Phần 1: Tác dụng chống viêm, chống oxy hóa, dưỡng ẩm và kháng sinh của Quercetin 3- O - - D-Glucuronide trong tế bào sừng và tế bào hắc tố ở người thông qua việc kích hoạt các con đường NF-κB và AP -1
Mar 21, 2022
Để biết thêm thông tin, liên lạctina.xiang@wecistanche.com
trừu tượng: Quercetin3- O - - D-glucuronid (Q -3- G), liên hợp glucuronid của quercetin, đã được báo cáo là cóchống viêmđặc tính trong các đại thực bào được kích thích bởi lipopolysaccharide, cũng như các đặc tính chống ung thư và chống oxy hóa. Không giống như quercetin, được mô tả rộng rãi là có nhiều hoạt tính dược lý bao gồm tác dụng bảo vệ da, các lợi ích và cơ chế dược lý của Q -3- G trong da vẫn còn được làm sáng tỏ. Nghiên cứu này tập trung vào việc mô tả các đặc tính bảo vệ da, bao gồm các đặc tính chống viêm và chống oxy hóa, của Q -3- Chống lại stress oxy hóa do tia UVB gây ra hoặc H2O 2-, các hiệu ứng hydrat hóa, vàantimelanogenesiscác hoạt động sử dụng tế bào sừng của người (HaCaT) và tế bào u ác tính (B16F10). Q -3- G điều chỉnh giảm sự biểu hiện của gen gây viêm và cytokine như cyclooxygenase -2 (COX -2) và yếu tố hoại tử khối u (TNF) - ở HO, hoặc UVB- tế bào HaCaT được chiếu xạ. Chúng tôi cũng chỉ ra rằng O -3- Gexhibits có tác dụng chống oxy hóa bằng cách sử dụng các xét nghiệm thu dọn gốc tự do, đo lưu lượng tế bào và sự gia tăng biểu hiện của yếu tố hạt nhân erythroid 2- yếu tố liên quan đến yếu tố 2 (Nrf2). Q -3- G làm giảm sản xuất melanin trong các tế bào B16F10 kích thích -melanocyte (-MSH) do tế bào B16F10 tạo ra. Các tác động và cơ chế hydrat hóa của Q -3- G được kiểm tra bằng cách đánh giá các gen liên quan đến yếu tố giữ ẩm, chẳng hạn như transglutaminase -1 (TGM -1), filaggrin (FLG) và tổng hợp axit hyaluronic (ĐÃ) -1. Ngoài ra, Q -3- G làm tăng quá trình phosphoryl hóa c-Jun, Jun-N-terminal kinase (JNK), kinase protein được kích hoạt bởi Mitogen (MAPK) kinase 4 (MKK4) và TAK1, liên quan đến MAPKs / AP Con đường -1 và quá trình phosphoryl hóa IkB, IkB kinase (IKK) -, Akt và Src, tham gia vào con đường NF-kB. Kết hợp lại với nhau, chúng tôi đã chứng minh rằng Q {35}} G có các đặc tính chống viêm, chống oxy hóa, dưỡng ẩm và chống hình thành tế bào sừng ở người và tế bào hắc tố thông qua các con đường NF-kB và AP -1.
Từ khóa: quercetin 3- O - - D-glucuronide; Bảo vệ tia cực tím; dưỡng ẩm; antimelanogenesis; AP -1; NF-kB
1. Giới thiệu
Da, cơ quan lớn nhất của cơ thể, cung cấp một hàng rào có vai trò chính trong việc bảo vệ cơ thể khỏi môi trường bên ngoài và các tác nhân gây hại như bức xạ tia cực tím, vi khuẩn truyền nhiễm và hóa chất có hại. Hàng rào này cũng điều chỉnh sự cân bằng điện giải và nhiệt độ của cơ thể và ngăn ngừa mất độ ẩm [1,2]. Da người được cấu tạo bởi ba lớp: biểu bì, hạ bì với các phần phụ và mô dưới da [3]. Lớp biểu bì đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì nhiệt độ cơ thể.
