Các phương pháp tạo và đánh giá các mô hình Zebrafish về bệnh thận ở người Phần 1
Apr 24, 2023
TRỪU TƯỢNG
Rối loạn liên quan đến thận ảnh hưởng đến hàng triệu người trên toàn thế giới. Một cuộc khảo sát bệnh nhân mắc bệnh thận mãn tính (CKD) cho thấy gánh nặng bệnh thận đang gia tăng hàng năm. Nghiên cứu về gánh nặng bệnh tật toàn cầu (GBD) năm 2017 đã xếp CKD là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ 12 trên toàn thế giới. Do đó, việc xác định nguyên nhân gây bệnh thận, phát triển các phương pháp chẩn đoán chính xác và phương pháp điều trị mới là rất phù hợp. Các sinh vật mẫu mô phỏng lại một cách trung thực các bệnh ở người đóng vai trò quan trọng trong việc tìm hiểu quá trình bệnh và cung cấp cơ sở quý giá để tìm ra phương pháp chữa trị. Zebrafish là một mô hình tuyệt vời để nghiên cứu sự phát triển, sinh lý bệnh và các khía cạnh phân tử của bệnh thận ở người. Trong tổng quan này, chúng tôi tóm tắt các thao tác di truyền và thử nghiệm khác nhau có thể được thực hiện ở cá ngựa vằn để hiểu rõ hơn về sinh lý bệnh của các bệnh thận ở người. Chúng tôi cho rằng những phương pháp này sẽ hữu ích trong việc phát triển các liệu pháp tiềm năng để điều trị bệnh thận.
Theo các nghiên cứu có liên quan,hột cálà một loại thảo mộc truyền thống của Trung Quốc đã được sử dụng trong nhiều thế kỷ để điều trị các bệnh khác nhau. Nó đã được khoa học chứng minh là có đặc tính chống viêm, chống lão hóa và chống oxy hóa. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng cistanche có lợi cho bệnh nhân mắc bệnh thận. Các thành phần hoạt chất của cistanche được biết là có tác dụng giảm viêm, cải thiện chức năng thận và phục hồi các tế bào thận bị suy yếu. Do đó, việc tích hợp cistanche trong kế hoạch điều trị bệnh thận có thể mang lại lợi ích to lớn cho bệnh nhân trong việc kiểm soát tình trạng của họ. Cistanche giúp giảm protein niệu, giảm nồng độ BUN và creatinine, đồng thời giảm nguy cơ tổn thương thận thêm. Ngoài ra, cistanche còn giúp giảm mức cholesterol và chất béo trung tính có thể gây nguy hiểm cho bệnh nhân mắc bệnhbệnh thận.
Để biết thêm thông tin:
David.deng
@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
TỪ KHÓA:CKD, AKI, một mô hình cá ngựa vằn về bệnh thận ở người, đại từ, bệnh lý thận
Giới thiệu
Thận là một trong những cơ quan quan trọng ở động vật có xương sống giúp loại bỏ các chất thải và duy trì nồng độ pH, ion và chất chuyển hóa của máu trong phạm vi sinh lý. Thận tiết ra erythropoietin điều chỉnh quá trình sản xuất hồng cầu và kích hoạt vitamin D giúp xương hấp thụ canxi. Có khoảng một triệu nephron trong mỗi quả thận của con người, là đơn vị cấu trúc và chức năng của cơ quan này. Do đó, các khiếm khuyết ở nephron ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của thận. Rối loạn chức năng thận có thể xảy ra do đột biến gen, nhiễm trùng, chấn thương, thuốc hoặc tiếp xúc với các hợp chất độc hại trong môi trường. Các bệnh mãn tính như tiểu đường, bệnh tim mạch và tăng huyết áp là nguyên nhân chính gây ra gánh nặng bệnh thận (Levey và cộng sự, 2010). Suy giảm chức năng thận cũng làm tăng nguy cơ biến chứng ở các hệ thống cơ quan khác (Thomas và cộng sự, 2008). Các loại bệnh thận phổ biến và nguyên nhân của chúng được nêu trong Bảng 1.
