Norwogonin làm giảm căng thẳng oxy hóa do thiếu oxy gây ra và quá trình chết trong tế bào PC12

Để biết thêm thông tin:ali.ma@wecistanche.com

trừu tượng

Cơ sở: Norwogonin là một flavone tự nhiên với ba nhóm hydroxyl phenolic trong cấu trúc xương và có tác dụng tuyệt vờichất chống oxy hóahoạt động. Tuy nhiên, tác dụng bảo vệ thần kinh của norwogonin vẫn chưa rõ ràng. Ở đây, chúng tôi đã nghiên cứu khả năng bảo vệ của norwogonin chống lại tổn thương oxy hóa gây ra bởi tình trạng thiếu oxy trong tế bào PC12. Phương pháp: Khả năng sống và quá trình chết của tế bào được kiểm tra bằng xét nghiệm MTT và nhuộm Annexin V-FITC / PI tương ứng. Hàm lượng oxy phản ứng (ROS) được đo bằng xét nghiệm DCFH-DA. Lactate dehydrogenase (LDH), malondialdehyde (MDA) vàchất chống oxy hóanồng độ enzyme được xác định bằng cách sử dụng bộ dụng cụ thương mại. Sự biểu hiện của các gen và protein liên quan được đo bằng PCR định lượng thời gian thực và phương pháp thấm phương Tây. Kết quả: Chúng tôi nhận thấy rằng norwogonin làm giảm bớt tổn thương do thiếu oxy gây ra ở tế bào PC12 bằng cách tăng khả năng sống của tế bào, giảm giải phóng LDH và cải thiện những thay đổi về hình thái tế bào. Norwogonin cũng hoạt động như mộtchất chống oxy hóabằng cách loại bỏ ROS, giảm sản xuất MDA, duy trì hoạt động của superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) và glutathione peroxidase (GPx), đồng thời giảm mức độ biểu hiện của HIF -1 và VEGF. Ngoài ra, wogonin còn ngăn chặn quá trình chết rụng của tế bào thông qua việc ức chế mức độ biểu hiện của caspase -3, cytochrome c và Bax trong khi tăng mức độ biểu hiện của Bcl -2 và tỷ lệ Bcl -2 / Bax. Kết luận: Norwogonin làm giảm tổn thương do thiếu oxy trong tế bào PC12 bằng cách dập tắt ROS, duy trì các hoạt động củachất chống oxy hóaenzyme, và ức chế con đường apoptosis của ty thể.

Từ khóa: Norwogonin,Hoạt động chống oxy hóa, Thiếu oxy, Căng thẳng oxy hóa, Apoptosis

Tiểu sử

Các sinh vật hiếu khí cần oxy (O2) để sản xuất năng lượng. Thiếu oxy được định nghĩa là cung cấp không đủ O2 để duy trì chức năng tế bào trong mô và thường xảy ra trong một số tình huống sinh lý như độ cao [1], và trong nhiều tình huống bệnh lý như đột quỵ [2]. Não đặc biệt nhạy cảm với tổn thương do thiếu oxy do tiêu thụ nhiều oxy, giàu axit béo không bão hòa và thấpchất chống oxy hóacông suất [3]. Ngày càng có nhiều bằng chứng chỉ ra rằng tình trạng thiếu oxy có thể gây ra các tác dụng phụ lên não [4–6].

Linlin Jing, Rongmin Gao, Jie Zhang, Dongmei Zhang, Jin Shao, Zhengping Jia và Huiping Ma

Khoa Dược, Bệnh viện 940 thuộc lực lượng Hỗ trợ Hậu cần của PLA, Lanzhou 730050, Cam Túc, Trung Quốc

Stress oxy hóa và quá trình apoptosis được coi là hai yếu tố góp phần gây ra tổn thương do thiếu oxy [7, 8]. Tiếp xúc với tình trạng thiếu oxy đã được báo cáo là làm tăng sản xuất các loại oxy phản ứng nội bào (ROS), tạo điều kiện cho stress oxy hóa. ROS quá mức, chẳng hạn như anion superoxide (O2-˙), hydrogen peroxide (H2O2) và gốc hydroxyl (HO •), dẫn đến những thay đổi cấu trúc và chức năng của tế bào bằng cách tấn công lipid, màng, protein và DNA, và sau đó gây ra tổn thương tế bào [ 9].

