sự ức chế phức hợp 1 trong chuỗi hô hấp của ti thể. 12-14 Do đó,metformincó thể làm giảm IRI ngoài các tác dụng hạ đường huyết của nó và đã được đề xuất như một chất bảo vệ cơ quan trong các trường hợp IRI xảy ra, chẳng hạn như cấy ghép. 15,16
Mục đích của nghiên cứu này là để đánh giá những tác động có lợi tiềm năng của việc điều hòa trước và điều hòa sau vớimetformintrên IRI ở hai mô hình truyền dịch bằng máy NMP (NMP) ex vivo cô lập khác nhau sử dụng thận chuột và lợn.
NOURISH KIDNEY:DRAGON HERB CISTANCHE
PHƯƠNG PHÁP
Nghiên cứu chuột
Loài vật.Đã sử dụng chuột Lewis đực nặng 270-300 g (Phòng thí nghiệm Harlan, Boxmeer, Hà Lan). Ủy ban chăm sóc và sử dụng động vật có tổ chức của Đại học Groningen đã phê duyệt đề cương nghiên cứu (DEC6708C). Động vật được chăm sóc theo Luật thí nghiệm động vật của Hà Lan, tuân theo Nguyên tắc chăm sóc động vật trong phòng thí nghiệm của Viện Y tế Quốc gia.
Thiết kế thử nghiệm, thu hồi và bảo quản nội tạng.Tổng số 31 con chuột được chia thành 6 nhóm (n =5-6 mỗi nhóm; Hình 1). Trong tất cả các nhóm, 15 phút W và 24 giờ bảo quản lạnh được sử dụng để gây ra chấn thương do thiếu máu cục bộ. Điều hòa sơ bộ được thực hiện bằng cách cho 300 mg / kgmetformin(1, 1- dimethylbiguanide hydrochloride; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) được hòa tan trong nước muối (0. 9 phần trăm NaCl) hoặc nước muối đơn lẻ qua đường miệng 12 và 2 giờ trước khi cắt thận. Nước muối, 30 mg / Lmetforminhoặc 300 mg / Lmetforminđã được thêm vào nước hoa làm chất sau điều hòa. Nồng độ 300 mg / kg thể trọng đã được chọn, vì liều lượng này dẫn đến huyết thanhmetforminnồng độ tương ứng với nồng độ được tìm thấy ở người trong quá trình bảo dưỡngmetformintrị liệu.17
Việc mua thận được thực hiện với những thay đổi nhỏ đối với quy trình DCD, như đã mô tả trước đây.18 Tóm lại, những con chuột được gây mê bằng 2–5% isoflurane và phẫu thuật mổ bụng được thực hiện thông qua một đường rạch ở giữa. Thuốc chống đông máu, sử dụng 500 IU heparin (Leo Pharma, Ballerup, Đan Mạch), được truyền qua tĩnh mạch lưng dương vật. Sau 15 phút WI, phẫu thuật cắt thận trái đã được thực hiện. Động mạch thận và niệu quản đã được đóng băng. Thận được rửa tại chỗ với 10 mL nước muối (37 độ) và 5 mL Dung dịch Bảo quản Lạnh 4 độ của Đại học Wisconsin (UW) (Bridge to Life, Columbia, SC). Sau khi được lấy ra, thận được rửa lại với 5 mL UW một lần nữa và được lưu trữ trong UW trong 24 giờ ở 4 độ.
