Điều chế con đường truyền tín hiệu của thụ thể Aryl Hydrocarbon tác động đến sự nhân lên của virus Junín Phần 1

Trừu tượng:

Virus Junín (JUNV), một thành viên của họ Arenaviridae, là tác nhân gây bệnh sốt xuất huyết Argentina, một bệnh lưu hành ở vùng nông thôn của Argentina thiếu hóa trị liệu cụ thể. Thụ thể Aryl hydrocarbon (AHR) được thể hiện trong một số mô của động vật có vú và đã được chỉ định là cảm biến của các phối tử từ các nguồn khác nhau và là bộ điều biến của phản ứng miễn dịch tế bào.

Virus Junin là một loại virus hiếm ảnh hưởng đến hệ thống miễn dịch của con người và gây ra phản ứng miễn dịch nghiêm trọng. Tuy nhiên, miễn dịch không phải là chiến lược duy nhất thất bại trong việc chống lại vi rút Junin.

Đầu tiên, nghỉ ngơi và ngủ đủ giấc là điều quan trọng để giữ cho hệ thống miễn dịch của bạn khỏe mạnh. Trong khi ngủ, cơ thể giải phóng các chất gọi là cytokine giúp hệ thống miễn dịch phản ứng hiệu quả hơn với vi-rút và các mối đe dọa bên ngoài khác.

Thứ hai, thói quen ăn uống lành mạnh cũng là chìa khóa để cải thiện khả năng miễn dịch. Ăn thực phẩm giàu vitamin C và D, chẳng hạn như trái cây họ cam quýt và nấm, có thể giúp tăng cường phản ứng miễn dịch của cơ thể.

Ngoài ra, tập thể dục vừa phải cũng có thể cải thiện khả năng miễn dịch. Tập thể dục đúng cách có thể làm tăng số lượng tế bào bạch cầu trong cơ thể, từ đó nâng cao khả năng của hệ thống miễn dịch.

Cuối cùng, một trạng thái tinh thần tốt cũng rất quan trọng đối với sức khỏe của hệ thống miễn dịch. Căng thẳng và lo lắng có thể ảnh hưởng đến phản ứng miễn dịch của cơ thể, vì vậy điều quan trọng là phải giữ tinh thần thoải mái và tích cực.

Nói tóm lại, mặc dù vi rút Junin có tác động đến hệ thống miễn dịch, nhưng bằng cách cải thiện lối sống và duy trì thái độ tích cực, chúng ta có thể cải thiện khả năng miễn dịch cũng như ngăn chặn và ứng phó hiệu quả với sự tấn công của vi rút. Từ quan điểm này, chúng ta cần cải thiện khả năng miễn dịch của mình. Cistanche có thể cải thiện đáng kể khả năng miễn dịch, bởi vì tro thịt chứa nhiều thành phần hoạt tính sinh học, chẳng hạn như polysacarit, hai loại nấm, Huang Li, v.v. Những thành phần này có thể kích thích hệ thống miễn dịch của nhiều loại tế bào trong hệ thống, tăng hoạt động miễn dịch của chúng.

Nhấp vào bổ sung cistanche Deserticola

Thật thú vị, các nghiên cứu gần đây đã gợi ý rằng việc kích hoạt hoặc làm suy yếu đường dẫn tín hiệu AHR có thể đóng một vai trò trong kết quả của các bệnh nhiễm vi-rút khác nhau ở người. Trong báo cáo hiện tại, tác dụng của điều chế dược lý của AHR đối với nhiễm JUNV trong ống nghiệm đã được phân tích. Một sàng lọc microarray ban đầu cho thấy con đường AHR đã được biểu hiện quá mức trong các tế bào gan bị nhiễm JUNV.

