PHẦN 1 Acteoside ức chế quá trình hình thành xương qua trung gian RANKL bằng cách ức chế cảm ứng C-Fos và lộ trình NF-KB và giảm sản xuất ROS
Mar 07, 2022
Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook2, Jeong-Chae Lee2,3*
1 Viện Nghiên cứu Y học Lâm sàng của Đại học Quốc gia Chonbuk, Viện Nghiên cứu Y sinh của Bệnh viện Đại học Quốc gia Chonbuk, Jeonju, Chonbuk, Hàn Quốc, 2 Khoa Chỉnh nha, Viện Khoa học Sinh học Răng miệng và Trường Nha khoa, Đại học Quốc gia Chonbuk, Jeonju, Chonbuk, Nam Hàn Quốc, 3 Khoa Khoa học Vật liệu Hoạt tính Sinh học, Trung tâm Nghiên cứu Vật liệu Hoạt tính Sinh học, Đại học Quốc gia Chonbuk, Jeonju, Chonbuk, Hàn Quốc
trừu tượng
Nhiều nghiên cứu đã báo cáo rằng các cytokine gây viêm là chất trung gian quan trọng cho quá trình tạo xương, do đó gây tiêu xương quá mức và loãng xương.Acteoside, hợp chất hoạt động chính củaRehmannia glutinosa, được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền phương Đông, có khả năng chống viêm và chống oxy hóa. Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy rằngacteosideức chế rõ rệt sự phân biệt và hình thành tế bào hủy xương từ đại thực bào tủy xương (BMM) và đại thực bào RAW264.7 được kích thích bởi chất kích hoạt thụ thể của phối tử yếu tố nhân-kappaB (NF-kB) (RANKL). Tiền xử lý Acteoside cũng ngăn chặn sự tiêu xương bởi các tế bào hủy xương trưởng thành theo cách phụ thuộc vào liều lượng.Acteoside(10 mM) làm giảm độc lực do RANKL kích thích hoạt hóa p38 kinase, kinase điều hòa tín hiệu ngoại bào, và c-Jun N-tận cùng kinase, và cũng ức chế sự hoạt hóa NF-kB bằng cách ức chế phosphoryl hóa của tiểu đơn vị p65 và chất ức chế kBa. Ngoài ra, sự gia tăng qua trung gian RANKL trong sự biểu hiện của c-Fos và yếu tố nhân của tế bào T hoạt hóa, tế bào chất 1 (NFATc1), và trong việc sản xuất yếu tố hoại tử khối u-a, interleukin (IL) -1 b và IL -6 dường như đã bị ức chế bởi quá trình xử lý trước acteoside. Hơn nữa, bằng miệngacteosidegiảm mất xương do cắt buồng trứng và sản xuất cytokine gây viêm để kiểm soát mức độ. Dữ liệu của chúng tôi gợi ý rằngacteosideức chế sự biệt hóa và trưởng thành của tế bào hủy xương từ các tiền chất của tế bào hủy xương bằng cách ức chế sự hoạt hóa do RANKL gây ra đối với các kinaza protein được kích hoạt bởi ty thể và các yếu tố phiên mã như NF-kB, c-Fos và NFATc1. Nói chung, những kết quả này cho thấy rằngacteosidecó thể hoạt động như một chất chống biến chất để giảm sự mất xương bằng cách ngăn chặn sự hoạt hóa tế bào hủy xương.
Vui lòng liên lạc để biết thêm thông tin:emily.li@wecistanche.com
Giới thiệu
Xương liên tục được tu sửa bằng hoạt động cân bằng của tế bào hủy xương và nguyên bào xương [1]. Nguyên bào xương phát sinh từ các tế bào tiền thân tạo máu thuộc dòng đơn bào / đại thực bào, trong khi nguyên bào xương thuộc dòng trung mô [2]. Sự kích hoạt bất thường của nguyên bào xương hoặc giảm tạo nguyên bào có thể phá vỡ cân bằng nội môi của xương, cuối cùng gây ra các bệnh như loãng xương, viêm khớp và ung thư xương [3,4]. Loãng xương là một bệnh xương phổ biến dẫn đến tăng nguy cơ gãy xương. Dạng loãng xương phổ biến nhất là do thiếu hụt estrogen ở phụ nữ mãn kinh. Các loại thuốc như corticosteroid và thuốc chống động kinh cũng có thể gây ra sự mất cân bằng giữa quá trình hủy và hình thành xương, có thể dẫn đến loãng xương [5]. Nhiều chất ức chế chống biến dạng bao gồm bisphosphonates, calcitonin, estrogen và chất điều hòa thụ thể estrogen chọn lọc đã được sử dụng để điều trị loãng xương. Các chất ức chế này duy trì khối lượng