Chủng ngừa vi-rút bất hoạt tự sinh từ mẹ giúp tăng cường khả năng miễn dịch với PRRSV ở lợn con Phần 1

Trừu tượng:

Khả năng miễn dịch có nguồn gốc từ lợn mẹ là một thành phần quan trọng cho sự sống sót và thành công của đàn con ở lợn để bảo vệ khỏi các mầm bệnh đang lưu hành như Vi-rút Hội chứng Hô hấp và Sinh sản ở lợn Loại 2 (PRRSV-2).

Mục đích của nghiên cứu này là điều tra việc truyền miễn dịch chống PRRSV cho heo con từ heo nái hậu bị nhận riêng virus sống biến đổi (MLV) (điều trị (TRT) 0) hoặc kết hợp với một trong hai loại tự sinh bất hoạt. vắc-xin (AIV, TRT 1 cộng 2). Lợn con từ những con hậu bị này đã được thử thách với chủng PRRSV-2 tự sinh ở hai tuần tuổi và phản ứng miễn dịch thích nghi (IR) của chúng được đánh giá cho đến 4 tuần sau khi tiêm chủng (dpi).

IR thể dịch và tế bào toàn thân đã được phân tích ở lợn nái hậu bị trước khi đẻ, ở lợn con, trước khi tiêm phòng và ở 2 và 4 wpi. Cả hai AIV đều bảo vệ một phần heo con với việc giảm bệnh phổi và tăng trọng; TRT 1 cũng làm giảm lượng virut trong máu heo con, điều này được giải thích rõ nhất bằng việc sản xuất các kháng thể trung hòa do AIV gây ra ở heo nái hậu bị và chuyển chúng sang heo con. Ở heo con, trước khi tiêm chủng, các nhà sản xuất IFN toàn thân chính là tế bào CD21 cộng với B. Từ 0 đến 4 wpi, vai trò của các tế bào B này đã giảm và các tế bào T CD4 trở thành các nhà sản xuất IFN toàn thân chính.

Virus sống tốt là virus không gây bệnh và chúng có mối quan hệ nhất định với khả năng miễn dịch của cơ thể con người. Virus sống có thể kích thích hệ thống miễn dịch của con người để tạo ra phản ứng miễn dịch, do đó nâng cao khả năng miễn dịch của con người. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng sau khi cơ thể con người bị nhiễm virus sống, nó sẽ giải phóng một số chất trung gian và cytokine, có thể kích hoạt các tế bào miễn dịch, thúc đẩy chức năng của hệ thống miễn dịch và tăng cường khả năng chống lại virus của cơ thể.

Ngoài ra, các loại virus lành tính và còn sống cũng có thể cạnh tranh chiếm giữ các tế bào, khiến mầm bệnh khó xâm nhập và sinh sản, từ đó bảo vệ cơ thể con người khỏi các bệnh lây nhiễm khác. Do đó, nhiễm virus lành tính và sống thích hợp có thể cải thiện khả năng miễn dịch của con người, nhưng nhiễm trùng quá mức có thể dẫn đến bệnh tật. Do đó, trong cuộc sống hàng ngày, mọi người nên chú ý kiểm soát sự lây nhiễm của virus sống và nâng cao khả năng miễn dịch thông qua lối sống lành mạnh. Từ quan điểm này, chúng ta cần cải thiện khả năng miễn dịch. Cistanche có thể cải thiện đáng kể khả năng miễn dịch. Tro thịt chứa nhiều loại hoạt chất sinh học, chẳng hạn như polysacarit, hai loại nấm và Huangli, v.v. Những thành phần này có thể kích thích các chức năng khác nhau của hệ thống miễn dịch. các tế bào giống như tế bào, làm tăng hoạt động miễn dịch của chúng.

Nhấp vào lợi ích sức khỏe của cistanche

Trong phổi, các tế bào T CD8 là tế bào sơ cấp và tế bào T CD4 là các tế bào sản xuất IFN thứ cấp, bao gồm một tập hợp con mới gồm các tế bào T CD8 −CCR7− CD4 của lợn, các tế bào CD4 TEMRA có khả năng biệt hóa ở giai đoạn cuối. Tóm lại, nghiên cứu này chứng minh rằng việc tiêm vắc-xin AIV cho lợn mẹ có thể cải thiện khả năng bảo vệ lợn con trước cai sữa chống lại virus PRRS-2; nó cho thấy tầm quan trọng của việc truyền kháng thể trung hòa cho heo con, và nó giới thiệu hai tập hợp con tế bào miễn dịch mới ở heo—tế bào CD21 cộng với tế bào B sản xuất IFN và tế bào T CD8 −CCR7− CD4.

từ khóa:

mẹ tiêm phòng; vắc xin vô hoạt tự sinh; chuyển giao miễn dịch; đáp ứng miễn dịch dịch thể; đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào; tế bào T; PRRSV; heo; Tế bào B sản xuất IFN; Tế bào CD4 TEMRA.

