Trong nghiên cứu hiện tại, galactan exopolysacarit (EPS) từnước tiểuKR780676 đã được đánh giá về khả nănggiảm bớt stress oxy hóasử dụng các xét nghiệm in vitro và nghiên cứu in vivo, saccharomyces cerevisiae (loại hoang dã) vàchống oxy hóa(sod14, sod24, tsa14, cta2 và ctt12)chống apoptotic(pep4 và fs14) vàchống lão hóa(sod24, tsa1 và ctt12)) đột biến xóa gen đồng phân. Galactan thể hiện DPPH mạnh vàhoạt động nhặt oxit nitricvới giá trị lCso lần lượt là 450 và 138 ug/mL. Trong mô hình đột biến nấm men, ứng suất oxy hóa do H,0.được tạo ra bởi galactan trong môi trường đã được loại bỏ rộng rãi như đã được xác nhận bằng cách sử dụng các thử nghiệm tại chỗ, sau đó là các nghiên cứu bằng kính hiển vi và nhuộm huỳnh quang DCF-DA. Xử lý bằng galactan dẫn đến giảm ROS được tạo ra trong các tế bào đột biến nấm men như được chứng minh bằng cường độ huỳnh quang giảm. Hơn nữa, galactan thể hiện khả năng bảo vệ chống lại tổn thương oxy hóa thông qua H,O, ức chế quá trình chết theo chương trình ở các chủng đột biến nấm men (pep4 và fs1) ​​dẫn đến tăng tỷ lệ sống sót bằng cách vô hiệu hóa stress oxy hóa. Trong thử nghiệm tuổi thọ theo trình tự thời gian, các tế bào WT được điều trị bằng galactanEPS cho thấy khả năng sống sót tăng 8% trong khi đột biến sod2 cho thấy mức tăng phần trăm 10-15 cho thấy tác dụng chống lão hóa rõ rệt. Galactan từ W.confused KR780676 có tiềm năng to lớn được sử dụng làm chất chống oxy hóa tự nhiên cho các ứng dụng công nghệ dược phẩm, dược phẩm và thực phẩm. Theo hiểu biết của chúng tôi, đây là báo cáo đầu tiên về đánh giá chuyên sâu các đặc tính chống oxy hóa in vivo của EPS vi khuẩn trong hệ thống mô hình loại bỏ nấm men.

Nhấp để có được Cistanche Rich trong EPS

Oxy hóa là một quá trình thiết yếu để duy trì các quá trình sinh học và cũng để sản xuất năng lượng trong tất cả các sinh vật sống. Các gốc oxy phản ứng (ROS) và gốc nitơ phản ứng (RNS) được tạo ra từ quá trình dị hóa bình thường của các phân tử oxy và nitơ tương ứng. Căng thẳng oxy hóa nghiêm trọng dẫn đến các tình trạng thoái hóa khác nhau như tổn thương DNA, thoái hóa tế bào và sinh ung thư. Những điều này có thể dẫn đến nhiều suy giảm sức khỏe nhưsự lão hóa, bệnh tim mạch, bệnh ung thư, xơ gan, xơ vữa động mạch, bệnh tiểu đườngvà viêm khớp dạng thấp2-6, Chất chống oxy hóa là các phân tử loại bỏ các gốc tự do được tạo ra trong thực phẩm hoặc hệ thống sống và giúp ngăn ngừa các tình trạng sức khỏe liên quan đến tổn thương oxy hóa-9. Mặc dù nhiều chất chống oxy hóa tổng hợp có sẵn dưới dạng chất thu gom gốc tự do mạnh, nhưng một số trong số chúng có liên quan đến một số tác dụng phụ không mong muốn. Theo quan điểm này, đã có sự quan tâm và nhu cầu ngày càng tăng đối với các chất chống oxy hóa tự nhiên trong ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm. Hầu hết các polysacarit dựa trên thực vật và nấm đã được báo cáo là tác nhân bảo vệ quan trọng chống lại ROS11–21. Nhiều exopolysacarit vi sinh vật (EPS) bao gồm từ vi khuẩn axit lactic (LAB) cũng đã được báo cáo về đặc tính chống oxy hóa đáng kể của chúng. Đây được coi là những lựa chọn thay thế an toàn hơn cho những chất tổng hợp. Trong những năm gần đây, nhiều EPS từ LAB đã được nghiên cứu về khả năng chống oxy hóa và ngăn ngừa tổn thương do oxy hóa22,23. Tiềm năng chống oxy hóa và vai trò bảo vệ của Weissella EPS cũng đã được báo cáo từ nhiều loại EPS được phân lập từ Weissella, nhiều chủng như Cistanche EPSWWC, W. confusa OF126, W. cibaria GA44, W. cibaria YB-1, W. confusa W4 và W. cibaria SJ1424–29. Các đặc tính chống oxy hóa in vivo có thể được nghiên cứu bằng cách sử dụng các hệ thống mô hình khác nhau như dòng tế bào30, C. Elegans31, men32 và chuột33. Trước đây, các hợp chất khác nhau đã được sàng lọc về các đặc tính chống oxy hóa tiềm năng của chúng bằng cách sử dụng hệ thống mô hình đột biến xóa gen nấm men Saccharomyces cerevisiae32,34–37.