Nhấp vào Cistanches để chống oxy hóa

Đồng thời, ROS được sản xuất quá mức cũng tạo điều kiện cho việc mở lỗ chuyển tiếp tính thấm của ty thể (mPTP) [10] và chuyển các protein pro-apoptosis đến màng ngoài ty thể, gây ra sự khử cực của màng ty thể và giải phóng cytochrome c [11]. Những thay đổi này cuối cùng gây ra quá trình chết rụng phụ thuộc vào ty thể [12]. Vì vậy, người ta tin rằngchất chống oxy hóavới khả năng ức chế hoặc loại bỏ ROS quá mức có thể phát huy tác dụng bảo vệ của chúng thông qua việc làm giảm stress oxy hóa và quá trình chết rụng do thiếu oxy. Rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằngchất chống oxy hóacác chất bổ sung như vitamin C [13], isoflavone [8], và các gốc nitroxide [14], có thể hạn chế tổn thương do thiếu oxy trong ống nghiệm và in vivo. Flavonoid là một nhóm lớn và đa dạng các chất chuyển hóa thứ cấp của thực vật ở khắp mọi nơi. Họ luôn được coi là một tự nhiên tuyệt vờichất chống oxy hóavới khả năng quét các gốc tự do và ức chế quá trình peroxy hóa lipid.

Hiện nay, ngày càng có nhiều sự chú ý đến nhóm hợp chất này do những tác dụng hữu ích của chúng đối với sức khỏe con người. Flavonoid đã được chứng minh là sở hữu một loạt các hoạt động dược lý, chẳng hạn như chống viêm, chống ung thư và hoạt động bảo vệ thần kinh, v.v., tất cả đều có thể là do các hoạt động chống oxy hóa của chúng [15]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng flavonoid thể hiện tác dụng bảo vệ tuyệt vời đối với tình trạng thất bại do thiếu oxy. Ví dụ, rutin có tác dụng bảo vệ thần kinh mạnh mẽ chống lại sự chết tế bào hạch võng mạc do thiếu oxy [16]. Một nghiên cứu gần đây cũng chứng minh rằng rutin có thể làm giảm bớt tổn thương do thiếu oxy do coban clorua gây ra bằng cách ức chế stress oxy hóa và quá trình apoptosis ở tế bào H9c2 [17]. Hơn nữa, Liu và cộng sự cho rằng nobiletin (3 ′, 4 ′, 5,6, 7, 8- hexamethoxy flavone) làm giảm tổn thương I / R cơ tim thông qua việc kích hoạt con đường Akt / GSK -3 trong tế bào H9c2 [18]. Ngoài ra, acacetin có thể bảo vệ tế bào cơ tim của chuột và nguyên bào cơ tim H9C2 chống lại tổn thương do thiếu oxy / tái oxy hóa thông qua việc kích hoạt đường truyền tín hiệu Nrf2 qua trung gian AMPK [19].

Norwogonin (5,7, 8- trihydroxy flavone, Hình 1) là một flavone có hoạt tính dược lý được tách ra từ rễ của cây Scutellaria baicalensis Georgi ("Hoàng kỳ" trong tiếng Trung Quốc), một loại thảo mộc truyền thống của Trung Quốc được sử dụng để điều trị cúm và ung thư [20, 21]. Tuy nhiên, các nghiên cứu hạn chế đã được báo cáo về các hoạt động sinh học của norwogonin do hàm lượng thấp trong thực vật tự nhiên. Để giải quyết vấn đề này, một số phương pháp tổng hợp norwogonin được báo cáo [22, 23].

Nghiên cứu trước đây của chúng tôi cũng đã thiết lập một phương pháp đơn giản để thu nhận norwogonin từ chrysin trong bốn bước [24]. Những nghiên cứu này đã ảnh hưởng tích cực đến việc đánh giá thêm các hoạt động sinh học của norwogonin. Các nghiên cứu đã tiết lộ rằng norwogonin sở hữu các hoạt động chống oxy hóa [25], chống ung thư [26, 27], kháng vi-rút [28], và kháng khuẩn [29] cũng như ức chế sự sản sinh ROS do cyanide kích thích [30]. Tuy nhiên, liệu norwogonin có khả năng bảo vệ chống lại tổn thương do thiếu oxy gây ra hay không vẫn chưa được biết. Mục đích của nghiên cứu này là để khảo sát tác dụng bảo vệ của norwogonin chống lại stress oxy hóa do thiếu oxy gây ra và quá trình chết rụng ở tế bào PC12.