1. Giới thiệu

Miễn dịch có nguồn gốc từ mẹ (MDI) ở động vật có vú là một bản giao hưởng đầy cảm hứng ("sự phức tạp hài hòa"—[1]). Trong hệ thống này, hay còn gọi là bản giao hưởng, người mẹ truyền sự bảo vệ miễn dịch (tạm thời và/hoặc lâu dài) cho con của mình trong thời kỳ mang thai thông qua nhau thai, sau khi sinh thông qua dịch tiết của tuyến vú hoặc cả hai [2]: con người nhận được globulin miễn dịch trong thời kỳ mang thai và cuối cùng thông qua tuyến vú. dịch tiết [3]; chó và động vật gặm nhấm nhận được globulin miễn dịch trong thời kỳ mang thai và qua dịch tiết từ vú, còn lợn và các vật nuôi khác chỉ nhận được globulin miễn dịch qua dịch tiết từ vú.

Tương tự như các loài khác, heo con nhận được MDI này dưới dạng globulin miễn dịch, tế bào miễn dịch và các phân tử liên quan đến miễn dịch khác [4,5]. Mặc dù có thể nhận được các globulin miễn dịch từ những con lợn nái khác nhau (= nuôi chéo), nhưng chỉ những con mẹ ruột mới có thể truyền thành công các tế bào miễn dịch cho con của chúng [5] và lượng sữa đầu ở lợn con làm giảm đáng kể tỷ lệ tử vong và cải thiện năng suất [6 ]. Các tế bào miễn dịch này bao gồm các tế bào B [7], cũng như các tập hợp con tế bào T khác nhau—CD4, CD8 và chủ yếu là thụ thể tế bào T (TCR)- tế bào δ T [8].

Các tập hợp con tế bào T này sau đó có thể được phân biệt rõ hơn dựa trên giai đoạn biệt hóa và mô hình di chuyển của chúng. Ở lợn, chuỗi CD8 được sử dụng để phân biệt CD8 − ngây thơ với CD8 cộng với các tế bào T CD4 có kinh nghiệm về kháng nguyên hoặc bộ nhớ [9–11]. Sự biểu hiện của thụ thể chemokine (CCR) 7 phân biệt rõ hơn CCR7 cộng với sự di chuyển của hạch bạch huyết với CCR7− tế bào T di chuyển đến mô ngoại vi [12]. Với phân tích kết hợp CD8/CCR7, sau đó chúng ta có thể phân biệt nhiều tập hợp con tế bào T khác nhau: CD8 −CCR7 cộng với các tế bào T CD4 ngây thơ, CD8 cộng với CCR7 cộng với các tế bào T CD4 bộ nhớ trung tâm (TCM) và CD8 cộng với CCR7− bộ nhớ hiệu ứng (TEM ) tế bào T CD4; CCR7− dẫn đến mô ngoại vi và CCR7 dẫn đến hạch bạch huyết cộng với các tế bào T CD8 và CD8 −CCR7−, CD8 cộng với CCR7− và CD8 cộng với CCR7 cộng với các tế bào TCR- δ T.
Mặc dù trước đây chúng tôi đã báo cáo rằng các tế bào TCR- δ T của lợn sở hữu kiểu di chuyển ngược so với các tế bào TCR- tương ứng của chúng, nhưng vai trò cụ thể của các tập hợp con khác nhau này vẫn chưa được mô tả [13]. Cả tập hợp tế bào miễn dịch và kháng thể đều được truyền cho thế hệ con cái để bảo vệ chúng chống lại các mầm bệnh khác nhau [4,5].

Trong nhiều thập kỷ, tác nhân gây bệnh nguy hiểm nhất đối với lợn là Virus Hội chứng Hô hấp và Sinh sản ở lợn (PRRSV, [14,15]). Có hai loại PRRSV chính— loại 1 và 2 (PRRSV-1 và 2); Tính đa dạng cao và khả năng ức chế miễn dịch của chúng làm cho PRRSV trở thành một căn bệnh nan giải, dẫn đến thiệt hại kinh tế to lớn cho ngành chăn nuôi lợn [16] và cho đến nay, trong khi vắc-xin bảo vệ một phần chống lại PRRSV, chúng vẫn chưa thể kiểm soát hoàn toàn căn bệnh này.