Nghiên cứu này tập trung vào cáckhả năng chống oxy hóa của galactan EPSđược sản xuất bởi chủng lợi khuẩn Cistanche KR780676 từ một loại thực phẩm lên men truyền thống của Ấn Độ (bột Idli)38,39. Trong bài báo này, galactan EPS được sàng lọc về khả năng chống oxy hóa trong ống nghiệm bằng cách sử dụng DPPH, oxit nitric và các thử nghiệm nhặt rác gốc hydroxyl và chất chống oxy hóa trong cơ thể sống,chống apoptoticVàđặc tính chống lão hóasử dụng hệ thống mô hình đột biến xóa gen nấm men.

Nguyên liệu và phương pháp

Tất cả các hóa chất bao gồm cả chất bổ sung phương tiện được mua từ Hi-Media Laboratories Pvt. Ltd., Ấn Độ và DCF-DA (2,7 Dichlorodihydrofuorescein diacetate) từ Sigma.

Nuôi cấy vi sinh vật.nước tiểuKR780676 được phân lập từ một loại thực phẩm lên men có tính axit của Ấn Độ (bột Idli), được báo cáo là tạo ra galactan EPS đã được sử dụng trong nghiên cứu này 38.

Phát hiện sản xuất EPS. Quá trình sản xuất EPS của W. confusa được quan sát từ cấp độ thuộc địa. Tóm lại, chủng này được nuôi cấy trên thạch MRS (được bổ sung 2% sucrose). Sau 48 giờ ở 30 độ, quan sát thấy sự xuất hiện của các khuẩn lạc nhầy/nhầy. Sản xuất galactan EPS đã được xác minh thêm dưới phân tích kính hiển vi điện tử quét (SEM).

Khai thác EPS. Quá trình trích xuất EPS được thực hiện theo phương pháp được mô tả trong Kavitake et al.38. Chất cấy tươi (10 phần trăm ) W. confusa được bổ sung vào môi trường MRS tăng cường sucrose 2 phần trăm ở 30 độ trong 48 giờ trong điều kiện tĩnh. Theo cách này, huyền phù được ly tâm (12,000×g trong 15 phút) để phân lập sinh khối và xử lý tiếp bằng axit trichloro axit để loại bỏ các gốc protein. Galactan-EPS được kết tủa bằng cách sử dụng etanol lạnh băng (gấp ba lần thể tích), ly tâm (19.200 × g trong 15 phút) và EPS thu được được hòa tan trong nước Milli-Q. EPS thô được thẩm tách ở 12–14 kDa (48 giờ, 4 độ ) và làm đông khô bằng phương pháp đông khô trong 48 giờ.

Đặc tính chống oxy hóa trong ống nghiệm của galactan EPS. Xét nghiệm DPPH cho galactan đã được thực hiện theo báo cáo trước đó của Ye et al.9 và phần trăm hoạt động nhặt rác ( phần trăm ) được tính theo phương trình sau.

trong đó Ao và As lần lượt là độ hấp thụ của mẫu đối chứng (trống, không có EPS) và mẫu. Thử nghiệm nhặt gốc oxit nitric (NO) đối với galactan được thực hiện theo Sreejayan et al.40 và được tính theo phương trình sau:

trong đó Ao là độ hấp thụ của đối chứng (trống, không có EPS) và As là độ hấp thụ khi có mặt của EPS. Hoạt động giảm năng lượng được đo đối với galactan EPS theo báo cáo của Ye et al.9 . Độ hấp thụ Te được đọc ở bước sóng 700nm và khả năng khử được biểu thị bằng khả năng hấp thụ cao của hỗn hợp phản ứng. Axit ascoricic (Vc) đã được sử dụng như một biện pháp kiểm soát tích cực. Hoạt động nhặt gốc Hydroxyl của galactan EPS được đánh giá theo mô tả của Yang và cộng sự41. Độ hấp thụ Te được đọc ở bước sóng 536 nm và tỷ lệ phần trăm nhặt rác được tính như sau:

trong đó A mẫu là độ hấp thụ của mẫu, A trắng là độ hấp thụ khi không có mẫu và dung dịch H2O2, và A đối chứng là độ hấp thụ khi không có mẫu

Đặc tính chống oxy hóa in vivo của galactan EPS trong các chủng đột biến nấm men.