bệnh thận
Bệnh thận đóng góp một phần đáng kể vào gánh nặng bệnh tật trên toàn cầu. Khoảng 750 triệu người trên toàn thế giới bị ảnh hưởng bởi các rối loạn liên quan đến thận (Crews và cộng sự, 2019). Bệnh thận mạn tính phổ biến nhất trong số đó với tỷ lệ toàn cầu là 13,4% (Hill và cộng sự, 2016). Nghiên cứu GBD năm 2010 đã xếp CKD là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ 18 trên toàn thế giới, đã tăng lên vị trí thứ 12 vào năm 2017 vì gây ra số ca tử vong cao nhất trên toàn cầu (Jha và cộng sự, 2013; Carney, 2020). Theo nghiên cứu GBD năm 2017, khoảng 697,5 triệu trường hợp mắc CKD đã được báo cáo trên toàn thế giới, trong đó 1,2 triệu người đã tử vong. Số ca tử vong do CKD ước tính sẽ tăng lên 4 triệu vào năm 2040 trong trường hợp xấu nhất (Foreman et al., 2018). Một phần ba bệnh nhân CKD sống ở hai quốc gia là Trung Quốc và Ấn Độ (Bikbov và cộng sự, 2020). Tình trạng CKD trong dân số Ấn Độ không rõ ràng do thiếu hệ thống thu thập dữ liệu chính xác. Khoảng 115 triệu trường hợp mắc CKD đã được báo cáo ở Ấn Độ vào năm 2017 (Bikbov et al., 2020). Các bệnh phổ biến nhất ở người dân Ấn Độ là bệnh tiểu đường và tăng huyết áp (Geldsetzer và cộng sự, 2018). Theo báo cáo của Hội đồng Nghiên cứu Y khoa Ấn Độ (ICMR), tỷ lệ mắc bệnh tiểu đường và tăng huyết áp trong dân số trưởng thành ở thành thị lần lượt là 28% và 21,4% (Varma, 2015). Từ 40% đến 60% bệnh nhân CKD, các trường hợp xảy ra do những biến chứng này và số lượng của chúng đang tăng lên nhanh chóng (Rajapurkar và cộng sự, 2012). Trung tâm dữ liệu về bệnh thận của Hiệp hội Thận học Quốc tế đã báo cáo tỷ lệ mắc CDK là 16,8% trong dân số Ấn Độ (Ene-Iordache et al., 2016). Nguyên nhân của CKD khác nhau trên khắp Ấn Độ. Andhra Pradesh, Odisha và Goa đã báo cáo mức độ cao của CKD do một nguyên nhân chưa rõ được gọi là bệnh thận kẽ mãn tính (Varughese và Abraham, 2018). Khi số lượng bệnh nhân CKD đang gia tăng trên toàn thế giới với tốc độ đáng báo động, cần phải tiến hành phân tích kỹ lưỡng về nguyên nhân gốc rễ của các bệnh thận phổ biến để tìm ra cách tốt hơn để phòng ngừa và chữa trị. Các sinh vật mô hình có thể bắt chước sinh lý con người và các tình trạng bệnh tật có thể cung cấp những con đường tuyệt vời để giải quyết các vấn đề trên. Cá ngựa vằn đã trở thành một mô hình hữu ích để nghiên cứu sự phát triển và bệnh tật, đồng thời cung cấp những cách đầy hứa hẹn để xác định các mục tiêu điều trị và thuốc mới. Trong bài đánh giá này, chúng tôi đã thảo luận về các phương pháp khác nhau để tái phát bệnh thận ở người ở cá ngựa vằn và cách sử dụng các mô hình này để hiểu khả năng gây bệnh và các cơ chế phân tử cơ bản của nó. Điều này có thể dẫn đến việc tạo ra các phương pháp trị liệu mới để quản lý và chữa các bệnh về thận.
Điểm tương đồng giữa thận người và cá ngựa vằn
Sự phát triển thận ở động vật có vú là duy nhất vì nó diễn ra thông qua ba cấu trúc riêng biệt trong quá trình hình thành phôi: đại từ, mesonephros và metanephros. Hai cấu trúc đầu tiên là nhất thời ở động vật có vú và chỉ có metanephros tồn tại trong suốt cuộc đời (Smyth et al., 2017; Jain, 2014). Pronephros là thận chức năng trong quá trình phát triển phôi ở động vật có xương sống bậc thấp như lưỡng cư và cá, được thay thế bởi mesonephros là thận chức năng ở các giai đoạn sau (Tahara et al., 1993; Diep et al., 2015). Bảng 2 mô tả khoảng thời gian của các dạng thận khác nhau ở người, chuột, Xenopus và cá ngựa vằn.
