Chiết xuất từ ​​lá ô liu (OLE) Theo dõi Vasopressin ‑ cảm ứng Aquaporin ‑ 2 bị suy giảm thông qua việc kích hoạt cơ quan thụ cảm canxi

Để biết thêm thông tin. tiếp xúc:tina.xiang@wecistanche.com

Vasopressin (AVP) làm tăng tính thấm nước trongthậnống thu thông qua quy chế buôn bán aquaporin -2 (AQP2). Một số rối loạn, bao gồm tăng huyết áp và tiết hormone chống bài niệu không thích hợp (SIADH), có liên quan đến bất thường trong cân bằng nội môi trong nước. Nó đã được chứng minh rằng một số hợp chất thực vật có lợi cho sức khỏe con người. Ở đây, tác dụng của chiết xuất từ ​​lá ô liu (OLE) đã được đánh giá bằng cách sử dụng các mô hình in vitro và in vivo. Các nghiên cứu chung cho thấy OLE ngăn chặn sự chuyển vị AQP2 do vasopressin gây ra đến màng sinh chất trong tế bào MCD4 và chuộtthận. Ủ với OLE làm giảm sự gia tăng phụ thuộc AVP của hệ số thấm nước thẩm thấu (Pf). , một chất ức chế CaSR chọn lọc, loại bỏ tác dụng ức chế của OLE đối với khả năng thấm nước phụ thuộc AVP. Các thí nghiệm in vivo cho thấy rằng điều trị bằng OLE làm tăng sự biểu hiện của mRNA CaSR và giảm mRNA AQP2 song song với sự gia tăng của AQP 2- miRNA nhắm mục tiêu -137. Kết hợp với nhau, những phát hiện này cho thấy rằng OLE đối kháng với hoạt động của vasopressin thông qua kích thích CaSR, chỉ ra rằng chiết xuất này có thể có lợi để làm giảm các rối loạn đặc trưng bởi tín hiệu CaSR bất thường và ảnh hưởng đến tái hấp thu nước ở thận.

Lá cây ô liu đã được sử dụng rộng rãi như một phương thuốc truyền thống để chữa một số bệnh, đặc biệt là ở các nước Địa Trung Hải. Lá thường được dùng trong chế độ ăn uống của con người như một chất chiết xuất hoặc bột để pha chế dịch truyền hoặc trà thảo mộc. Phân tích đặc điểm hóa học cho thấy lá cây ô liu chứa một số hợp chất hoạt tính sinh học có thể có tác dụng có lợi trong một số bệnh như hội chứng chuyển hóa, rối loạn lipid máu và tăng huyết áp. Nhiều polyphenol như oleuropein, hydroxytyrosol và tyrosol đã được tìm thấy làm giàu trong chiết xuất lá ô liu xanh (OLE) 5, và chúng được biết là có liên quan đến việc ngăn ngừa một số bệnh đặc trưng bởi stress oxy hóa. Do đó, trong vài năm gần đây, mối quan tâm nghiên cứu về tác dụng có lợi tiềm năng của chiết xuất lá ô liu ngày càng tăng giữa các nhà khoa học trong các lĩnh vực nghiên cứu khác nhau. loại kênh Ca2 plus. Điều thú vị là OLE được phát hiện có tác dụng hạ huyết áp đối với tăng huyết áp di truyền ở chuột tăng huyết áp tự phát (SHR), liên quan đến việc cải thiện chức năng mạch máu *. Tái hấp thu nước quá mức đóng một vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của tăng huyết áp. Ở những bệnh nhân cao huyết áp, được điều trị bằng chiết xuất lá ô liu, một số yếu tố gây viêm được tìm thấy có liên quan đến việc giảm huyết áp. Bên cạnh đó, giữ nước quá mức đặc trưng cho một số rối loạn như xơ gan, suy tim và tiết hormone chống bài niệu không thích hợp (SIADH). Cân bằng nội môi trong cơ thể được kiểm soát chặt chẽ bởi hormone chống bài niệu vasopressin (AVP) được tiết ra trong tình trạng mất nước. AVP liên kết với thụ thể V2R cognate của nó khu trú tại màng đáy bên củathậncác tế bào chính do đó kích hoạt đường dẫn tín hiệu cAMP dẫn đến sự chuyển vị của các túi mang aquaporin -2 (AQP2) từ vùng nội bào đến màng sinh chất đỉnh nơi xảy ra quá trình tái hấp thu nước. Ở cấp độ phân tử, một số yếu tố có thể điều chỉnh sự cân bằng nước ở thận, Mức độ tăng cao của canxi làm giảm quá trình vận chuyển AOP2 phụ thuộc vào vasopressin trong thời gian ngắn thông qua việc kích hoạt thụ thể cảm nhận canxi (CaSR) 1,12. Mặt khác, sự hoạt hóa CaSR trong các tế bào biểu mô ống thận gần bất tử có điều kiện, được phân lập từ nước tiểu của con người, gây ra sự gia tăng đáng kể canxi tế bào và làm giảm đáng kể sự gia tăng cAMP do forskolin (FK), một chất hoạt hóa trực tiếp của cvclase adenylate3. , trong tế bào MCD4 của ống thu thận, biểu hiện ổn định kênh nước AOP2, kích thích CaSR làm giảm sự gia tăng phosphoryl hóa AQP2 phụ thuộc cAMP ở serine 256, đây là một sự kiện quan trọng trong dòng dẫn truyền tín hiệu được kích hoạt bởi vasopressin và cuối cùng làm tăng tính thấm nước4 , 15 Hơn nữa, trongquả thậncác lát cắt từ thận chuột trong tủy bên trong, việc kích hoạt CaSR với calcimimetic NPS-R568 gây ra sự gia tăng đáng kể AQP 2- miRNA nhắm mục tiêu -137, xác nhận sự tương tác chặt chẽ giữa đường dẫn tín hiệu CaSR và AQP { {4}} độ thấm nước phụ thuộcl.17.Trong nghiên cứu này, tác dụng của chiết xuất lá ôliu, thu được từ cây Coratina địa phương, được đánh giá trên chức năng AQP2 do vasopressin gây ra trong các tế bào MCD4 của ống thu thận biểu hiện ổn định AOP2 và trong dDAVP những con chuột được điều trị được tiêm chất chiết xuất. Chúng tôi cung cấp bằng chứng cho thấy điều trị OLE chống lại phản ứng với vasopressin trong tế bào thận, điều này có thể giải thích một phần tác dụng lợi tiểu của nó. Điều thú vị là, hiệu ứng này dường như có liên quan đến sự kích hoạt CaSR do OLE gây ra, một thụ thể được biết là có tác động qua lại tiêu cực với thụ thể vasopressinl2.