Máy định mức truyền dịch.Phương pháp NMP chuột đã được mô tả nhiều trước đó.18 Tóm lại, NMP được thực hiện trong 90 phút bằng máy bơm con lăn (Ismatec ISM404, Zürich, Thụy Sĩ). Áp lực tưới máu được đặt ở 102 mmHg, được kiểm soát tại động mạch thận. Trong nhóm đối chứng, dịch truyền bao gồm 100 mL William's Medium E được bổ sung 30 mmol / L HEPES, 50 g / L albumin, và 7 mmol / L creatinine (tất cả Sigma-Aldrich). Trong các nhóm thử nghiệm, 30 hoặc 300 mg / Lmetforminđã được thêm vào nước hoa. Chất lỏng truyền dịch được cung cấp oxy với 95% oxy và 5% carbon dioxide với lưu lượng 0. 5 L / phút. Nhiệt độ của dịch truyền được duy trì ở 37 độ bằng cách sử dụng nồi cách thủy và thiết bị trao đổi nhiệt (Julabo, Seelbach, Đức). Lưu lượng được ghi lại 10 phút một lần, sử dụng cảm biến lưu lượng đã hiệu chuẩn (ME1PXN Inline, Transonic Systems, Ithaca, NY). Sau NMP, các mẫu sinh thiết thận được ngâm ngay trong 4% formaldehyde hoặc đông lạnh nhanh trong nitơ lỏng và sau đó được bảo quản ở -80 độ.
Hình 1Biểu diễn giản đồ của các nhóm thí nghiệm. Các nhóm chứa 5–7 quả thận. HMP, truyền dịch bằng máy hạ thân nhiệt; NMP, truyền dịch bằng máy Na Uy; WIT, thời gian thiếu máu cục bộ ấm.
Nghiên cứu về con heo
Loài vật.Thận của lợn Landrace Hà Lan cái được lấy từ một lò mổ. Các con vật đã được làm choáng và kiểm tra sức khỏe theo quy trình tiêu chuẩn của địa phương. Trong quá trình thải độc, khoảng 1 L máu được thu thập trong một hộp chứa 25, 000 IU heparin không phân đoạn (Leo Pharma). Vì vật liệu phế thải của lò mổ đã được sử dụng nên không cần sự chấp thuận của ủy ban đạo đức động vật.
Thiết kế thử nghiệm, thu hồi và bảo quản nội tạng.Để gây ra chấn thương do thiếu máu cục bộ, 30 phút WI đã được sử dụng. Sau giai đoạn này, thận được rửa bằng 180 mL nước muối ở 4 độ. Ngay sau khi rửa, sinh thiết vỏ não được thực hiện (Invivo, Best, Hà Lan) và được bảo quản trong 4% formaldehyde đệm. Để phù hợp với việc vận chuyển từ lò mổ đến phòng thí nghiệm và như một kỹ thuật bảo quản, động mạch thận đã được đóng băng và thận được gắn vào một thiết bị truyền dịch bằng máy hạ thân nhiệt có điều khiển bằng áp suất dễ thay đổi (HMP) (Vận chuyển Hỗ trợ Thận; Hỗ trợ Nội tạng, Groningen, Hà Lan ). Thận được tưới máu ở độ 4 bằng cách sử dụng Dung dịch truyền dịch máy UW 500 mL trong 3 giờ (Bridge to Life, London, UK) có hoặc không bổ sung 2 mgmetformin, với áp suất động mạch trung bình là 25 mmHg. Oxy (1 0 0 phần trăm) được cung cấp cho máy tạo oxy (Hilite LT1000; Medos Medizintechnik AG, Stolberg, Đức) với tốc độ dòng cố định 0,1 L / phút.