xương bằng cách ức chế chức năng của tế bào hủy xương [6]. Liệu pháp thay thế estrogen là phương pháp điều trị phổ biến nhất để ngăn ngừa và điều trị chứng loãng xương sau mãn kinh. Tuy nhiên, liệu pháp thay thế estrogen trong thời gian dài có thể làm tăng nguy cơ ung thư nội mạc tử cung và ung thư vú. Do đó, nhiều nhà điều tra đã tập trung nỗ lực vào việc phát triển một chất chống dị ứng mới không có tác dụng phụ [7–10]. Bởi vì tế bào hủy xương có chức năng tiêu xương, đặc biệt ức chế tế bào hủy xương đã được coi là mục tiêu chính trong nhiều nghiên cứu. Osteoclasts là các tế bào khổng lồ đa nhân được hình thành bởi các đơn nhân tiền thân của họ monocyte / đại thực bào thông qua sự tăng sinh tuần tự, biệt hóa và hợp nhất của các tế bào tiền thân tạo máu [11]. Yếu tố kích thích thuộc địa đại thực bào (M-CSF) và chất kích hoạt thụ thể của phối tử yếu tố nhân (NF) -kB (RANK) (RANKL) là những yếu tố cần thiết cho sự biệt hóa tế bào hủy xương [12]. Ngoài ra, một số cytokine gây viêm, chẳng hạn như yếu tố hoại tử khối u (TNF) và interleukin (IL) -1 b, góp phần vào quá trình tạo xương bằng cách điều chỉnh cảm ứng RANKL, osteoprotegerin và M-CSF [7,13]. RANKL liên kết với thụ thể RANK bề mặt tế bào dẫn đến RANKL / RANK / TNFR
Các yếu tố liên quan (TRAF) phức hợp kích hoạt tuần tự NFkB và kinase protein hoạt hóa mitogen (MAPK), bao gồm cJun N-terminal kinase (JNK), p38 kinase và kinase liên quan đến tín hiệu ngoại bào (ERK) [14]. Sự hoạt hóa này đóng một vai trò quan trọng trong việc làm trung gian cho sự biệt hóa, hoạt hóa và tồn tại của tế bào hủy xương. 7,9]. Vì vậy, tín hiệu RANKL được coi là mục tiêu chính của các tác nhân chống biến chất ngăn chặn sự hoạt hóa tế bào hủy xương và không gây xương.Acteosidelà hoạt chất chính của Rehmannia glutinosa, được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền phương Đông [15,16].Acteosidelà một chất chống oxy hóa mạnh và có các hoạt động chống độc gan, chống viêm và chống cảm thụ [17–20]. Trước đây chúng tôi thấy rằngacteosidegiảm hoạt động của tyrosinase và sinh tổng hợp melanin bằng cách điều chỉnh tín hiệu ERK [21], bảo vệ chống lại tổn thương nướu do oxy phản ứng (ROS) qua trung gian [22] và ngăn chặn tổn thương tế bào qua trung gian mycotoxin [23]. Những tác động này có liên quan chặt chẽ đếnacteosideKhả năng loại bỏ ROS và điều chỉnh tín hiệu qua trung gian MAPK. Đặc biệt, ROS được đề xuất cho các đường truyền tín hiệu gây ra bởi RANKL trung gian và các sự kiện tế bào trong tế bào hủy xương. Tiền xử lý với chất chống oxy hóa ức chế sự hoạt hóa NF-kB, ERK và IkBa do RANKL gây ra, do đó ngăn chặn quá trình tạo xương [24]. Những phát hiện này gợi ý mạnh mẽ rằng, ngoài hoạt động chống viêm, và hoạt động chống oxy hóa là rất quan trọng đối với một tác nhân chống biến dạng, do đóacteosidecó thể ngăn chặn quá trình tạo tế bào xương do RANKL gây ra. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã khám phá xem liệuacteosidecó tác dụng điều trị chứng mất xương. Chúng tôi đã kiểm tra tác động củaacteosidevề biệt hóa tế bào hủy xương và tiêu xương và các cơ chế tế bào liên quan bằng cách sử dụng các hệ thống thí nghiệm in vitro và in vivo.
Nguyên liệu và phương pháp
Chuẩn mực đạo đức
Thực hành chăm sóc và sử dụng động vật đã được Ủy ban Đại học Quốc gia Chonbuk phê duyệt về Đạo đức trong Chăm sóc và Sử dụng Động vật Phòng thí nghiệm (Giấy phép số CBU 2010-0007). Tất cả các thí nghiệm trong nghiên cứu này được thực hiện theo hướng dẫn của Ủy ban chăm sóc và sử dụng động vật của trường Đại học.