Tìm hiểu thêm tác dụng của cistanche đối với thận

Kết quả

Ảnh hưởng của OLE đến chức năng AQP2 do vasopressin gây ra trong tế bào MCD4. Để điều tra sự liên quan có thể có của OLE đối với chức năng AQP2 phụ thuộc vào vasopressin,thậnCác tế bào MCD4 của ống thu, biểu hiện ổn định thụ thể vasopressin 2 (V2R) và AQP2 của người, được sử dụng làm mô hình thử nghiệm18. Nghiên cứu hội tụ (Hình 1A) cho thấy, so với các tế bào được xử lý dDAVP, trong đó nhuộm AQP2 khu trú trên màng sinh chất đỉnh, điều trị bằng OLE ngăn cản sự bản địa hóa màng của AOP2 do kích thích với dDAVP. Phù hợp với những quan sát này, điều trị OLE làm suy giảm sự gia tăng phản ứng thẩm thấu thời gian do dDAVP gây ra (được chỉ ra là 1 / t trong Hình 1B) (OLE / dDAVP =88. 70 ± 1. 86 phần trăm, n =292 ô so với dDAVP =206. 8 ± 5,49 phần trăm, n =186 ô; p<0.001).altogether these="" findings="" suggested="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" principal="" cell="" permeability="" by="" preventing="" aqp2="" translocation="" from="" an="" intracellular="" vesicle="" pool="" to="" the="" apical="" plasma="" membrane.="" vasopressin-induced="" aop2="" trafficking="" is="" controlled="" by="" intracellular="" camp="" which="" stimulated="" the="" camp-dependent="" kinase="" (pka)1.="" further,="" to="" evaluate="" the="" functionality="" of="" the="" v2r="" in="" the="" presence="" of="" ole="" in="" terms="" of="" camp="" production,="" permeable="" 8-br-camp="" was="" used="" as="" an="" external="" source="" of="" camp.="" treatment="" with="" 8-br-camp="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" elicited="" by="" ole="" on="" osmotic="" water="" permeability(ole/8-br-camp="188.7±3.56%,n=293" cells="" vs="" ole="85.93±2.27%," n="238"><0.001).therefore, to="" evaluate="" whether="" treatment="" with="" ole="" regulates="" aqp2="" trafficking="" by="" fine-tuning="" intracellular="" camp="" level,="" fluorescence="" resonance="" energy="" transfer(fret)technology="" was="" applied.="" compared="" to="" untreated="" cells="" (ctr),="" normalized="" netfret="" signals="" are="" reduced="" with="" ddavp="" stimulation(ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.00l; fig.2a),consistent="" with="" a="" significant="" increase="" of="" intracellular="" camp.="" conversely,="" treatment="" with="" ole="" prevented="" the="" ddavp="" dependent="" decrease="" of="" netfront="" signals="" consistent="" with="" a="" decrease="" of="" the="" vasopressin="" dependent="" camp="" release="" (ole/ddavp="92.97±3.46%," n="211" cells="" vs="" ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells;=""><0.05; fig.2a).treatment="" with="" ole="" alone="" did="" not="" affect="" the="" intracellular="" cgmp="" level="" compared="" with="" cells="" left="" under="" basal="" conditions(ole="96.15±3.80%," n="184" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.05).besides, western="" blotting="" studies(fig.2b)revealed="" that="" treatment="" with="" ole="" significantly="" reduced="" the="" ddavp="" induced="" increase="" of="" aqp2="" phosphorylation="" at="" serine="" 256(aqp2-ps256),="" indicating="" that="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking,="" in="" response="" to="" ole,="" are="" dependent="" on="" camp-pka="" function.="" the="" phosphorylation="" level="" of="" aqp2-ps256="" in="" response="" to="" ole="" was="" not="" statistically="" different="" from="" the="" control="" even="" though="" it="" tended="" to="" be="" reduced.="" to="" gain="" insight="" into="" the="" molecular="" signals="" underlying="" the="" action="" of="" ole,="" intracellular="" calcium="" dynamics="" were="" evaluated.="" mcd4="" cells="" endogenously="" express="" a="" functional="" calcium-sensing-receptor(casr)20,="" which="" plays="" an="" important="" role="" in="" controlling="" aqp2="" expression="" and="" trafficking'4.long="" term="" incubation="" with="" ole(0.1="" mg/ml)slightly="" increased="" the="" intracellular="" calcium="" level="" compared="" with="" untreated="" cells(fig.3;="" ole="209.0±13.45" nm,n="128" cells="" ys="" ctr="163.3±8.957" nm,n="97cells:"><0.05).co-incubation with="" ole(0.1="" mg/ml)="" and="" the="" selective="" nps2143(1um)antagonist="" of="" the="" casr="" abolished="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" mobilization(ole/nps2143="168.8±11.43" nm,n="144" cells="" ys="" ole="209.0+13.45" nm.="" n="128"><0.05).to dissect="" further="" intracellular="" calcium="" signals="" in="" response="" to="" ole,="" functional="" experiments="" were="" also="" performed="" under="" acute="" stimulation="" with="" ole="" and="" nps2143.="" short-term="" treatment="" with="" ole="" (1="" mg/ml)="" evoked="" specific="" calcium="" oscillations(fig.4a)="" that="" were="" prevented="" when="" cells="" were="" pretreated="" with="" the="" selective="" casr="" inhibitor="" nps2143（10="" μm）.="" statistical="" analysis="" of="" the="" fluorescence="" responses（fig.="" 4b）revealed="" that="" incubation="" with="" ole="" increased="" cytosolic="" calcium="" by="" 97.06±6.93%(vs="" atp="" 100.00±2.28%).pretreatment="" with="" nps2143="" reduced="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" increase(ole/nps2143="18.87±2.17%,n=59" cells="" vs="" ole="97.06±6.93%," n="50" cell;=""><0.001).to deeper="" investigate="" whether="" the="" effect="" of="" ole="" on="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" occurred="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling,="" functional="" studies="" were="" performed="" as="" previously="" shown="" (fig.1b).="" interestingly,="" treatment="" with="" nps2143="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ole="" on="" avp-regulated="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.5;="" ole/ddavp/nps2143="190.4±7.15%," n="191 cells" vs="" ole/ddavp="88.70±1.86%,n=292"><0.001), suggesting="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" the="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling.="" compared="" to="" untreated="" cells,="" treatment="" with="" only="" nps2143="" did="" not="" affect="" the="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.="">

