MiR-214 Cải thiện tổn thương thận cấp tính do nhiễm trùng huyết do PTEN / AKT / mTOR điều chỉnh Autophagy
Feb 28, 2022
Trừu tượng. Các nghiên cứu trước đây đã gợi ý rằng stress oxy hóa và autophagy dẫn đến cấp tínhchấn thương thận (AKI) trong quá trình nhiễm trùng huyết và microRNA (miR)-214 đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệthậnchịu stress oxy hóa. Nghiên cứu hiện tại nhằm kiểm tra xem việc từ bỏ bảo vệ miR-214 có liên quan đến autophagy trong nhiễm trùng huyết hay không. Vai trò của autophagy đã được nghiên cứu trong một mô hình chuột thắt và đâm thủng manh tràng (CLP). Phản ứng chuỗi polymerase định lượng phiên mã ngược (RT-qPCR) đã được sử dụng để phân tích biểu hiện của miR-214. Cấu trúc và chức năng củathậnthu hoạch từ những con chuột đã được đánh giá.Thậnnồng độ autophagy được phát hiện bằng hóa chất miễn dịch, miễn dịch huỳnh quang và thấm nước phương tây. Người ta thấy rằng miR-214 có thể làm giảm bớt AKI ở chuột tự hoại bằng cách ức chế mức độthậnautophagy (bằng tiếng Anh). Hơn nữa, miR-214 đã ức chế autophagy bằng cách tắt tiếng biểu hiện PTEN trongthậnmô của chuột tự hoại. Những fifindings chỉ ra rằng AKI do CLP cải thiện miR-214 bằng cách giảm stress oxy hóa và ức chế autophagy thông qua việc điều chỉnh con đường PTEN / AKT / mTOR.
Từ khoá:microRNA-214, nhiễm trùng huyết, tổn thương thận cấp tính, autophagy, thận
Giới thiệu Sắcchấn thương thận(AKI) là một trong những biến chứng thường gặp nhất của nhiễm trùng huyết và xảy ra ở 40-50% bệnh nhân nhiễm khuẩn, với tỷ lệ tử vong cao tới 60% (1). Tuy nhiên, cơ chế bệnh sinh của AKI do nhiễm trùng huyết vẫn chưa rõ ràng. Autophagy đã được báo cáo là đóng vai trò quan trọng trong AKI do nhiễm trùng huyết và ức chế kết quả tự thực bào trong sự phát triển của AKI trong quá trình nhiễm trùng huyết (2,3). Các nghiên cứu trước đây (4,5) đã xác nhận rằng nhiễm trùng huyết kích hoạt autophagy ở nhiều cơ quan, bao gồmthận(6) và các quá trình autophagic có liên quan đến việc loại bỏ ty thể bị hư hỏng và stress oxy hóa (7). Tuy nhiên, autophagy quá mức có thể gây chết tế bào không mong muốn và có hại (8). Do đó, nồng độ autophagy vừa phải là chìa khóa để giảm AKI do nhiễm trùng huyết. Các nghiên cứu trước đây đã báo cáo rằng miR-214 cải thiện AKI do thiếu máu cục bộ do tái tưới máu bằng cách ức chế quá trình apoptosis (9) và miR-214 ngăn chặn stress oxy hóa trong bệnh thận tiểu đường thông qua các loài oxy phản ứng (ROS) / AKT / mTOR con đường tín hiệu (10). Nghiên cứu hiện tại cho thấy miR-214 có thể làm giảm rối loạn chức năng cơ tim do nhiễm trùng huyết ở chuột bằng cách ức chế autophagy (11). Tuy nhiên, liệu miR-214 có thể cải thiện AKI do nhiễm trùng huyết hay không vẫn còn phải được làm sáng tỏ. Trong nghiên cứu hiện tại, người ta đã đưa ra giả thuyết rằng miR-214 làm giảm AKI do CLP gây ra bằng cách giảm stress oxy hóa và ức chế autophagy thông qua việc điều chỉnh con đường PTEN / AKT / mTOR.
CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN BỆNH THẬN / THẬN
Vật liệu và phương pháp
Động vật.Tổng cộng có 100 con chuột đực Côn Minh (trọng lượng, 20,40±2,92 g; tuổi, 6-8 tuần) được cung cấp bởi Trung tâm Động vật Phòng thí nghiệm Y tế của Đại học Y Hà Bắc (Thạch Gia Trang, Trung Quốc) đã được sử dụng trong nghiên cứu hiện tại. Tất cả những con chuột đã thích nghi với chu kỳ sáng / tối 12 giờ ở 24 ° C với độ ẩm 50% và được tiếp cận miễn phí với thức ăn và nước vào ≥1 tuần trước khi thí nghiệm. Tất cả các quy trình thử nghiệm đã được thực hiện theo đúng hướng dẫn của Viện Y tế Quốc gia (Ấn phẩm NIH số 85-23, sửa đổi năm 1996) và được phê duyệt bởi Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật Tổ chức của Bệnh viện Trung ương Cangzhou (phê duyệt số 2017-020-01). Tất cả các ca phẫu thuật được thực hiện dưới gây mê và mọi nỗ lực đã được thực hiện để giảm thiểu đau khổ.
Thắt và đâm thủng manh tràng (CLP).CLP được thực hiện trên chuột để tạo ra mô hình nhiễm trùng huyết do chuột, như đã mô tả trước đây (12). Sau khi gây mê bằng cách hít phải isoflurane (gây ra ở mức 3% và duy trì ở mức 0,5%), một vết mổ giữa 1 cm đã bị cắt. Manh tràng tiếp xúc (khoảng cách 1 cm từ đầu) được thắt bằng hai lỗ thủng bằng kim 23 thước. Manh tràng nhẹ nhàng đùn một lượng nhỏ phân và được đặt trở lại vị trí giải phẫu của nó. Thành bụng được khâu thành từng lớp bằng bím tóc lụa 3-0. Theo quy trình, 1 ml nước muối 0,9% được tiêm dưới da. Những con chuột được cung cấp quyền truy cập miễn phí vào nước duy nhất. Chuột mô hình giả được vận hành theo cách tương tự như mô hình CLP mà không có CLP.
Thiết kế thử nghiệm.Chuột (n = 6 cho phẫu thuật giả và CLP) được gán ngẫu nhiên cho bảy nhóm: nhóm Sham, nhóm CLP, adenovirus (Ad) -protein huỳnh quang xanh (GFP) + nhóm CLP, nhóm Ad-miR-214 + CLP, nhóm chống miR-214 + CLP, chất ức chế PTEN + nhóm CLP và nhóm Ad-miR-214 + PTEN + nhóm CLP. Những con chuột nhóm Sham đã tiếp xúc với quy trình tương tự nhưng không bị thắt và đâm thủng manh tràng. Chuột trong các nhóm khác được thắt và thủng manh tràng. Tất cả những con chuột đã nhanh chóng được gây mê bằng cách hít phải isoflurane để thu thập máu, nước tiểu vàthậnmẫu 24 giờ sau lần xử lý cuối cùng.
Adenovirus qua trung gian Ad-miR-214, chống miR-214 hoặc Ad-GFPchuyển gen in vivo và thuốc ức chế PTEN tiêm. Ad-miR-214, chống miR-214 hoặc Ad-GFP (Shanghai GenePharma Co., Ltd.) đã được đưa vào khoang bụng của chuột 4 ngày trước CLP. Một thời gian ngắn, chuột đã được gây mê bằng cách hít phải isoflurane. Một ống thông chứa 200 μl adenovirus (2x1011 pfu, biểu hiện miR-214, chống miR-214 hoặc Ad-GFP) đã được tiêm cho chuột bình thường thông qua tiêm trong phúc mạc. Chất ức chế PTEN (VO-OHpic, trong phúc mạc, Sigma-Aldrich; Merck KGaA) được dùng cho chuột CLP đã được tiêm thuốc chống miR-214 thông qua tiêm trong phúc mạc với liều duy nhất là 10 μg / kg 30 phút trước khi dùng adenovirus.
Đánh giá chức năng thận. Các mẫu máu được thu hoạch từ tim chuột, sau đó là ly tâm (ở nhiệt độ phòng trong 15 phút ở 3.000 x g) để thu thập huyết thanh. Nồng độ nitơ urê máu (BUN) và creatinine huyết thanh (Cr) trong huyết thanh được xác định bằng máy phân tích tự động Hitachi 7600 (Hitachi, Ltd.). ELISA được sử dụng để phân tích mức độchấn thương thậnphân tử-1 (KIM-1; mèo. không. RKM100; R &D Hệ thống, Inc.) và lipocalin liên quan đến gelatinase bạch cầu trung tính (NGAL; cat. no. DY3508; R &D Hệ Thống, Inc.) trong mẫu nước tiểu.