Có hai loại vắc-xin chính để bảo vệ chống lại PRRSV—vắc-xin vi-rút sống biến đổi (MLV) và vắc-xin bất hoạt, chủ yếu là vắc-xin bất hoạt tự sinh (AIV); tuy nhiên, cả hai loại đều phải đối mặt với những thách thức của họ.

Thời gian dài để phát triển các vắc-xin MLV rất sinh miễn dịch có nghĩa là chúng thường dị hợp hơn với các chủng PRRSV phổ biến ở trang trại, và trong khi AIV được hướng trực tiếp chống lại các chủng phổ biến ở trang trại này, thì bản chất bất hoạt của chúng khiến chúng thường ít sinh miễn dịch hơn.

Những thách thức này dẫn đến việc thiếu khả năng bảo vệ đặc biệt ở lợn con có thể do 3 yếu tố: thứ nhất, tỷ lệ đột biến cao của PRRSV làm hạn chế khả năng bảo vệ dị hợp nên làm giảm hiệu lực của vắc xin MLV; thứ hai, khả năng ức chế miễn dịch của nó làm hạn chế các loại vắc-xin yếu hơn (ví dụ: AIV) và sự chậm trễ trong việc tạo ra phản ứng miễn dịch bảo vệ khiến lợn con đặc biệt dễ mắc bệnh [17]; và thứ ba, sự hiểu biết của chúng ta về đáp ứng miễn dịch đối với PRRSV, đặc biệt là ở heo con, còn hạn chế. Loving và Lunney đã đưa ra một đánh giá tốt về hiểu biết chung về phản ứng miễn dịch đối với PRRSV [18,19].

Chủ yếu dựa vào thời gian kéo dài để thiết lập miễn dịch do vắc-xin gây ra đối với PRRSV, người chăn nuôi lợn thường tiêm vắc-xin cho lợn nái hậu bị và lợn nái để có thể truyền miễn dịch cho lợn con. Nghiên cứu về việc tiêm phòng cho lợn mẹ bằng cách sử dụng MLV thương mại chống lại loại PRRS-1 không cản trở việc tiêm phòng cho lợn con 2 hoặc 3-tuần tuổi và nó bảo vệ một phần lợn con chống lại thử thách dị chủng [20]. Chiến lược tiêm phòng này cũng tạo ra các tế bào tiết ra IgG, IgA và interferon (IFN) đặc hiệu của PRRSV-1-trong sữa non và sữa của lợn nái đã được tiêm phòng. Các tế bào sản xuất IFN này rất quan trọng trong các phản ứng chống vi-rút, bao gồm cả PRRSV [19,21].
Việc tiêm phòng này cũng tạo ra IgG kháng PRRSV trong huyết thanh, có thể phát hiện được sau sáu tuần tuổi đối với heo con chưa được tiêm phòng và duy trì ổn định ở heo con đã được tiêm phòng trước thử thách; tuy nhiên, không thể phân biệt được các tế bào tiết IFN với các mức nền ở heo con trước cai sữa [22]. Mặc dù việc sử dụng MLV là một tiêu chuẩn của ngành, nhưng chế độ tiêm chủng kết hợp giữa tiêm vắc xin MLV nguyên tố và AIV tăng cường dường như hứa hẹn sẽ khắc phục từng nhược điểm của việc sử dụng MLV và AIV độc lập.

Do đó, mục tiêu chính của nghiên cứu này là xác định không chỉ liệu mà còn cả cách thức tiêm vắc-xin cho người mẹ bằng hai loại AIV khác nhau (phương pháp điều trị (TRT) 1 cộng với 2) có thể thúc đẩy việc tiêm vắc-xin MLV theo tiêu chuẩn ngành hay không (TRT 0 ), để bảo vệ đàn con tốt hơn khỏi thử thách sớm của PRRSV2. Để đạt được mục tiêu này, chúng tôi đã nghiên cứu phản ứng miễn dịch qua trung gian dịch thể và tế bào (CMI) do vắc-xin gây ra ở những con nái hậu bị này và chúng tôi thử thách những con cai sữa sớm ở những con nái trong mỗi nhóm này lúc 2 tuần tuổi. Đáp ứng miễn dịch toàn thân và cục bộ của những heo con này được theo dõi trong 2–4 tuần.