<0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" alt="Figure 2. Efects of OLE on AQP2 phosphorylation and cAMP production in MCD4 cells. (A) Evaluation of cAMP production by FRET experiments in MCD4 cells transiently transfected with H96 as described in the " materials="" and="" methods"="" section.="" histogram="" reports="" netfret="" measured="" in="" cells="" under="" basal="" conditions,="" treated="" with="" ddavp="" (100 nm="" for="" 30 min),="" ole="" (0.1 mg/ml="" o/n),="" or="" co-treated="" with="" ole="" and="" ddavp.="" te="" treatment="" with="" ddavp="" displayed="" a="" signifcantly="" higher="" camp="" production="" depicted="" as="" a="" reduced="" netfret="" signal.="" data="" are="" shown="" as="" single="" values="" in="" a="" scatter="" plot="" reporting="" means±s.e.m=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

Ảnh hưởng của OLE trên thận của chuột được tiêm OLE.

Để điều tra sâu hơn các hoạt động của OLE, các nghiên cứu in vivo đã được thực hiện. Cụ thể, chuột đã được tiêm OLE (25 0 mg / kg / ngày) mỗi ngày một lần trong ba ngày. Ngoài ra, chuột được đồng điều trị với OLE, trong 3 ngày và dDAVP, trong 3 0 phút. Đánh giá mRNA CaSR được phân lập từ ống thu thận của chuột và được xử lý cho PCR thời gian thực (Hình 6) cho thấy sự gia tăng đáng kể CaSR mRNA trong OLE (OLE =1. 87 ± 0,29, n {{ 10}} chuột so với CTR =1. 02 ± 0,17, n =5 chuột; p<0.05) and="" ole/ddavp(ole/ddavp="2.77±0.25," n="5" rats="" vs="" ctr="1.02±0.17,n=5" rats="" and="" ddavp="1.08±0.11," n="5" rats;=""><0.001)injected rats="" compared="" with="" control="" and="" ddavp="" animals,="" casr="" signaling="" can="" regulate="" the="" expression="" level="" of="" selective="" mirnas,="" which="" downregulated="" the="" expression="" level="" of="" aqp216.based="" on="" these="" findings,="" and="" considering="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" aqp2="" function,="" the="" level="" of="" mir-137,="" a="" known="" aqp2-targeting="" mir="" in="" the="" renal="" collecting="" duct,="" was="" evaluated.="" compared="" to="" control="" rats="" (fig.7),="" the="" level="" of="" mir-137="" in="" the="" renal="" collecting="" ducts="" of="" ole(ole="4.18.10-8±1.07.10-8ng,n=5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.05)and ole/ddavp="" rats="" was="" increased="" indicating="" that="" treatment="" with="" ole="" upregulates="" the="" casr="" signaling="" and="" the="" expression="" level="" of="" the="" mir-137(ole/ddavp="4.38.10-8±47.01·10-9ng," n="5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.01 and="" vs="" ddavp="2.1610-8±3.52.10-°ng," n="5"><0.05). to="" verify="" whether="" the="" increase="" of="" mir-137="" affected="" the="" expression="" level="" of="" aqp2,="" renal="" samples="" were="" processed="" for="" real-time="" pcr.="" data(fig.8a)revealed="" that="" the="" expression="" levels="" of="" aqp2="" mrna="" were="" lower="" in="" ole(ole="0.36±0.06,n=5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5"><0.01)and ole/ddavp(ole/ddavp="0.65±0.12," n="5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5" rats="" and="" ddavp="1.03±0.16,n=5" rats;=""><0.05)renal samples="" compared="" with="" specimens="" obtained="" from="" control="" animals.="" besides,="" western="" blotting="" analysis(fig.="" 8b)showed="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" the="" abundance="" of="" aop2="" regardless="" of="" ddavp="" stimulation(ole/ddavp="0.62±0.13,n=5" rats="" vs="" ddavp="1.04±0.16,n=5"><0.05)indicating that="" the="" ole-induced="" reduction="" of="" aqp2="" mrna="" expression="" level="" coincided="" with="" a="" decrease="" of="" aqp2="" protein="" content.="" to="" evaluate="" the="" effect="" of="" ole="" on="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking="" in="">quả thận, phân tích Western blotting và nghiên cứu đồng tiêu được thực hiện (Hình 9). Ở chuột được tiêm OLE / dDAVP, quá trình phosphoryl hóa AQP2 ở serine 256 đã giảm đáng kể so với mô thận của động vật được điều trị bằng dDAVP (OLE / dDAVP =0. 77 ± 0. 16, n =5 chuột so với dDAVP =2. 16 ± 0. 25, n =5 chuột; p<0.001,fig.9a),thereby confirming="" the="" in="" vitro="" findings(fig.2b).="" besides,="" confocal="" studies="" (fig.9b)="" of="" kidney="" sections="" revealed="" that="" exposure="" to="" ole="" prevented="" the="" aop2="" mem-brane="" localization="" that="" instead="" was="" observed="" in="" ddavp="" treated="">