Máy định mức truyền dịch.Thận được tái tưới máu bằng cách sử dụng thiết lập NMP ex vivo trong 4 giờ đã được mô tả trước đó. Trong nghiên cứu của chúng tôi, việc tăng liều lượngmetforminhoặc nước muối được thêm vào bằng cách sử dụng một máy bơm truyền. Nói tóm lại, sau HMP, động mạch thận đã được quét và rửa sạch. Niệu quản được đóng hộp để lấy nước tiểu, sau đó, thận được cân, sinh thiết được lấy và lưu trữ trong 4% formaldehyde đệm để phân tích thêm. NMP được thực hiện với 5 0 0 mL bạch cầu cạn kiệt, (BioR 02 plus; Fresenius Kabi, Bad Homburg, Đức) máu tự thân, được cung cấp oxy (carbogen, lưu lượng 0,5L / phút) trong 4 giờ ở áp suất động mạch trung bình là 80 mmHg. Các hợp chất khác được thêm vào chất lỏng truyền dịch được cung cấp trong Bảng S1. Trong nhóm thử nghiệm,metforminđược hòa tan trong dung dịch lactate Ringer (20 mg / mL; Baxter, Utrecht, Hà Lan) được truyền bằng cách sử dụng một máy bơm truyền được điều khiển bởi phần mềm tùy chỉnh, trong đó có thể xác định cấu hình dịch truyền (Alaris; CareFusion, Rolle, Thụy Sĩ). Cứ 30 phút một lần trong thời gian NMP , tốc độ truyền được tăng lên theo một lịch trình xác định trước (Bảng S2). Lịch trình này dựa trên dữ liệu dược động học của con người chỉ ra rằngmetforminđộ thanh thải cao gấp bốn lần so với độ thanh thải creatinin.19 Ở nhóm chứng, thận được tưới máu mà không cần bổ sungmetformin. Đối với mỗi thí nghiệm, lưu lượng được ghi lại bằng cách sử dụng đầu dò lưu lượng kẹp (ME7PXL; Transonic Systems), được gắn vào ống gần với động mạch thận. Đầu dò lưu lượng này đã được hiệu chuẩn cho ống được sử dụng. Cứ sau 15 phút trong quá trình NMP, nước tiểu được thu thập và thay thế bằng một thể tích tương ứng của dung dịch Ringer lactat, cũng đã được ghi lại. Nhiệt độ của dịch truyền được duy trì ở 37 độ bằng cách sử dụng bộ trao đổi nhiệt tích hợp, được kết nối với nồi cách thủy (Julabo). Các mẫu máu và nước tiểu được lấy sau 15 và 60 phút và cứ sau mỗi giờ để phân tích sinh hóa. Khi NMP được hoàn thành, sinh thiết được lấy và lưu trữ trong 4% formaldehyde đệm, hoặc đông lạnh nhanh và bảo quản ở độ -80 để phân tích thêm.
CẢI TIẾN BỔ SUNG CHỨC NĂNG KIDNEY
Cả hai nghiên cứu
Các phân tích sinh hóa.Các mẫu nước hoa và nước tiểu được ly tâm (1.300 g trong 10 phút ở mô hình chuột và 1, 000 g trong 12 phút ở mô hình lợn, cả hai đều ở 4 độ) và phần nổi phía trên được lưu trữ ở {{7} } bằng cấp . Lactate dehydrogenase (LDH), aspartate aminotransferase (ASAT) và creatinine được xác định tương ứng trong perfusate và creatinine trong nước tiểu, tương ứng bởi Trung tâm Phòng thí nghiệm của Trung tâm Y tế Đại học Groningen bằng cách sử dụng các phân tích sinh hóa tiêu chuẩn. Lượng protein bài tiết trong nước tiểu chuột được đo bằng cách sử dụng Thử nghiệm Protein Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), trong khi tổng nồng độ protein trong nước tiểu lợn được đo bằng các phân tích sinh hóa tiêu chuẩn tại Trung tâm Phòng thí nghiệm.
Phản ứng chuỗi polymerase định lượng thời gian thực.Phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực (PCR) được thực hiện theo quy trình tiêu chuẩn trên hệ thống PCR thời gian thực của Tagman Applied Biosystems 7900HT, như đã mô tả trước đây. mã hóa cho ET -1); endothelial nitric oxide synthase (eNOS); và yếu tố giống Krüppel 2 (KLF -2), kích hoạt nội mô (yếu tố Von Willebrand (wWF); phân tử kết dính tế bào mạch máu 1 (VCAM -1) và IL -6), và protein sốc nhiệt 70 (HSP -70) được thực hiện với các bộ mồi được liệt kê trong Bảng S3. Tóm lại, RNA tổng số được chiết xuất từ các phần thận bằng cách sử dụng TRlzol (Life Technologies, Gaithersburg, MD). CDNA thu được từ chuột được sử dụng làm tham chiếu nội bộ trong quá trình PCR để kiểm tra hiệu quả của mồi. Biểu hiện gen được chuẩn hóa với giá trị trung bình của hàm lượng -actin mRNA. Kết quả được biểu thị dưới dạng 2- △ ACT, trong đó giá trị CT thể hiện sự khác biệt giữa các giá trị ngưỡng chu kỳ.
