Tổng Quan Về Thành Phần Phlorotannins Trong Fucales Phần 2

5. Phương pháp choĐặc tính và định lượng

Mặc dù mối quan tâm ngày càng tăng theo cấp số nhân đối với các hoạt tính sinh học của PT và các ứng dụng tiềm năng trong một loạt các chiến lược trị liệu, một trong những khó khăn chính khi xử lý các hợp chất này là đặc tính hóa học và làm sáng tỏ cấu trúc của chúng. Do tính biến đổi hóa học rất lớn và độ phức tạp của PT, đồng thời với sự hạn chế về tiêu chuẩn thương mại, việc phân tích PT hiện vẫn là một nhiệm vụ khá khó khăn. Khá phổ biến là tìm thấy công việc không vượt quá ước tính của các PT bằng phương pháp so màu [56,72,73]. Tuy nhiên, nhiều nỗ lực đã được thực hiện để làm sáng tỏ các đặc điểm cấu trúc của PT, vốn đã cung cấp những hiểu biết có liên quan về hóa học của các hợp chất này.

Glycoside của cistanche cũng có thể làm tăng hoạt động của SOD trong các mô tim và gan, đồng thời làm giảm đáng kể hàm lượng lipofuscin và MDA trong mỗi mô, loại bỏ hiệu quả các gốc oxy phản ứng khác nhau (OH-, H₂O₂, v.v.) và bảo vệ chống lại tổn thương DNA gây ra bởi gốc OH. Cistanche phenylethanoid glycoside có khả năng loại bỏ gốc tự do mạnh mẽ, khả năng khử cao hơn vitamin C, cải thiện hoạt động của SOD trong huyền phù tinh trùng, giảm hàm lượng MDA và có tác dụng bảo vệ nhất định đối với chức năng màng tinh trùng. Cistanche polysacarit có thể tăng cường hoạt động của SOD và GSH-Px trong hồng cầu và mô phổi của chuột lão hóa thực nghiệm do D-galactose gây ra, cũng như làm giảm hàm lượng MDA và collagen trong phổi và huyết tương, đồng thời tăng hàm lượng elastin, có tác dụng nhặt rác tốt đối với DPPH, kéo dài thời gian thiếu oxy ở chuột già, cải thiện hoạt động của SOD trong huyết thanh và làm chậm quá trình thoái hóa sinh lý của phổi ở chuột già thực nghiệm. Với sự thoái hóa hình thái tế bào, các thí nghiệm đã chỉ ra rằng Cistanche có khả năng chống oxy hóa tốt và có tiềm năng trở thành dược phẩm ngăn ngừa và điều trị các bệnh lão hóa da. Đồng thời, echinacoside trong Cistanche có khả năng đáng kể trong việc loại bỏ các gốc tự do DPPH và có khả năng loại bỏ các loại oxy phản ứng và ngăn chặn sự thoái hóa collagen do gốc tự do gây ra, đồng thời cũng có tác dụng sửa chữa tốt đối với tổn thương anion gốc tự do của thymine.

Nhấp vào Bổ sung Cistanche Tubulosa

【Để biết thêm thông tin:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Trong lĩnh vực này, sắc ký lỏng kết hợp với khối phổ tiếp tục là một công cụ phân tích mạnh mẽ để phân tích nhanh các hợp chất này, mặc dù có một số sắc thái khi so sánh với phenolics đất. Chủ đề này thúc đẩy những khám phá được thực hiện trong những năm qua về các phương pháp được sử dụng để tách và xác định các PT từ Fucales.

5.1. Định lượng phlorotannin bằng quang phổ

Các phương pháp đo quang phổ để định lượng PT cung cấp một cách tiếp cận nhanh chóng và đơn giản để đánh giá hàm lượng PT trong một mẫu hoặc dịch chiết nhất định. Là các hợp chất phenolic, các phương pháp Folin-Denis hoặc Folin-Ciocalteu (FC) vẫn là phương pháp khả thi để theo dõi tổng hàm lượng PT. Cả hai phương pháp đều dựa trên sự khử nổi tiếng qua trung gian hóa học phenol của thuốc thử phosphotungstic-phosphomolybdic (thuốc thử FC) tạo thành màu xanh lam với phổ hấp thụ ở khoảng 760 nm [74]. Tuy nhiên, mặc dù PT là hợp chất phenolic chính có trong rong nâu, nhưng một số hợp chất phenolic không phải phlorotannin khác cũng có mặt [75]. Hơn nữa, thuốc thử này thiếu độ nhạy vì nó không chỉ phản ứng với phenolic mà còn với bất kỳ chất khử nào (ví dụ: đường, protein, vitamin, thiol và ion vô cơ) trong mẫu, do đó, đo khả năng khử tổng của nó [76] . Do đó, khi trọng tâm là các PT, đây có thể không phải là cách tiếp cận phù hợp nhất vì những phản ứng không đặc hiệu này có thể dẫn đến kết quả đọc sai và ước tính sai. Một phương pháp cụ thể hơn đã được phát triển bởi Stern et al. [77] sử dụng 2,4- dimethoxybenzaldehyde (DMBA) để phản ứng cụ thể với 1,3- và 1,3,5-phenol thay thế, chẳng hạn như phloroglucinol và PT, và tạo thành sắc tố triphenylmethane có thể được theo dõi trong phạm vi 510 nm. Tuy nhiên, phản ứng này phụ thuộc vào mức độ phân nhánh của hợp chất hoặc sự có mặt của các nhóm hydroxyl bổ sung, chẳng hạn như quầng sáng. Vì phản ứng với DMBA phải xảy ra giữa các nhóm hydroxyl thông qua hai, bốn hoặc sáu vị trí, nên việc thay thế các vị trí này sẽ cản trở sự hình thành nhóm mang màu, cuối cùng dẫn đến đánh giá thấp.