Thảo luận

Canxi là một chất truyền tin nội bào quan trọng giúp điều chỉnh rất nhiều chức năng của tế bào2. Tín hiệu canxi bất thường có thể dẫn đến một số bệnh bao gồm suy tim, ung thư và tăng huyết áp23. Việc kiểm soát cụ thể sự biểu hiện và hoạt động của các protein kiểm soát nhiều tín hiệu canxi nội bào đã được chứng minh thành công khi đối mặt với nhiều rối loạn và do đó rất hấp dẫn để phát triển thuốc. Nghiên cứu này cung cấp những hiểu biết mới về cơ chế hoạt động của OLE bằng cách cho thấy khả năng điều chỉnh tín hiệu canxi nội bào thông qua việc kích thích CaSR có liên quan đến việc tinh chỉnh sự vận chuyển và biểu hiện AQP2 do vasopressin gây ra. Trong điều kiện sinh lý, AQP2 đóng một vai trò quan trọng trong việc kiểm soát cân bằng nội môi nước trong cơ thể25. Kích thích máy móc nội bào, dẫn đến nội địa hóa AQP2 ở màng sinh chất đỉnh, dẫn đến giữ nước bất thường và hậu quả là hạ natri máu như trong hội chứng tiết hormone chống bài niệu (SIADH) không thích hợp, xơ gan và suy tim sung huyết-. mô hình SIADH, liên quan đến bệnh thận đa nang 1 đơn bội, mức canxi nội bào cơ bản đã giảm đáng kể so với mức đo được trong ống góp của chuột hoang dã. Canxi nội bào thấp điều hòa hoạt động của một số enzym bao gồm cả protein phosphatase PP2A, dẫn đến điều hòa quá trình phosphoryl hóa AOP2 ở serine 2561. Ngược lại. sự hoạt hóa CaSR với calcimetic NPS-R568 làm tăng nồng độ calci nội bào và giảm mức cAMP trong các tế bào thiếu PKD1. Điều quan trọng là, canxi trong tế bào có thể điều chỉnh giảm lượng cyclase3 adenyl hóa ức chế canxi, do đó tinh chỉnh mức độ nội bào của cAMP. Trong tế bào MCD4, thực sự, sự kích thích CaSR với NPS-R568 làm giảm AQP 2- pS256 thông qua việc ức chế adenylate cyclase4.Trong nghiên cứu này, việc điều trị bằng OLE đã ngăn chặn sự gia tăng phụ thuộc vào vasopressin của cAMP và AOP 2- pS256, có thể thứ phát do tăng nồng độ canxi nội bào. Lưu ý, việc tiếp xúc với nguồn cAMP bên ngoài bằng cách sử dụng 8- Br-cAMP có thể thẩm thấu, đã chống lại đáng kể tác dụng ức chế của OLE trên con đường V2R.

Nồng độ canxi tế bào tăng cao có thể dẫn đến chết tế bào và quá trình apoptosis. Tuy nhiên, sự gia tăng bền vững canxi nội bào từ 25 0 nM đến lớn hơn 6 0 0 nM đã thúc đẩy sự sống sót của tế bào thần kinh4. Trong tế bào MCD4, điều trị bằng OLE ở 0,1 mg / ml không hiển thị một tác dụng độc tế bào. Ở nồng độ này, OLE (0,1 mg / ml) làm tăng nhẹ mức canxi nội bào. Hình ảnh canxi cho thấy kích thích cấp tính với OLE gây ra sự gia tăng nhất thời canxi nội bào thông qua sự hoạt hóa CaSR bị loại bỏ khi tế bào được nuôi cấy trước với chất đối kháng CaSR chọn lọc NPS2143, Trong tế bào ống thận gần, sự hoạt hóa dị ứng của CaSR với I-ornithine làm giảm sản xuất ROS do đó điều hòa giảm stress oxy hóa ty thể gây ra quá trình chết rụng tế bào356. Hơn nữa, nghiên cứu trước đây của chúng tôi cho thấy rằng sự biểu hiện của các biến thể tăng chức năng của CaSR làm giảm giải phóng ROS và S-glutathionyl hóa của AQP237. Ủ với OLE làm giảm quá trình tạo ROS trong tế bào MCD435 nhờ khả năng chống oxy hóa của nó. Tuy nhiên, hiện tại vẫn chưa rõ liệu OLE có ảnh hưởng đến quá trình AOP 2- S-glutathionylation hay không. Nhiều nghiên cứu cho thấy OLE hoặc oleuropein, là thành phần chính của OLE, có thể có vai trò bảo vệ bằng cách ức chế sự chết của tế bào, 39 Tuy nhiên, tác dụng phụ thuộc vào liều lượng đã được mô tả ở chuột nhận OLE. Các phản ứng có lợi thu được ở liều 250 và 500 mg / kg. Ngược lại, ở nồng độ cao hơn, việc điều trị bằng OLE có thể có những tác động có hại có thể do tác dụng chống oxy hóa của một số hợp chất phyto. Trong nghiên cứu này, những con chuột được tiêm OLE với liều 250 mg / kg trong ba ngày cho thấy sự điều hòa CaSR. Mức độ biểu hiện của CaSR được tăng lên bởi một số hợp chất hoạt động như chất hoạt hóa allosteric của thụ thể. Calcimimetics, thực sự, làm giảm vôi hóa mạch máu bằng cách tăng sinh tổng hợp CaSR trong tế bào cơ trơn mạch máu của con người0. Trong cuộc thi này, không thể loại trừ khả năng một số hợp chất trong OLE có thể hoạt động như các chất điều biến allosteric của CaSR. Mặt khác, kích thích bằng vasopressin có thể dẫn đến giải phóng IL -6 có thể góp phần làm tăng mức độ biểu hiện của CaSR42.