Đồng thời, sự lây nhiễm của các tế bào Vero và Huh-7 với các chủng JUNV IV4454 và Candid#1 đã bị ức chế đáng kể theo cách phụ thuộc vào liều lượng bằng cách điều trị bằng CH223191, một chất đối kháng AHR cụ thể, được phát hiện bằng các thử nghiệm lây nhiễm, thực tế- thời gian RT-PCR và phát hiện miễn dịch huỳnh quang protein virus. Hơn nữa, vai trò tiền virus của AHR trong nhiễm trùng JUNV dường như không phụ thuộc vào con đường IFN-I. Những phát hiện của chúng tôi ủng hộ các quan điểm đầy hứa hẹn về điều chế dược lý của AHR như một mục tiêu tiềm năng để kiểm soát AHF.

từ khóa:

Aryl hydrocacbon thụ thể; vi rút Junin; vi rút đấu trường; sốt xuất huyết Argentina; mục tiêu điều trị của vật chủ.

1. Giới thiệu

Hiện tại, ngày càng có nhiều bằng chứng ủng hộ rằng thụ thể aryl hydrocarbon (AHR) là một bộ điều biến quan trọng của phản ứng miễn dịch của vật chủ và đặc điểm này góp phần vào kết quả lâm sàng khác biệt của nhiễm trùng ở cấp độ cá nhân và dân số [1,2]. AHR là một thụ thể tế bào chất được biểu hiện phổ biến trong các mô của động vật có vú, hoạt động như một cảm biến của nhiều loại phối tử nội sinh và ngoại sinh có nguồn gốc khác nhau như chất ô nhiễm, chế độ ăn uống, hệ vi sinh vật và sự trao đổi chất của vật chủ [3–5].

Thật vậy, người ta cho rằng AHR có tác động lớn đến sự tương tác giữa các yếu tố môi trường và nhiễm virus [1,2]. Sau khi AHR nhận ra một phân tử phối tử, nó sẽ được chuyển vị trí vào nhân nơi nó dị hóa với bộ chuyển vị hạt nhân thụ thể aryl hydrocarbon và điều chỉnh sự biểu hiện của các gen chuyển hóa xenobiotic (CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1).

AHR cũng có thể tương tác với các yếu tố phiên mã khác, chẳng hạn như NF-kB, để điều chỉnh một loạt các đường dẫn tín hiệu, bao gồm cả những đường dẫn liên quan đến phản ứng miễn dịch [6–8]. AHR có thể điều chỉnh sự biểu hiện của gen điều hòa miễn dịch và thay đổi con đường biệt hóa của tế bào đuôi gai và tế bào T gây viêm [9–11].

Các nghiên cứu gần đây do nhóm nghiên cứu của chúng tôi thực hiện đã chứng minh rằng việc kích hoạt đường dẫn tín hiệu AHR đóng vai trò hỗ trợ vi rút trong Zika (ZIKV), sốt xuất huyết (DENV), [12] và hội chứng hô hấp cấp tính nặng do vi rút corona 2 (SARS-CoV{{ 4}}) nhiễm trùng [13]. Lưu ý, người ta đã xác nhận rằng sự ức chế AHR dẫn đến sự nhân lên của vi-rút giảm trong các mô hình vi-rút này, cho thấy AHR đại diện cho một chiến lược chống vi-rút đầy hứa hẹn.

Virus Junín (JUNV) là một loại virus có bộ gen RNA phân đoạn được bao bọc từ họ Arenaviridae [14]. Mỗi đoạn RNA mã hóa cho hai loại protein ngược chiều nhau. Một mặt, đoạn lớn (L RNA) mã hóa cho RNA polymerase phụ thuộc RNA (L) và protein nền (Z).

Mặt khác, đoạn nhỏ (S RNA) mã hóa cho nucleoprotein (NP) và cho tiền chất glycoprotein (GPC), được phân cắt bởi các protease để tạo ra ba tiểu đơn vị (GP1, GP2 và SSP peptide tín hiệu) là liên kết với nhau để tạo thành phức hợp glycoprotein [14].