Xét nghiệm viêm huyết thanh cytokine.TNF-α huyết thanh (mèo không. H052) và IL-6 (cat. no. H007) đã được kiểm tra bằng bộ dụng cụ ELISA thương mại (Viện kỹ thuật sinh học Nam Kinh Jiancheng) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.Đo lường các dấu hiệu stress oxy hóa. Bộ xét nghiệm tương ứng (Viện Kỹ thuật Sinh học Nam Kinh Jiancheng, Nam Kinh, Trung Quốc) đã được sử dụng để đo nồng độ malondialdehyd (MDA) và kiểm tra hoạt động của superoxide dismutase (SOD) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Mô học và điểm chấn thương hình ống. Tất cả những con chuột đã phải chịuthậntưới máu dưới gây mê 24 giờ sau CLP. Cácthậnmẫu vật đã được cố định trong paraformaldehyd 4% trong 72 giờ ở 4 ° C. Các mẫu mô sau đó được khử nước trong một loạt các dung dịch ethanol được phân loại, được nhúng trong các phần parafin và cutinto 4-μm. Các phần (4 μm) được cắt bằng cách sử dụng một hệ thống vi mô và các phần mô được nhuộm bằng hematoxylin (5 phút) và eosin (1 phút) ở nhiệt độ phòng để kiểm tra mô học. Các slide được đánh giá và chấm điểm bằng kính hiển vi (BX51, Olympus Corporation).Thậncác mô có thay đổi mô bệnh học sau đây được đánh giá là bị tổn thương: Mất viền bàn chải, không bào hóa, hình thành phôi, giãn và gián đoạn ống thận, ly giải tế bào và hoại tử tế bào. Tổn thương mô được kiểm tra một cách mù quáng và được chấm điểm bằng tỷ lệ phần trăm ống bị tổn thương: 0, không có thiệt hại; 1, 0‑25; 2, 25‑50; 3, 50‑75; 4, >75% (13).
Kính hiển vi điện tử truyền dẫn (TEM).Tươithậnđược rửa trong nước muối đệm phốt phát, và cắt thành các khối 1 mm và cố định tuần tự trong 2,5% glutaraldehyd trong 24 giờ ở 4 °C. Các phần được ngâm trong 1% osmium tetroxide trong 2 giờ ở 4 ° C, mất nước trong ethanol phân loại và nhúng trong epoxyresin. Cuối cùng, các phần siêu mỏng (60 nm) được nhuộm gấp đôi với uranyl acetate và chì citrate ở 20 ° C trong 60 phút. Việc quan sát được thực hiện trên kính hiển vi điện tử truyền qua (Tecnai; Hitachi, Ltd.) ở 80 kV sử dụng Electron Microscopy Film 4489 (ESTAR đế dày; Kodak).
Hóa mô miễn dịch (IHC).Tươithậncác mô được cố định trong paraformaldehyd 4% (trong 72 giờ ở 4 °C) và được nhúng trong parafin. Các mẫu vật được cắt thành các phần dày 4 μm và điếc trong xylene. Sau khi các phần mô được rửa bằng PBS, chúng được đun sôi trong dung dịch đệm citrate 10 mM (pH 6.0) trong 4 phút để lấy kháng nguyên và sau đó bị chặn bằng 10% huyết thanh dê trong PBS ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Kháng thể chính (kháng LC3B; 1:400; mèo số 4412; Công nghệ tín hiệu di động, Inc.) được thêm vào theo hướng dẫn và ủ ở 4 °C trong 12 giờ. Kháng thể thứ cấp (DÊ antirabbit HRP; 1:2.000; mèo không. BS13278; Bioworld Công Nghệ, Inc.) đã được thêm vào và ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. DAB (100 μl) được thêm vào và chống lại trong 5 phút với vết bẩn được quan sát thấy dưới kính hiển vi ánh sáng (Model CX31-P; Tập đoàn Olympus). Cường độ nhuộm màu tích cực, xuất hiện màu nâu, được xác định bằng phần mềm phân tích hình ảnh Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc.). Mật độ quang tích phân (IOD) được tính toán để đại diện cho cường độ. Giá trị IOD tăng lên khi biểu hiện protein tăng lên.