Mặc dù các phương pháp này được coi là hữu ích để ước tính nhanh chóng và sơ bộ hàm lượng PT của nhiều mẫu, nhưng nhược điểm chính của chúng là không có khả năng định lượng và xác định chính xác các hợp chất riêng lẻ, điều này khiến cần phải chuyển sang các kỹ thuật phân tích và phân tách tinh vi và mạnh mẽ hơn để cho phép làm sáng tỏ đúng đắn các đặc điểm cấu trúc của PT.

5.2. Phương pháp tách và xác định phlorotannins'

5.2.1. HPLC-DAD

Do sự giống nhau về cấu trúc và độ phức tạp của chúng, việc phân tích và xác định các hợp chất riêng lẻ của PT vẫn là một nhiệm vụ khá khó khăn. Một trong những vấn đề chính gặp phải trong phân tích PT là sự phân tách sắc ký của chúng. Sự tương đồng gần gũi của các cấu trúc hợp chất và khả năng hình thành nhiều đồng phân gây khó khăn cho việc phân tách các PT riêng lẻ một cách thích hợp khi sử dụng HPLC và ngay cả trong biến thể nâng cấp của nó, UHPLC. Trong lĩnh vực này, tài liệu được chia thành hai cách tiếp cận chính: sắc ký đảo ngược và pha thường. Một mặt, mặc dù sắc ký đảo ngược rất hữu ích để tách các hợp chất có cấu trúc tương tự trong các mẫu phức tạp, nhưng bản chất phân cực cao của PT khiến chúng có ái lực đặc biệt với pha động, dẫn đến quá trình rửa giải rất nhanh và tạo thành các "bướu" điển hình, kém phân giải. ” [78]. Tuy nhiên, kỹ thuật này đã được sử dụng rộng rãi để phân tích PT của nhiều Fucales, bao gồm một số loài thuộc chi Fucus (F. vesiculosus, F. Aguirre, F. serratus, và F. xoắn ốc), Cystoseira (C. nodi caulis) , C. tamariscifolia và C. usneoides), A. nodosum và B. chia đôi, trong số những loài khác; và mặc dù nó thường không cho phép tách các hợp chất dài hơn 8–10 đơn vị, nhưng nó rất hữu ích để đạt được những hiểu biết có giá trị về mức độ polyme hóa thấp của cấu hình PT của các loại rong biển này [16,47,48,50,79]. Mặt khác, pha thông thường liên quan đến việc sử dụng pha tĩnh phân cực giúp giữ lại các hợp chất phân cực cao này tốt hơn. Trước đây, việc sử dụng kỹ thuật này để phân tách và phân lập PT thường xuyên hơn, với các tác giả áp dụng quá trình tiền acetyl hóa các hợp chất. Thật vậy, bằng cách sử dụng kỹ thuật này, Glombitza và đồng nghiệp của ông đã có thể phân lập và mô tả đặc điểm của một số PT từ các chi Cystophora, Sargassum và Carpophyllum [80–83], và thậm chí xác định được các PT halogen hóa trong Carpophyllum angustifolium [84] và ở các loài khác nhau từ chi, Cystophora [85,86]. Gần đây hơn, Koivikko et al. [87] đã phát triển một phương pháp NP-HPLC phù hợp để tách các PT của F. vesiculosus theo mức độ trùng hợp của chúng mà không yêu cầu bước acetyl hóa trước đó và có khả năng tạo ra sắc ký đồ với thời gian lưu và độ rõ cực đại được cải thiện so với RP-HPLC. Kỹ thuật này cũng đã được sử dụng để phân tích các chất chuyển hóa PT trong các mẫu nước tiểu của những người tình nguyện sử dụng A. nodosum [88]. Vấn đề chính của NP-HPLC là các PT cao hơn với số lượng nhóm hydroxy cao hơn sẽ thiết lập các tương tác mạnh với các pha tĩnh phân cực, khiến chúng rất khó rửa giải. Hơn nữa, việc kết nối các dung môi NP điển hình với ESI có thể là một thách thức do độ nhạy giảm do hiệu quả ion hóa kém trong 100% dung môi không phân cực [78].