Mặc dù mức độ phức tạp tổng thể của thận tăng lên khi chúng ta tiến tới các dạng cao hơn, nephron là đơn vị cấu trúc và chức năng của tất cả các loại thận. Mỗi nephron có ba phần: tiểu thể thận để lọc máu, ống thận để hấp thụ và bài tiết các chất hòa tan, và ống thu thập để thu thập các chất thải không mong muốn để bài tiết. Biểu mô ống được tạo thành các phân đoạn khác nhau để thực hiện các chức năng cụ thể. Nephron từ tất cả các dạng thận có kiểu phân đoạn tương tự nhau (Desgrange và Cereghini, 2015). Tổ chức phân đoạn của nephron của đại từ và mesonephros của cá ngựa vằn tương tự như metanephros của động vật có vú, như thể hiện trong Hình 1. Ống đại từ của cá ngựa vằn được chia thành ống lượn gần (PCT), ống lượn gần thẳng (PST) và ống lượn gần (DE). ) và các ống cuối xa (DL), tương tự như mô hình phân đoạn của các nephron metanephric của động vật có vú. Cá ngựa vằn có một tuyến nội tiết tên là tiểu thể Stannius (CS), duy trì cân bằng nội môi canxi (Krishnamurthy, 1976). CS được hình thành bởi sự chuyển hóa của các tế bào biểu mô thận ở giữa các phân đoạn DE và DL, dần dần tách ra khỏi ống và tạo thành tuyến CS được ghép nối nằm ở vị trí sau phúc mạc ở bề mặt thận ở cá trưởng thành (Roberts và Ellis, 2012; Naylor và cộng sự, 2018). Một trong những khác biệt chính giữa nephron của cá ngựa vằn và động vật có vú là thiếu vòng Henle ở cá ngựa vằn, hoạt động như một hệ số nhân ngược dòng để tạo ra gradient thẩm thấu tủy để bảo tồn nước. Phân khúc này không có bất kỳ tiện ích nào đối với cá ngựa vằn vì đây là loài cá nước ngọt (Elmonem et al., 2018). Mỗi phân đoạn sở hữu các loại tế bào riêng biệt và các biểu hiện gen đặc trưng cho phân đoạn, được bảo tồn giữa các động vật có xương sống (Verlander, 1998; Desgrange và Cereghini, 2015). Tất cả các loại thận theo con đường phát triển tương tự. Bốn giai đoạn sau đây lần lượt tham gia vào quá trình phát triển nephron; A: cảm ứng trung bì trung gian để hình thành nguyên thủy thận, B: biểu mô hóa và phát triển ống thận, C: định hình nephron thành các phân đoạn chuyên biệt, và D: tạo mạch của nephron để lọc máu (Drummond, 2003).
Phương pháp tạo mô hình cá ngựa vằn về bệnh thận ở người
Cá ngựa vằn sở hữu một cặp đại từ bắt đầu hình thành sau 12 giờ sau khi thụ tinh (hpf) và hoạt động đầy đủ sau 48 hpf. Có sẵn toàn bộ trình tự bộ gen, 71% gen của con người có ít nhất một chỉnh hình của cá ngựa vằn, dễ xử lý, phôi trong suốt, thời gian tạo ra ngắn, kỹ thuật thao tác gen hiệu quả, phương pháp tạo cá chuyển gen và sàng lọc nhanh chóng khiến cá ngựa vằn trở thành sinh vật mẫu phù hợp nhất để nghiên cứu các bất thường về thận (Howe và cộng sự, 2013; Poureetezadi và Wingert, 2016). Một trong những đặc điểm quan trọng của cá ngựa vằn trưởng thành là khả năng tái tạo các nephron mới bằng quá trình tân tạo thận để đáp ứng với tổn thương thận (Chambers và Wingert, 2016). Bảng 3 mô tả sự so sánh giữa cá ngựa vằn và các sinh vật mô hình phổ biến khác như chuột và Xenopus. Các thao tác di truyền ở cá ngựa vằn đã chỉ ra rằng các thành phần di truyền mới của sự phát triển và chức năng thận có thể được xác định bằng cách sử dụng sinh vật mô hình này (Poureetezadi và Wingert, 2016). Có một số phương pháp để tạo ra các mô hình cá ngựa vằn về bệnh thận ở người.