Phiên mã ngược-định lượng(Rt-q) Pcr. Tổng RNA được chiết xuất từmô thậnsau cảm ứng của mô hình sử dụng thuốc thử TRIzol (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Theo hướng dẫn của bộ phiên âm ngược TaqMan (cat. no. N8080234; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.), RNA được phiên âm ngược lại thành cDNA. Các điều kiện chu trình nhiệt sau đây đã được sử dụng (miR-214): Biến tính ban đầu ở 95 ° C trong 5 phút; tiếp theo là 40 chu kỳ biến tính ở 95 ° C trong 30 giây, ủ ở 60 ° C trong 30 giây và kéo dài ở 72 ° C trong 30 giây RT-qPCR được thực hiện bằng Hệ thống phát hiện trình tự ABI Prism 7500 (PerkinElmer, Inc.) và bộ PCR xanh SYBR tiêu chuẩn (Toyobo Life Science). U6 được sử dụng làm bộ điều khiển nội bộ cho miR-214. Các chuỗi mồi như sau: miR-214, forward, 5'-AGCATAATACAGCAGGCACAGACAGAC-3' và đảo ngược, 5'-AAAGGTTGTTCTCCACTCTCTCAC-3'; U6, tiền đạo, 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3' và đảo ngược, 5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'. Những experi- ments này đã được sao chép sáu lần. Kết quả được phân tích bằng phương pháp 2-ΔΔCq (14). Các mức biểu thức mRNA của LC3, p62, PTEN, AKT và mTOR đã được đánh giá thông qua RT-qPCR. Với β-actin làm tham chiếu bên trong của các gen này, 2-ΔCq được sử dụng để đo lường sự biểu hiện tương đối của các gen đích. Các trình tự mồi được hiển thị trong Bảng I được tổng hợp bởi Sangon Biotech Co., Ltd.
Phương Tây blotting. Thậnmô được trộn với RIPA lysate (Viện Công nghệ sinh học Beyotime) để làm cho đồng nhất và ly giải bị dừng lại khi không quan sát thấy mô nhìn thấy được. Các mẫu được ly tâm ở 13.000 x g trong 10 phút ở -4 ° C và chất siêu âm đã được thu hồi để phân tích đốm màu phương Tây. Tóm lại, nồng độ protein được xác định bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm protein BCA vi mô (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Các mẫu protein (80 μg mỗi mẫu) được tách ra bằng cách giảm điện di natri dodecyl sulfate-polyacrylamidegel 12% và sau đó được chuyển lên màng polyvinylidene difluoride ở 4 ° C qua đêm. Các protein được tách ra đã được chuyển đến màng PVDF. Sau khi chặn sữa tách kem 5% ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ, màng được ủ qua đêm (ở 4 °C) với các kháng thể chính. Các kháng thể chính sau đây (tất cả Các công nghệ tín hiệu tế bào, Inc.) đã được sử dụng: Chuỗi ánh sáng 3B (1: 1.000; mèo số 4412), p62 (1: 1.000; cat. số 4412), Anti-PTEN (1: 1.000; cat. số 9188), chống phosphoryl hóa (p) -AKT (Ser473) (1: 1.000; cat. số 4060), chống AKT (1: 1.000; cat. số 9272), chống p-mTOR (Ser 2448) (1: 1.000; cat. số 5536), anti-mTOR (1: 1.000; cat. no. 2972) và β-actin (1: 2,000; cat. no. 4970). Sau khi rửa, các màng được ủ (ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ) với các kháng thể thứ cấp chống thỏ liên hợp HRP (1: 3.000; mèo không. Máy bay A0208; Viện Công nghệ sinh học Beyotime). Các dải protein được phát hiện với Immobilon Western (MilliporeSigma) và được phân tích bằng cách sử dụng phần mềm Total-Lab TL120 (Nonlinear Dynamics, 2.01). Sự biểu hiện của protein đã được bình thường hóa thành β-actin.