Chúng tôi cho thấy rằng tiêm vắc-xin tăng cường AIV có thể cải thiện khả năng bảo vệ heo con chống lại thách thức PRRSV ở 2 tuần tuổi và chúng tôi cũng xác định các cơ chế miễn dịch cơ bản và mô tả đặc điểm của phản ứng thể dịch và CMI chống PRRSV ở những heo con này. Ngoài ra, chúng tôi đã phát hiện hai loại tế bào mới ở lợn: (1) tế bào T CD8 −CCR7− CD4 góp phần mạnh mẽ vào việc sản xuất IFN- trong dịch rửa phế quản phế nang (BAL)—tế bào CD4 TEMRA tiềm năng và (2) nguồn chính của phản ứng chống PRRSV đặc biệt ở heo con—tế bào B sản xuất IFN.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Thiết kế nghiên cứu, động vật và xử lý mẫu

Mục đích của nghiên cứu này là để đánh giá hiệu quả của các loạt vắc-xin PRRSV2 khác nhau ở người mẹ đối với khả năng miễn dịch bảo vệ ở heo con cai sữa đối với PRRSV-2. Trước nghiên cứu, một chủng PRRSV-2 đang lưu hành (đa hình chiều dài đoạn giới hạn (RFLP), 1-7-4) từ một công ty thịt lợn ở Bắc Carolina đã được hai công ty khoa học sinh học độc lập phân lập và nhân giống; họ đã sản xuất hai loại vắc-xin tự sinh riêng biệt. Cả hai loại vắc-xin đều chứa các thành phần độc quyền khác nhau nhưng chứa cùng một chủng 1-7-4 PRRSV-2 bất hoạt. Thiết kế của nghiên cứu này được minh họa trong Hình 1.

Cả hai loại vắc-xin đều được tiêm bắp trong một loạt bốn liều trước khi đẻ: theo lịch tiêm chủng của công ty thịt lợn Bắc Carolina, 46 nái hậu bị âm tính với PRRSV-2 trong một trang trại lợn nái thương mại đã được tiêm vắc-xin Ingelvac PRRS MLV (Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, Đức) chín tuần trước khi sinh sản. Để duy trì thuật ngữ thống nhất trong suốt nghiên cứu này, lợn cái trưởng thành về mặt sinh dục đã đăng ký (ở đây được định nghĩa là lợn hậu bị) sẽ được gọi là lợn hậu bị ngay cả sau khi chúng được phối giống và sinh con (thường được gọi là lợn nái). Bốn tuần trước khi phối giống, các mẫu máu của tất cả heo hậu bị được thu thập để lấy huyết thanh và sau đó heo hậu bị được phân bổ thành ba phương pháp điều trị: TRT 0 (chỉ tiêm phòng MLV); TRT 1 (tiêm vắc xin MLV cộng với 4 liều vắc xin bất hoạt (1-7-4) tự sinh 1); hoặc TRT 2 (tiêm chủng MLV cộng với 4 liều vắc xin bất hoạt (1-7-4) tự sinh 2).

Gilts that did not breed were dropped from the study. 3 weeks before farrowing, blood was collected from pregnant gilts for the isolation of serum and peripheral blood mononuclear cells (PBMC). At this point, five gilts remained in both TRT 0 and TRT 2; nine gilts remained in TRT 1. Within these gilts, we selected three gilts per group to provide the piglets for the challenge study. The selected gilts had an adequate litter size (>7) và hiệu giá trung hòa tập trung huỳnh quang (FFN) trong huyết thanh cao nhất (tiêu chí miễn dịch chính) và phản ứng IFN- tế bào T CD4 cao nhất (tiêu chí miễn dịch phụ) chống lại chủng thách thức AIV trong nhóm của họ. Đối với TRT 1 cộng với 2, các hiệu giá FFN này nằm trong khoảng từ 1:4 đến 1:128. Vì TRT {{10}} không có bất kỳ hiệu giá nào chống lại chủng AIV, nên chúng tôi đã chọn những con hậu bị có hiệu giá kháng MLV cao nhất; các hiệu giá này dao động từ 1:16 đến 1:32. Phản ứng IFN- trong tất cả các nái hậu bị được chọn dao động từ 0.09–0.21 phần trăm của tổng số tế bào T CD4.

Mỗi con hậu bị này cung cấp bốn con heo con cho nghiên cứu thử thách. Vào lúc 2 tuần tuổi (= 0 tuần sau khi nhiễm bệnh, wpi), bốn heo con có trọng lượng lứa đẻ trung bình cao nhất đã được chọn cho nghiên cứu thử thách và vận chuyển đến cơ sở chuồng trại An toàn sinh học Cấp 2 của Đại học Bang North Carolina ( NCSU) Tài nguyên động vật trong phòng thí nghiệm (LAR) (Raleigh, North Carolina). Tại đây, họ được phân ngẫu nhiên vào một trong sáu chiếc bút trong cùng một phòng; hai con lợn mỗi lần điều trị được nhốt trong mỗi chuồng (một con cho mỗi lứa hậu bị). Tóm lại, có tổng cộng 36 heo con trong nghiên cứu với 12 heo con cho mỗi nhóm điều trị.