Loại nấm men, S. cerevisiae, BY4741 dại (WT) (MATa his3∆:leu2∆:met15∆:ura3∆) và các chủng đột biến xóa gen được mua từ Thermo Fisher Khoa học, Hoa Kỳ. Các chủng nấm men được nuôi cấy trong môi trường men peptone dextrose (YPD) có bổ sung hoặc không bổ sung 200 µg/mL Geneticin (G418 sulfat) để chọn lọc các thể đột biến. Môi trường rắn YPD được điều chế bằng cách bổ sung 2% Bacto agar vào môi trường lỏng YPD42.

Ảnh hưởng của EPS đến sự phát triển của nấm men. Nuôi cấy loại nấm men hoang dã (WT) tăng trưởng theo cấp số nhân (khoảng 1× 104 tế bào) được xử lý với các nồng độ khác nhau (0–400 ug/mL) EPS trong đĩa vi giếng và thể tích cuối cùng được tạo ra là 200 μL với canh trường YPD. Nuôi cấy Te được ủ trong 18 giờ ở 30 độ, sau đó pha loãng nối tiếp và trải trên các đĩa thạch YPD. Các đĩa Te được ủ ở 30 độ trong 2 ngày và đếm các đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) và khả năng sống sót được biểu thị bằng phần trăm CFU43.

Đo lường các dấu ấn sinh học của stress oxy hóa. Các tế bào WT của nấm men phát triển theo cấp số nhân đã được xử lý trước có hoặc không có 300 ug/ml EPS trong 2 giờ. Mười tế bào được tiếp xúc với 1 mM H2O2 trong 1 giờ ở 30 độ trong tủ ấm có máy lắc và được xử lý để đo hoạt tính SOD và mức peroxy hóa lipid theo phương pháp được mô tả trong các báo cáo trước đó44–46

Đặc tính chống oxy hóa của EPS trong đột biến xóa gen S. cerevisiae.

Nuôi cấy nấm men WT và các chủng đột biến thiếu chất chống oxy hóa (sod1∆, sod2∆, tsa1∆, cta1∆, ctt1∆, glr1∆ và yhb1∆) tăng trưởng theo cấp số nhân được xử lý với 300 ug/mL EPS trong 2 giờ sau đó tiếp xúc với 1 mM H2O2 trong 1 giờ. Các tế bào được pha loãng liên tục được trải trên các đĩa thạch YPD, được ủ trong 2 ngày ở 30 độ và khả năng sống sót đã được tính toán. Đối với xét nghiệm tại chỗ, dịch cấy được pha loãng liên tiếp trong 10-các nếp gấp, 4 μL trong số đó được phát hiện trên các đĩa thạch YPD và ủ ở 30 độ trong 2 ngày và chụp ảnh43,47. Phát hiện và đo lường ROS. WT tăng trưởng theo hàm mũ và các chủng đột biến thiếu chất chống oxy hóa (sod1∆, sod2∆, tsa1∆, cta1∆ và ctt1∆) được xử lý trước có hoặc không có EPS trong 2 giờ và tiếp xúc với 1 mM H2O2 trong 1 giờ ở 30 độ. Các viên tế bào sau khi ly tâm ở tốc độ 5000 vòng / phút trong 5 phút được rửa hai lần bằng dung dịch đệm PBS, được treo lại trong 200 μL PBS và được ủ với 20 μM DCF-DA trong bóng tối trong 15–20 phút ở nhiệt độ phòng. Ngay sau khi ủ, các tế bào được rửa hai lần bằng PBS, gắn trên các phiến kính và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang Olympus Ix71 dưới vật kính 40 × sử dụng bộ lọc màu xanh lam. Để định lượng ROS, các tế bào nhuộm DCF DA đã được nối lại trong 200 μL PBS sau khi rửa và cường độ huỳnh quang DCF được đo bằng máy đo quang phổ kế ở bước sóng phát xạ và cực đại kích thích là 495/529nm. Các đơn vị huỳnh quang được vẽ trên từng nền văn hóa được xử lý và không được xử lý và so sánh48,49.

Hoạt động chống apoptotic của galactan.

Xét nghiệm tại chỗ và CFU. Các tế bào WT và các tế bào đột biến thiếu totic (pep4∆ và fs1∆) được tăng trưởng theo cấp số nhân đã được xử lý trước bằng EPS và được ủ cùng với các biện pháp kiểm soát chưa được xử lý tương ứng trong 2 giờ. Đối với số lượng CFU, các mẫu cấy được xử lý hoặc xử lý bằng EPS trong 2 giờ và ủ với 0.5 mM H2O2 trong 1 giờ. Mỗi môi trường nuôi cấy đã pha loãng huyết thanh được trải trên các đĩa thạch YPD và được ủ ở 30 độ trong 2 ngày và khả năng sống của tế bào được biểu thị bằng phần trăm CFU. Đối với xét nghiệm spot, các mẫu cấy được cho phép pha loãng nối tiếp, sau đó chấm lên các đĩa thạch YPD có hoặc không có 1 mM H2O2. Các đĩa được ủ ở 30 độ trong 2 ngày và chụp ảnh47.