Trong thận, sự kích thích tín hiệu CaSR có liên quan đến sự điều hòa giảm biểu hiện AQP2 có thể thông qua miR -137 thế hệ.miRNAs là bộ điều biến hậu phiên mã quan trọng. Một số miRNA phụ thuộc vasopressin nhắm mục tiêu biểu hiện AQP2 cũng đã được mô tả43. Việc chuyển đổi với miR -32 và miR -137 đã làm giảm đáng kể mức độ biểu hiện của AOP2 trong các ô mpkCCDc14. Điều thú vị là OLE có thể làm giảm các tín hiệu viêm và phát huy tác dụng bảo vệ bằng cách điều chỉnh mức độ biểu hiện của một số miRNA ". Đặc biệt, trong các tế bào đa dạng u nguyên bào thần kinh đệm, OLE thúc đẩy sự biểu hiện của các miRNA khác nhau bao gồm miR -13745 có liên quan đến quá trình điều hòa của con đường tín hiệu Akt / mTOR 46. Đáng lưu ý, điều trị bằng oleuropein ngăn chặn tín hiệu Akt / mTOR thông qua việc kích hoạt CAMK và AMPK ". Kích hoạt CaSR với NPS-R568 kích hoạt AMPK và làm giảm hoạt động mTOR trong tế bào ống gần của người3. Phù hợp với những phát hiện này, ủ với OLE làm tăng canxi trong tế bào, điều hòa hoạt động PKA và giảm kích thước u nang trong mô hình nuôi cấy tế bào 3D48. Những phát hiện này kết hợp với nhau cho thấy rằng OLE có thể hữu ích trong việc điều trị các rối loạn đặc trưng bởi rối loạn điều hòa động lực canxi nội bào liên quan đến điều hòa giảm tín hiệu CaSR.

Chiết xuất lá ô liu bao gồm một số thành phần hoạt tính sinh học, bao gồm polyphenol, chất xơ và khoáng chất49. Hiện tại, vẫn chưa rõ liệu một hợp chất hoặc một sự kết hợp hiệp đồng của các hợp chất phytogic trong OLE có thể có lợi trong việc điều chỉnh các phản ứng nội bào hay không. Chất chiết xuất được sử dụng trong nghiên cứu này đã được ứng dụng như một chất phụ gia thực phẩm có thể có và do đó điều quan trọng là phải xác định tác động sinh lý của chính chất chiết xuất xem xét rằng một số phenol, bao gồm hydroxytyrosol, có thể được thận lọc và thu hồi trong nước tiểu50. Các nghiên cứu sâu hơn sẽ cung cấp hiệu quả của các thành phần cụ thể có thể tích cực điều chỉnh tín hiệu canxi nội bào thông qua CaSR. Để kết luận, nghiên cứu này cung cấp bằng chứng rằng OLE có thể được coi là một chất bổ trợ tiềm năng mới, hữu ích để giảm thiểu các rối loạn đặc trưng bởi giảm biểu hiện CaSR cũng như tín hiệu và ảnh hưởng đến tính thấm nước của thận.

Nguyên liệu và phương pháp

Hóa chất và kháng thể.Tất cả hóa chất và thuốc kháng sinh đều được mua từ Merck (Merck KGaA, Darmstadt, Đức). Calcein-AM, Fura -2- AM, môi trường nuôi cấy tế bào, huyết thanh bò thai (FBS) và Chất nền phát quang Super Signal West Pico đã được mua từ Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Hoa Kỳ) .Aquaporin { {2}} (AQP2) được phát hiện bằng cách sử dụng các kháng thể đặc hiệu (C-tail Ab) được nuôi dưỡng chống lại một peptit tổng hợp tương ứng với 15 axit amin đầu C cuối cùng của AQP2 người !. Kháng thể AQP 2- pS256 đã được Giáo sư Peter Deen ân cần tặng. Kháng thể kháng peroxidase kết hợp với peroxidase từ cải ngựa thứ cấp của dê chống lại thỏ được lấy từ Merck (Merck KGaA, Darmstadt, Đức). Một kháng thể thứ cấp chống thỏ chống dê kết hợp với Alexa -488 đã được mua từ Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Hoa Kỳ).

Sản xuất chiết xuất giàu phenolics và đặc điểm hóa học.Việc sản xuất chiết xuất giàu phenolic từ lá ô liu được thực hiện như báo cáo trong Ranieri et al.35. Sau khi xay bằng máy xay (Waring-Commercial, Torrington, CT, USA), nước ddH2O được thêm vào (tỷ lệ 1/2 0, w / y) và sau đó được siêu âm (CEIA, Viciomaggio, Ý) ba lần , trong 30 phút ở 35 ± 5 độ mỗi lần. Cuối cùng, các chất chiết xuất được lọc qua giấy lọc, đông khô và được bảo quản ở -20 độ C. Các chất chiết xuất thu được được lọc bằng bộ lọc nylon 0,45 μm （Merck KGaA, Darmstadt, Đức） và được sử dụng để xác định đặc tính hóa học. Tổng hàm lượng phenol, hoạt tính chống oxy hóa và xác định các hợp chất phenol đơn lẻ được thực hiện theo Difonzo và cộng sự. OLE cho thấy hàm lượng polyphenol, được xác định bởi Folin-Ciocalteu, bằng 195 mg. đương lượng axit gallic (GAE) và hoạt tính chống oxy hóa, được xác định bằng ABTS (2,2'-azino-bis (3- ethylbenzothiazoline -6- muối sulfonic axit diammonium）, chiếm 750 μmol TE （Trolox đương lượng) .