During the study, four piglets died before the end of the study: three piglets from one gilt (TRT 0) died within 30 h of arrival at LAR and were dropped from the study. Additionally, one pig (TRT 2) was euthanized between weeks three and four of the study due to high fever (>106◦ F) và thiếu phản ứng với kích thích vật lý. Con lợn này được đưa vào tất cả các phân tích cho đến tuần thứ 3 và phổi của nó được đánh giá về bệnh lý. Không có phân tích tế bào học dòng chảy (FCM) nào xảy ra đối với con vật này khi khám nghiệm tử thi.

Một ngày sau khi cai sữa và đến NCSU, tất cả heo con được tiêm trong mũi các hạt vi rút 1 × 105,5 PRRSV-2 (chủng tự sinh 1-7-4) trong 1 ml dung dịch muối đệm phốt phát 1X (PBS, Corning, Corning, NY, USA) (500 µL/lỗ mũi), được duy trì ở tư thế nằm ngửa trong 30 giây và quay trở lại chuồng của chúng. Một nửa số động vật bị hy sinh ở 2 dpi và những con còn lại bị hy sinh ở 4 dpi. Khi khám nghiệm tử thi, BAL, phổi và các hạch bạch huyết khí phế quản (TrBr LNs) đã được thu thập và xử lý như mô tả trước đây [13].

Việc lấy mẫu diễn ra trước khi cấy (0 wpi) và sau đó hàng tuần, như thể hiện trong Hình 1. Huyết thanh được lấy trong các ống Ống tách huyết thanh (SST) (Becton Dickinson (BD) Bioscatics, San Jose, CA, USA) và máu để phân lập PBMC được thu thập trong các ống heparin (Khoa học sinh học BD). Nhà ở động vật là hướng dẫn của Viện Y tế Quốc gia dành cho động vật nghiên cứu. Lợn con được tiếp cận với nước không giới hạn, được cho ăn chế độ cai sữa chuyển tiếp, sau đó là chế độ ăn thông thường hai lần mỗi ngày và duy trì ở nhiệt độ 83 ◦F với 12-chu kỳ sáng/tối 12-giờ. Các quy trình thử nghiệm đã được phê duyệt bởi Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật Thể chế của Đại học Bang NC (IACUC) ID# 17-166A (29 tháng 11 năm 2017).

2.2. Sự lan truyền, chuẩn độ và đánh giá của virus

Vi rút phân lập -2 PRRSV (chủng, 1-7-4) đã được lan truyền trên các đại thực bào phế nang lợn âm tính với PRRSV (PAM) trong RPMI-1640, 1× với L-glutamine (Corning, Corning, NY , Hoa Kỳ) được bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò (FBS) (VWR, Radnor, PA, Hoa Kỳ) và 1X kháng sinh-kháng nấm (Corning) (được gọi là RPMI-đầy đủ) trong khoảng 30 giờ trong bình T-75 (Sarstedt, Nümbrecht, Đức) cho đến khi quan sát thấy hiệu ứng tế bào học. Các bình được làm tan băng một lần và phần nổi phía trên được quay ở 2200 g ở 4 ◦C trong 10 phút. Để cô đặc virus, dịch nổi phía trên sau đó được chuyển sang các ống ly tâm 36 mL Nalgene (Thermo Fisher Khoa học, Rochester, NY, Hoa Kỳ) và quay trong Máy siêu ly tâm Sorvall 100S (Sorvall, Thermo Fisher Khoa học), Newtown, CT, Hoa Kỳ) ở 73 ,000 g ở 4 ◦C trong 2 giờ.

Phần nổi phía trên đã bị loại bỏ, và viên nhỏ được tạo huyền phù lại trong môi trường (RPMI hoàn chỉnh) và được lưu trữ trong các phần dịch 100 µL ở -80 ◦C. Hiệu giá liều truyền nhiễm nuôi cấy mô 50 (TCID50) của dung dịch gốc virus được xác định bằng cách sử dụng PAM như đã mô tả trước đây (phương pháp Spearman–Karber TCID50 theo hướng dẫn xét nghiệm chẩn đoán của OIE [Tổ chức Thú y Thế giới, trước đây là Văn phòng Quốc tế về Dịch tễ học (OIE) ), "Chương 2.8.7 Hội chứng hô hấp và sinh sản ở lợn", Terr. Man., Số tháng 5 năm 2015, 2015].