Các phương pháp thay thế gần đây đã được khám phá để khắc phục những vấn đề này. Đây là trường hợp của sắc ký lỏng tương tác ưa nước (HILIC), được coi là một biến thể của sắc ký lỏng pha thường, và được đặc trưng bởi sự kết hợp của pha tĩnh ưa nước với dung dịch rửa giải nước thấp pha đảo ngược, thúc đẩy sự hình thành hai lớp trong thiết bị di động. nghĩa là, một lớp giàu nước hình thành trên bề mặt của pha tĩnh phân cực và một lớp giàu chất hữu cơ khác hình thành trên lớp đó (Hình 3), tạo ra một hệ thống giống như chiết lỏng/lỏng bên trong cột [89 ]. Trong chế độ sắc ký này, các chất phân tích được phân bố giữa hai lớp này và được rửa giải theo sự dịch chuyển cân bằng phân vùng xảy ra giữa hai pha này, mặc dù các tương tác khác, chẳng hạn như lưỡng cực-lưỡng cực, liên kết hydro và lực tĩnh điện cũng đóng một vai trò quan trọng [90 ].

Những đặc điểm này làm cho các cột HILIC trở nên phù hợp nhất để tách các PT, cho phép chúng thiết lập các tương tác mạnh với pha tĩnh phân cực, do đó làm tăng thời gian lưu và thời gian tách của chúng. Kỹ thuật này đã được áp dụng để tách các PT từ dịch chiết của các Fucales khác nhau, cụ thể là F. vesiculosus, F. xoắn ốc, A. nodosum, S. longicorns và P. canaliculata, cho phép tách và phát hiện các hợp chất có độ trùng hợp nằm trong khoảng từ 3 đến 49 đơn vị [78], vượt xa so với báo cáo của Tierney et al. [45], người đã thực hiện một nghiên cứu tương tự bằng cách sử dụng cột RP để định hình F. xoắn ốc, A. nodosum và P. canaliculata và chỉ đạt được khả năng phát hiện các hợp chất có DP tối đa 16 đơn vị [45].

Gần đây hơn, các kỹ thuật 2D LC (Hình 4) đã được sử dụng thành công để đánh giá các hỗn hợp PT phức tạp trong chiết xuất rong biển, đạt được sự phân tách được cải thiện đáng kể. Theo phương pháp này, các mẫu được bơm vào một thiết bị chứa hai cột phân tách được kết nối tuần tự để dung dịch rửa giải thoát ra từ cột thứ nhất được chuyển sang cột thứ hai, cột này sẽ chạy trong các điều kiện khác nhau. Thông thường, cột thứ hai có một cơ chế phân tách bổ sung cho cột đầu tiên, do đó các pic được phân giải kém từ cột thứ nhất có thể được phân tách chính xác trong cột thứ hai [91]. Trong trường hợp cụ thể của PT, các thiết lập được báo cáo thường xuyên nhất mô tả sự kết hợp của các cột HILIC (chiều thứ nhất) để tách các hợp chất theo mức độ trùng hợp của chúng, với các cột RP (chiều thứ hai), cho phép phân tách theo tính kỵ nước của chúng. Sử dụng kỹ thuật này, Montero et al. đã có thể phân tách và phát hiện hơn 50 hợp chất trong loài Cystoseria abies-marina [4] và hơn 70 hợp chất trong Sargassum muticum [92]. Bảng 2 tổng hợp các cấu hình và điều kiện sắc ký khác nhau đã được sử dụng theo thời gian để phân tách và phát hiện các PT trong Fucales.