Phát hiện dấu hiệu chống apoptotic của EPS

sử dụng các chủng nấm men đột biến. Để xác nhận thêm hành động giải cứu của EPS đối với các tế bào nấm men khỏi cái chết của tế bào apoptotic do hydro peroxide gây ra trong nấm men, WT và các chủng đột biến thiếu khả năng chống apoptotic (pep4∆ và fs1∆) đã được kiểm tra các dấu hiệu của quá trình tự hủy. Các tế bào WT, pep4∆ và fs1∆ tăng trưởng theo cấp số nhân được xử lý hoặc xử lý với 300 µg/mL EPS trong 2 giờ và sau đó được tiếp xúc với 1 mM H2O2 trong 1 giờ. Cả tế bào đã xử lý và chưa xử lý đều được nhuộm bằng acridine cam và ethidium bromide (AO/EB) và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang để tìm sự ngưng tụ của chất nhiễm sắc50,51. Đối với nhuộm DAPI, các tế bào đã xử lý và chưa xử lý được cố định bằng 4% paraformaldehyde và ủ với 1 ug/mL DAPI trong 5–10 phút trong bóng tối ở nhiệt độ phòng. Các tế bào được gắn trên các phiến kính sau khi rửa bằng PBS và được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang Olympus IX71 (bộ lọc UV, vật kính 40 ×) để phân mảnh hạt nhân52,53.

Tác dụng chống lão hóa của EPS bằng thử nghiệm tuổi thọ theo thời gian.

Các chủng nấm men dại và đột biến thiếu chất chống oxy hóa (sod2∆, tsa1∆ và ctt1∆) được nuôi cấy để đạt đến giai đoạn ổn định và được ủ có hoặc không có EPS cho xét nghiệm tuổi thọ theo trình tự thời gian (CLS). Khả năng sống sót của mọi chủng được tính toán trong các khoảng thời gian khác nhau từ 0 đến 30 ngày. Khả năng sống của tế bào được biểu thị bằng phần trăm CFU cho cả môi trường nuôi cấy được xử lý và không được xử lý54,55. Phân tích thống kê. Tất cả các thí nghiệm được thực hiện ba lần (± SD) và được phân tích thống kê bằng phần mềm IBM SPSS 20 trong mô hình ANOVA một chiều. Test so sánh HSD của Tukey (p<0.05) was used to measure the significance level. 

Kết quả và thảo luận Vi khuẩn axit lactic (LAB) được phân lập từ thực phẩm lên men đã thu hút sự chú ý rất lớn của các nhà công nghệ thực phẩm trong vài năm qua vì đặc tính lợi khuẩn đã được chứng minh của chúng. Trong số các vi khuẩn phân lập được từ thực phẩm lên men của Ấn Độ có Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Leuconostoc spp. và Weisella spp ít được khám phá hơn. Giống như các LAB có lợi khác, chủng Cistanche KR780676 được phân lập từ bột bánh idli lên men trong phòng thí nghiệm của chúng tôi đã được báo cáo là hoạt động như một ứng cử viên sinh học tiềm năng39. Các báo cáo trước đây, galactan này đã được đặc trưng là một homopolysacarit tuyến tính và cũng được sàng lọc về các đặc tính hóa lý, chức năng và nhũ hóa của nó38,56–58. Chúng tôi cũng đã báo cáo rằng các tế bào và chất nổi trên bề mặt tế bào của W. confusa KR780676 cho thấy hoạt động chống oxy hóa mạnh39. Sản xuất EPS từ W. confusa KR780676 đã được quan sát trên đĩa thạch MRS được làm giàu với 2% sucrose, được ủ trong 48 giờ (Hình 1A-i), cho thấy các khuẩn lạc nhầy nhụa của Weissella và nó đã được xác nhận thêm trong ảnh SEM (của khuẩn lạc Weissella) cho thấy sự hiện diện của galactan EPS cùng với các tế bào (Hình 1A-ii). Quá trình sản xuất EPS từng bước được tổng quan với biểu diễn bằng hình ảnh trong Hình 1B.

Đặc tính chống oxy hóa trong ống nghiệm của galactan EPS. Như được hiển thị trong Hình 2A, hoạt động nhặt rác DPPH được quan sát là phụ thuộc vào nồng độ, hoạt động nhặt rác tăng theo nồng độ galactan. Nồng độ hiệu quả tối đa một nửa (IC50) của axit ascorbic là 8,8 µg/mL, trong khi EPS của galactan là 450 µg/mL. 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là một gốc tự do ổn định giúp định vị các electron chưa ghép cặp với toàn bộ phân tử, do đó ngăn cản các phân tử thu nhỏ lại và tạo ra màu tím đậm59. Khi dung dịch DPPH được thêm vào các nồng độ khác nhau (50 đến 500 µg/mL) của galactan, nó sẽ làm giảm màu tím khi nồng độ tăng. Các chất chống oxy hóa khi phản ứng với một điện tử của DPPH thì màu tím đậm của DPPH chuyển sang màu tím nhạt; và cường độ của màu phụ thuộc vào hoạt tính chống oxy hóa của chất nền60. Galactan cho thấy tiềm năng nhặt rác 60% DPPH, cao hơn EPS từ vi khuẩn nội sinh Paenibacillus polymyxa EJS-3 (<45.40%)33.