Chuột, Hóa chất và Đồ dùng trong Phòng thí nghiệm
Chuột ICR cái bốn tuần tuổi được mua từ OrientBio Inc. (Seoul, Hàn Quốc) và được nuôi ở nhiệt độ 2261uC và độ ẩm 5565% trong chu kỳ sáng / tối 12 giờ với quyền tiếp cận miễn phí thức ăn và nước uống. Acteoside (3, 4- dihydroxy-b-phenethyl-Oa-rhamnopyranose syl- (1R3) -4- O-caffeoyl-bD-glucopyranoside; C29H36O15) (Hình. S1) được phân lập từ lá Rehmannia glutinosa. Acteoside được hòa tan trong nước muối đệm phosphat (PBS) trước khi sử dụng. RANKL, TNF-a, IL -1 b, IL -6 và M-CSF đã được mua từ hệ thống R & D (Minneapolis, MN, Hoa Kỳ). Các kháng thể đặc hiệu cho c-Fos, p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa và b-actin được lấy từ Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA ). Các kháng thể cho p-p38 và p38 được mua từ Công nghệ Tín hiệu Tế bào (Danvers, MA, USA). CalciumAssay và Osteocalcin (OC) EIA Kits lần lượt được mua từ BioAssay Systems (Hayward, CA, USA) và Biomedical Technologies (Stoughton, MA, USA) để xác định các thông số sinh hóa huyết thanh. Bộ xét nghiệm acid phosphatase kháng tartrat (TRAP) của chuột (Hệ thống chẩn đoán miễn dịch, Scottsdale, AZ, USA) cũng được sử dụng để đo mức TRAP5b huyết thanh. Trừ khi có quy định khác, các hóa chất bổ sung được lấy từ Công ty Hóa chất Sigma (St. Louis, MO, Hoa Kỳ) và đồ dùng trong phòng thí nghiệm là từ SPL Life Sciences (Pochun, Hàn Quốc).
Nuôi cấy tế bào
Tế bào tủy xương được lấy từ xương chày và xương đùi của chuột cái ICR 6 tuần tuổi theo các phương pháp đã mô tả trước đây [25]. Hỗn dịch tủy xương được ủ trong đĩa nuôi cấy 100- mm với 50 ng / ml M-CSF. Sau 3 ngày, các tế bào kết dính được sử dụng làm đại thực bào tủy xương (BMM) để tạo ra sự biệt hóa tế bào xương. Một số tế bào tủy xương cũng được ủ trong 48 giờ mà không có M-CSF, và các tế bào kết dính được nuôi cấy trong môi trường biệt hóa nguyên bào xương, như được mô tả ở những nơi khác [25]. Tế bào đại thực bào RAW264.7 được nuôi cấy trong môi trường Eagle's đã sửa đổi (DMEM) của Dulbecco bổ sung 10% huyết thanh bò thai (FBS), 2 mM L glutamine và kháng sinh. Những tế bào này được sử dụng như một dòng tế bào đối ứng cho BMM để khám phá tác động của acteoside lên quá trình tạo xương.
Phân biệt Osteoclastic và nhuộm TRAP
BMM đã được xử lý trước với các nồng độ khác nhau (0 - 50 mM) của acteoside trong 2 giờ trước khi kích thích với 100 ng / ml RANKL. Môi trường nuôi cấy được thay thế bằng môi trường mới vào ngày 2 và 5. Sau 7 ngày ủ, các mẫu cấy được cố định trong 4% paraformaldehyde đệm PBS và nhuộm TRAP bằng kit sigma Aldrich theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các tế bào dương tính với TRAP được đếm bằng kính hiển vi quang học và các tế bào chứa 3 nhân trở lên được coi là tế bào hủy xương. Tế bào RANKL 264,7 cũng được tiếp xúc với 100 ng / ml RANKL sau khi xử lý trước với acteoside trong 2 giờ và sau 7 ngày ủ, các tế bào được xử lý để nhuộm TRAP.
Đo lường khả năng tồn tại của tế bào
Khả năng sống của tế bào được xác định bằng cách sử dụng thuốc thử muối tetrazolium (WST) {1}} hòa tan trong nước. Tóm lại, các tế bào BMM hoặc RAW264.7 được nuôi cấy trong môi trường tăng trưởng chứa 10% FBS và kháng sinh được xử lý bằng 10 mM acteoside hoặc các hợp chất phenolic như quercetin, luteolin, apigenin hoặc epigallocatechin -3- gallate (EGCG). Thuốc thử WST -8 được thêm vào các mẫu cấy sau 48 giờ ủ. Sau khi ủ thêm 4 giờ, độ hấp thụ cụ thể của WST -8- được đo ở bước sóng 450 nm bằng đầu đọc vi tấm (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, Hoa Kỳ).
Thử nghiệm hấp thụ xương
BMM (16105 tế bào / ml) được lơ lửng trong a-MEM chứa 50 ng / ml M-CSF và 100 ng / ml RANKL, sau đó được phân chia trên một 24- đĩa giếng được phủ bằng tinh thể nano canxi phốt phát (OAAS {{6} }; Chất nền thử nghiệm hoạt động của tế bào xương, Oscotec Inc., Choongnam, Hàn Quốc) ở mật độ 26104 tế bào / cm2 có và không có acteoside. Sau khi ủ trong 7 ngày, các tế bào được lấy ra khỏi đĩa với 5% natri hypoclorit, và sự hình thành hố được quan sát dưới kính hiển vi quang học. Khu vực hấp thụ lại cũng được đo bằng máy phân tích hình ảnh và được biểu thị bằng phần trăm của giá trị kiểm soát.