Phương pháp

Vật liệu và thuốc thử

Norwogonin (độ tinh khiết Lớn hơn hoặc bằng 98 phần trăm) được tổng hợp theo phương pháp đã báo cáo trước đây của chúng tôi [24]. Rutin (độ tinh khiết Lớn hơn hoặc bằng 96%) được mua từ Công ty TNHH Công nghệ sinh học Từ Nguyên (Tây An, Thiểm Tây, Trung Quốc). Norwogonin và rutin được hòa tan trong dimethyl sulfoxide (DMSO) vô trùng, được bảo quản ở - 20 độ, và được pha loãng trong môi trường nuôi cấy tế bào ngay trước khi sử dụng. Môi trường Eagle's cải tiến (DMEM), huyết thanh bò thai (FBS), streptomycin và penicillin của Dulbecco đã được mua từ Solarbio co., Ltd. (Bắc Kinh, Trung Quốc).

Các bộ dụng cụ chứa malondialdehyde (MDA), lactate dehydrogenase (LDH), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) và glutathione peroxidase (GPx) được lấy từ Viện Kỹ thuật Sinh học Nam Kinh Jiancheng (Giang Tô, Trung Quốc). 2 ′, 7′-dichloride-hydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) và (3- (4, 5- dimethylthiazol -2- yl) -2, 5- diphenyltetrazolium bromide) tetrazolium (MTT) được lấy từ Sigma-Aldrich Co (St. Louis, MO, Hoa Kỳ). Các kháng thể chính đối với yếu tố gây giảm oxy máu -1 (HIF -1), yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF), u lympho tế bào B -2 (Bcl -2), Bcl {{17 }} protein X liên kết (Bax), Caspase -3, Cytochrome C và -actin đều được mua từ Abcam (Cambridge, Vương quốc Anh). Kháng thể thứ cấp được lấy từ Công ty ZsBio (Bắc Kinh, Trung Quốc).

Một bộ phân tích apoptosis được lấy từ Viện Công nghệ Sinh học Beyotime (Giang Tô, Trung Quốc). Tất cả các hóa chất và dung môi đều thuộc loại phân tích và được lấy từ một nhà cung cấp thương mại ở Trung Quốc. Nuôi cấy tế bào Các tế bào PC12 được mua từ Ngân hàng Tế bào của Viện Khoa học Trung Quốc (TCR 9, Thượng Hải, Trung Quốc) và được duy trì trong DMEM với 10 phần trăm (v / v) FBS, 100 U / mL penicilin và 100 U / mL streptomycins ở 37 độ trong tủ ấm được làm ẩm có chứa 5% CO2. Để đánh giá độc tính tế bào của norwogonin, tế bào PC12 (đoạn 4 ~ 6) đã được ủ trước với các nồng độ khác nhau (10− 8, 10− 7, 10− 6, 10− 5, 10− 4 mol / L) của nor wogonin cho 1 h và sau đó nuôi cấy trong 24 h. Tiếp xúc với tình trạng thiếu oxy Để tạo ra mô hình tổn thương do thiếu oxy tế bào, các tế bào PC12 đã phải chịu một môi trường thiếu oxy (1 phần trăm O2, 5 phần trăm CO2 và 94 phần trăm N2) ở 37 độ trong 24 giờ trong một buồng được làm ẩm. Tế bào đối chứng Normoxic được nuôi cấy ở 37 độ trong tủ ấm 5% CO2 trong 24 giờ.

Để đánh giá tác dụng bảo vệ của norwogonin chống lại tổn thương do thiếu oxy gây ra, tế bào PC12 được ủ trước với các nồng độ khác nhau (1 0 - 8, 1 0 - 7, 10− 6, 10− 5 mol / L) của norwogonin trong 1 giờ trước khi điều trị thiếu oxy. Khả năng sống sót của tế bào Khả năng sống sót của tế bào được đo bằng xét nghiệm MTT như đã mô tả trước đây [31]. Tóm lại, các tế bào PC12 (1 × 105 tế bào / mL) được cấy vào 96 đĩa nuôi cấy giếng. Sau đó, các nồng độ khác nhau của norwogonin được thêm vào các giếng. Một lượng DMSO tương đương đã được thêm vào các giếng kiểm soát. Nồng độ cuối cùng của DMSO trong môi trường nuôi cấy tế bào là 0,1 phần trăm. Sau khi ủ ở điều kiện không oxy hoặc thiếu oxy, 10 μL MTT (5,0 mg / mL) được thêm vào mỗi giếng, sau đó ủ ở 37 độ trong 4 giờ. Sau đó, phần nổi phía trên có MTT được loại bỏ và sản phẩm formazan được hòa tan trong 100 μL DMSO. Độ hấp thụ được đo trên đầu đọc vi tấm SpectraMax i3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) ở bước sóng 570 nm. Kết quả được biểu thị bằng tỷ lệ phần trăm tương đối của nhóm đối chứng. Tế bào PC12 nhuộm Hematoxylin và eosin (HE) được gieo trên các tấm phủ thủy tinh được ủ trong 24 giờ trước khi chúng được xử lý bằng norwogonin theo cách tương tự như đã mô tả ở trên.

