Sự Tiến Hóa Phân Tử Của Protein Diệt Khuẩn/Tăng Tính Thấm (BPIFA1) Điều Chỉnh Các Phản Ứng Miễn Dịch Bẩm Sinh Ở Động Vật Có Vú Phần 1

Trừu tượng:

Protein diệt khuẩn/tăng tính thấm, một yếu tố chính của hệ thống miễn dịch bẩm sinh của động vật có vú, tham gia vào quá trình bảo vệ miễn dịch tự nhiên chống lại vi khuẩn xâm nhập. BPIFA1 đóng góp tích cực vào việc bảo vệ vật chủ thông qua nhiều cơ chế, chẳng hạn như kháng khuẩn, chất hoạt động bề mặt, kiểm soát chất lỏng trên bề mặt đường thở và các hoạt động điều hòa miễn dịch. Tuy nhiên, lịch sử tiến hóa và lực chọn lọc trên gen BPIFA1 ở động vật có vú trong quá trình tiến hóa thích nghi vẫn chưa được hiểu rõ. Nghiên cứu này đã kiểm tra gen BPIFA1 của con người so với gen của các loài động vật có vú khác để ước tính áp lực chọn lọc bắt nguồn từ quá trình tiến hóa thích nghi. Để đánh giá liệu lựa chọn tích cực có xảy ra hay không, chúng tôi đã sử dụng một số thử nghiệm khả năng khác nhau (M1 so với M2 và M7 so với M8).

Tỷ lệ của các vị trí được chọn tích cực là đáng kể, với giá trị nhật ký khả năng là 93,63 đối với protein BPIFA1. Máy chủ Lựa chọn đã được sử dụng trên cùng một bộ dữ liệu để xác nhận lại lựa chọn tích cực cho các trang web cụ thể bằng cách sử dụng mô hình Kết hợp Cơ học-Thực nghiệm, do đó cung cấp thêm bằng chứng hỗ trợ cho kết quả lựa chọn tích cực. Đã có bằng chứng thuyết phục về các tín hiệu chọn lọc tích cực trong gen BPIFA1 của các loài động vật có vú, điều này có ý nghĩa hơn đối với các dấu hiệu chọn lọc và tạo tín hiệu.

Protein BPIFA1, còn được gọi là LPLUNC1 hoặc Gen 6 liên quan đến ung thư vòm họng (NAG6), là một loại protein được biểu hiện cao ở đường hô hấp trên và khoang miệng. Protein BPIFA1 có liên quan chặt chẽ đến khả năng miễn dịch.

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng protein BPIFA1 có tác dụng kháng khuẩn và điều hòa miễn dịch. Protein BPIFA1 có thể liên kết với Escherichia coli xâm lấn và phá hủy màng tế bào của nó, do đó đóng vai trò kháng khuẩn. Ngoài ra, protein BPIFA1 đóng vai trò điều hòa miễn dịch bằng cách kích hoạt các con đường thụ thể giống như Toll (TLR) 4 và TLR2, thúc đẩy phản ứng viêm, chết theo chương trình và kích hoạt tế bào miễn dịch.

Mối quan hệ giữa protein BPIFA1 và các bệnh về đường hô hấp cũng đã được nghiên cứu rộng rãi. Ví dụ, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng mức độ biểu hiện của protein BPIFA1 trong các bệnh về đường hô hấp như hen phế quản và bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính (COPD) có liên quan chặt chẽ đến mức độ nghiêm trọng của bệnh. Đặc biệt trong điều kiện nhiễm trùng, mức độ biểu hiện của protein BPIFA1 có thể tăng lên đáng kể, do đó tham gia vào quá trình điều hòa phản ứng miễn dịch của hệ hô hấp và cân bằng hệ thực vật.

Do đó, không thể bỏ qua vai trò của protein BPIFA1 trong hệ thống miễn dịch và mối quan hệ của nó với các bệnh về đường hô hấp và nhiễm trùng cần được nghiên cứu sâu hơn. Do đó, chúng ta cần đặc biệt chú ý đến việc cải thiện khả năng miễn dịch của mình. Cistanche có tác dụng đáng kể trong việc cải thiện khả năng miễn dịch. Các polysacarit trong thịt có thể điều chỉnh phản ứng miễn dịch của hệ thống miễn dịch của con người, cải thiện khả năng căng thẳng của các tế bào miễn dịch và tăng cường các tế bào miễn dịch. tác dụng diệt khuẩn.