Phân tích Western Blot
Toàn bộ protein ly giải được chuẩn bị trong đệm ly giải như được mô tả ở những nơi khác [26]. Các protein tế bào và hạt nhân đã được chuẩn bị như đã mô tả trước đây [25]. Một lượng bằng nhau của chiết xuất protein được tách 12–15 phần trăm SDS-PAGE và thấm lên màng polyvinyl difluoride. Các đốm màu được thăm dò bằng kháng thể sơ cấp qua đêm ở 4uC trước khi ủ với kháng thể thứ cấp trong đệm chặn trong 1 giờ. Các đốm màu được phát triển với sự phát quang hóa học tăng cường (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, Vương quốc Anh) và cho tiếp xúc với phim X-quang (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, USA).
Thử nghiệm hoạt động MAPK
Tế bào được xử lý trước bằng acteoside trong 2 giờ và sau đó được kích thích bằng RANKL thêm -30 phút. Các hoạt động MAPK được xác định bằng cách sử dụng các bộ xét nghiệm đo miễn dịch, chẳng hạn như bộ xét nghiệm p-p38kinase (Assay Designs, Inc., MI, USA), bộ xét nghiệm enzyme p-ERK (Assay Designs) và bộ kit ELISA sandwich p-SAPK / JNK ( Công nghệ tín hiệu tế bào, MA, Hoa Kỳ). Tất cả các quy trình đều tuân theo hướng dẫn của nhà sản xuất và độ hấp thụ được đo bằng đầu đọc vi tấm.
Xét nghiệm dịch chuyển di động điện di (EMSA)
Phản ứng liên kết DNA-protein được thực hiện trong 3 0 phút ở nhiệt độ phòng, với 10–15 mg protein trong 20 ml đệm chứa 1 mg / ml BSA, 0,5 mg / ml poly (dI-dC), 5 phần trăm glycerol , 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50 mm NaCl, 30, 000 CPM của [a -32 P] dCTP được gắn nhãn oligonucleotide và đoạn Klenow của DNA polymerase. Các mẫu được tách trên gel polyacrylamide 6%, được làm khô và chiếu qua phim X-quang (Eastman Kodak Co.) trong 12–24 giờ ở 270uC. Trình tự mồi oligonucleotide cụ thể cho NF-là 59- AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTGGCC TGG A -39 và 39- GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGGACC GGA CCT GGA A {{30 }}.
Xét nghiệm Luciferase NF-kB
Các đại thực bào RAW264.7 trong 24- đĩa giếng đã được truyền bằng vectơ phóng xạ 0. 8 mg kB-luciferase bằng cách sử dụng 2 ml Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Vào 24 giờ sau khi chuyển nạp, các tế bào được kích thích bằng RANKL khi có và không cóacteosidetrong 24 giờ. Các tế bào được tiếp tục lại trong dung dịch đệm ly giải phóng viên 100 ml (Promega, Madison, WI, USA). Một lượng bằng nhau của các mẫu protein đã được đặt vào 96- các vi mẫu tốt và trộn với chất nền luciferase. Sự phát quang được đo bằng cách sử dụng một máy đo độ sáng vi tấm (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Đức). Trong thí nghiệm này, một peptide ức chế NF-B có thể thẩm thấu (BIOMOL, Butler Pike, PA, USA) được sử dụng như một chất ức chế kB dương tính.