Oxit nitric được tạo ra khi natri nitroprusside bị phân hủy trong dung dịch nước có độ pH là 7,2. Nitrat và nitrit được tạo ra trong điều kiện hiếu khí khi oxit nitric liên kết với oxy61. Như được thể hiện trong Hình 2B, galactan có khả năng làm giảm quá trình tạo oxit nitric từ natri nitroprusside khi nồng độ có tác dụng tối đa một nửa (IC50) là 138 µg/mL, trong khi axit ascorbic tiêu chuẩn là 11 µg/mL. Như được hiển thị trong Hình 2C, hoạt động giảm năng lượng của EPS có mối tương quan thuận với nồng độ của nó theo thứ tự tăng dần. Tiêu chuẩn (axit ascorbic) cho thấy khả năng khử cao hơn galactan EPS phù hợp với Ye et al.9 . Hoạt động khử năng lượng của galactan cho thấy hoạt động chống oxy hóa tiềm năng. Khi kali ferricyanua [K3Fe(CN)6] được thêm vào galactan EPS, các chất chống oxy hóa có trong nó sẽ khử thành kali ferricyanua [K4Fe(CN)6]

Hình 2. Đặc tính chống oxy hóa trong ống nghiệm của galactan. (A) Hoạt động nhặt gốc DPPH, (B) Thử nghiệm oxit nitric, (C) Thử nghiệm khử năng lượng và (D) Hoạt động nhặt gốc hydroxyl của galactan EPS.

Hoạt động nhặt gốc Hydroxyl của galactan được thể hiện trong Hình 2D. Galactan cho thấy 41,93% là hoạt động cao nhất, trong khi 58,10% theo tiêu chuẩn ở cùng nồng độ (1 mg/mL). Xu hướng kết quả phù hợp với các báo cáo trước đây về EPS từ Lactobacillus plantarum C88 (85,21 phần trăm đối với EPS có nồng độ 4 mg/mL)62 và Paenibacillus polymyxa EJS-3 (68,55 phần trăm đối với EPS có nồng độ 1 mg/mL)63. So với tiêu chuẩn, galactan cho thấy hiệu quả 72,16 phần trăm trong khi EPS từ Lactobacillus plantarum C8862 và Paenibacillus polymyxa EJS-363 cho thấy hiệu suất tương ứng là 95,19 và 68,55 phần trăm.

Đặc tính chống oxy hóa in vivo của galactan EPS trong mô hình nấm men. Các báo cáo trước đây đã chỉ ra các đặc tính sinh học tăng cường sức khỏe khác nhau như chống tăng sinh, chống loét, giảm cholesterol, chống oxy hóa, chống viêm và các hoạt động điều hòa miễn dịch của EPS có nguồn gốc từ LAB64. Theo quan điểm này, điều quan trọng là phải đánh giá tác dụng chống oxy hóa chi tiết của EPS có thể hỗ trợ tiềm năng prebiotic và/hoặc men vi sinh của chúng, chủ yếu để duy trì cân bằng nội môi đường ruột bằng cách giảm căng thẳng oxy hóa. Bộ máy chống oxy hóa của tế bào đóng một vai trò quan trọng trong việc giảm bớt ROS không thể tránh khỏi được tạo ra thông qua các con đường trao đổi chất quan trọng của tế bào. Sự mất cân bằng giữa khả năng chống oxy hóa bẩm sinh của tế bào và ROS được tạo ra có thể rất bất lợi cho tế bào. Căng thẳng oxy hóa nghiêm trọng gây ra thiệt hại tiềm ẩn đối với các thành phần quan trọng của tế bào, protein, axit nucleic và các phân tử lipid, từ đó ảnh hưởng đến nhiều con đường truyền tín hiệu thiết yếu và gây ra quá trình chết theo chương trình. Việc bổ sung các chất chống oxy hóa trong chế độ ăn uống đã được chứng minh là làm giảm tần suất của các dấu hiệu tổn thương tế bào như nồng độ ROS, tổn thương DNA qua trung gian ROS, quá trình chết theo chương trình và biến đổi tế bào, điều này dẫn đến giảm tỷ lệ mắc các rối loạn liên quan đến tuổi tác65 EPS vi khuẩn như xanthan và levans đã chứng minh hoạt tính chống oxy hóa trong các thử nghiệm in vitro (thử nghiệm DPPH và gốc hydroxyl)5 và chống lại các tế bào ung thư dạ dày ở người BGC-823, tương ứng66. Trước đây, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã đánh giá tác dụng chống oxy hóa, chống chết theo chương trình và chống lão hóa của galactan EPS được phân lập từ W. confusa KR780676 bằng cách sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae BY4741 làm sinh vật mẫu.