Phân tích thống kê. Phân tích thống kê được thực hiện bằng graphpad prism 9.0 (GraphPad Software, Inc.). Tất cả dữ liệu được trình bày dưới dạng phương tiện ± độ lệch chuẩn hoặc trung vị (phạm vi tương đương) cho các biến liên tục, tùy thuộc vào phân phối của chúng. Các đặc điểm và kết quả cơ bản được so sánh bằng cách sử dụng ANOVA một chiều, sau đó là thử nghiệm posthoc của Tukey, hoặc thử nghiệm Kruskal-Wallis, sau đó là thử nghiệm của Dunn khi thích hợp. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Kết quả
Điểm thời gian 24 giờ sau CLP. Các nghiên cứu trước đây đã báo cáo (6,15,16) rằng phân tích sinh hóa (tức là LC3 và p62) cho thấy rằng thông lượng tự thực bào bị ức chế với sự tiến triển của nhiễm trùng huyết sau 6-8 giờ CLP. Trong nghiên cứu hiện tại, số lượng autolysosome trongthậnnhững con chuột được điều trị CLP tăng lên trong vòng 24 giờ sau phẫu thuật. Ngoài ra, việc phân tích các dấu hiệu củachấn thương thậncho thấy rằngchức năng thậnbị hư hại nghiêm trọng nhất 24 giờ sau clp. Do đó, điểm thời gian 24 giờ sau CLP đã được chọn cho các thí nghiệm sau.
Tác dụng điều hòa đối với miR-214 trong các mô thận. Phân tích RT-qPCR được sử dụng để phát hiện biểu hiện miR-214 ở chuột được xử lý CLP. Nó đã được tìm thấy rằng biểu hiện miR-214 đã được điều chỉnh một chút trongthậncác mô sau phẫu thuật CLP 24 giờ, so với nhóm giả (1,47 lần, P<0.01, fig.="" 1a).="" the="" present="" study="" examined="" the="" reactive="" increase="" in="" mir‑214="" expression="" during="" sepsis="" as="" a="" compensatory="" protective="" mechanism.="" therefore,="" it="" evaluated="" the="" role="" of="" mir‑214="" in="" aki="" during="" sepsis="" by="" regulating="" its="" expression.="" as="" shown="" in="" fig.="" 1b,="" ad‑mir‑214="" increased="" mir‑214="" expression="" by="" 4.13‑fold="" 4="" days="" after="" intraperitoneally="" injecting="" 2x1011="" pfu/mice="" adenovirus,="" whereas="" anti‑mir‑214="" decreased="" mir‑214="" expression="" by="" 81.16%="" in="" the="">thậnmô, so với nhóm giả (cả hai P<0.01). by="" contrast,="" ad‑gfp="" as="" a="" control="" group="" did="" not="" affect="" mir‑214‑3p="" expression,="" compared="" with="" the="" sham="" group="" (both="" p="">0.05).
CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN SUY THẬN/THẬN
Tác dụng của miR-214 đối với rối loạn chức năng thận ở chuột tự hoại.Tất cả những con chuột đã được hy sinh để thu thập máu, nước tiểu vàthậnmẫu 24 giờ sau phẫu thuật CLP. BUN và Cr là những chỉ số quan trọng về mức độ nghiêm trọng củaThậnsuy giảm (17). Hơn nữa, NGAL và KIM-1 đã được xác định là dấu ấn sinh học cụ thể củachấn thương thậnvà biểu hiện gia tăng của họ có liên quan đến sớmThậntổn thương ống thận ở AKI (17). Như thể hiện trong Hình 2A-D, mức độ BUN, Cr, KIM-1 và NGAL đã tăng đáng kể sau phẫu thuật CLP so với nhóm giả mạo. Tuy nhiên, Ad-miR-214 đã giảm đáng kể mức BUN, Cr, KIM-1 và NGAL so với nhóm CLP (tất cả P<0.01), whereas="" anti‑mir‑214="" exhibited="" opposite="" effects="" in="" these="">chức năng thậnthông số. Tuy nhiên, sau khi tiền xử lý bằng thuốc ức chế PTEN, tác dụng bảo vệ của Ad-miR-214 đã được tăng cường. Kết quả cho thấy miR-214 làm giảm rối loạn chức năng thận ở chuột nhiễm trùng.