Đo lường Cytokine
Tế bào BMM hoặc RAW264.7 được kích thích bằng RANKL với sự hiện diện của acteoside trong 24- đĩa nuôi cấy giếng. Sau 48 giờ ủ, các phần nổi trên bề mặt nuôi cấy được thu thập và đánh giá bằng ELISA sử dụng bộ dụng cụ OptEIATM cụ thể TNF-a-, IL -1 b- và IL -6- theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược thời gian thực (RT-PCR)
Biểu hiện mRNA của các dấu hiệu tế bào hủy xương, chẳng hạn như c-Fos, NFATc1 và TNF-a, được xác định bằng RT-PCR thời gian thực. Tóm lại, RNA tổng số được chiết xuất từ đại thực bào bằng Trizolreagent theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Invitrogen) .cDNA được tổng hợp với 1 mg RNA tổng số bằng cách sử dụng SuperScriptReverse Transcriptase II và mồi (Invitrogen). Power SYBRGreen PCR Master Mix (Hệ thống sinh học ứng dụng, Thành phố Foster, CA, Hoa Kỳ) được sử dụng để phát hiện sự tích tụ của sản phẩm PCR trong quá trình đạp xe với hệ thống phát hiện trình tự ABI 7500 (Hệ thống ứng dụng). Sau khi biến tính ở 95uC trong 10 phút, PCR là
Đo ROS nội bào
Dung dịch gốc 29, 79- dichlorodihydrofluorescein-diacetate (DCFH-DA) (5 0 mM; Calbiochem, Darmstadt, Đức) được pha chế trong DMSO và được bảo quản ở 220uC trong bóng tối. Tóm lại, BMM (106 tế bào / ml trong 6- đĩa giếng) được nuôi cấy với 50 ng / MLM-CSF trong 24 giờ và sau đó được xử lý với các nồng độ khác nhau (0–10 mM) của acteoside 2 giờ trước khi kích thích với 100 ng / mlRANKL. Sau 1 giờ đồng ủ, các tế bào này sau đó được ủ với 25 mM DCFH-DA trong 30 phút. Sự phát huỳnh quang màu lục của 29, 79- dichlorofluorescein (DCF) được ghi lại ở bước sóng 515 nm (FL 1) bằng cách sử dụng hệ thống FACS VantageH (Becton-Dickinson, San Jose, CA, Hoa Kỳ) và 10, 000 sự kiện đã được tính cho mỗi mẫu.
Gây loãng xương do phẫu thuật cắt buồng trứng
Chuột ICR cái (6 tuần tuổi) được sử dụng cho nghiên cứu này. Chuột được phẫu thuật giả (Sham, n=10) hoặc phẫu thuật cắt buồng trứng (OVX, n=20) dưới gây mê. Một tuần sau khi phẫu thuật, những con chuột OVX được chia ngẫu nhiên thành 2 nhóm, mỗi nhóm 10 con: OVX hai bên và OVX hai bên được bổ sung 200 ml PBS chứa 1 mM acteoside bằng đường uống (nhóm AC). Miệngacteosideđược tiêm 3 ngày một lần trong 8 tuần sau khi phẫu thuật, và cùng một lượng PBS được dùng cho Nhóm Sham và OVX. Sau 1 ngày kể từ lần tiêm cuối cùng, chuột được hiến tế và sau đó các thông số sinh hóa trong huyết thanh và cấu trúc xương 3- chiều được phân tích.
Xác định các thông số sinh hóa huyết thanh
Các mẫu máu được thu thập thông qua chọc dò tim và huyết thanh được thu thập bằng cách ly tâm. Các mẫu huyết thanh được lưu trữ ở 280uC để phân tích các thông số sinh hóa. Nồng độ IL -1 b và IL -6 trong huyết thanh được ước tính bằng cách sử dụng bộ ELISA như được mô tả ở trên, trong khi hoạt tính phosphatase kiềm (ALP) được xác định bằng cách sử dụng một xét nghiệm so màu sinh hóa đo lượng p -nitrophenol được sản xuất từ chất nền p-nitrophenol photphat, như được mô tả ở những nơi khác [27]. Để ước tính các dấu ấn sinh học của quá trình hình thành và tiêu xương, nồng độ OC, canxi và TRAP5b trong huyết thanh cũng được xác định theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Phân tích cấu trúc xương và các thông số hình thái
Phần đùi của chuột (nhóm Sham, OVX và AC) được mổ xẻ và đổ đầy nước muối sinh lý để kiểm tra cơ học. Độ bền cơ học của xương đùi được đo như mô tả ở những nơi khác [28]. Tải trọng gãy được ghi lại là lực đỉnh tính bằng niutơn tại điểm mà trục giữa của gãy xương đùi phải. Ngoài ra, xương đùi nhẹ của mỗi con vật được phân tích mô hình học bằng hệ thống chụp cắt lớp vi tính (micro-CT) (hệ thống chụp X-quang vi tiêu điểm SkyScan 1076, Kontich, Bỉ). Nói tóm lại, xương trong kho chứa 4% formaldehyde được làm khô bề ngoài trên khăn giấy trước khi được bọc trong nhựa '' màng bám '' hoặc trong parafilm, để tránh bị khô trong quá trình quét. Mỗi chiếc xương bọc nhựa được đặt trong các ống xốp bằng nhựa / polystyrene được gắn theo chiều dọc theo chiều ngang trong buồng mẫu máy quét 1076 để chụp ảnh vi-CT. Quá trình quét được thực hiện bằng cách sử dụng điện áp nguồn 100 kV và dòng điện nguồn 140 mA với độ phân giải 35 mm. Mô hình ba chiều của xương ngoài cùng của xương đùi đã được tái tạo bằng cách sử dụng SkyScan CT Analyzer phiên bản 1.11. Các thông số cấu trúc như mật độ khoáng xương trabecular (BMD, g / cm3), phần trăm thể tích xương (thể tích xương (BV) / thể tích mô (TV), phần trăm), độ dày (Tb.Th, mm), độ phân tách (Tb.Sp , mm) và số (Tb.N, 1 / mm) sau đó được đo.