Nuôi cấy tế bào và phương pháp điều trị.Các tế bào MCD4 của ống thu vỏ chuột, biểu hiện ổn định AQP2 của người và V2R-Rluc nghệ được sử dụng làm mô hình thử nghiệm18. Các tế bào được nuôi trong hỗn hợp 1: 1 gồm môi trường Eagle's đã sửa đổi Dalbec-cos và F -12 được bổ sung 5% (y / y) huyết thanh bò thai. 1 phần trăm (y / y) L-glutamine và 1 phần trăm penicillin / streptomycin, 5 μM dexamethasone, 4 0 0 ug / ml G418 （cho kháng AQP2） và 1 ug / ml puromycin (cho V2R-Rluc kháng) , trong bầu không khí được làm ẩm 5% CO, ở 37 độ. Các tế bào MCD4 được để trong điều kiện cơ bản (CTR) hoặc được điều trị lâu dài bằng OLE ở 0,1 mg / ml O / N, dDAVP ở 100 nM trong 30 phút, hoặc được đồng xử lý với OLE và dDAVP hoặc NPS2143 ở l μM O / N .Ngoài ra, các tế bào được tiếp xúc với 8- Br-cAMP ở 500 μM trong 45 phút, các thí nghiệm ngắn hạn được thực hiện với OLE ở 1 mg / ml trong 5 phút và NPS2143 ở 10 μM trong 15 phút. Thử nghiệm đã được thực hiện 3-5 lần độc lập bằng cách sử dụng các ô từ các đoạn khác nhau.

Mô hình động vật và phương pháp điều trị.Tất cả các quy trình đã được thực hiện theo thỏa thuận với Hướng dẫn Quốc gia Đan Mạch về chăm sóc và xử lý động vật thí nghiệm và các hướng dẫn đã xuất bản của Viện Y tế Quốc gia, các quy trình đã được Viện Y học Lâm sàng phê duyệt. Đại học Aarhus, theo giấy phép sử dụng động vật thí nghiệm do Bộ tư pháp Đan Mạch cấp (Số phê duyệt 2015-15-0201-00658). Các nghiên cứu được thực hiện trên chuột Wistar đực trưởng thành với trọng lượng ban đầu là 200-225 g. Động vật được duy trì theo chế độ ăn tiêu chuẩn dành cho loài gặm nhấm (Altromin, Lage, Đức) và được sử dụng nước máy miễn phí. Trong các thí nghiệm, chuột được nhốt thành từng nhóm hai con trên mỗi lồng, với chu kỳ sáng-tối 12 giờ 12 phút, nhiệt độ 21 ± 2 độ C và độ ẩm 55 ± 2 phần trăm. Năm con chuột được điều trị bằng cách tiêm dưới da 1 ng dDAVP (Sigma-Aldrich, Glostrup, Đan Mạch) trong nước muối 200 ul / con, và năm con chuột được điều trị bằng phương tiện làm đối chứng. Sau 30 phút, những con chuột bị giết và thận được xử lý như mô tả dưới đây.

Tế bào và IMCD ly giải.Tế bào được nuôi cấy trên đĩa {{0}} mm và được tiếp tục lại trong bộ đệm chứa 22 0 mM mannitol, 7 0 mM sucrose, {{1 0}}. 5 M EGTA pH 8,0,0,5 M EDTA pH 8,0,1 M Tris-HCl pH 7,4 khi có mặt của protease (1 mM PMSF, 2 mg / ml leupeptin và 2 mg / ml pepstatin A) và phosphataza (10 mM NaF và 1 mM natri orthovanadat) chất ức chế. Alternativelv, các phần thận khoảng 0,5 mm được chuẩn bị và cân bằng trong 10 phút trong dung dịch đệm chứa 1i8 mM NaCl, 16 mM Hepes, 17 mM Na-Hepes, 14 mM glucose, 3,2 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,8 mM MgSO4, và 1,8 mM KH2PO4 (pH7,4). Nhú sau được cắt nhỏ bằng kéo trong cùng một dung dịch đệm với sự có mặt của protease (1 mM PMSF, 2 mg / mlleupeptin và 2mg / mlpepstatin A) và phosphatase (10 mM NaF và 1 mM natri chất ức chế orthovanadate) Sau khi sonica-tion (60 kHz trong 5 giây), dịch ly tâm được ly tâm ở 12, 000 × g trong 10 phút. các chất nổi phía trên được thu thập và sử dụng cho các nghiên cứu hấp thụ miễn dịch '8.