Tác dụng của miR-214 đối với viêm thận và stress oxy hóa.Như thể hiện trong Hình 3A và B, CLP đã nâng cao đáng kể mức độ TNF-α và IL-6, trong khi Ad-miR-214 làm giảm đáng kể mức độ của các điểm đánh dấu này. So với
Tác dụng của miR-214 đối với autophagy thận ở chuột tự hoại.Nghiên cứu hiện tại đã xem xét những thay đổi trong LC3 trongthậnmô thông qua nhuộm IHC. Như thể hiện trong Hình 6, cường độ nhuộm màu dương tính LC3 tăng đáng kể ở nhóm CLP so với nhóm giả (P<0.01) due="" to="" the="" activated="" autophagy.="" the="" expression="" level="" of="" lc3="" was="" lower="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group="" and="" higher="" in="" the="" anti‑mir‑214="" group="" in="" comparison="" with="" the="" clp="" group=""><0.01). however,="" the="" administration="" of="" pten="" inhibitor="" enhanced="" the="" inhibition="" of="" autophagy="" effect="" of="">
miR-214 kích hoạt đường dẫn AKT/mTOR để ức chếautophagy bằng cách im lặng PTEN trong các mô thận.Tác dụng của CLP đối với autophagy trongthậncác mô đã được điều tra bằng cách đánh giá mức độ LC3-II / I và p62. Con đường tín hiệu PTEN / AKT / mTOR đóng một vai trò quan trọng trong autophagy (18). Để điều tra ảnh hưởng của miR-214 trên con đường PTEN-AKT / mTOR, nồng độ protein của LC3-II / I, p62, AKT, p-AKT, mTOR, p-mTOR và PTEN đã được phân tích thông qua phương tây blotting và RT-qPCR hậu môn- ysis. Như thể hiện trong Hình 7A-C, sự thay đổi trong các protein này nhanh chóng xảy ra, với sự gia tăng tỷ lệ LC3-II / LC3-I và giảm mức p62 (cả P<0.01) in="" the="" clp‑induced="" sepsis="" group.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" was="" significantly="" decreased,="" while="" the="" level="" of="" p62="" (both=""><0.01) was="" significantly="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" however,="" the="" inhibition="" of="" mir‑214="" displayed="" an="" opposite="" tendency="" to="" the="" above="" indicators="" (both=""><0.01). by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" and="" the="" levels="" of="" p62="" in="">thậnmô (cả P>0,05). Hai chỉ số của LC3-II / LC3-I và p62 không có sự khác biệt đáng kể giữa nhóm Ad-miR-214, nhóm ức chế PTEN và nhóm ức chế Ad-miR-214 + PTEN (tất cả P>0,05). Những kết quả này cho thấy autophagy được gây ra bởi CLP, và sự biểu hiện quá mức của miR-214 có thể ức chế một phần nó.
Như minh họa trong Hình 7A và D-F, mức biểu thức của PTEN (P)<0.01) was="" increased,="" and="" the="" expression="" levels="" of="" p‑akt="" (ser473)="" and="" p‑mtor="" (ser2448)=""><0.01) were="" decreased="" by="" clp.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" expression="" level="" of="" pten="" was="" reduced,="" while="" those="" of="" p‑akt="" and="" p‑mtor="" (all=""><0.01) were="" subsequently="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" expression="" levels="" of="" pten,="" p‑akt="" and="" p‑mtor="">thậnmô (tất cả P>0,05). Không có sự khác biệt rõ rệt trong các chỉ số trên giữa nhóm Ad-miR-214, nhóm ức chế PTEN và nhóm ức chế Ad-miR-214 + PTEN (tất cả P>0,05). Những phát hiện này cho thấy CLP gây rathậnautophagy mô bằng cách ức chế con đường AKT / mTOR. Ad-miR-214 đã kích hoạt đường dẫn AKT/mTOR bằng cách tắt tiếng PTEN trongthậnMô. Tuy nhiên, so với nhóm CLP, chống miR-214 không ức chế đáng kể sự biểu hiện của mTOR. Do đó, RT-qPCR được sử dụng thêm để xác định sự biểu hiện mRNA của các gen liên quan đến con đường tín hiệu PTEN / AKT / mTOR. Theo kết quả của RT-qPCR (Hình 8), so với nhóm Sham, mức độ biểu hiện mRNA của p62, LC3 và PTEN đã tăng lên rõ rệt, trong khi biểu thức mRNA của AKT và mTOR đã giảm trong nhóm CLP. So với nhóm CLP, Ad-miR-214, PTEN
chất ức chế và các nhóm ức chế Ad-miR-214 + PTEN cho thấy biểu hiện mRNA của LC3 và PTEN giảm, nhưng biểu hiện mRNA của p62, AKT và mTOR tăng (tất cả P<0.05); in="" the="" anti‑mir‑214="" group,="" an="" opposite="" changing="" tendency="" was="" observed="" (all=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" above="" indicators="" among="" the="" ad‑mir‑214="" group,="" the="" pten="" inhibitor="" group="" and="" the="" ad‑mir‑214="" +="" pten="" inhibitor="" group="" (all="" p="">0,05). Do đó, ảnh hưởng của p62 đối với autophagy có thể xảy ra ở cấp độ phiên mã hơn là ở cấp độ sau phiên mã. Các kết quả hiện tại đã chứng minh rằng miR-214 downreg- đã loại bỏ biểu hiện của PTEN và kích hoạt đường dẫn tín hiệu AKT / mTOR.