chuyển tiếp di truyền
Màn hình di truyền về phía trước được sử dụng để xác định các gen có liên quan đến kiểu hình quan tâm (Lawson và Wolfe, 2011). Cả đột biến hóa học và đột biến chèn đều được sử dụng trong sàng lọc di truyền về phía trước (Patton và Zon, 2001). Gây đột biến hóa học là một sàng lọc dựa trên ba thế hệ, trong đó những con đực trưởng thành được điều trị bằng các chất gây đột biến hóa học như ethyl methane sulphonate (EMS), ethyl nitrosourea (ENU) hoặc các chất gây đột biến vật lý như bức xạ gamma để tạo ra một số đột biến trong tế bào mầm (Varshney và Burgess, 2014). Cá mang đột biến sau đó được lai với cá cái kiểu hoang dã để tạo ra cá F1 chứa các alen duy nhất của đột biến được tạo ra. Các cá F1 được lai xa để tạo ra các cá thể mang F2, sau đó được lai với nhau để thu được các thể đột biến đồng hợp tử của chúng ở thế hệ F3. Con cái có kiểu hình mong muốn sau đó được phân lập và sử dụng để lập bản đồ gen và giải trình tự để xác định gen đột biến (Patton và Zon, 2001). Các biến thể khác của màn hình này, chẳng hạn như sử dụng lưỡng bội đơn bội và đồng hợp tử, có thể giúp giảm thời gian và nỗ lực cần thiết để xác định kiểu hình và đột biến gen gây bệnh (Patton và Zon, 2001 đã thảo luận chi tiết). Các dòng phóng thích biến đổi gen biểu hiện protein huỳnh quang trong cơ quan quan tâm có thể được kết hợp với sàng lọc di truyền chuyển tiếp thông thường để dễ dàng sàng lọc các đột biến quan tâm. Một màn hình đột biến dựa trên ENU đã dẫn đến việc xác định cá ngựa vằn đột biến bóng đèn (lib) cho thấy các khiếm khuyết về hình thái và phân đoạn nephron tương tự như phôi cá ngựa vằn thiếu axit retinoic (RA). Người ta phát hiện ra rằng các thể đột biến lib có quá trình chuyển đổi từ C sang A ở nucleotide 174 của aldh1a2, được dự đoán là sẽ tổng hợp một protein bị cắt ngắn có chiều dài 58 axit amin, do đó hủy bỏ chức năng aldh1a2 và ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp RA từ retinaldehyd. Phân tích lib, đột biến không cổ (nls) có đột biến điểm trong miền xúc tác của phôi được xử lý aldh1a2 và DEAB (chất ức chế tổng hợp axit retinoic) cho thấy mức độ RA điều chỉnh sự phân đoạn nephron bằng cách thay đổi biểu hiện không gian của các yếu tố phiên mã cụ thể (Wingert và Davidson, 2011; Begemann và cộng sự, 2001; Mullins và cộng sự, 1994). Một người đột biến khác có tên Zeppelin đã giúp xác định brac2 là yếu tố điều chỉnh sự phát triển của tế bào chân (Kroeger et al., 2017).
Đột biến chèn là một phương pháp dựa trên transposon hoặc chống vi-rút được sử dụng để chèn DNA ngẫu nhiên vào các locus gen khác nhau và DNA ngoại lai này sau đó giúp xác định gen bị đột biến (Amsterdam et al., 1999). Phòng thí nghiệm Hopkins tại MIT đã thực hiện sàng lọc đột biến chèn vào phôi cá ngựa vằn bằng cách sử dụng vec tơ retrovirus. Họ đã xác định được 12 gen liên quan đến các kiểu hình thận khiếm khuyết cho thấy các u nang ở vùng ống cầu thận, trong đó có 4 gen liên quan đến sự hình thành lông mao (Sun et al., 2004). Hạn chế của phương pháp di truyền thuận là quy trình sàng lọc rườm rà và tốn thời gian. Tuy nhiên, những tiến bộ trong công nghệ giải trình tự mới đã làm cho phương pháp di truyền học tiến bộ hiệu quả hơn nhiều.
Loại bỏ gen bằng cách sử dụng các hạt nhân có thể lập trình