Kính hiển vi cùng tiêu điểm.Các nghiên cứu đồng bộ đã được thực hiện như đã mô tả trước đây1. Tóm lại, các tế bào được nuôi cấy trên các tấm PET nuôi cấy tế bào và được xử lý như mô tả ở trên. Ngoài ra, các phần thận thu được từ đối chứng, OLE, dDAVP và OLE với chuột được xử lý bằng dDAVP đã được thực hiện các thí nghiệm miễn dịch huỳnh quang như đã mô tả trước đây. Hình ảnh thu được bằng kính hiển vi huỳnh quang quét laser đồng tiêu Leica TCS SP2 (Leica Microsystems, Heerbrugg, Thụy Sĩ). Điện di trên gel và phương pháp hấp thu miễn dịch. Protein được phân tách trên 12% gel polyacrylamide không vết (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, US.A.) trong các điều kiện khử như đã mô tả trước đây =5, 52. Một cách ngắn gọn, các dải protein đã được chuyển vào màng Immobilon-P (Merck KGaA, Darmstadt, Đức) và được đánh dấu miễn dịch bằng cách sử dụng kháng thể kháng AQP2 (Pre-C-tail Ab) và chống AQP 2- pS256. Các tín hiệu miễn dịch thu được bằng cách sử dụng Chất phát quang siêu tín hiệu West Pico với Hệ thống Chemidoc (Phòng thí nghiệm Bio-Rad, Inc., Hercules, CA, Hoa Kỳ). Các sợi dây được chuẩn hóa thành tổng số protein bằng công nghệ không vết (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Phân tích đo lường được thực hiện bằng ImageLab (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) và phân tích bằng GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Xét nghiệm độ thấm nước.Độ thấm nước thẩm thấu được đo như đã mô tả trước đây43. Tóm lại, các tế bào MCD4 được nuôi cấy trên các tấm bìa thủy tinh 40- mm. Sau khi xử lý, các tế bào được nạp 10 μM Calcein-AM thấm qua màng trong 45 phút ở 37 độ, 5% CO, trong DMEM / F -12. Các tấm phủ được gắn trong một buồng truyền dịch (Hệ thống buồng kín FCS2, BIOPTECHS, Butler, Hoa Kỳ). và phân tích hình ảnh. Các mẫu được nạp Calcein-AM được kích thích ở bước sóng 490 nm. Các phép đo huỳnh quang, sau đây là đẳng áp (140 mM NaCl. 5 mM KCl, 1 mM MgCl. 1 mM CaCl., 10 mM axit Hepes sulfonic, 5 mM Glucose, pH7.4) hoặc hyperosmotic (dung dịch đẳng tích được thêm với 135 mM Mannitol) các dung dịch . được thực hiện bằng phần mềm Metafluor (Thiết bị phân tử, Công nghệ phân tích MDS, Toronto, Canada). Dữ liệu về thời gian phát huỳnh quang sau khi tưới tế bào bằng dung dịch iso và hyperosmotic đã được ghi lại. Quá trình thời gian co rút của tế bào được đo bằng hằng số thời gian (Ki, được biểu thị bằng 1 / r, giây), một tham số tương quan với độ thấm nước, thu được bằng cách khớp dữ liệu với một hàm số mũ được phân tích bằng GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego , CA, Hoa Kỳ).

Phép đo truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang.Để đánh giá sự thay đổi cAMP nội bào, công nghệ truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) đã được áp dụng. Đối với các thí nghiệm FRET, các tế bào được truyền plasmid mã hóa cảm biến H96 có chứa mô-típ đồng thuận liên kết cAMP của EPAC1 được nhúng giữa protein huỳnh quang màu lục lam (CFP) và cp173Venus-Venus như được trình bày trước đó32.33.54. Plasmid mã hóa cho đầu dò H96 là một món quà từ Dr.K. Jalink. Hình ảnh các tế bào biểu hiện ECFP và / hoặc EYFP và phát hiện FRET được thực hiện bằng kính hiển vi TE 2000- S ngược (kính hiển vi Nikon Eclipse, Tokyo, Nhật Bản). Mỗi hình ảnh đã được chỉnh sửa và phân tích như được hiển thị trước đây55.

Các phép đo canxi nội bào. Các phép đo canxi nội bào được thực hiện như đã trình bày trước đây56. Tóm lại, các ô MCD4 được tải với 4 μM Fura -2 AM trong 15 phút ở 37 độ trong DMEM / F -12. Dung dịch Ringer được sử dụng để tưới máu cho các tế bào trong thí nghiệm chứa 140 mM NaCl, 5 mM KCl 1 mM MgCl, 10 mM HEPES, 5 mM Glucose, 1,8 mM CaCl, pH 7,4. Trong phép đo huỳnh quang, các tấm phủ có các ô quá tải được gắn trong một buồng truyền dịch (Hệ thống buồng kín FCS2. BIOPTECHS. Butler, USA). Các phép đo được thực hiện bằng kính hiển vi TE 2000- S ngược (kính hiển vi Nikon Eclipse, Tokyo. Nhật Bản), Tỷ lệ giữa cường độ huỳnh quang ở bước sóng 340 và 380 nm được vẽ biểu đồ và tính toán như sự thay đổi của độ huỳnh quang. Đặc biệt, kích thích với OLE （1 mg / ml） hoặc NPS2143 （10 μM） được so sánh trong cùng một loại tế bào với những kích thích thu được sau khi kích thích với liều tối đa của chất chủ vận qua trung gian canxi ATP （100 μM） được sử dụng làm kiểm soát nội bộ (100%).

Mức canxi nội bào được đo ở trạng thái ổn định và được hiệu chuẩn như mô tả của Grynkiewicz57. OLE và NPS2143 đã được sử dụng lâu dài ở mức 0. 1 mg / ml và l uM, và mỗi mẫu được hiệu chuẩn bằng cách bổ sung 5 μM ionomycin với sự hiện diện của 1 mM EGTA （Rm.） Sau đó là 5 μM ionomycin trong 5 mM CaCl, (RMA).

Phân tích PCR thời gian thực của mRNA AQP2 và CaSR ở chuột đối chứng và được điều trị.Các thí nghiệm PCR thời gian thực được thực hiện để đo lường sự biểu hiện tương đối của mRNA trong ống góp nội tủy (IMCD) được phân lập từ các nhú thận chuột đối chứng và được điều trị. Các lát thận có kích thước khoảng 0. 5 mm được tạo ra và cân bằng trong 10 phút trong dung dịch đệm chứa 118 mM NaCl, 16 mM HEPES, 17 mM Na-Hepes, 14 mM glucose, 3,2 mM KCl, 2,5 mM CaCl2,1,8 mM MgSO4 và 1,8 mM KH2PO4 (pH 7,4). Nhú thận được phân lập dưới kính hiển vi soi nổi. Sau đó, các mẫu vật từ chuột đối chứng và chuột đã qua xử lý được băm nhỏ bằng máy cắt kéo trực tiếp tại Trizol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Hoa Kỳ), theo đề xuất của nhà sản xuất (25C trong 10 phút; 42C trong 60 phút; 85C trong 5 phút). Khuếch đại PCR thời gian thực được thực hiện bằng cách sử dụng TagMan Fast Advanced Master Mix với các xét nghiệm CaSR, AOP2 và GAPDH (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) trong Hệ thống PCR thời gian thực StepOne (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA ), cài đặt các điều kiện chu kỳ nhiệt theo quy định của nhà sản xuất (95 độ C trong 20 giây; 40 chu kỳ tự nhiên thay đổi ở 95 · C trong 1 giây và 60 độ C trong 20 giây). Kết quả được biểu thị bằng 2- giá trị (định lượng tương đối) với △ ACt=(Ct target-Ct GAPDH) được xử lý- (Ct target-Ct GAPDH) Sham1.