Đương nhiên, bất kể cột được sử dụng là gì, U/HPLC luôn yêu cầu ghép nối với hệ thống phát hiện để theo dõi các hợp chất khi chúng rửa giải. Máy dò UV-Vis, đặc biệt là mảng photodiode (PDA), được cho là máy dò phổ biến nhất được nối với HPLC do nhiều hợp chất tự nhiên quan tâm hấp thụ trong vùng UV-Vis (từ 190–600 nm) [93]. Đặc biệt, phenolic thường thể hiện độ hấp thụ mạnh ở khoảng 270–280 nm, và các PT cũng không ngoại lệ, vì cực đại hấp thụ của chúng gần bằng 270 nm [94]. Việc xác định các hợp chất sử dụng HPLC-PDA có thể đạt được bằng cách so sánh phổ UV và thời gian lưu của một hợp chất nhất định với tiêu chuẩn thương mại của nó. Hơn nữa, kỹ thuật này rất hữu ích để xác định hàm lượng của các hợp chất riêng lẻ trong các mẫu phức tạp, vì nồng độ của các hợp chất đó, được xuất ra dưới dạng độ hấp thụ, có thể được đo định lượng bằng Định luật Beer [95]. Tuy nhiên, việc áp dụng phương pháp này để xác định và định lượng PT là rất hạn chế do chỉ có một số lượng nhỏ các tiêu chuẩn thương mại sẵn có cho mục đích này. Do đó, việc xác định các PT thường đòi hỏi các kỹ thuật mạnh hơn, chẳng hạn như khối phổ (MS) hoặc cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).

5.2.2. Khối phổ

Việc sử dụng MS kết hợp trực tiếp với các thiết bị U/HPLC đã cách mạng hóa đặc tính của các chiết xuất phức tạp, mang lại độ nhạy cao và cải thiện khả năng phân tích trong một thời gian tương đối ngắn. Vì lý do đó, kỹ thuật này đã trở thành một phương pháp ổn định để mô tả đặc tính và nhận dạng các hợp chất phenolic nói chung, bao gồm cả các PT. Tandem MS hoặc MS/MS cho phép phát hiện tỷ lệ khối lượng trên điện tích (m/z) của các ion giả phân tử của hợp chất (thường được tạo ra thông qua quá trình ion hóa phun điện) khi chúng rửa giải khỏi cột và tiếp tục thu được sự phân mảnh tương ứng của chúng các mẫu thông qua phân ly do va chạm (CID) [118]. Đây là một bước quan trọng trong việc gán các PT vì các mảnh được hình thành có thể cung cấp thông tin quan trọng về các đặc điểm cấu trúc của ion mẹ tạo ra chúng. Thông thường, hầu hết mọi PT đều có đỉnh cơ sở tại MS2 tương ứng với việc mất một hoặc hai gốc nước [46]. Tương tự như vậy, việc mất 126 Da là một đặc điểm chung của các hợp chất này vì điều này tương ứng với nửa phloroglucinol, là khối xây dựng của các PT [119]. Sự xuất hiện của một số tổn thất trung tính nhất định gây bất lợi cho những người khác là điều quan trọng để hiểu loại liên kết được thiết lập giữa các đơn vị phloroglucinol. Ví dụ: giả sử rằng các liên kết C−C thường cần năng lượng cao hơn để phá vỡ so với các liên kết C−O−C, fucol, phlorethols và fucophlorethols với cùng mức độ trùng hợp sẽ hiển thị cùng trọng lượng phân tử, nhưng cuối cùng tạo ra các kiểu phân mảnh khác nhau. Trong phlorethol, sự phân mảnh có thể xảy ra ở cả hai phía của liên kết ether, tạo ra tổn thất trung tính 126, 142 hoặc 110 Da (Hình 5A), tương ứng với phloroglucinol, tetrahydroxy benzen hoặc resorcinol, cũng như sự kết hợp của chúng với phloroglucinol bổ sung hoặc nước các đơn vị. Ngược lại, việc phá vỡ các liên kết CC đặc trưng trong nhiên liệu chỉ có thể dẫn đến thất thoát trung tính 126 Da (phloroglucinol) và vì các liên kết này cần năng lượng cao hơn để phá vỡ, nên nhiên liệu cũng thường xuất hiện tổn thất trung tính 14, 28, 44 và 84 Da (Hình 5B), cũng như sự kết hợp của chúng với phloroglucinol bổ sung hoặc gốc nước, là dấu hiệu cho thấy sự phân cắt vòng chéo. Các hợp chất hiển thị cả hai loại phân cắt rất có thể là fucophlorethols (Hình 5A, B) [48]. Mặt khác, fuhalol dễ phân biệt hơn một chút vì các hợp chất này có sự sắp xếp giống như chloroethyl có chứa ít nhất một nhóm hydroxyl bổ sung. Do đó, ion giả phân tử của một hội trường với mức độ trùng hợp nhất định luôn thể hiện m/z 16 Da cao hơn, so với phloretin tương đương của nó (Hình 5C). Ngoài ra, phổ MS/MS của các hợp chất này thường xuất hiện nhiều ion sản phẩm và/hoặc tổn thất trung tính tương ứng với tetrahydroxy benzen và sự kết hợp của nó với phloroglucinol (ví dụ: [MH]− tại m/z 265, 389, 513, v.v.) [92].

【Để biết thêm thông tin:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】