Ảnh hưởng của EPS đến sự phát triển của nấm men. Các tế bào nấm men dại được xử lý với các nồng độ EPS khác nhau không cho thấy bất kỳ khiếm khuyết tăng trưởng nào, xác nhận rằng galactan không gây ra bất kỳ độc tính tế bào hoặc khiếm khuyết tăng trưởng nào ở bất kỳ nồng độ nào trong khoảng từ 0 đến 400 ug/mL (Hình 3A ). Các tế bào được xử lý với nồng độ galactan 300 ug/mL hoặc cao hơn cho thấy sự tăng trưởng cao hơn đáng kể cho thấy rằng galactan có hoạt tính kích thích sự phát triển của nấm men.

Nồng độ galactan là 300 ug/mL được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo với các chủng nấm men. Galactan làm giảm hoạt động của enzym SOD. Sau hoạt động chống oxy hóa mạnh trong ống nghiệm được hiển thị bởi galactan EPS, tiếp tục được kiểm tra tác động của nó đối với hoạt động SOD trong các tế bào WT của nấm men. Kết quả của chúng tôi (Hình 3B) cho thấy rằng ứng suất oxy hóa do xử lý bằng H2O2 gây ra đã làm tăng mạnh hoạt tính SOD của các tế bào WT được xử lý bằng H2O2-so với các tế bào không được xử lý. Ngược lại, xử lý trước bằng galactan đối với các tế bào WT sau đó tiếp xúc với H2O2 dẫn đến hoạt động SOD giảm gần gấp đôi so với hoạt động của các tế bào được xử lý bằng H2O2 đơn thuần cho thấy galactan giúp các tế bào nấm men quản lý quá trình oxy hóa do gốc superoxide gây ra. căng thẳng47,67.

stress oxy hóagây ra bởi quá trình xử lý peroxide kích hoạt enzyme superoxide và sự thay đổi mức độ hoạt động của SOD là thước đo trực tiếp mức độ căng thẳng oxy hóa tế bào. Trong nghiên cứu này, phương pháp khử NBT được sử dụng, trong đó, NBT là chất chỉ thị sản xuất gốc superoxide. Ức chế giảm NBT là biện pháp trực tiếp của SOD. Vì SOD cạnh tranh với NBT đối với các gốc superoxide được tạo ra bằng cách cho riboflavin tiếp xúc với ánh sáng khả kiến ​​với sự có mặt của oxy và methionine, là chất cho điện tử. Superoxit khử NBT thành sản phẩm có màu xanh da trời, formazan, có thể đo màu ở bước sóng 560 nm.

Các báo cáo trước đây chỉ ra rằng LAB EPS đã phát huy tác dụng chống oxy hóa theo cách phụ thuộc vào nồng độ trong các thử nghiệm in vitro và trong các dòng tế bào ung thư ruột kết cũng như các mô hình in vivo. Khả năng loại bỏ ROS của EPS có thể là do các nhóm hóa học đa dạng của chúng68. Các EPS khác (500 µg/ml) từ Bacillus amyl hóa lỏng đã được chứng minh là có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của SOD và bảo vệ các tế bào HepG2 khỏi stress oxy hóa do H2O2 68 gây ra. Tương tự, EPS từ L. plantarum cho thấy tác động phụ thuộc vào nồng độ lên hoạt động SOD trong tế bào Caco2 chống lại H2O2-gây ra stress oxy hóa69. Kết quả của chúng tôi, phù hợp với các báo cáo này cho thấy rằng tiền xử lý galactan EPS giúp loại bỏ các gốc superoxide gây ra bởi quá trình xử lý H2O2 trong các tế bào WT của nấm men.

EPS làm giảm quá trình peroxid hóa lipid của tế bào. Malondialdehyd (MDA) là dấu ấn sinh học peroxid hóa lipid tế bào được nghiên cứu nhiều nhất cho thấy mức độ căng thẳng oxy hóa. MDA là một dialdehyde ổn định về mặt hóa học, có tính phản ứng cao và có thể dễ dàng liên kết với protein, axit nucleic và lipoprotein. Nó có khả năng gây đột biến cao và có thể ảnh hưởng lớn đến các đặc tính sinh hóa của các phân tử sinh học này, điều này gây hại cho các con đường truyền tín hiệu khác nhau70. Sự gia tăng nồng độ MDA là một chỉ báo về tổn thương mô do ROS gây ra và mức độ gia tăng của nó được phát hiện trong một số bệnh lý ở người46. Trong nghiên cứu này, để kiểm tra xem tiền xử lý EPS ảnh hưởng như thế nào đến quá trình peroxy hóa lipid do H2O2 gây ra trong các tế bào WT của nấm men, mức độ MDA đã được ước tính. Kết quả cho thấy mức MDA giảm khoảng 1,{7}} lần trong các tế bào được xử lý trước bằng EPS, so với các tế bào chỉ tiếp xúc với H2O2 như minh họa trong Hình 3C.