Nhấn vào đây để biết toàn bộ thực phẩm cistanche

Chúng tôi đã thực hiện các thử nghiệm xác suất so sánh các mô hình khác nhau dựa trên tỷ lệ dN/dS để nhận ra các codon cụ thể dưới áp lực chọn lọc tích cực. Chúng tôi đã xác định các vị trí được chọn tích cực trong miền LBP-BPI của protein BPIFA1 trong bộ gen của động vật có vú, bao gồm miền liên kết lipid với mức độ chọn lọc rất cao đối với DPPC. BPIFA1 kích hoạt hệ thống miễn dịch bẩm sinh của đường hô hấp trên để đáp ứng với nhiều tín hiệu di truyền trong bộ gen của động vật có vú. Những phát hiện này làm nổi bật những tiến bộ tiến hóa trong các tác dụng điều hòa miễn dịch đóng vai trò quan trọng trong khả năng phòng vệ kháng khuẩn và kháng vi-rút của các loài động vật có vú.

từ khóa:

BPIFA1; diệt khuẩn; hệ miễn dịch; tiến hóa phân tử; chọn lọc tích cực.

1. Giới thiệu

Protein tăng tính thấm diệt khuẩn (BPI) là một loại protein kháng khuẩn hiệu quả cao, liên kết và vô hiệu hóa lipopolysacarit được giải phóng từ màng ngoài của vi khuẩn [1]. Gen chứa nếp gấp BPI A thành viên 1 (BPIFA1) được biết là có tác động đến hệ thống miễn dịch tại chỗ và những tác động này có khả năng ảnh hưởng đến sự phát triển và xâm lấn của vi sinh vật [2]. Một trong những cơ chế tiềm ẩn làm nền tảng cho mối liên kết này là khả năng BPIFA1 tăng cường khả năng hấp thụ vi khuẩn của các tế bào thực bào và khả năng tiêu diệt chúng [3].

Mặc dù chúng có độ tương tự trình tự tối thiểu, BPI có hai miền áp dụng nếp gấp cấu trúc giống nhau [1,4]. Sự xâm lấn của vi khuẩn gram âm dẫn đến phản ứng tích hợp của vật chủ được tạo điều kiện thuận lợi nhờ sự hiện diện của protein liên kết với lipopolysacarit (LBP). LBP là một protein liên kết nội độc tố được liên kết chặt chẽ và phối hợp với BPI [5]. BPIFA1 kiểm soát hệ vi sinh vật niêm mạc và tín hiệu interferon cơ bản. SPLUNC1 (trước đây gọi là BPIFA1) là một thành viên gia đình chứa protein gấp nếp có hoạt tính kháng khuẩn, chất hoạt động bề mặt và điều hòa miễn dịch, tất cả đều góp phần bảo vệ vật chủ. Hệ thống hô hấp là nơi biểu hiện chính của nó [6]. SPLUNC1, dạng tương đồng của con người với gen PLUNC của chuột, thể hiện kiểu biểu hiện tương tự ở đường hô hấp trên và vùng mũi họng giống như dạng tương đồng của chuột. Hành động kháng khuẩn chống lại vi khuẩn gram âm được hiển thị bởi protein kháng khuẩn được mã hóa [5]. Trong ung thư phổi không phải tế bào nhỏ, nó có thể đóng vai trò là dấu hiệu phân tử tiềm năng để xác định vi di căn. Nhiều biến thể phiên mã đã được phát hiện là kết quả của sự ghép nối thay thế của vùng 3' chưa được dịch mã; tuy nhiên, bản chất đầy đủ của chỉ ba trong số các biến thể phiên mã này được hiểu [7].