Một trong những lợi thế chính của việc sử dụng cá ngựa vằn làm sinh vật mẫu là sự sẵn có của các kỹ thuật chỉnh sửa bộ gen hiệu quả như CRISPR/Cas, TALEN và ZFN (Sertori et al., 2016). CRISPR (Lặp lại Palindromic ngắn xen kẽ theo cụm thường xuyên)/ Cas9 là công nghệ chỉnh sửa bộ gen linh hoạt và được sử dụng phổ biến nhất ở cá ngựa vằn. Một thể khảm của CRISPR RNA (crRNA) và crRNA kích hoạt chuyển hóa (tracrRNA) được thiết kế như một RNA hướng dẫn duy nhất (sgRNA), cùng với protein Cas9/mRNA được tiêm vào phôi cá ngựa vằn ở giai đoạn một tế bào (Varshney et al. , 2016). SgRNA liên kết với trình tự DNA đích 20bp liền kề với trình tự NGG mô-đun liền kề protospacer (PAM) trong bộ gen, Cas9 sau đó tạo ra một vết cắt sợi đôi trong trình tự DNA đích. Điều này sau đó tốt nhất là được sửa chữa bằng cách nối đầu không tương đồng, đây là một cơ chế sửa chữa dễ bị lỗi dẫn đến việc tạo ra chèn/xóa ngẫu nhiên (indel) dẫn đến những thay đổi trong khung đọc của trình tự mã hóa và do đó, hủy bỏ chức năng của gen quan tâm. Các phương pháp tiên tiến đã được phát triển trong những năm gần đây để tăng hiệu quả của kỹ thuật chỉnh sửa bộ gen dựa trên CRISPR (Liu và cộng sự, 2019). Có thể xóa một đoạn DNA lớn bằng cách sử dụng hai hoặc nhiều sgRNA cùng một lúc (Kim và Zhang, 2020). Cũng có thể nhắm mục tiêu đồng thời nhiều gen một cách hiệu quả trong một phôi cá ngựa vằn (Shah et al., 2016). Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để tạo ra cá ngựa vằn đột biến để tái phát bệnh thận ở người bằng cách sử dụng công nghệ CRISPR/Cas9. Loại bỏ protein màng tế bào Arl13b qua trung gian CRISPR dẫn đến việc tạo ra các đột biến bắt chước "hội chứng Joubert" (Cantagrel et al., 2008). Có báo cáo rằng đột biến gen ELMO1 ở người góp phần gây ra bệnh thận do tiểu đường. Cá ngựa vằn đột biến elmo1 biểu hiện các kiểu hình được thấy trong phôi tăng đường huyết được tạo ra do sự phá vỡ gen pdx1 như cầu thận lớn hơn, tế bào nang khiếm khuyết, cổ ngắn hơn và siêu lọc, do đó làm nổi bật chức năng được bảo tồn của gen này (Sharma et al., 2016). Cá ngựa vằn magi2a đột biến biểu hiện hội chứng thận hư kháng steroid, hội chứng này cũng được quan sát thấy ở những người bị đột biến MAGI2 (Jobst-Schwan và cộng sự, 2019). Những quan sát này làm nổi bật sự phù hợp của cá ngựa vằn như một sinh vật để mô hình hóa bệnh thận ở người.
Một phương pháp khác để tạo ra các đột biến cá ngựa vằn là Hạt nhân hiệu ứng giống như bộ kích hoạt phiên mã (TALEN) dựa trên chỉnh sửa bộ gen. Trong kỹ thuật này, miền liên kết DNA TALE được tạo thành từ các đơn phân, mỗi đơn phân bao gồm các phần lặp song song của 34 gốc axit amin liên kết với một nucleotide cụ thể trong trình tự DNA. Các trình tự TALE này có nguồn gốc từ vi khuẩn gây bệnh Xanthomonas làm thay đổi quá trình phiên mã gen trong tế bào chủ (Boch và Bonas, 2010). Cấu trúc nhắm mục tiêu TALEN bao gồm tín hiệu định vị hạt nhân, miền liên kết DNA và miền nuclease FokI ở đầu carboxyl của chúng. TALEN hoạt động theo cặp với các vị trí liên kết của chúng nằm trên các chuỗi DNA đối diện được phân tách bằng trình tự đệm 12 đến 25 bp. Các cấu trúc liên kết với vị trí mục tiêu trong nhân và tạo ra sự đứt gãy sợi đôi, sau đó được sửa chữa bằng cách nối đầu không tương đồng (Liu et al., 2014). Cá ngựa vằn đột biến được tạo ra bởi CRISPR hoặc TALEN có thể kích hoạt các gen bù đắp cho sự mất mát của các gen quan tâm, do đó gây khó khăn cho việc phát hiện ra chức năng của gen (Rossi và cộng sự, 2015). Tuy nhiên, có thể xác định các gen bù này bằng phân tích phiên mã bằng phương pháp giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS), có thể giúp xác định chức năng của gen quan tâm. Việc xác định các gen và con đường phân tử bù đắp cho sự mất chức năng của gen có thể giúp tìm ra các phương pháp điều trị mới đối với các đột biến gen gây ra các bệnh nghiêm trọng (El-Brolosy và Stainier, 2017).