Thử nghiệm phân biệt và khoáng hóa Osteogenic
Tế bào tủy xương được nuôi cấy trong đĩa nuôi cấy giếng {{{{1 0}}}} được xử lý bằng DAG (10 nM dexamethasone, 50 mM axit ascorbic, và 20 mM b-glycerophosphate) với sự hiện diện của 10 mM acteoside. Sau 2 tuần biệt hóa, các tế bào được cố định bằng ethanol 70% (thể tích) lạnh trong 1 giờ và nhuộm bằng nước cất alizarin red Sin 0,2% trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau khi các tế bào được tiêu hủy và làm khô trong không khí, các đĩa nuôi cấy tế bào được đánh giá bằng kính hiển vi ánh sáng sử dụng kính hiển vi đảo ngược (Nikon TS100, Nhật Bản). Để định lượng lượng thuốc nhuộm đỏ, vết bẩn được rửa giải bằng 10% acetyl pyridinium clorua bằng cách lắc trong 20 phút và độ hấp thụ được đo ở bước sóng 560 nm. Lượng canxi lắng đọng trong các lớp tế bào cũng được đo bằng Bộ Canxi (Wako Chemical Inc. Osaka, Nhật Bản) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ngoài ra, sự biểu hiện của các dấu hiệu mRNA dành riêng cho xương, chẳng hạn như yếu tố phiên mã liên quan đến runt -2 (Runx2), osterix, sialoprotein của xương (BSP) và OC được xác định bằng RT-PCR thời gian thực. Mồi Oligonucleotide của những điểm đánh dấu này được thiết kế với kích thước sản phẩm nhỏ hơn 200 bp sử dụng Phần mềm PrimerExpress 3.0 (Hệ thống sinh học ứng dụng) như được mô tả ở những nơi khác [27].
Phân tích thống kê
Trừ khi có chỉ định khác, tất cả dữ liệu được biểu thị dưới dạng độ lệch chuẩn (SD) trung bình 6 của 3 thí nghiệm độc lập trở lên. ANOVA một chiều được sử dụng để so sánh nhiều lần bằng phần mềm SPSS phiên bản 12. 0. Giá trị p, 0. 05 được coi là có ý nghĩa thống kê.
Kết quả
Acteoside ức chế sự hình thành tế bào xương bởi Macrophagesin một cách phụ thuộc vào liều lượng
Để xác minh tác dụng của acteoside đối với sự biệt hóa BMM thành tế bào hủy xương, các tế bào được nuôi cấy với các nồng độ khác nhau (0 - 20 mM) acteoside trong 7 ngày với sự hiện diện của 50 ng / ml M CSF và 100 ng / ml RANKL . Acteoside làm giảm số lượng tế bào hủy cốt bào phụ thuộc vào liều lượng. Khi các tế bào được xử lý trước với 10 mM acteoside trong 2 giờ, số lượng tế bào hủy xương giảm 43% so với các tế bào được bổ sung M-CSFand RANKL (Hình. 1A). Hình 1B cho thấy sự biệt hóa của tế bào hủy xương qua trung gian RANKL và sự ức chế của nó bằng cách điều trị kết hợp với acteoside. Phù hợp với kết quả này, tiền xử lý acteoside làm giảm sự biệt hóa do RANKL kích thích của RAW264.7cells và sự hình thành tế bào hủy xương (Hình 1C và D). Khi so sánh tiềm năng chống hủy xương của acteoside trên BMM với tiềm năng chống hủy xương của một số hợp chất phenolic ở cùng nồng độ (10 mM), luteolin cho thấy hoạt tính cao nhất (Hình 2A). Tuy nhiên, bản thân luteolin, quercetin hoặc apigenin đã làm giảm khả năng tồn tại của tế bào (Hình 2B). Tất cả các hợp chất ức chế sự phân hóa tế bào hủy xương bởi các đại thực bào RAW264.7 với các hoạt động tương đối sau: luteolin. quercetin=apigenin .EGCG=acteoside (Hình 2C). Bản thân luteolin, quercetin hoặc apigenin cũng cho thấy khả năng tồn tại của tế bào giảm (Hình 2D). Ngược lại, điều trị bằng quercetin chỉ làm giảm đáng kể khả năng sống ở cả tế bào BMM và RAW264,7, khi các tế bào này tiếp xúc với 10 mM mỗi hợp chất trong 2 ngày với 50 ng / ml M-CSF, 100 ng / ml RANKL, hoặc cả hai (dữ liệu không được hiển thị). Khi nồng độ của các hợp chất này được yêu cầu để ức chế 50 phần trăm
Sự hình thành tế bào hủy xương trong BMM (IC50) được tính toán bằng cách sử dụng các đường cong hoạt động nồng độ, IC50 của acteoside, quercetin, luteolin, apigenin và EGCG lần lượt là 5,1, 2,3, 2,6, 4,8 và 6,6 mM (Hình 2E). Kết quả này tương tự như trường hợp đại thực bàoRAW264.7 đã được kiểm tra. Những dữ liệu này cho thấy luteolin và quercetin có các hoạt động chống tạo clastogenic cao hơn acteoside. Ngược lại, quercetin ở IC50 cũng có tác dụng độc nhẹ đối với tế bào (dữ liệu không được hiển thị).