Cả chuột và người đều có mức độ biểu hiện gen BPIFA1 đáng kể ở phần trên của khí quản, nhưng biểu hiện này giảm dần theo khoảng cách từ khí quản, đạt mức tối thiểu tại điểm phân nhánh của phế quản chính và trở nên không thể phát hiện được ở ngoại vi của phổi. [số 8]. Các nghiên cứu biểu hiện gen mở rộng ở chuột và người đã thất bại trong việc phát hiện BPIFA1 trong mô phổi ngoại biên [9]. Ngoại trừ mức độ biểu hiện mRNA của BPIFA1 rất thấp trong tuyến ức chuột, tim chuột và niêm mạc khứu giác, BPIFA1 không được biểu hiện ở bất kỳ cơ quan hoặc mô nào bên ngoài hệ hô hấp của loài gặm nhấm [10]. Không có dấu hiệu cho thấy BPIFA1 mRNA có trong bất kỳ mô nào sau đây của con người: tim, gan, não, dạ dày, ruột non, nhau thai, cơ xương, tuyến tụy, lá lách, hạch bạch huyết bình thường, tế bào lympho ngoại vi, tuyến tiền liệt, tinh hoàn hoặc buồng trứng [11].

Sự biểu hiện của BPIFA1 mRNA tuân theo một mô hình phân phối có thể so sánh cao trong các mô phôi và mô trưởng thành. Mô hình này được quan sát thấy ở cả hai loại mô [1]. Sự biểu hiện quá mức của BPIFA1 ở chuột biến đổi gen đã tạo ra các đại thực bào phế nang với quá trình opsonin hóa và thực bào tăng cường của các ống nano carbon trong một mô hình viêm đường thở có kiểm soát [12]. Ngoài ra, các vi khuẩn nano gram âm cộng sinh đã được chứng minh là đồng địa hóa với BPIFA1 trong các tế bào biểu mô của các mô ung thư vòm họng [13]. Các mẫu được lấy từ những bệnh nhân trước đây được xác định là mắc ung thư biểu mô vòm họng. Những phát hiện của một nghiên cứu gần đây cho thấy rằng sự tương tác giữa BPIFA1 và LPS không vi khuẩn có thể làm giảm phản ứng viêm của cơ thể do LPS không vi khuẩn gây ra. [1].

Phạm vi tác dụng kháng khuẩn của nó và việc bảo tồn cấu trúc của nó ở động vật có xương sống thở không khí ngụ ý rằng BPIFA1 đã phát triển để cung cấp khả năng bảo vệ vật chủ thiết yếu [14]. Tuy nhiên, do vị trí của nó trong đường thở gần và mức độ cao trong điều kiện cơ bản, BPIFA1 có thể không thể thiếu. Điều này là do tác nhân kháng vi sinh vật có nhiều ở động vật [15]. Do đó, BPIFA1 dường như có tác dụng đáng kể nhất trong việc tránh nhiễm trùng và làm sạch nó trước sự xâm nhập của mầm bệnh. Nhiễm trùng do vi khuẩn trong hệ thống hô hấp có thể được ngăn ngừa nhờ các chức năng này, có thể báo hiệu việc kích hoạt khả năng miễn dịch và cải thiện quy định của các chức năng đường thở khác [15].

Những thay đổi thích ứng để đáp ứng nhu cầu môi trường được cho là bị hạn chế bởi các yếu tố lý sinh, nhưng các khía cạnh cấu trúc của các địa điểm chứa những thay đổi thích ứng không thể dự đoán được bởi bất kỳ lý thuyết tiến hóa nào [16]. Điều này là do các hạn chế về sinh lý hạn chế các loại thay thế được phép duy trì chức năng của protein [17]. Chọn lọc tích cực có thể phổ biến hơn ở các phần protein nơi đột biến dự kiến ​​sẽ có tác động thấp hơn so với các phần khác của protein, mặc dù điều này chưa được chứng minh (ví dụ: các vị trí điều hòa dị lập thể) [18]. Tuy nhiên, các vùng chức năng dự kiến ​​sẽ vẫn được bảo tồn đáng kể trong quá trình tiến hóa, mặc dù những thay đổi thích nghi có liên quan đến việc cố định nhanh chóng các đột biến thuận lợi [19]. Quá trình tiến hóa phân tử của các chuỗi protein bị ảnh hưởng đáng kể bởi quá trình chọn lọc tự nhiên.