đánh giá miRNA -137 ở chuột kiểm soát và được điều trị.Nội dung miRNA {{0}} trong ống thu nội tủy bên trong chuột được kiểm soát và điều trị đã được đánh giá bằng cách sử dụng TagMan Advanced miRNA Assays (has-miR -137; Assay ID; 477904 mir; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA .US.A), cho phép thông báo có độ nhạy cao và cụ thể về miRNA trưởng thành bằng cách sử dụng PCR định lượng. Các lát thận có kích thước khoảng 0,5 mm được tạo ra và cân bằng trong 10 phút trong dung dịch đệm chứa 118 mM NaCl, 16 mM HEPES, 17 mM Na-Hepes, 14 mM glucose, 3,2 mM KCl, 2,5 mM CaCl2,1,8 mM MgSO4 và 1,8 mM KH2PO4 (pH7,4). Nhú thận được phân lập dưới kính hiển vi soi nổi. Các mẫu vật từ chuột đối chứng và đã được xử lý sau đó được băm bằng máy cắt kéo trực tiếp tại Trizol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) để chiết xuất RNA tổng số. TaqMan Bộ tổng hợp miRNA cDNA nâng cao （Danh mục n²∶A25576; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA） đã được sử dụng để tổng hợp cDNA, theo quy trình do nhà sản xuất cung cấp (phản ứng nối đuôi Poly (A); phản ứng thắt; phản ứng phiên mã ngược; phản ứng miR-Amp). ARN tổng hợp (UUAUUGCUUAAGAAUACGCGUAG) với 59- phosphor được Thermo Fisher Scientific tổng hợp và được sử dụng để thực hiện đường chuẩn để nội suy các giá trị mẫu miRNA và để có được đánh giá chính xác (tính bằng nanogram) của hàm lượng miR -137 trong mẫu 16, bằng cách sử dụng GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Phân tích thống kê.Tất cả các giá trị được báo cáo dưới dạng giá trị trung bình ± SEM Phân tích thống kê được thực hiện bởi ANOVA một chiều, theo sau là kiểm tra nhiều so sánh Newman-Keuls với * p<0.05 considered="" statistically="" different="">

Tuyên bố, phê duyệt đạo đức và đồng ý tham gia.Các nghiên cứu trên động vật được thực hiện theo Hướng dẫn Quốc gia Đan Mạch về chăm sóc và xử lý động vật thí nghiệm và các hướng dẫn đã xuất bản của Viện Y tế Quốc gia. Ủy ban đạo đức chăm sóc động vật của Viện Y học Lâm sàng, Đại học Aarhus đã phê duyệt các đề cương nghiên cứu, theo giấy phép sử dụng động vật thí nghiệm do Bộ Tư pháp Đan Mạch cấp (Số phê duyệt 2015-15-0201-00658). Các tác giả xác nhận rằng tất cả các phương pháp đã được thực hiện theo các hướng dẫn và quy định có liên quan. Hơn nữa, các tác giả xác nhận rằng nghiên cứu được thực hiện tuân thủ các hướng dẫn ARRIVE.

Người giới thiệu

1. El, SN & Karakaya, S. Cây ô liu (Olea europaea) để lại những tác dụng có lợi cho sức khỏe con người. Nutr. Khải huyền 67, 632–638.

2. Javadi, H., Yaghoobzadeh, H., Esfahani, Z., Reza Memarzadeh, M. & Mehdi Mirhashemi, S. Ảnh hưởng của chiết xuất lá ô liu đối với phản ứng chuyển hóa, chức năng gan, thận và các dấu ấn sinh học viêm ở bệnh nhân tăng huyết áp. PJBS 22, 342–348.

3. Saibandith, B., Spencer, JPE, Rowland, IR & Commane, DM Olive polyphenol, và hội chứng chuyển hóa. Phân tử

4. Cherif, S. và cộng sự. Một thử nghiệm lâm sàng của chiết xuất Olea đã được chuẩn độ trong điều trị tăng huyết áp động mạch thiết yếu. J. Pharm. Bụng. 51, 69–71 (1996).

5. Difonzo, GRA và cộng sự. Chiết xuất màu xanh lá cây từ cây ô liu cortina để lại đặc tính chống oxy hóa và hoạt tính sinh học. J. Funct. Thực phẩm 31, 8.

6. Herrero, M. và cộng sự. Các khả năng mới để hóa trị các sản phẩm phụ của dầu ô liu. J. Chromatogr. 1218, 7511–7520.

7. Marchetti, C. et al. Chiết xuất lá ô liu giàu oleuropein ảnh hưởng đến động lực của canxi và làm suy giảm khả năng tồn tại của các tế bào ung thư trung biểu mô ác tính. eCAM 2015, 908493.

8. Romero, M. và cộng sự. Tác dụng hạ huyết áp của chiết xuất lá ôliu giàu oleuropein ở chuột tăng huyết áp tự phát. Chức năng Thực phẩm 7, 584–593.

9. Hall, JE Rối loạn chức năng thận, hơn là rối loạn chức năng mạch máu không thượng thận. Điều hòa chứng tăng huyết áp do muối. Lưu hành 133, 894–906.

10. Wilson, JL, Miranda, CA & Knepper, MA Vasopressin và quy định của aquaporin -2. Clin. Hết hạn. Nephrol. 17, 751–764.