JUNV là tác nhân gây bệnh sốt xuất huyết Argentina (AHF) [15], một bệnh lưu hành ảnh hưởng đến dân số lao động nông thôn ở vùng Pampa ẩm ướt của Argentina. Lưu ý, một đặc điểm đặc trưng của AHF là một loạt các triệu chứng lâm sàng do bệnh nhân nhiễm bệnh biểu hiện. Bệnh nhẹ hoặc không có triệu chứng, với các triệu chứng giống như cúm, xảy ra ở 70–80 phần trăm các ca nhiễm trùng. Tuy nhiên, các trường hợp nghiêm trọng liên quan đến biến chứng xuất huyết và thần kinh với tỷ lệ tử vong từ 20 đến 30% ở bệnh nhân nhập viện [15].

Điều quan trọng là vắc-xin sống giảm độc lực có tên là Candid#1 đã được chứng minh là có hiệu quả cao trong việc ngăn ngừa các trường hợp nặng của AHF [15,16]. Tuy nhiên, phương pháp điều trị duy nhất chống lại căn bệnh này là sử dụng huyết tương miễn dịch từ những bệnh nhân đang hồi phục; một liệu pháp đã được chứng minh là chỉ làm giảm số ca tử vong nếu được thực hiện trong vòng 8 ngày sau khi xuất hiện các triệu chứng đầu tiên [17].

Mặc dù trong những năm gần đây, nhiều bằng chứng đã được thu thập về tác dụng của AHR trong quá trình lây nhiễm, nhưng vẫn chưa có bằng chứng rõ ràng về vai trò của nó trong quá trình lây nhiễm vi rút Arena [2].

Vì người dân nông thôn thường xuyên tiếp xúc với các phối tử AHR, chẳng hạn như các chất gây ô nhiễm từ ngành nông nghiệp như hóa chất nông nghiệp, thuốc trừ sâu và các sản phẩm phụ từ quá trình đốt cháy nhiên liệu hóa thạch [18], chúng tôi đã đánh giá trong nghiên cứu này về tác động của điều chế dược lý AHR trong ống nghiệm đối với phản ứng của tế bào đối với nhiễm trùng JUNV và khả năng sử dụng AHR như một mục tiêu ứng cử viên để can thiệp điều trị bệnh AHF.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. dòng tế bào

Các dòng tế bào sau đã được sử dụng: Huh-7 (JCRB Cell Bank #0403) và HepG-2 ATCC HB8065, hai dòng tế bào ung thư biểu mô có nguồn gốc từ tế bào gan người; Vero ATCC CCL-81, một dòng tế bào biểu mô thận có nguồn gốc từ khỉ. Mỗi dòng tế bào được nuôi cấy trong Môi trường thiết yếu tối thiểu (MEM) của Eagle (Gibco, ThermoFisher Khoa học, Waltham, MA, Hoa Kỳ) được bổ sung 5% huyết thanh bê sơ sinh (NBCS) (Gibco, ThermoFisher Khoa học, Waltham, MA, Hoa Kỳ) và được bổ sung với 50 µg/mL gentamycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 1 mM natri pyruvate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 2 mM L-glutamine (Gibco, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) và được đệm bằng HCl/NaHCO3. Các dòng tế bào được nuôi cấy và duy trì ở 37 ◦C với môi trường 5% CO2.

2.2. Chủng virus

Các chủng vi-rút sau đây đã được sử dụng: chủng IV4454 giảm độc lực tự nhiên thu được từ một trường hợp AHF nhẹ ở người [19] và chủng Candid#1 giảm độc lực bằng vắc-xin [20]. Các tế bào Vero được sử dụng cho cả việc tạo nguồn dự trữ vi rút và chuẩn độ vi rút thông qua xét nghiệm mảng bám tiêu chuẩn.