Hình 2Các thông số chức năng thận và tưới máu được đánh giá trong và sau khi truyền dịch bằng máy nor dì cho thận chuột và heo. Tổng độ thanh thải creatinin của thận chuột (a) và heo (b). Tổng sản lượng nước tiểu (c, d) và tổng lượng protein bài tiết qua nước tiểu (e, f) của thận chuột và heo tương ứng. Dữ liệu được trình bày dưới dạng sai số trung bình ± chuẩn của giá trị trung bình. Các nhóm chứa 5–7 quả thận. * P <0. 0="" 5="" và="" **="" p=""><>
Chấm điểm hình thái.Các mẫu sinh thiết chứa 4% formaldehyde được nhúng vào parafin và được cắt thành các lát 4 μm. Coupe sau đó được nhuộm bằng axit Schiff định kỳ và cho điểm về hoại tử tế bào ống gần (từ nhẹ đến nặng: 1-5), phù nề (từ nhẹ đến nặng: 1-4) và hút chân không tế bào ống gần ( từ nhẹ đến nặng: 1-4). 21 Đánh giá mô bệnh học đã được thực hiện bởi hai nhà nghiên cứu. Một nhà bệnh lý học lâm sàng độc lập có nhiều kinh nghiệm trong việc đánh giá các dấu hiệu mô bệnh học của tổn thương sau khi tưới máu bằng máy lên các cơ quan của chuột và lợn đã xác nhận điểm số.
Các phép tính.Sức cản mạch nội thượng thận (IVR) được tính bằng cách chia áp lực động mạch trung bình cho lưu lượng (tính bằng mmHg / mL phút). Độ thanh thải creatinin được tính toán để ước tính mức lọc cầu thận bằng công thức sau: [creatinin trong nước tiểu] * lưu lượng nước tiểu / [creatinin trong nước hoa].
Phân tích thống kê.Tất cả dữ liệu được biểu thị dưới dạng sai số trung bình ± chuẩn của giá trị trung bình. Khi so sánh hai nhóm tại một thời điểm duy nhất, sự khác biệt được đánh giá bằng cách sử dụng bài kiểm tra t của Học sinh chưa ghép đôi. Tất cả các thử nghiệm thống kê đều có hai mặt và P Nhỏ hơn hoặc bằng 0. 05 được coi là có ý nghĩa thống kê. Thống kê SPSS phiên bản 23 (IBM, Armonk, NY) được sử dụng cho tất cả các phân tích. Diện tích dưới đường cong (AUC) được tính toán theo quy tắc hình thang, và được sử dụng để ước tính tổng độ thanh thải creatinin, tổng lượng protein bài tiết trong nước tiểu, và tổng mức ASAT và LDH trong dịch tưới.
Lưu ý: Cây thuốc cổ truyền Trung Quốc cistanche (còn được gọi là "thảo mộc rồng" và "nhân sâm sa mạc"), chỉ mọc ở sa mạc khô cằn và ấm áp. Là một trong chín loại thảo mộc bất tử, Cistanche (cistanche tubulosa / cistanche desticola / sa mạcliving cistanche / cistanche salsa) chứa nhiều thành phần hiệu quả như echinacoside, acteoside, tổng số glycoside phenylethanoid, flavonoid, polysaccharides, v.v. Các loại thảo mộc và thực phẩm nuôi dưỡng khả năng miễn dịch của con người, các cơ quan nội tạng, tế bào não và tế bào thần kinh ... cải thiện chức năng tình dục và chức năng thận; chống mệt mỏi; chống lão hóa; Cải thiện bộ nhớ; chống bệnh Parkinson; chống bệnh Alzheimer; chống oxy hóa; giảm táo bón; chống viêm; thúc đẩy sự phát triển của xương, làm trắng da; bảo vệ gan; vân vân.