Sự thảo luận
Nghiên cứu hiện tại cho thấy autophagy quá mức gây bất lợi chochức năng thậnở chuột tự hoại. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng miR-214 có liên quan đến sự tăng sinh, di căn, xâm lấn và hoạt động như một oncogene cho các tế bào và mô (19-22). Các nghiên cứu báo cáo rằng miR-214 phục vụ một lớp bảo vệ chống lại AKI thông qua quá trình apoptosis giảm, stress oxy hóa và giảm các yếu tố viêm (21,23). Nghiên cứu hiện tại đã kiểm tra thêm các cơ chế làm cơ sở cho tác dụng bảo vệ của miR-214 đối với AKI do nhiễm trùng huyết bằng cách tập trung vào sự tham gia tiềm ẩn của miR-214 trong việc điều chế autophagy. Kết quả cho thấy stress oxy hóa xảy ra trongthậnsau khi thực hiện phẫu thuật CLP. Trong khi đó, việc kích hoạt autophagy xảy ra trongthận.Tăng LC3 II / I và giảm p62 trongthậnđã được quan sát thấy sau khi điều trị bằng phẫu thuật CLP. Đúng như dự đoán, biểu hiện quá mức của miR-214 đã giảm đáng kểthậnchấn thương bệnh lý vàthậnrối loạn chức năng do nhiễm trùng huyết. Tuy nhiên, sự ức chế miR-214 cho thấy xu hướng từ bỏ bảo vệ ngược lại. Ngoài ra, tác dụng bảo vệ của Ad-miR-214 được tăng cường bởi chất ức chế PTEN.
Trong một tự hoạithận, sự thổi phồng quá mức đi kèm với sự gia tăng lớn trong việc sản xuất ROS và một số lượng lớn ROS gây ra những thay đổi trong cấu trúc ty thể và làm suy yếu chức năng ty thể, khiến cơ thể rơi vào vòng luẩn quẩn làm trầm trọng thêmthậnthiệt hại (24,25). Do đó, stress oxy hóa có thể là một trong những cơ chế bệnh lý chính của AKI do nhiễm trùng huyết. Nghiên cứu hiện tại đã cung cấp thêm bằng chứng chứng minh stress oxy hóa quá mức, được chỉ ra bằng cách tăng sản xuất MDA và giảm hoạt động SOD trongthậncác mô sau phẫu thuật CLP. Hơn nữa, người ta thấy rằng sự biểu hiện quá mức của miR-214 có thể bảo vệthậnchống lại tổn thương oxy hóa do CLP gây ra, có liên quan đến ức chế tự thực bào. Điều này phù hợp với các nghiên cứu trước đây rằng miR-214 bảo vệ các tế bào và mô khác nhau chống lại stress oxy hóa (26,27).
Autophagy đóng vai trò như một 'con dao hai lưỡi' trong sự phát triển của nhiễm trùng huyết: Autophagy cơ bản có thể phát huy tác dụng bảo vệ bằng cách loại bỏ các protein oxy hóa độc hại, nhưng tự thực bào quá mức có thể dẫn đến chết tế bào tự thực bào dưới áp lực nghiêm trọng, chẳng hạn như phun trào ROS (28,29). Nó đã được chứng minh rằng autophagy được kích hoạt ban đầu trong nhiễm trùng huyết, tiếp theo là giai đoạn rối loạn chức năng tiếp theo do chết tế bào tự thực bào (30), làm nặng thêm tổn thương oxy hóa do nhiễm trùng huyết gây ra. Trong nghiên cứu hiện tại, chất ức chế PTEN hoặc biểu hiện quá mức miR-214 cho thấy sự bảo vệ chống oxy hóa ở những con chuột được điều trị CLP. Tuy nhiên, sự ức chế miR-214 cho thấy xu hướng ngược lại với việc bảo vệ chống oxy hóa. Vì vậy, autophagy quá mức hoặc không đầy đủ có thể gây ratổn thương thận; cả hai đều không lành mạnh và cuối cùng gây ra chết tế bào. Do đó, giữ mức độ autophagy vừa phải là chìa khóa để làm giảm tổn thương oxy hóa trong tình trạng nhiễm trùng.
CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN CƠN ĐAU THẬN / THẬN
Bằng chứng tích lũy đã chỉ ra rằng miR-214 ức chế autophagy trong các tế bào và mô khác nhau (31-33). Trong nghiên cứu hiện tại, biểu hiện quá mức của miR-214 đã được tìm thấy để ức chế autophagy do CLP gây ra trongmô thận,như được chỉ ra bởi những thay đổi trong các dấu hiệu protein, chẳng hạn như LC3-II / I và p62. Hơn nữa, kết quả đã chứng minh rằng sự biểu hiện quá mức của miR-214 làm giảm tổn thương oxy hóa do CLP gây ra bằng cách ức chế autophagy quá mức. Nghiên cứu hiện tại cũng đã điều tra các cơ chế phân tử mà miR-214 điều chỉnhthậnautophagy trong AKI do nhiễm trùng huyết. PTEN / AKT / mTOR là một con đường tín hiệu quan trọng điều chỉnhthậnautophagy (34,35) và đóng vai trò then chốt trong AKI do nhiễm trùng huyết, và PTEN là chất ức chế âm tính với đường truyền tín hiệu PI3K/AKT/mTOR. Các nghiên cứu trước đây báo cáo rằng miR-214 có thể điều chỉnh autophagy thông qua đường dẫn tín hiệu PI3K / AKT / mTOR trong các mô hình khác nhau (36-38). Ma et al (39 tuổi) phát hiện ra rằng miR-214 có thể điều chỉnh autophagy ở thận tiểu đường. Do đó, người ta đã đưa ra giả thuyết rằng tác động của miR-214 đối với AKI do CLP gây ra có thể liên quan đến việc điều chỉnh con đường PTEN / AKT / mTOR. Đáng chú ý, kết quả của nghiên cứu hiện tại cho thấy phẫu thuật CLP làm tăng đáng kể mức độ PTEN nhưng làm giảm mức độ p-AKT và p-mTOR, chỉ ra rằng phẫu thuật CLP đã làm bất hoạt con đường AKT / mTOR. Ngoài ra, sự biểu hiện quá mức của miR-214 đã kích hoạt con đường AKT / mTOR bằng cách im lặng PTEN trong tự động thực bào do CLP gây ra trongthậnMô. Tuy nhiên, anti-miR-214 không ức chế đáng kể sự biểu hiện của mTOR trong các phân tích western blot. Do đó, RT-qPCR đã được sử dụng thêm để xác định sự biểu hiện mRNA của các gen liên quan đến con đường tín hiệu PTEN / AKT / mTOR. Nghiên cứu hiện tại đã xác định rằng miR-214 đã giảm quy định biểu hiện của PTEN và kích hoạt đường dẫn tín hiệu AKT / mTOR để ức chế autophagy. Tuy nhiên, các nghiên cứu toàn diện hơn nữa nên được thực hiện để có được các chi tiết bổ sung liên quan đến cơ chế củathậnautophagy trong điều kiện tự hoại.
Để kết luận, kết quả của nghiên cứu hiện tại cho thấy miR-214 đóng vai trò bảo vệ chống lại nhiễm trùng huyết gây rachấn thương thậnbằng cách giảm stress oxy hóa và ức chế autophagy thông qua việc điều chỉnh con đường PTEN / AKT / mTOR. Các fifinding hiện tại gợi ý rằng miR-214 có thể là mục tiêu điều trị tiềm năng cho AKI do nhiễm trùng huyết. Tuy nhiên, nghiên cứu hiện tại đã sử dụng chuột 6-8 tuần tuổi, vì vậy cần nghiên cứu thêm về cơ chế của miR-214 ở chuột trưởng thành.