Môi trường được lấy ra và các tấm phủ thủy tinh được rửa bằng PBS lạnh, tiếp theo là cố định bằng metanol trong 10 phút ở nhiệt độ phòng, và sau đó rửa bằng PBS lạnh ba lần trong 5 phút. Cuối cùng, tế bào được nhuộm theo quy trình nhuộm HE [32]. Việc phân tích tế bào được thực hiện bằng kính hiển vi OLYMPUS IX73 (100 ×) để xác minh những thay đổi hình thái tế bào. Hình ảnh kỹ thuật số thu được bằng máy ảnh kỹ thuật số DXM 1200 C (Nikon) được kết hợp với kính hiển vi. Hàm lượng ROS Mức ROS nội bào trong tế bào PC12 được xác định bằng xét nghiệm DCFH-DA [33]. Một cách ngắn gọn, tế bào PC12 (1 × 105 tế bào / mL) được gieo vào 6- đĩa giếng. Sau khi xử lý thiếu oxy, tế bào PC12 được rửa sạch bằng PBS và sau đó được ủ trong môi trường nuôi cấy chứa 10 μM DCFH-DA trong 30 phút trong bóng tối ở 37 độ. Các tế bào được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang đảo ngược Olympus (Tokyo, Nhật Bản) và được phân tích bằng máy đo tế bào dòng Bec tấn Dickinson FACScan (BD Biosciences, CA, Hoa Kỳ) với bước sóng kích thích 488 nm và bước sóng phát xạ 525 nm. Mức ROS được biểu thị bằng tỷ lệ phần trăm kiểm soát tương đối. Sự rò rỉ LDH, hàm lượng MDA và hoạt động của enzym chống oxy hóa Tế bào PC12 (1 × 105 tế bào / mL) được cấy vào đĩa 90 mm. Sau khi xử lý tình trạng thiếu oxy như mô tả ở trên, 50 μL dịch nuôi cấy nổi trên mỗi đĩa được thu thập và hoạt tính LDH trong môi trường được phát hiện bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm thương mại (Viện Công nghệ Sinh học Jiancheng, Nam Kinh, Trung Quốc) và được biểu thị bằng U / mL. Các tế bào PC12 được thu hoạch và đồng nhất sau khi rửa hai lần bằng PBS lạnh. Nồng độ của tổng số protein được đo bằng bộ xét nghiệm protein BCA. Hàm lượng MDA và hoạt tính của enzym chống oxy hóa được xác định bằng cách sử dụng các bộ xét nghiệm thương mại (Viện Công nghệ Sinh học Jiancheng, Nam Kinh, Trung Quốc).

Nội dung của MDA được trình bày dưới dạng protein nmol / mg. Các hoạt động của SOD, CAT và GPx được trình bày dưới dạng U / mg protein. Quá trình chết tế bào (nhuộm Annexin-V / PI) Sau khi điều trị thiếu oxy, tế bào PC12 được thu hoạch, rửa sạch hai lần bằng PBS lạnh, và sau đó được treo bằng đệm liên kết. Tế bào được xử lý bằng dung dịch Annexin V-FITC và PI theo quy trình của nhà sản xuất (Beyotime, Thượng Hải, Trung Quốc). Việc thu thập dữ liệu được thực hiện bằng máy đo lưu lượng tế bào Becton Dickinson FACScan (BD Biosciences, CA, Hoa Kỳ). Phân tích định lượng PCR thời gian thực Tổng số RNA của tế bào PC12 được chiết xuất bằng thuốc thử Trizol (Takara, Đại Liên, Trung Quốc) và được chuyển đổi thành cDNA bằng Bộ thuốc thử PrimeScript TM RT (AK4301,