Tất cả công việc với các tác nhân truyền nhiễm được thực hiện trong các cơ sở An toàn sinh học cấp 2 và được Văn phòng An toàn và Sức khỏe Môi trường tại Trường Khoa học, Đại học Buenos Aires phê duyệt. Tất cả nhân viên tham gia vào quy trình lây nhiễm đã được tiêm vắc-xin Candid-1 do Instituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas Tiến sĩ JI Maiztegui (Pergamino, Buenos Aires, Argentina) cung cấp.

2.3. Phân tích vi mô

Tổng cộng có 5 × 105 tế bào HepG2 được cấy vào các bình nuôi cấy 25 cm2 và bị nhiễm JUNV IV4454 ở bội số nhiễm (MOI) là 1 hoặc nhiễm giả. RNA được chiết xuất và tinh chế bằng cách sử dụng RNAeasy (Qiagen, Hilden, Đức) sau 24 và 48 giờ sau khi nhiễm bệnh (pi). Nồng độ RNA được đo bằng Nanodrop. Hồ sơ biểu hiện gen của các tế bào HepG2 được đặc trưng bằng cách sử dụng phân tích microarray (Affymetrix Human U133 Plus 2.0 GeneChips) để xác định các gen chủ được điều hòa phiên mã bởi sự lây nhiễm.

Tổng số gen chủ được điều chỉnh đáng kể bởi sự lây nhiễm được tính toán cho từng thời điểm bằng cách xác định các gen cho thấy, ít nhất, sự thay đổi lần thứ 1.6-trong biểu hiện và xác suất 95 phần trăm được biểu hiện khác biệt (p {{ 3}}.05).

Phần mềm WebGestalt (http://www.webgestalt.org, được truy cập vào ngày 3 tháng 7 năm 2020), sử dụng cơ sở dữ liệu Wikipathways đã được sử dụng cho Gene Onology và các phân tích biểu hiện quá mức của lộ trình. Các thử nghiệm lặp lại đã được thực hiện vào các ngày khác nhau (n=3 thử nghiệm độc lập cho mỗi điều kiện).

2.4. Hợp chất phân tử nhỏ

Chất đối kháng cạnh tranh tổng hợp dành riêng cho AHR CH223191, 1-Metyl-N-[2-metyl4-[2-(2-metyl phenyl)diazenyl]phenyl]{ {9}}H-pyrazole-5-carboxamit (Tocris Bioscience, Bristol, Vương quốc Anh), được hòa tan trong dimethyl sulfoxide (DMSO) và được sử dụng ở nồng độ 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40 và 80 µM.

Chất chuyển hóa tryptophan L-kynurenine, (2S)-2-Amino-4-(2-aminophenyl)-4-oxobutanoic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) là được hòa tan trong DMSO và được sử dụng ở nồng độ 2,5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 và 320 µM.

Tất cả các phương pháp điều trị được thực hiện trong điều kiện không có ánh sáng, vì các hợp chất này có tính nhạy cảm với ánh sáng.

2.5. Xét nghiệm khả năng sống của tế bào

Để xác định khả năng tồn tại của tế bào, các lớp đơn lớp tế bào Huh-7 và Vero được nuôi cấy trong các đĩa 96 giếng trong 24 giờ trong MEM 5% NBCS. Các đơn lớp tế bào ở mức hợp lưu 90 phần trăm được xử lý với các nồng độ khác nhau của CH223191 (1,25 µM đến 80 µM) và kynurenine (5 µM đến 320 µM) trong 72 giờ. Mock được xử lý với cùng nồng độ DMSO như liều xử lý phối tử cao nhất và được coi là 100% khả năng sống của tế bào.

Tất cả các phương pháp điều trị đã được thực hiện trong bốn lần. Khả năng tồn tại của tế bào được đánh giá bằng 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) (Sigma-Aldrich, St .Louis, MO, USA) xét nghiệm. Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 570 nm trong đầu đọc vi bản FLUOstar OPTIMA. Phần trăm khả năng sống của tế bào được xác định bằng cách tương đối hóa kết quả độ hấp thụ xử lý bằng cách sử dụng các giá trị độ hấp thụ Mock.