Loại bỏ gen bằng cách sử dụng morpholino antisense oligos
Morpholinos là các oligonucleotide không anion tương đối ổn định so với các oligomer DNA hoặc RNA của chúng (Summerton, 1999). Các oligonucleotide antisense morpholino liên kết với mARN của protein đích tại vị trí bắt đầu dịch mã của nó và ngăn chặn quá trình dịch mã của nó. Một loại oligos antisense morpholino khác có thể nhắm mục tiêu vào các mối nối nối và chặn quá trình nối pre-mRNA (Summerton, 1999). Hiệu ứng oligo Morpholino-antisense là tạm thời và có thể được sử dụng để nghiên cứu vai trò phát triển ban đầu của các gen quan tâm. Việc tiêm morpholino-antisense oligo được thực hiện ở giai đoạn tế bào 1-4 của phôi cá ngựa vằn và hiệu quả của nó có thể được nhìn thấy cho đến 3-5 ngày sau khi thụ tinh (pdf) (Bill và cộng sự, 2009). Morpholino antisense oligonucleotide thường hiển thị các hiệu ứng ngoài mục tiêu (Robu et al., 2007). Các thí nghiệm kiểm soát như thí nghiệm giải cứu nên được thực hiện bằng cách tiêm morpholino cùng với mRNA mà loại oligo antisense này không thể nhắm mục tiêu để xác minh tính đặc hiệu của nó (Eisen và Smith, 2008). Một loại morpholino kích hoạt bằng ảnh đã được phát triển, hoạt động của nó có thể được kiểm soát theo không gian và thời gian bằng cách tiếp xúc với tia cực tím (Tallafuss et al., 2012). Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện bằng cách sử dụng phương pháp loại bỏ gen oligo qua trung gian morpholino antisense để hiểu các bệnh thận ở người. Ví dụ, việc loại bỏ gen nephrocystin-3 dẫn đến sự hình thành u nang và não úng thủy trong phôi cá ngựa vằn theo cách tương tự như bệnh nephronophthisis loại-3 (Zhou và cộng sự, 2010).
Các kháng sinh aminoglycoside thường được sử dụng để điều trị nhiều bệnh nhiễm trùng đe dọa tính mạng được biết đến với tác dụng gây độc cho thận và tai (Mingeot-Leclercq và Tulkens, 1999). Gentamicin là một loại kháng sinh thường được sử dụng có thể gây tổn thương thận cấp tính (AKI) ở cá ngựa vằn. Gentamicin làm phẳng biểu mô viền bàn chải, mất biểu mô ống thận, biến dạng cấu trúc cầu thận, tăng phospholipid trong lysosomal và tích tụ bạch cầu hoặc mảnh vụn tế bào trong lòng ống, giống như quá liều gentamicin ở người (Cianciolo Cosentino et al., 2010). Cá ngựa vằn có thể tái tạo và thay thế các nephron bị hư hỏng. Gentamicin xúc phạm có thể được sử dụng để nghiên cứu tái tạo thận ở cá ngựa vằn (Kamei et al., 2015). Tổn thương gentamicin gây ra phản ứng tái tạo kích hoạt các tế bào gốc thận trải qua các giai đoạn đặc tả, tăng sinh và biệt hóa để tạo ra các nephron mới. Mất khoảng 14 đến 21 ngày ở cá trưởng thành để tái tạo nephron (Diep et al., 2011; McCampbell et al., 2015). Cisplatin, được sử dụng như một loại thuốc hóa trị liệu để điều trị khối u, cũng có tác dụng gây độc cho thận, như đã quan sát thấy ở cá ngựa vằn (Hentschel et al., 2005). Etimicin là một aminoglycoside khác có thể được sử dụng trong khi bắt chước độc tính trên thận và độc tính trên tai thấp ở phôi cá ngựa vằn (Shao và cộng sự, 2020). Do đó, AKI và tái tạo thận có thể được nghiên cứu ở cá ngựa vằn với sự trợ giúp của các loại kháng sinh này.
Tổn thương cơ học ở thận
Cá ngựa vằn có thể bị thương về thể chất khi cắt bỏ, đâm hoặc làm lạnh. Chấn thương phẫu thuật có thể được thực hiện bằng cách sử dụng nhíp nhỏ để đâm vào khu vực mong muốn của đại từ để tạo ra mô hình AKI. Kỹ thuật này được sử dụng để làm tổn thương ống đại tràng gần với lỗ huyệt, làm cản trở dòng chảy của chất lỏng và dẫn đến hình thành nang trong vòng 30 phút (Kramer-Zucker, 2005). Người ta thấy rằng việc giảm tốc độ dòng chảy của chất lỏng trong đại từ tạo ra áp suất ngược tại vị trí đi vào của chất lỏng, gây ra sự giãn nở trong lòng ống và hình thành nang. Một nhóm các nhà nghiên cứu khác đã tạo ra sự tắc nghẽn trong ống đại tràng ở 50 hpf hoặc trong ống trung thận của 12-cá ngựa vằn một tháng tuổi bằng cách sử dụng nhíp để kẹp khu vực gần ống góp xa (Hellman và cộng sự, 2010). Họ đã phát hiện ra rằng sẹo ống dẫn đến sự gia tăng tốc độ đập của lông mao và điều chỉnh lại yếu tố phiên mã foxj1a điều chỉnh biểu hiện gen sinh mỡ. Điều này cho thấy rằng tổn thương đối với các ống đại trực tràng tạo ra tín hiệu cơ học dựa trên lông mao để duy trì cân bằng nội môi nephron.