Takara, Đại Liên, Trung Quốc). Gen mã hóa cDNA HIF -1, VEGF, Bcl -2, Bax, caspase -3, cytochrome C và glyceraldehyde -3- phosphate dehydrogenase (GAPDH) được khuếch đại bằng phương pháp thực định lượng PCR thời gian sử dụng Hệ thống phát hiện thời gian thực 7300 (Hệ thống sinh học ứng dụng, CA, Hoa Kỳ). Các mồi được sử dụng được thể hiện trong Bảng 1. Điều kiện chu kỳ PCR là 95 độ trong 30 giây, tiếp theo là 40 chu kỳ 95 độ trong 5 giây và 60 độ trong 31 giây. Mức mRNA được tính bằng phương pháp 2- ΔΔCt và chuẩn hóa thành GAPDH, là gen tham chiếu. Các tế bào PC12 Western blot được thu hoạch và đồng nhất trong các tác nhân RIPA. Nồng độ của tổng số protein được định lượng bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm protein BCA. 30 ug mẫu được phân giải trên điện di SDS-PAGE 12% và sau đó được chuyển sang màng polyvinylidene fluoride (PVDF) (Millipore, Billerica, MA, USA).

Các màng được chặn bằng sữa khô không béo 5% trong dung dịch đệm TBST trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng và được ủ với các kháng thể chính: anti-HIF -1 (1: 3 0 0, ab179483, Abcam, UK), anti-VEGF (1: 1000, ab46154, Abcam, UK), anti-Bcl -2 (1: 1000, ab59348, Abcam, UK), anti-Bax (1: 500, ab32503, Abcam, UK), anti caspase -3 (1: 300, ab44976, Abcam, UK), anti cytochrome C (1: 1000, ab13575, Abcam, UK) và anti - - actin (1: 2000, ab8227 , Abcam, Vương quốc Anh) ở 4 độ qua đêm. Sau đó, các màng được rửa sạch và ủ với các kháng thể thứ cấp (1: 2000, ZsBio, Bắc Kinh, Trung Quốc;) trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Các dải phản ứng miễn dịch được hình dung bằng cách sử dụng thuốc thử phát quang hóa học (ECL) tăng cường. Cường độ tương đối của các dải được chuẩn hóa theo kiểm soát nội bộ -actin và được phân tích bằng Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA).

Phân tích thống kê

Các kết quả được biểu thị bằng giá trị trung bình ± SD thu được từ ít nhất ba thí nghiệm độc lập. Sự khác biệt giữa các nhóm được phân tích bằng cách sử dụng phân tích phương sai một chiều (ANOVA), sau đó là bài kiểm tra sau bài học Student – ​​Newman– Keuls. Giá trị P của <0. 05="" được="" coi="" là="" có="" ý="" nghĩa="" thống="">

Kết quả

Norwogonin bảo vệ tế bào PC12 chống lại tổn thương do thiếu oxy gây ra

Đầu tiên, để loại trừ hoạt động tăng sinh của norwogonin, độc tính tế bào của nó trên các tế bào PC12 bình thường được xác định bằng xét nghiệm MTT. Như đã thấy trong Hình 2a, sự tăng sinh tế bào không thay đổi đáng kể sau khi điều trị bằng norwogonin ở nồng độ 1 × 1 0 - 8 -1 × 1 0 - 5 mol / L (P> 0,05 ). Tuy nhiên, khả năng sống của tế bào giảm đáng kể khi tăng nồng độ norwogonin lên 1 × 10-4 mol / L (P <0,05). kết="" quả="" chỉ="" ra="" rằng="" norwogonin="" không="" biểu="" hiện="" độc="" tính="" hoặc="" hoạt="" động="" tăng="" sinh="" trên="" tế="" bào="" pc12="" ở="" nồng="" độ="" 1="" ×="" 10−="" 8="" -1="" ×="" 10−="" 5="" mol="">