Trước đây, EPS từ L. plantarum C88 đã được chứng minh là làm giảm mức MDA do xử lý H2O2 gây ra, theo cách phụ thuộc vào liều lượng (50–200 ug/ml) trong tế bào Caco2, cho thấy tổn thương màng tế bào ruột do peroxide gây ra có thể được giảm bớt bằng cách bổ sung EPS69 (zhang 2013). Hơn nữa, 500 ug/mL EPS từ B. amyloliquefaciens làm giảm đáng kể MDA do H2O2-gây ra trong các tế bào HepG271. Kết quả của chúng tôi về mức H2O2-gây ra MDA trong các tế bào nấm men và mức giảm đáng kể của nó sau khi xử lý trước các tế bào bằng galactan EPS cho thấy rằng việc xử lý bằng galactan EPS làm giảm quá trình peroxy hóa lipid do ROS của tế bào gây ra và do đó, có thể bảo vệ các tế bào các tế bào khỏi tổn thương mô do các gốc peroxide gây ra và hỗ trợ duy trì tính toàn vẹn của tế bào

thí nghiệm. * đại diện cho P<0.0001 a signifcant increase/decrease in EPS+ H2O2 treated samples compared to those treated with H2O2 alone.

Galactan bảo vệ các đột biến gen chống oxy hóa của nấm men dưới áp lực oxy hóa. Để đánh giá khả năng chống oxy hóa của galactan, các thể đột biến nấm men thiếu gen chống oxy hóa khác nhau (thiếu các gen phản ứng với stress oxy hóa khác nhau) được xử lý bằng galactan và sau đó tiếp xúc với H2O với liều lượng dưới mức gây chết người2 42. Các đột biến SOD (sod1∆ và sod2∆), catalase (cta1∆ và ctt1∆), thioredoxin peroxidase (tsa1∆), glutathione reductase (glr1∆) và nitric oxide oxidoreductase (yhb1∆) khi được xử lý bằng H2O2. cho thấy tỷ lệ sống thấp (sod1∆ 10,8% , sod2∆ 13,17% , tsa1∆ 13,55% , cta1∆ 15,34% , ctt1∆ 17,06% , glr1∆ 27,37% và yhb1∆ 33,87% ) so với WT. Ngược lại, với tiền xử lý bằng galactan, khả năng chống lại stress oxy hóa tăng lên ở tất cả các đột biến thiếu gen chống oxy hóa và khả năng sống sót của chúng tăng lên đáng kể (sod1∆ 78,43% , sod2∆ 59,96% , cta1∆ 87% , ctt1∆ 87% , tsa1 ∆ 72,73 phần trăm , glr1∆ 75,26 phần trăm và yhb1∆ 82,41 phần trăm ) như trong Hình 4A. Những kết quả này gợi ý rằng galactan có thể loại bỏ hiệu quả các gốc tự do gây ra bởi H2O2 ở những người đột biến thiếu các gen phản ứng với stress oxy hóa cụ thể và bảo vệ các tế bào chống lại stress oxy hóa. Sự bảo vệ tương tự cũng được quan sát thấy trong thử nghiệm tại chỗ, trong đó galactan đã giải cứu các thể đột biến khỏi stress oxy hóa và tăng khả năng sống sót như trong Hình 4B.