2.3. nhiễm trùng huyết

Huyết thanh phân lập được phòng thí nghiệm chẩn đoán của công ty thịt lợn Bắc Carolina phân tích bằng cách sử dụng phản ứng chuỗi polymerase định lượng Phiên mã ngược (RT qPCR) với bộ RNA/DNA mầm bệnh 5X MagMAX (Thermo Fisher Khoa học) và bộ VetMAX PRRSV qPCR (Thermo Fisher Khoa học). Huyết thanh nái hậu bị đã được tiêm phòng là âm tính với PRRSV (qPCR) khi đẻ được xác định bởi Phòng thí nghiệm Chẩn đoán Thú y Đại học Bang Iowa (ISU VDL, Ames, IA, USA). Các giá trị ∆Ct được tính bằng cách lấy giá trị Ct được coi là âm tính với PRRSV (Ctneg=37) đối với PRRSV trừ đi giá trị Ct của một mẫu: ∆Ct=37 − Ctx.

2.4. Xác nhận kháng thể trung hòa và xác định các mẫu dương tính

Các mẫu huyết thanh từ lợn nái và lợn con đã được chuyển đến Phòng thí nghiệm Chẩn đoán và Nghiên cứu Động vật của Đại học Bang Nam Dakota (Brookings, SD), nơi đã hoàn thành việc xác định kháng thể trung hòa (NA) PRRSV-2 bằng cách sử dụng FFN và chủng tiêm chủng 1-7-4. Một kết quả khả quan là độ pha loãng huyết thanh cao nhất với mức giảm 90 phần trăm hoặc cao hơn về số lượng đơn vị tạo tiêu điểm huỳnh quang [23].

2.5. Quy trình khám nghiệm tử thi, chấm điểm và phân lập tế bào mô

Khi khám nghiệm tử thi (2 hoặc 4 wpi), động vật bị giết bằng cách tiêm Euthasol vào tĩnh mạch gây chết người (Covetrus, MW, 390 mg/mL pentobarbital, 50 mg phenytoin/mL). Sau đó, phổi, tuyến ức và TrBr LN được thu hoạch.

Đối với phổi, chụp ảnh lưng và bụng; phổi được rửa bằng 1× PBS để thu dịch rửa phế nang phế quản (BAL) và tổng cộng năm mẫu được lấy để làm mô học: một mẫu từ thùy đuôi bên phải và bên trái, thùy giữa bên phải và bên trái và sau đó một mẫu từ thùy phụ. Các mẫu mô học được cố định trong chất cố định Formaldehyde/Zn (Khoa học kính hiển vi điện tử, Hatfield, PA) trong 24 giờ, chuyển sang ethanol 70% và nhuộm bằng hematoxylin và eosin (H&E). Các tiêu bản nhuộm màu (mô học) và ảnh chụp phổi (bệnh lý tổng thể) đã được chuyển đến ISU VDL và được chấm điểm bởi một nhà nghiên cứu bệnh học chẩn đoán thú y, người đã mù mờ về các phương pháp điều trị và ngày khám nghiệm tử thi; tổn thương phổi và chấm điểm viêm phổi kẽ đã được thực hiện như mô tả trước đây [24].

Hình ảnh chụp phổi và chụp ảnh chụp phổi được đánh giá về tỷ lệ phần trăm phổi bị ảnh hưởng bởi bệnh viêm phổi. Cụ thể, tỷ lệ phần trăm viêm phổi được ước tính trực quan cho từng thùy phổi và tổng tỷ lệ phần trăm cho toàn bộ phổi được tính toán dựa trên tỷ lệ trọng số của từng thùy so với tổng thể tích phổi. Mỗi thùy trong số bốn thùy sọ não chiếm 10 phần trăm, thùy phụ chiếm 5 phần trăm và mỗi thùy trong số hai thùy đuôi chiếm 27,5 phần trăm tổng số phổi.

Các phần mô bệnh học phổi được kiểm tra mù để tìm các tổn thương vi thể và mỗi thùy được cho điểm ước tính dựa trên mức độ nghiêm trọng của viêm phổi kẽ như sau: 0=không có tổn thương vi thể; 1=viêm phổi kẽ tối thiểu; 2=viêm phổi kẽ nhẹ; 3=viêm phổi kẽ trung bình; 4=viêm phổi kẽ phong phú; 5=viêm phổi kẽ nặng, đa ổ; 6=viêm phổi kẽ nặng, lan tỏa. Đối với tất cả các mô được thu thập (phổi, tuyến ức và TrBr LN), mô được cắt thành từng miếng nhỏ và ép qua bộ lọc cống tròn bằng thép không gỉ (Grainger, Lake Forest, IL, USA) thành các ống 50 ml với PBS lạnh như băng để rửa giải huyền phù tế bào đơn. Các khối xơ được lọc bằng bộ lọc 40 µm (BD Bioscatics, San Jose, CA, USA).