ActeosideỨc chế sự hấp thu xương của đại thực bàoActeoside cũng ngăn chặn quá trình tiêu xương qua trung gian RANKL theo cách phụ thuộc vào liều lượng, được đo bằng hệ thống mô hình in vitro (Hình 3A). Sự tiêu xương bị ức chế đáng kể khi BMM được ủ với 1 mM acteoside (Hình 3B). Điều trị acteoside 10 mM gần như làm suy giảm hoàn toàn sự hình thành hố do RANKL gây ra bởi BMMs. Tương tự, acteoside làm giảm quá trình tiêu xương trong các tế bào RAW264.7 được kích thích bởi RANKL (Hình S2A và B). Khả năng củaacteosideđể ức chế tiêu xương phụ thuộc vào thời gian điều trị liên quan đến kích thích RANKL. Acteoside (10 mM) được thêm vào 4 ngày sau khi kích thích RANKL không làm giảm sự hình thành hố trong BMM, ngược lại nó ngăn chặn số lượng tế bào hủy xương được hình thành (Hình 3C). Kết quả khác biệt này một phần là do vùng hố đã được hình thành sau 4 ngày hình thành kích thích RANKL (Hình 3D).
ActeosideGiảm điều chỉnh tín hiệu RANKL sớm Đường dẫn
RANKL tạo ra sự hoạt hóa của 3 MAPK và NF-kB nổi tiếng trong tiền chất của tế bào hủy xương, và sự hoạt hóa này là cần thiết cho sự biệt hóa sớm của tế bào hủy xương. Để hiểu các cơ chế có thể có mà acteoside ức chế quá trình tạo xương, chúng tôi đã nghiên cứu tác động của acteoside lên MAPK và kích hoạt NF-B trong đại thực bào. Các tế bào BMM và RAW264.7 được xử lý trước với 10 mM acteoside trong 2 giờ và sau đó được kích thích với RANKL 100 ng / ml trong 30 phút. Quá trình phosphoryl hóa MAPK được kiểm tra bằng phương pháp phân tích miễn dịch và thấm phương Tây. Acteosidepre ngăn chặn sự gia tăng do RANKL gây ra ở p-p38, p-ERK và p-JNK. Kết quả này được hỗ trợ bởi phân tích đo lường miễn dịch, trong đó tiền xử lý với 10 mM acteoside ức chế đáng kể mức MAPK được phosphoryl hóa trong các đại thực bào này (Hình 4C). Điều trị bằng RANKL làm tăng liên kết DNA của NF-kB, trong khi đó, acteoside ức chế sự hoạt hóa liên kết NF-kB-DNA do RANKL gây ra (Hình 5A). Sự ức chế này nổi bật hơn ở các BMM so với các tế bào RAW264,7. Acteoside cũng làm giảm quá trình phosphoryl hóa p65 và IkBa do RANKL kích thích trong tế bàoBMM và RAW264.7 (Hình 5B và C). Thêm 10 mMacteoside gần như ức chế hoàn toàn cả sự phân hủy và hoạt hóa của IkBa trong BMMs (Hình 5B). Để xác nhận thêm rằng kích hoạt NF kB có liên quan đến hoạt động của acteoside, cấu trúc promoter-luciferase kB đã được truyền nhanh chóng vào RAW264.7cells. Các tế bào được ủ với 100 ng / ml RANKL có hoạt tính promoter kB cao hơn 3- lần, hoạt tính này bị suy giảm đáng kể bởi 10 mM acteoside (Hình. 5D).
Acteoside ức chế sản xuất các cytokine gây viêm và sự biểu hiện của TNF-a, c-Fos và NFATc1in Đại thực bào kích thích RANKL
TNF-a, IL -1 b và IL -6 rất quan trọng trong việc hình thành và chức năng của tế bào hủy xương, được điều khiển bởi các đại thực bào được kích thích bởi NF-kB tín hiệu NF-kB. RANKL kích thích sản xuất các cytokine này, và việc sản xuất này đã giảm rõ rệt khi tiền xử lý acteoside 10 mM trong BMM (Hình 6A). Tương tự, acteoside làm giảm sản xuất cytokine do RANKL gây ra, ngoại trừ IL -6, trong đại thực bào RAW264.7 (Hình. S3). Để hiểu cơ chế phân tử của hoạt động của acteoside trong quá trình tạo xương, chúng tôi đã kiểm tra thêm ảnh hưởng của acteoside lên biểu hiện TNF-a, c-Fos và NFATc1. RANKL đã điều chỉnh sự biểu hiện mRNA của các yếu tố này trong các tế bào BMM và RAW264.7 (Hình 6B và C). Tiền xử lý với 10 mM acteoside ức chế đáng kể biểu hiện gây ra RANKL của các yếu tố này ở cả hai
BMM và ô RAW264.7. Tiền xử lý Acteoside cũng làm giảm mạnh mức protein của c-Fos và NFATc1 trong các BMM được kích thích bằng RANKL (Hình 6D). Những kết quả này cho thấy rằngacteosideđiều chỉnh giảm RANKL tạo ra chất trung gian hình thành tế bào hủy xương ở mức độ gen và protein.