Sau đó, chúng tôi kiểm tra tác dụng bảo vệ của norwogonin chống lại tổn thương tế bào PC12 do thiếu oxy. Như thể hiện trong Hình 2b, so với nhóm đối chứng, khả năng sống sót của tế bào ở nhóm thiếu oxy giảm xuống còn 58,71 phần trăm (P <0. 0="" 1).="" so="" với="" điều="" trị="" thiếu="" oxy,="" được="" xử="" lý="" trước="" bằng="" pc12="" được="" bảo="" vệ="" phụ="" thuộc="" vào="" liều="" lượng="" 1="" ×="" 1="" 0="" -="" 8,="" 1="" ×="" 1="" 0="" -="" 7="" và="" 1="" ×="" 1="" 0="" -="" 6="" mol="" l="" tế="" bào="" chống="" lại="" tổn="" thương="" do="" thiếu="" oxy="" gây="" ra,="" phục="" hồi="" khả="" năng="" sống="" của="" tế="" bào="" từ="" 58,71="" đến="" 62,79="" phần="" trăm="" (p=""><0,05), 66,68="" phần="" trăm="" (p=""><0,01) và="" 69,88="" phần="" trăm="" (p=""><0,01), tương="" ứng.="" tiền="" xử="" lý="" với="" rutin="" 1="" ×="" 10−="" 6="" mol="" l="" cũng="" thể="" hiện="" tác="" dụng="" bảo="" vệ,="" làm="" tăng="" đáng="" kể="" khả="" năng="" sống="" của="" tế="" bào="" lên="" 63,78="" phần="" trăm="" so="" với="" xử="" lý="" thiếu="" oxy.="" khả="" năng="" sống="" sót="" được="" xử="" lý="" trước="" với="" 1="" ×="" 10="" -="" 5="" mol="" l="" norwogonin="" đã="" giảm="" xuống="" còn="" 63,43%,="" vẫn="" cao="" hơn="" đáng="" kể="" so="" với="" ở="" nhóm="" thiếu="" oxy="" (p=""><0,05). những="" kết="" quả="" này="" chứng="" minh="" rằng="" norwogonin="" cho="" thấy="" sự="" bảo="" vệ="" tế="" bào="" đáng="" kể="" ở="" nồng="" độ="" 1="" ×="" 10−="" 8="" -1="" ×="" 10−="" 5="" mol="" l="" và="" nồng="" độ="" hiệu="" quả="" nhất="" là="" 1="" ×="" 10−="" 6="" mol="" l.="" sau="" đó="" liều="" này="" được="" sử="" dụng="" làm="" liều="" tối="" ưu="" trong="" các="" thí="" nghiệm="">

Khả năng bảo vệ của norwogonin cũng đã được xác minh bằng các thay đổi hình thái. Như thể hiện trong Hình 2c, các tế bào PC12 không được xử lý thiếu oxy phát triển tốt với hình dạng đều đặn (fusiform), kích thước đồng nhất. Sau khi tiếp xúc với tình trạng thiếu oxy, các tế bào PC12 có biểu hiện co rút, hình dạng tròn, bong vảy và giảm mật độ tế bào. Các tế bào được xử lý trước bằng norwogonin hoặc rutin trước khi tiếp xúc với tình trạng thiếu oxy phát triển tốt hơn, số lượng tế bào bong vảy giảm và hình dạng tế bào phục hồi bình thường. Bên cạnh đó, khả năng bảo vệ của norwogonin đã được xác nhận bởi sự rò rỉ LDH, có liên quan đến việc mất tính toàn vẹn của màng tế bào. Như được thể hiện trong Hình 2d, hoạt độ LDH trong môi trường nuôi cấy đã tăng lên đáng kể sau khi tiếp xúc với tình trạng thiếu oxy (P <0.>

Tiền xử lý với norwogonin hoặc rutin làm giảm đáng kể sự rò rỉ LDH, cho thấy norwogonin và rutin khôi phục tính toàn vẹn của màng tế bào. Norwogonin ức chế stress oxy hóa do thiếu oxy trong tế bào PC12 ROS và MDA là hai chỉ số quan trọng của stress oxy hóa tế bào do thiếu oxy gây ra. Như thể hiện trong Hình 3a và b, hàm lượng ROS và MDA tăng lên đáng kể đã được quan sát thấy trong các tế bào PC12 sau khi tiếp xúc với tình trạng thiếu oxy. Việc tiền xử lý bằng Norwogonin hoặc rutin đã ức chế đáng kể việc sản xuất ROS và MDA.

Các enzym chống oxy hóa, chẳng hạn như SOD, CAT và GPx, được coi là hệ thống bảo vệ chính chống lại stress oxy hóa trong tế bào. Như được thể hiện trong Hình 3c-e, tiếp xúc với tình trạng thiếu oxy đã ức chế đáng kể hoạt động của SOD, CAT và GPx trong tế bào PC12. Điều trị bằng norwogonin hoặc rutin đã đảo ngược những thay đổi này và khôi phục hoạt động của các enzym chống oxy hóa. Tất cả những kết quả này chỉ ra rằng norwogonin đã bảo vệ các tế bào PC12 chống lại stress oxy hóa do thiếu oxy gây ra.