Các tế bào được tiến hóa với các hệ thống bảo vệ chống oxy hóa bằng enzyme để chống lại stress oxy hóa nội sinh do ROS tạo ra thông qua các phản ứng sinh lý khác nhau, nếu không sẽ có tác động xấu đến sức khỏe của tế bào. Các báo cáo trước đây và kết quả của chúng tôi trong nghiên cứu này cho thấy rằng EPS có thể loại bỏ ROS và cải thiện khả năng tồn tại của tế bào. Kết quả của chúng tôi với các chủng đột biến phản ứng với stress oxy hóa ở nấm men cho thấy rằng việc xử lý Galactan EPS giúp loại bỏ cả các gốc superoxide tế bào và ty thể do xử lý H2O2 gây ra, bằng chứng là khả năng sống sót của các chủng đột biến nấm men sod1∆ và sod2∆ tăng lên tương ứng. SOD là chất bảo vệ chống oxy hóa bằng enzyme chính trong các tế bào chống lại stress oxy hóa nội sinh và ngoại sinh và đột biến ở những gen này có liên quan đến bệnh ung thư và rối loạn thoái hóa. Tương tự như vậy, việc giải cứu chất chống oxy hóa của cta1∆ và ctt1∆ (đột biến catalase) bằng cách xử lý EPS cho thấy rằng việc điều trị bằng galactan EPS giúp bảo vệ chống lại stress oxy hóa peroxisomal và tế bào do H2O2 gây ra. Catalase chịu trách nhiệm giải độc tế bào hydrogen peroxide và sự thiếu hụt của nó có liên quan đến sự khởi đầu của các rối loạn liên quan đến tuổi tác. TSA1, thioredoxin peroxidase vừa là protein tế bào chất liên kết với ribosome vừa là protein tự do giúp giải phóng các tế bào khỏi stress hydro peroxide. Các báo cáo cho thấy TSA1 cũng có vai trò sửa chữa tổn thương DNA do oxy hóa. Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng điều trị bằng EPS giải cứu các tế bào tsa1∆ của nấm men khỏi căng thẳng do peroxide gây ra. Peroxiredoxin của động vật có vú có tác động tích cực đến sự phát triển, trao đổi chất và chức năng miễn dịch của tế bào. Sự thiếu hụt của chúng dẫn đến căng thẳng oxy hóa tế bào tăng cao, ảnh hưởng đến các đường truyền tín hiệu quan trọng và có liên quan đến các rối loạn thoái hóa thần kinh, khối u ác tính và các bệnh viêm nhiễm 72. Cơ chế chống oxy hóa glutathione là một hệ thống bảo vệ chống oxy hóa enzyme đầu tiên khác có trong tế bào để vượt qua stress oxy hóa. GLR1 là men tương đồng của glutathione reductase ở động vật có vú, định vị ở cả bào tương và ty thể73. Glr khử glutathione oxy hóa (GSSH) thành glutathione khử (GSH) và đóng vai trò duy trì nồng độ GSH trong tế bào, từ đó giải độc các gốc superoxide và hydroxit, do đó bảo vệ tế bào khỏi stress oxy hóa74. Kết quả của chúng tôi cho thấy độ nhạy cao của men glr1∆ với H2O2 đã được giảm bớt bằng cách xử lý trước bằng galactan EPS cho thấy rằng galactan EPS có thể bảo vệ các tế bào thiếu GLR1 khỏi stress oxy hóa. Thật thú vị, sự thiếu hụt glutathione reductase có liên quan đến lão hóa và các rối loạn chuyển hóa, thoái hóa và tim mạch liên quan đến tuổi tác75,76. Như được hiển thị trong Hình 4A, yhb1∆ cũng được bảo vệ bởi galactan EPS chống lại áp lực H2O2, điều này cho thấy rằng galactan EPS bảo vệ các tế bào thiếu YHB1 khỏi stress oxy hóa. Nấm men YHB1 là một loại huyết sắc tố yêu thích đã được báo cáo để bảo vệ các tế bào khỏi stress oxit nitric77 và stress oxy hóa78. Bằng chứng cho thấy rằng thể tương đồng của YHB1 ở người xuất hiện để giải cứu các tế bào khỏi độc tính alpha-synuclein, một dấu ấn sinh học của bệnh Parkinson79. Những phát hiện trước đây và kết quả của chúng tôi cho thấy rằng EPS có thể thúc đẩy sự sống của tế bào chống lại sự phát triển của các rối loạn thoái hóa.

Để đánh giá mức độ ROS trong các đột biến nấm men có sự hiện diện và vắng mặt của galactan dưới tác động của H2O2, các tế bào nấm men được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang và mức độ oxy hóa nội bào được tính toán bằng máy đo quang phổ47,48. Các đột biến nấm men được xử lý bằng H2O2 đơn thuần cho thấy nhiều tế bào phát quang màu xanh lá cây hơn so với các tế bào được xử lý trước bằng galactan. (Hình 4C). Cường độ huỳnh quang DCF tăng khoảng 60 phần trăm , trong khi với xử lý sơ bộ bằng galactan, cường độ này giảm xuống khoảng 30 phần trăm ở các đột biến nấm men được xử lý bằng H2O2-so với WT và đối chứng tương ứng (Hình 4D). Cả kết quả hiển vi và phép đo quang phổ đều cho thấy mức độ ROS tăng lên trong các tế bào thiếu các gen chống oxy hóa cụ thể so với các biện pháp kiểm soát tương ứng. Các mẫu nuôi cấy được xử lý trước bằng galactan và sau đó tiếp xúc với H2O2 cho thấy huỳnh quang giảm đi so với các mẫu không xử lý trước bằng galactan, điều này cho thấy rằng galactan làm giảm sự tiếp xúc với H2O2 cảm ứng ROS trong các tế bào đột biến nấm men và thúc đẩy sự sống của tế bào. Trong tất cả các thí nghiệm trên, khi các tế bào được rửa sạch trước khi bổ sung H2O2 cho thấy không có sự giải cứu đáng kể nào (dữ liệu bổ sung) cho thấy quá trình loại bỏ ROS bằng galactan là do loại bỏ trực tiếp trong môi trường chứ không phải trong hoạt động nội bào.