Chấn thương thận do laser
Cắt bỏ tế bào qua trung gian laser được sử dụng như một công cụ để nghiên cứu tổn thương thận và bắt chước AKI ở cá ngựa vằn. Johnson và cộng sự, (2011) đã mô tả một phương pháp cắt bỏ qua trung gian laser, sau đó theo dõi các nephron tái tạo. Họ đã tiêm 40 kDa dextran-FITC vào thân của một số phôi cá ngựa vằn ở 48-55 hpf để dán nhãn cho các tế bào biểu mô ống lượn gần, sau đó được nhắm mục tiêu cho quá trình cắt bỏ qua trung gian laser ở 72 hpf. Phôi bị cắt bỏ sau đó được tiêm lại rhodamine dextran để theo dõi các tế bào biểu mô ống lượn gần. Họ phát hiện ra rằng một ống lượn gần đã phát triển đầy đủ được hình thành vào ngày thứ 7 sau quá trình cắt bỏ qua trung gian laser (Johnson và cộng sự, 2011). Một giải pháp thay thế khác là sử dụng dòng biến đổi gen dành riêng cho thận để xác định các tế bào để cắt bỏ qua trung gian laser và theo dõi hành vi của các tế bào lân cận. Một ánh sáng laze tím có bước sóng 405 nm đã được sử dụng để nhắm vào ống đại trực tràng của cá ngựa vằn Tg(atp1a1a.4:GFP) (Palmyre et al., 2014). Vì quang phổ kích thích của GFP nằm trong dải ánh sáng từ xanh lam đến tím, nên nó hấp thụ ánh sáng laze có bước sóng 405 nm, hoạt động như một nguồn năng lượng để có khả năng gây ra tổn thương tại các tế bào biểu mô đích. Thí nghiệm này đã dẫn đến khám phá ra rằng di chuyển tế bào là phản ứng chính của biểu mô bị tổn thương. Di chuyển tế bào tập thể gây ra sự kéo dài cơ học cung cấp các kích thích cho sự tăng sinh tế bào để sửa chữa ống bị thương. Để xác định thời điểm khi ống tiền âm của cá ngựa vằn có được khả năng tái sinh, Yakulov và cộng sự, (2018) đã sử dụng một 2-laser photon để cắt bỏ một phần nhỏ của ống tiền âm trong Tg(cldn2b:lyn-GFP) phôi tại các thời điểm khác nhau và tuân theo quá trình tái sinh. Họ phát hiện ra rằng quá trình cắt bỏ các ống đại từ của 2-phôi ngày tuổi được sửa chữa nhanh chóng bằng các phản ứng di cư, trong khi 1-phôi ngày tuổi không có khả năng này. Họ đã tiến hành lập hồ sơ biểu hiện gen của phôi cá ngựa vằn bị thương và phát hiện ra rằng cxcr4b và mica có liên quan đến quá trình sửa chữa này (Yakulov et al., 2018).
di truyền hóa học
Các phân tử hoạt tính sinh học nhỏ có thể được sử dụng để can thiệp vào chức năng của protein và hiểu được vai trò sinh học của chúng. Một số lượng lớn các thư viện hóa học có sẵn trên thị trường hoặc có thể được tùy chỉnh để thăm dò các chức năng của protein. Các thư viện phân tử nhỏ này bao gồm chất ức chế kinase, chất ức chế protease, thụ thể hạt nhân và phối tử có thể được sử dụng để xác định vai trò của các con đường truyền tín hiệu liên quan đến sự phát triển và chức năng của cơ quan (Kawasumi và Nghiêm, 2007). Trong vài thập kỷ qua, cá ngựa vằn đã nổi lên như một sinh vật mô hình động vật có xương sống mạnh mẽ để sàng lọc hóa học thông lượng cao và chấm điểm kiểu hình (Kaufman et al., 2009). Cao và cộng sự, (2009) đã sử dụng phương pháp sàng lọc hóa học để xác định các hợp chất có thể đảo ngược kiểu hình do đột biến ở pkd2 (gen gây bệnh PKD) và ift172 (gen chịu trách nhiệm hình thành lông mao). Họ đã phát hiện ra rằng chất ức chế pan-histone deacetylase (pan-HDAC) trichostatin A (TSA) và chất ức chế HDAC đặc hiệu loại I axit valproic (VPA) có thể ngăn chặn sự hình thành nang thận trong mô hình loại trừ pkd2 (Cao et al., 2009 ). Do đó, di truyền hóa học có thể là một công cụ hữu ích để xác định các ứng cử viên thuốc mới có thể đảo ngược hoặc ngăn chặn tình trạng bệnh tật.