Ngoài ra, khả năng tăng trưởng và hình thái của các tế bào được xử lý đã được nghiên cứu dưới kính hiển vi ánh sáng. Ảnh được chụp vào lúc 72 giờ bằng kính hiển vi Nikon Eclipse TS100; độ phóng đại: 100×; NA: 0,25.

2.6. Điều trị và nhiễm virus

Các lớp đơn lớp tế bào Vero và Huh{{0}} đã được xử lý trước bằng CH223191 và kynurenine được pha loãng trong MEM 1,5% NBCS trong 1 giờ hoặc 24 giờ, tương ứng, ở 37 ◦C. CH223191 được sử dụng ở nồng độ nằm trong khoảng từ 1,25 đến 20 µM, trong khi kynurenine được sử dụng ở nồng độ nằm trong khoảng từ 5 đến 80 µM. Sau đó, lây nhiễm virus được thực hiện với chủng IV4454 hoặc Candid#1 ở MOI là 0,5. Sau 1 giờ, chất cấy được loại bỏ và các tế bào được tiếp xúc với cả hai hợp chất trong 48 giờ ở nồng độ đã đề cập. Vào lúc 48 giờ, chất nổi trên bề mặt pi đã được thu thập để xét nghiệm mảng bám và các đơn lớp tế bào được xử lý cho phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp hoặc RT-qPCR.

2.7. Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp

Huh-7 đơn lớp được xử lý bằng CH223191 hoặc kynurenine và bị nhiễm JUNV như đã đề cập ở trên đã được cố định ở 48 giờ pi bằng metanol trong 10 phút ở −20 ◦C, rửa ba lần bằng PBS và được bảo quản trong PBS mới ở 4 ◦C cho đến khi chế biến.

Các kháng thể sau đã được sử dụng: kháng thể đơn dòng kháng NP sơ cấp của chuột (1:200) (NA05-AG12) [21] và kháng thể thứ cấp Alexa Fluor 488 kết hợp với dê kháng chuột (1:200) (A{{ 10}}) (ThermoFisher Khoa học, Waltham, MA, Hoa Kỳ). Nhân tế bào được nhuộm bằng 40,6-diamidino-2- phenylindole (DAPI) (1:1000) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Dữ liệu chụp ảnh và kính hiển vi thu được bằng cách sử dụng kính hiển vi huỳnh quang Olympus IX71 có gắn máy ảnh QImaging Exi-Aqua (kích thước điểm ảnh: 6,45 µm; diện tích bộ tách sóng quang: 1392 × 1040 pixel2 ).

Định lượng dữ liệu huỳnh quang được thực hiện bằng phần mềm Fiji (phiên bản 1.53v) (Viện Y tế Quốc gia, Bethesda, MD, Hoa Kỳ). Định lượng thủ công nhân nhuộm màu DAPI và tế bào dương tính với NP được thực hiện thủ công thông qua plugin bộ đếm tế bào có trong phần mềm Fiji (phiên bản 1.53v). Các tế bào được coi là dương tính nếu có thể phát hiện nhuộm kháng nguyên virus NP. Tỷ lệ tế bào dương tính với NP được biểu thị bằng tỷ lệ giữa các tế bào dương tính với NP và tổng số ô trong mỗi trường, sau đó tỷ lệ phần trăm trung bình được xác định và trình bày.

Cường độ huỳnh quang của các tế bào dương tính với NP thu được bằng cách đo giá trị xám trung bình của từng tế bào và trừ đi huỳnh quang nền. Các ổ virus được phân định bằng cách xem xét các nhóm tế bào dương tính với NP được bao quanh bởi các tế bào âm tính với NP. Các tiêu điểm của virus được đếm trên 3 hình ảnh khác nhau từ 3 trường được chọn ngẫu nhiên khác nhau và kích thước tiêu điểm trung bình được xác định bởi số lượng tế bào hình thành chúng.