Acteoside làm giảm độ sáng tạo ROS nội bào trong BMM trong cách xử lý phụ thuộc vào liều lượng
Vì đã biết rằng sản xuất ROS nội bào có tương quan với quá trình tạo xương do RANKL kích thích, chúng tôi đã nghiên cứu xem liệu acteoside có ức chế sản xuất ROS trong quá trình biệt hóa tế bào hủy xương qua trung gian RANKL hay không bằng cách sử dụng thuốc nhuộm nhạy cảm với oxy hóa, thấm qua tế bào, DCFH-DA. Phân tích lưu lượng tế bào cho thấy rằng tín hiệu huỳnh quang trung bình đặc hiệu choDCF trong BMM rõ ràng đã bị dịch chuyển sang phải sau khi kích thích với RANKL, so với các tế bào đối chứng không được điều trị (Hình 7A). Sự thay đổi này tương tự như trường hợp các đại thực bào RAW264.7 được quan sát thấy sau khi kích thích RANKL (dữ liệu không được hiển thị). Điều trị BMM với acteoside làm giảm cường độ tín hiệu của DCF theo cách phụ thuộc vào liều lượng. Tiền xử lý với 10 mM acteoside gần như làm giảm hoàn toàn mức ROS nội bào được tạo ra trong quá trình biệt hóa tế bào hủy xương xuống mức kiểm soát chưa được điều trị (Hình 7B).
Quản lý Acteoside đường uống ức chế sự thay đổi của các dấu hiệu sinh hóa xương và mất xương ở chuột đã cắt trứng
Để khám phá tác động của acteoside đối với sự mất xương, chúng tôi đã chuẩn bị một mô hình động vật bị loãng xương bằng cách cắt bỏ buồng trứng. Không có sự khác biệt đáng kể về trọng lượng cơ thể giữa OVX và Shammice trong thời gian thử nghiệm (dữ liệu không được hiển thị). Nhóm có nồng độ IL -1 b và IL -6 trong huyết thanh cao hơn đáng kể so với nhóm Sham (Hình 8). Sự gia tăng gây ra bởi phẫu thuật cắt buồng trứng đối với những cytokine gây viêm này đã bị giảm độc lực khi dùng acteoside đường uống (nhóm AC). Nồng độ huyết thanh của các dấu hiệu chu chuyển xương như ALP, canxi, TRAP5b và OC đã tăng lên đáng kể ở nhóm OVX. Trong số các dấu hiệu loãng xương này, mức độ tăng của canxi, TRAP5b và OC ở chuột OVX rõ ràng đã bị ức chế khi điều trị bằng acteoside, trong khi mức ALP trong huyết thanh không bị thay đổi khi điều trị. Tải trọng gãy tối đa trung bình đến giữa trục xương đùi bên phải ở nhóm OVX thấp hơn đáng kể so với nhóm Sham (Hình 9A). Điều trị bằng Acteoside đã nâng mức dự phòng gãy xương tối đa lên mức dự phòng của nhóm Sham. Khi xương vỏ của xương đùi được mổ xẻ và quan sát bằng kính hiển vi quang học, các đặc điểm loãng xương thể hiện ở nhóm OVX gần như biến mất hoàn toàn ở chuột AC (Hình 9B). Để xác minh tác dụng của acteoside trên mô hình loãng xương do OVX, BMD và các thông số hình thái xương ở mặt ngoài của xương đùi gần nhẹ đã được phân tích bằng vi-CT. Như được thể hiện trong Hình 9C, một sự thay đổi của cấu trúc xương đùi đã được tìm thấy ở chuột OVX, trong khi sự thay đổi này được giảm bớt khi điều trị với acteoside. Kết quả từ phân tích vi-CT cho thấy BMD, một thước đo sức mạnh của xương, đã giảm đáng kể trong OVXmice (Hình 9D). So với nhóm Sham, chuột OVX cũng cho thấy những thay đổi đáng kể về BV / TV, Tb. Sp và Tb. N, nhưng không phải Tb.Th. Việc điều trị bằng miệng acteoside đối với chuột OVX đã ngăn chặn đáng kể sự thay đổi ở BMD cũng như BV / TV và Tb.N.