2.6. Phân lập máu ngoại vi, kích thích vi rút và nhuộm/phân tích IFN-FCM

Quá trình phân lập PBMC được thực hiện bằng phương pháp ly tâm tỷ trọng Ficoll-Paque (GE Healthcare, Uppsala, Thụy Điển) và ống SepMate-50 ml (STEMCELL Technologies, Vancouver, BC, Canada) theo giao thức của nhà sản xuất. PBMC và số lượng tế bào huyền phù tế bào đơn lẻ đã được hoàn thành trên hệ thống đếm tế bào CASY (Hệ thống Schärfe, hiện tại: Roche Innovatis AG, Bielefeld, Đức). Đối với thử nghiệm sản xuất IFN, 5 × 105 PBMC và tế bào lympho từ phổi và TrBr LN được mạ thành tám lần lặp lại trong đĩa đáy tròn giếng 96- (Corning) trong 100 µl RPMI hoàn chỉnh và để yên qua đêm trong môi trường tủ ấm ở 37◦ C và 5 phần trăm CO2. Sáng hôm sau, 100 µL RPMI-đầy đủ chứa chủng PRRS 1-7-4 (Multiplicity of Infection, MOI=0.1) được thêm vào từng giếng; các đĩa được đưa trở lại tủ ấm trong 24 giờ kích thích virus.

Trong 4 giờ nuôi cấy cuối cùng, monensin (5 µg/mL, Alfa Aesar, Haverhill, MA, USA) đã được thêm vào để ngăn chặn sự giải phóng IFN- từ các tế bào. Sau khi hoàn thành quá trình ủ 24 giờ, các bản sao được gộp lại và nhuộm màu như đã nêu trong Bảng 1; trung bình 276.756 tế bào lympho sống đơn lẻ (SLL) đã được ghi lại trên Cytoflex bằng phần mềm CytExpert (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). Phân tích dữ liệu được thực hiện với FlowJo phiên bản 10.6.1 (FLOWJO LLC). Hệ thống phân cấp cổng để phân tích phản ứng IFN- được thể hiện trong Hình 4 và 5 cho PBMC và trong Hình bổ sung S1 và Hình 7 cho BAL, mô phổi và TrBr LN.

2.7. Phân tích thống kê

Các phân tích thống kê được thực hiện bằng Graphpad Prism 8 (Phần mềm Graphpad, San Diego, CA, USA). Dữ liệu với một bộ dữ liệu đầy đủ được phân tích bằng ANOVAs hai chiều (trong suốt nghiên cứu) hoặc một chiều (khi khám nghiệm tử thi). Dữ liệu bị thiếu điểm dữ liệu (chủ yếu là do việc mổ xác 50% số lợn ở 2 dpi) được phân tích bằng mô hình tác động hỗn hợp (Khả năng tối đa bị hạn chế, REML). Tất cả các phép so sánh nhiều lần được thực hiện với phép thử so sánh nhiều lần của Dunnett. Minh họa dữ liệu được thực hiện bằng cách sử dụng các biểu đồ violon hiển thị phân phối, các điểm riêng lẻ, trung vị (nếu có, đường đứt nét màu đen) và các khoảng 25/75 (dưới dạng một đường có màu, có thể áp dụng). Các phân tích tương quan giữa mức nAb của heo nái và heo con được thực hiện bằng cách sử dụng các hệ số tương quan Pearson và khoảng tin cậy 95 phần trăm hai đuôi.

3. Kết quả

3.1. Thiết kế nghiên cứu và hiệu quả của vắc-xin—Dấu hiệu lâm sàng, Viremia, Tăng cân và Bệnh lý phổi

Nghiên cứu được tiến hành như mô tả trong Hình 1. Sau khi tiêm chủng PRRSV, lợn biểu hiện các triệu chứng nhẹ của PRRSV bắt đầu trong vòng 3–4 ngày kể từ khi nhiễm bệnh—sốt [chủ yếu ở mức 1 wpi, dns], thờ ơ, giảm ăn, ho/hắt hơi nhẹ. Không có sự khác biệt đáng kể nào được quan sát đối với các triệu chứng này và chúng vẫn tồn tại ở các mức độ khác nhau cho đến khi khám nghiệm tử thi. Hình 2 minh họa tình trạng nhiễm virut trong máu, mức tăng trọng lượng cơ thể hàng tuần cũng như điểm tổng thể và điểm mô bệnh học.