2.8. Phát hiện axit nucleic của virus

Theo hướng dẫn của nhà sản xuất, việc chiết xuất axit nucleic được thực hiện từ các đơn lớp tế bào bị nhiễm bệnh bằng cách sử dụng bộ K1501 của Highway ADN/ARN PuriPrep-VIRUS (Inbio Highway, Buenos Aires, Argentina). Tải lượng virus JUNV RNA và định lượng phiên mã tế bào được thực hiện bằng RT-qPCR. Phiên mã ngược được thực hiện bằng cách sử dụng đoạn mồi ngẫu nhiên và phiên mã ngược của virus gây bệnh bạch cầu ở chuột Moloney (M-MLV RT).

Để khuếch đại đoạn, các đoạn mồi sau đã được sử dụng: JUNV-np (Chuyển tiếp: 5 0 -GGC ATC CTT CAG AAC ATC-30, Đảo ngược: 50 -CGC ACA GTG GAT CCT AGGC{{4} } ), ahr (Chuyển tiếp: 50 -ATC CTT CCA AGC GGC ATA GAG ACC-30; Đảo ngược: 50 -CAA AGA AGC TCT TGG CTC TCA GG-30 ), cyp1a1 ( Chuyển tiếp: 50 -TTCCGACACTCTTCCTTCGT-30; Đảo ngược: 50 -ATGGTTAGCCCATAGATGGG-30 ), -actin (Chuyển tiếp: 50 -TTA GTT GCG TTA CAC CCT TTC TTG{{17 }}; Đảo ngược: 50 -TCA CCT TCA CCG TTC CAG TTT-30 ). Chi tiết chu trình PCR như sau: khử tự nhiên ban đầu 2 phút ở 95 ◦C; 45 chu kỳ khuếch đại bao gồm 30 giây ở 95 ◦C, 1 phút ở 58 ◦C và 1 phút ở 72 ◦C; chu kỳ cuối cùng là 5 phút ở 72 ◦C; cuối cùng, các đường cong nóng chảy đã được thực hiện. Việc phát hiện được thực hiện bằng thiết bị MyiQ2 (Phòng thí nghiệm Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Kết quả được báo cáo là 2−∆∆Ct (Thay đổi số lần) và được chuẩn hóa bằng cách sử dụng -actin làm gen giữ nhà.

2.9. xét nghiệm mảng bám

Sản lượng virus được xác định bằng xét nghiệm mảng bám tiêu chuẩn. Các chất nổi trên bề mặt tế bào đã được thu thập và pha loãng nối tiếp đã được chuẩn bị để lây nhiễm các đơn lớp tế bào Vero trong 1 giờ ở 37 ◦C. Sau khi virus hấp thụ, chất cấy được loại bỏ, MEM 5% NBCS được bổ sung 0.7% methylcellulose được thêm vào và các tế bào được ủ trong 1 tuần ở 37 ◦C trong tủ ấm 5% CO2. Sau đó, các đơn lớp tế bào được cố định bằng 10% formaldehyde, rửa sạch và nhuộm màu tím pha lê. Hiệu giá virus được tính toán sau khi định lượng đơn vị hình thành mảng bám (PFU).

2.10. Phân tích thống kê

Phân tích thống kê microarray được thực hiện bằng phần mềm WebGestalt (//www. webgestalt.org/, được truy cập vào ngày 3 tháng 7 2020). Dữ liệu được mô tả là trung bình ± SD ANOVA một chiều với bài kiểm tra sau đại học của Dunnett bằng GraphPad Prism 8 (phiên bản 8.0.1) cho Windows 11 (Phần mềm GraphPad, San Diego, CA, Hoa Kỳ) đã được thực hiện để đánh giá ý nghĩa thống kê. p Nhỏ hơn hoặc bằng 0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê.

For more information:1950477648nn@gmail.com