Mô hình tổn thương thận do di truyền
Mô hình cắt bỏ mô cảm ứng về mặt di truyền có thể được sử dụng ở cá ngựa vằn trong đó nitroreductase (NTR) của vi khuẩn được biểu hiện dưới sự kiểm soát của một yếu tố thúc đẩy lựa chọn thúc đẩy sự biểu hiện của NTR trong một phân đoạn cụ thể của đại từ. NTR chuyển đổi metronidazole thành một chất chuyển hóa gây độc tế bào có thể gây chết tế bào biểu hiện NTR (Curado et al., 2008). Zhou và Hildebrandt (2012) đã sử dụng kỹ thuật này để gây tổn thương cho các tế bào podocytes bằng cách biểu hiện NTR dưới sự kiểm soát của chất kích thích podocin trong dòng cá ngựa vằn Tg (pod: NTR-mCherry). Họ cũng đã phát triển một dòng chuyển gen kép VDBP-GFP (protein liên kết với Vitamin D được gắn thẻ GFP) như một chất đánh dấu protein niệu cùng với dòng Tg(pod: NTR-mCherry). Điều trị bằng metronidazole gây tổn thương tế bào chân dẫn đến phù nề toàn thân và tích tụ VDBP-GFP trong ống lượn gần, bắt chước kiểu hình của hội chứng thận hư ở người (Zhou và Hildebrandt, 2012).
Phương pháp đánh giá sự phát triển và chức năng của đại từ ở cá ngựa vằn
Chúng tôi đã mô tả các phương pháp tạo mô hình bệnh thận ở người bằng cách sử dụng cá ngựa vằn. Việc tạo ra một mô hình bệnh bằng cách sử dụng một sinh vật khác là bước đầu tiên, cần được đánh giá về khả năng tóm tắt lại một cách trung thực các khía cạnh khác nhau của một căn bệnh gặp ở người. Zebrafish cung cấp nhiều lợi thế có thể được sử dụng để đánh giá nhanh khả năng đóng vai trò là vật thay thế để hiểu các bệnh thận ở người như được thảo luận dưới đây.
Sàng lọc dựa trên hình thái học
Hầu hết các phôi cá ngựa vằn đột biến thường cho thấy sự khác biệt về hình thái, so với loại hoang dã có thể dễ dàng đánh giá bằng cách quan sát dưới kính hiển vi. Độ trong suốt của phôi cá ngựa vằn và khả năng tồn tại đến 5 ngày ngay cả khi có các khiếm khuyết phát triển nghiêm trọng là một lợi thế lớn trong màn hình dựa trên hình thái học. Những thay đổi hình thái phổ biến được quan sát thấy ở phôi cá ngựa vằn với các đại từ khiếm khuyết bao gồm phù màng ngoài tim, u nang đại từ, trục cơ thể cong và não úng thủy (Poureetezadi và Wingert, 2016; Outtandy et al., 2019). Phù nề là một trong những dấu hiệu phổ biến của thận bị khiếm khuyết, dấu hiệu này cũng được thấy ở các khiếm khuyết cơ quan khác như sự phát triển của tim (Hanke và cộng sự, 2013). Các thể đột biến bị khiếm khuyết ở thận có thể phát triển u nang do sự tăng sinh khác của các tế bào biểu mô, có thể dễ dàng quan sát thấy dưới kính hiển vi (Zhao và Malicki, 2007; Yamaguchi và cộng sự, 2006). Trục cơ thể cong thường thấy ở những người đột biến có khiếm khuyết lông mao. Cá ngựa vằn đột biến như Locke (lok), shen yantf214a(shy), garbustm304 (grb), và zatortg238a (zar) là một số ví dụ khác cho thấy trục cơ thể cong (Zhao và Malicki, 2007). Cá ngựa vằn đột biến với khuyết tật thận cho thấy nhiều khiếm khuyết hình thái trong cùng một phôi. Việc loại bỏ hai gen polycystin pkd1a và pkd1b đã dẫn đến trục cơ thể bị cong ở miệng, não úng thủy, sụn và dị tật sọ mặt với tần suất thấp của u nang tiền liệt tuyến (Mangos et al., 2010). Các đột biến của protein vận chuyển nội bào ift57, ift88 và ift172, trong đó lông mao bị khiếm khuyết, có trục cơ thể cong về phía bụng (Lunt et al., 2009). Do đó, cá ngựa vằn đột biến với thận khiếm khuyết biểu hiện nhiều đặc điểm hình thái có thể dễ dàng xác định.
Để biết thêm thông tin: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501