Những phát triển gần đây trong giải trình tự bộ gen và các phương pháp suy luận đáng tin cậy ở cấp độ phát sinh gen và quần thể đã giúp tiến hành đánh giá nhanh chóng và mạnh mẽ về tốc độ tiến hóa và sự thích nghi do chọn lọc tự nhiên thúc đẩy [20]. Ở cả cấp độ phát sinh loài và dân số, một lượng lớn công việc đã được tiến hành để xây dựng các phương pháp suy luận. Hơn nữa, khả năng tiếp cận ngày càng tăng của dữ liệu cấu trúc và chức năng protein đã cho phép các nhà nghiên cứu kiểm tra tác động của các hạn chế về cấu trúc và chức năng đối với sự tiến hóa và thích ứng của các chuỗi protein [16]. Do các giới hạn được áp đặt bởi cấu trúc và chức năng của chúng, tốc độ tiến hóa và thích nghi là khác nhau đối với các protein và vị trí khác nhau trong cùng một protein [19].

Phần lớn các chức năng của tế bào được đan xen phức tạp với các mạng lưới điều hòa biểu hiện gen cho phép các sinh vật chịu được mức độ nhiễm trùng cao hơn hoặc giảm thiểu tác động của những nhiễm trùng đó [21]. Hầu hết các thành phần tạo nên sinh lý tế bào có liên quan mật thiết đến các hệ thống điều hòa biểu hiện gen này, thường là những thích nghi tiến hóa cũ [22]. Các cơ chế này đã thu hút một mức độ quan tâm đáng kể trong nghiên cứu đã sử dụng một tập hợp hạn chế các loài mô hình có sẵn thông tin di truyền [23]. Tuy nhiên, người ta biết rất ít về các cơ chế dẫn đến sự phát triển của các hệ thống này hoặc cách chúng thích nghi với các môi trường đa dạng khi quá trình phát triển diễn ra.

Nghiên cứu này nhằm mục đích điều tra nguồn gốc tiến hóa của gen BPIFA1 để tiết lộ các đặc điểm hóa lý của nó và áp dụng bộ gen so sánh để đưa ra đánh giá về gen ở các loài động vật có vú khác nhau. Chúng tôi đã tiến hành các nghiên cứu so sánh chuyên sâu về gen protein diệt khuẩn/tăng tính thẩm thấu (BPIFA1), gen điều chỉnh phản ứng miễn dịch bẩm sinh ở động vật có vú, để hiểu rõ hơn về cách thức hoạt động của những gen này. Có khả năng áp lực chọn lọc sẽ có ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển của sự thích nghi. Trong nghiên cứu này, chúng tôi điều tra lịch sử của các gen này ở các loài động vật có xương sống khác nhau, cũng như sự đa dạng di truyền và chọn lọc tự nhiên đã ảnh hưởng như thế nào đến sự phát triển của họ gen này theo thời gian.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Truy xuất và phân tích trình tự

Trình tự axit amin và nucleotide mã hóa của gen BPIFA1 ở 34 loài động vật có vú, bao gồm cả con người là loài tham chiếu trong nghiên cứu này, được thu thập từ Ngân hàng gen (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank, truy cập vào ngày 20 tháng 9 năm 2021) và chúng được căn chỉnh bằng công cụ Clustal Omega trong phần mềm MEGA 6 [24]. Phương pháp khả năng tối đa đã được sử dụng trong phần mềm MEGA 6 để tạo cây phát sinh loài cho gen BPIFA1. Cây này được xây dựng dựa trên mối quan hệ tiến hóa giữa các gen. Thử nghiệm bootstrap đã tính toán số lần thay thế trung bình trên mỗi trang web và độ dài nhánh trung bình bằng cách sử dụng phương pháp khả năng tối đa với 1000 lần lặp lại để xác định phân cụm phân loại. Phương pháp này được sử dụng để chọn cấu trúc liên kết cho các giá trị khả năng ghi nhật ký nâng cao hơn [25,26]. Tên loài và số gia nhập được sử dụng để nghiên cứu gen BPIFA1 được cung cấp trong Bảng bổ trợ S1.