Như được minh họa trong Hình 2A, tất cả lợn đều âm tính với PRRSV-2 khi cai sữa và việc tiêm trong mũi với PRRSV-2 đã gây ra tình trạng nhiễm vi-rút trong máu đạt mức cao nhất là 2 wpi. Mặc dù không có sự khác biệt về lượng vi-rút trong máu giữa TRT 0 và TRT 2, TRT 1 có lượng vi-rút trong máu thấp hơn đáng kể trong hai tuần đầu tiên so với nhóm đối chứng TRT 0. Tăng trọng của lợn ở tất cả các nhóm rất giống nhau trong ba tuần đầu tiên; tuy nhiên, khi kết thúc nghiên cứu—và so với TRT 0—TRT 2 và TRT 1 có mức tăng cân hàng tuần cao hơn đáng kể—Hình 2B. Đáng chú ý nhất, trong khi bệnh lý phổi thường được giải quyết khi nhiễm PRRSV và do đó tương tự giữa các nhóm ở 4 dpi (dns), cả hai lần tiêm vắc-xin AIV cho mẹ, vì vậy TRT 1 cộng với 2, làm giảm đáng kể bệnh lý phổi ở 2 wpi: cả hai đều giảm mức phần trăm tổn thương đại thể và/hoặc viêm phổi kẽ (Hình 2C, D). Tỷ lệ tổn thương phổi đại thể ở phổi từ TRT 0 là từ 20–70 phần trăm ; ngược lại, hầu hết lợn trong TRT 1 cộng với 2 có tỷ lệ tổn thương phổi dưới 20% —Hình 2C. Tương tự, trong khi điểm số mô bệnh học trung bình đối với bệnh viêm phổi kẽ ở lợn TRT 0 là 3, thì tỷ lệ này lần lượt là 1,8 đối với TRT 1 và 1,2 đối với TRT 2. So với TRT 0, điều này cho thấy xu hướng có ý nghĩa (p=0.07) và giảm đáng kể mô bệnh học phổi ở lợn từ lợn nái hậu bị được tiêm phòng AIV—Hình 2D. Những dữ liệu này chứng minh rằng việc tiêm vắc-xin AIV có thể làm giảm đáng kể lượng vi-rút trong máu và bệnh lý phổi, ngoài ra, chúng cũng cho thấy rằng việc tiêm vắc-xin AIV cho lợn mẹ chống lại PRRSV-2 có thể tăng cường khả năng miễn dịch của 2-lợn con tuần tuổi.

3.2. Cảm ứng các kháng thể trung hòa từ mẹ và chuyển chúng sang heo con

Cảm ứng đáp ứng miễn dịch thể dịch ở lợn hậu bị và con cái của chúng được phân tích bằng cách xác định các chuẩn độ NA FFN (Hình 3).

Việc tiêm vắc xin cho tất cả các nhóm có chuẩn độ NA do MLV gây ra ở heo nái hậu bị từ 4 đến 64 tuổi mà không có sự khác biệt đáng kể giữa ba nhóm (dns). Ngược lại, trong khi chỉ tiêm vắc-xin MLV (TRT 0) không bao gồm NA chống lại chủng dị hợp 1-7-4, thì cả hai loại vắc-xin tăng cường AIV đều tạo ra hiệu giá NA lên tới 1:16 (đối với TRT 2) và thậm chí là 1 :128 (đối với TRT 1)—Hình 3A.

Các NA huyết thanh này được chuyển từ mẹ sang heo con (Hình 3B): Trong khi heo con TRT 0 không có hiệu giá NA ở 0 wpi, heo con TRT 1 và TRT 2 sở hữu NA huyết thanh để biến dạng 1-7-4 trước đó nhiễm trùng tương quan trực tiếp với nồng độ NA của mẹ (Hình 3C, r=0.886, p < 0.0001). Các hiệu giá NA này giảm trong hai tuần đầu tiên, trước khi ổn định ở mức 4 wpi. Tuy nhiên, so với TRT 0, heo con từ hậu bị được tiêm vắc-xin AIV (TRT 1 cộng với 2) có nồng độ NA huyết thanh cao hơn đáng kể trước thử thách và các nồng độ tăng này kéo dài đến 2–3 tuần tuổi, vì vậy cho đến 4–5 tuần tuổi—Hình 3B.

For more information:1950477648nn@gmail.com