2.2. Phân tích lựa chọn

Các phương pháp xác suất tối đa được sử dụng để so sánh tỷ lệ dN/dS cho từng vị trí codon để xác định các codon cụ thể trong trình tự gen BPIFA1 của động vật có vú chịu sự chọn lọc tích cực [27,28]. CODEML được thực thi trong PAML [29] và máy chủ web DATA MONKEY (https://www.datamonkey.org, được truy cập vào ngày 29 tháng 9 năm 2021) [30] được sử dụng để phân tích và kết quả được chỉ định bằng cách sử dụng tỷ lệ thay thế của các codon mà cao hơn đáng kể so với 1 đối với các codon theo lựa chọn tích cực. Bước đầu tiên của nghiên cứu này là xác định liệu có xảy ra lựa chọn tích cực hay không bằng cách sử dụng thử nghiệm tỷ lệ khả năng tối đa.

Phân tích này xác định sự hiện diện của các vị trí có tỷ lệ dN/dS lớn hơn một. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã đối chiếu một mô hình rời rạc (chung chung) thực hiện chức năng này với một mô hình null ngăn cản sự xuất hiện của các trang web có giá trị lớn hơn 1 [31]. Các phân tích được so sánh bằng cách sử dụng phân phối nhật ký khả năng (2∆l) với df=4. Giả thuyết không (M7) khẳng định rằng phân phối bị giới hạn bởi các giá trị 0 và 1. Một mô hình thay thế (M8) với hai tham số, omega (ω) và beta ( ), cho phép suy ra một giá trị từ tập dữ liệu, có thể lớn hơn 1 [27]. Các phân tích sử dụng khả năng hiệu ứng cố định (FEL), khả năng đếm tổ tiên khả năng đơn lẻ (SLAC) và khả năng hiệu ứng ngẫu nhiên (REL) đều phát hiện ra rằng gen BPIFA1 chịu sự lựa chọn tích cực khi các giá trị toàn cầu cho sự khác biệt đồng nghĩa và không đồng nghĩa ở mỗi vị trí được so sánh [32].

Giai đoạn thứ hai là sử dụng ước tính xác suất tối đa để xác định vị trí axit amin là đối tượng của sự lựa chọn tích cực trong suốt quá trình tiến hóa. Định lý Bayes, dự đoán xác suất sau của các trang web có thể được lựa chọn tích cực, đã được sử dụng để thực hiện mục tiêu này. Lựa chọn tích cực đã được quan sát thấy hoạt động tại các vị trí axit amin với xác suất sau dao động từ 95% đến 99% [33]. Dư lượng axit amin có xác suất cao là giá trị lớn hơn một đã được xử lý theo quy trình chọn lọc. Mô hình Thụy Sĩ và Phyre 2 (http://www.sbg.bio.ic.ec.k/pyre/html, được truy cập vào ngày 28 tháng 9 năm 2021) là các ứng dụng dựa trên web hiển thị vị trí của các axit amin được chọn thuận lợi trên cấu trúc protein [34].

Chúng tôi đã dự đoán vị trí bảo tồn tiến hóa của axit nucleic và axit amin trong protein bằng công cụ ConSurf (//consurftest.tau.ac.il, được truy cập vào ngày 28 tháng 9 năm 2021), dựa trên mối quan hệ phát sinh gen giữa các trình tự [ 35]. Trình tự của codon được căn chỉnh của BPIFA1 đã được kiểm tra trong Selecton phiên bản 2.2 (//secton.tau.ac.il, được truy cập vào ngày 28 tháng 9 năm 2021), cho phép xác định các tỷ lệ khác nhau của các codon khác nhau bên trong các trình tự được căn chỉnh. Các tỷ lệ này được đo bằng cách sử dụng phương pháp suy luận Bayes thông qua các thử nghiệm khả năng khác nhau. Điều này đã được thực hiện để xác nhận các codon được chọn tích cực [36]. Ngoài ra, kết quả Lựa chọn được hiển thị bằng nhiều màu sắc khác nhau để biểu thị các tiêu chí lựa chọn khác nhau.

2.3. Phân tích tái tổ hợp

Để tìm bằng chứng về sự tái tổ hợp, chúng tôi đã thực hiện quy trình lựa chọn mô hình dựa trên khả năng thống kê có thể sàng lọc qua nhiều cách sắp xếp trình tự để tìm kiếm các điểm ngắt và phát hiện DNA có khả năng tái tổ hợp. Kỹ thuật này đã sử dụng một thuật toán di truyền để tìm kiếm sự sắp xếp của một số trình tự cho các điểm dừng tái tổ hợp nhằm đạt được mục tiêu của nó. Cách tiếp cận GARD rất đơn giản để nắm bắt, dễ dàng mở rộng và có khả năng song song hóa cao. Các thí nghiệm mô phỏng mở rộng đã chứng minh rằng phương pháp này đánh bại các công cụ hiện tại khác trong hầu hết các trường hợp, đặc biệt là về độ chính xác.

Để điều tra bằng chứng về sự tái tổ hợp, trước tiên, các trình tự nucleotide được đánh giá để xác định các kiểu đơn bội (Na) và ước tính các vị trí đa hình (S), số lượng trung bình của sự khác biệt giữa các nucleotide (K) và sự đa dạng của nucleotide (π) bằng phần mềm DnaSP 5.10 [37 ]. Việc phát hiện điểm ngắt và đánh giá tín hiệu tái tổ hợp trong trình tự nucleotide được thực hiện bằng công cụ GARD trực tuyến của máy chủ web Datamonkey [38]. Ngoài ra, việc sử dụng GARD để sàng lọc các trình tự tái tổ hợp đảm bảo rằng các phương pháp tập trung vào việc xác định lựa chọn tích cực có các đặc điểm thống kê chấp nhận được.

2.4. Phân tích tương tác Protein-Protein

Nhiều mối quan tâm đã được hướng tới việc điều tra làm thế nào các tương tác protein-protein được bảo tồn từ loài này sang loài khác. Vì có một số rào cản trong việc xác định thử nghiệm và xác nhận dữ liệu tương tác, nên sẽ rất thú vị khi hiểu một PPI được chuyển từ một loài đã được chứng minh ở một loài khác [39]. Ngân hàng dữ liệu STRING là một nguồn tài nguyên tin sinh học miễn phí chứa thông tin mô tả cách các protein tương tác với nhau như một phần của một số con đường. Số lượng đường nối mỗi nút protein và giá trị khoảng cách được sử dụng để xác định các nút trung gian, đại diện cho các protein đóng vai trò sinh học quan trọng và liên kết mật thiết với nhau. Việc tạo mạng được thực hiện bằng phần mềm STRING và Cytoscape (//www.cytoscape.org, được truy cập vào ngày 29 tháng 9 năm 2021) được sử dụng để hiển thị mạng [40]. Bằng cách xác định các tương tác protein-protein của BPIFA1 giữa các protein miễn dịch và phân tích đồng biểu hiện bằng STRING phiên bản 9.1 (//www.string-db.org,được truy cập vào ngày 29 tháng 9 năm 2021), chúng tôi có thể xác định thêm cách thức hoạt động của BPIFA1 ở cấp độ phân tử.

2.5. Phân tích cấu trúc của Protein BPIFA1

Trong phân tích này, chúng tôi đã xây dựng cấu trúc tinh thể của protein BPIFA1 của con người bằng cách sử dụng mô hình tương đồng với các công cụ trực tuyến, chẳng hạn như mô hình của Thụy Sĩ (//swissmodel.Exasy.org, truy cập vào ngày 29 tháng 9 năm 2021) [41], I-TESSAR [42] và Phyre2 (http://www.sbg. bio1.ic.ac.uk/phyre2/html, truy cập ngày 29 tháng 9 năm 2021) [43]. Phương pháp gradient liên hợp và trường lực Amber trong phần mềm UCSF Chimera 1.10.1 đã được sử dụng để giảm protein mục tiêu được lắp ráp. Ngoài ra, máy chủ web ProSA đã được sử dụng để đánh giá các thuộc tính hóa học lập thể của cấu trúc dự kiến ​​[22].

For more information:1950477648nn@gmail.com