Tế bào sừng, thành phần phong phú trong biểu bì da, tương tác chặt chẽ với tế bào khác thông qua các mô tế bào và các điểm nối chặt chẽ cho phép tạo ra một hàng rào lý hóa hiệu quả [4]. Mặc dù da có chức năng như một hàng rào bảo vệ, nhưng bức xạ tia cực tím (UV) có ảnh hưởng đáng kể đến hầu hết các tế bào, bao gồm tế bào sừng, lớp ngoài cùng của da. Bức xạ UV có thể gây lão hóa da, tổn thương da, nếp nhăn và tăng sắc tố, được coi là một trong những yếu tố nguy cơ nghiêm trọng nhất [5]. Ánh sáng UV bao gồm ba dải bước sóng: UVA (320-400 nm), UVB (280-320 nm) và UVC (200-280 nm). Be-side hydrogen peroxide (H2O2), đã được biết đến là nguyên nhân gây ra stress oxy hóa, UVB có thể dẫn đến việc sản xuất các loại oxy phản ứng (ROS) thông qua việc kích hoạt các enzym tạo ROS [6]. Sự tích tụ không kiểm soát của ROS trong các tế bào bao gồm tế bào sừng đã được mô tả là gây ra các thay đổi oxy hóa đối với lipid, protein, axit nucleic và các phân tử nội bào khác, dẫn đến các loại tổn thương da và các quá trình liên quan đến lão hóa như chết tế bào, stress oxy hóa, và viêm [7,8]. Ngoài ra, phản ứng stress oxy hóa được biết là có ảnh hưởng đến sự phá hủy các thành phần tế bào khác nhau [9]. Các tế bào da bị tổn thương cũng có thể dẫn đến các phản ứng viêm, dẫn đến da bị tổn thương mãn tính [10]. Một loại tổn thương da qua trung gian UVB hoặc H2O 2- thông qua các quá trình sinh học là sự biểu hiện của các gen gây viêm như cyclooxygenase -2 (COX -2) và các cytokine gây viêm [11]. Do đó, việc phát triển các tác dụng bảo vệ da an toàn hơn, mạnh mẽ hơn và hiệu quả hơn là điều cần thiết để ngăn ngừa và ngăn chặn các bệnh liên quan đến UVB hoặc H2O2, tổn thương da đã được khắc phục.
Hydrat hóa da cũng đóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì chức năng bình thường của nó. Đặc biệt, lớp sừng (SC) có tác dụng bảo vệ, chống lại sự mất nước [12]. Hàm lượng nước của lớp sừng tham gia vào quá trình bong vảy da và trưởng thành thích hợp, trong khi không đủ nước trong SC sẽ thúc đẩy sự tích tụ và rối loạn chức năng của tế bào giác mạc [12,13]. Ở giai đoạn cuối cùng của quá trình biệt hóa tế bào sừng, màng sinh chất và các bào quan tế bào của nó biến mất, sau đó dòng canxi tạo ra transglutaminase (TGM) để liên kết chéo với các protein khác. Sự thiếu hụt hoặc mất TGM -1 dẫn đến sự liên kết chéo của lớp bao tế bào bị lỗi. Lamella ichthyosis là một ví dụ về bệnh do mất TGM -1. Hơn nữa, filaggrin (FLG), chất nền keratin được hình thành, đóng một vai trò trong sự hình thành SC vì nó hoạt động như một giá đỡ để liên kết các protein và lipid có vỏ được cornified [14] bằng cách xúc tác các phản ứng liên kết chéo g-glutamyl lysine, ATGM và màng -các enzym liên kết, truyền đạt tính toàn vẹn cho các SC [15]. Ngoài ra, axit hyaluronic (HA) là một loại yếu tố độ ẩm tự nhiên (NMF) liên quan đến việc duy trì độ ẩm trên da và thể hiện một hồ sơ riêng biệt trong quá trình lão hóa da nội tại, là một chất phân phối thuốc và là một thành phần quan trọng của chất nền ngoại bào [16,17]. HA đóng một vai trò trong việc tăng độ ẩm cho da bằng cách điều chỉnh các gen tổng hợp axit hyaluronic (HAS); bên cạnh đó, axit retinoic (vitamin A) có thể điều chỉnh HA trong lớp biểu bì một cách hiệu quả [17]. TGM -1, FLG và HAS -12, 3 là các gen liên quan đến sản xuất NMF [18]. Hơn nữa, việc kích hoạt các yếu tố phiên mã như protein kích hoạt -1 (AP -1) và yếu tố hạt nhân (NF) -kB tham gia vào việc sản xuất các chất chống viêm giúp tối ưu hóa hàng rào bảo vệ da và dưỡng ẩm cho da thông qua các con đường AP -1 và NF-kB [19]. Các enzyme tín hiệu ngược dòng trong con đường AP -1 bao gồm các kinase protein được kích hoạt bởi mitogen (MAPK) như c-Jun N-terminal kinase (JNK), kinase điều hòa tín hiệu ngoại bào (ERK) và p38, trong khi Src, Akt, IkB -kinase (IKKo /) và KBO (IkBa) thuộc con đường NF-KB [20. Da cũng tạo ra hắc tố ở lớp biểu bì, đặc biệt là ở tế bào hắc tố - nguồn chính của hắc tố - góp phần quyết định màu da và hình thành hắc tố [21]. Chiếu tia UVB và hormone kích thích -melanocyte (o-MSH) có thể kích thích bài tiết melanin, do đó kích hoạt quá trình hình thành hắc tố [22. Trong quá trình hình thành hắc tố, -MSH kích hoạt protein kinase A (PKA), yếu tố phiên mã liên quan đến protein vi mô (MITF), và liên kết yếu tố phản ứng cAMP (CREB) [23]. Một trong những chức năng của melanin được coi là ngăn ngừa tổn thương da do tia UV, kể cả ánh sáng mặt trời. Tuy nhiên, việc sản xuất dư thừa melanin hoặc thiếu hụt hàm lượng melanin gây ra bởi quá trình lão hóa, hormone kích thích tế bào hắc tố và tiếp xúc với tia cực tím sẽ thúc đẩy tàn nhang, nám da, nám da do tuổi già và các rối loạn tăng / giảm sắc tố khác có thể có tác động tiêu cực đến ngoại hình và làn da sức khỏe [24]. Do đó, việc kiểm soát sự hình thành hắc tố cũng được mong muốn để duy trì cả sức khỏe và vẻ ngoài thẩm mỹ của cơ thể con người.
Quercetinlà một flavonoid loại flavonol được phân bổ chủ yếu có trong rau, trái cây, đồ uống và cây thuốc [25]. Do đó, quercetin đã được nghiên cứu rộng rãi để có các lợi ích dược lý bao gồm chống viêm, chống xơ vữa động mạch,chất chống oxy hóa, chống ung thư và các đặc tính bảo vệ da, và có liên quan đến sự hình thành hắc tố [24, 26-29]. Tuy nhiên, một số công trình sử dụng các phương pháp nhạy cảm và đáng tin cậy đã chứng minh rằng quercetin không được phát hiện trong huyết tương [30-33] và hầu như không được tìm thấy trong não [34,35]. Quercetin, thường trình bày dưới dạng glycoside, được hấp thu tốt và hầu hết được thủy phân và chuyển hóa ở ruột non, ruột kết, gan và thận thành các chất chuyển hóa liên hợp [3 0, 36-38]. Chỉ các chất chuyển hóa liên hợp như glucuronid hoặc sulfat (tương ứng được methyl hóa hoặc không được methyl hóa), chứ không phải là aglycone quercetin hoặc các glycoside của nó, mới được phát hiện trong máu tuần hoàn. 3 / -methyl-quercetin -3- glucuronid, quercetin -3- glucuronid và quercetin -3 '- sulfat đã được xác định là các chất chuyển hóa chính trong huyết tương sau 1,5 giờ kể từ khi ăn hành chiên [30, 32]. Các chất chuyển hóa quercetin này được hình thành trong ruột non và gan bởi các enzym chuyển hóa sinh học bao gồm UDP-glucuronyltransferase là kết quả của quá trình chuyển hóa giai đoạn II [29,39,40]. Người ta cũng báo cáo rằng các chất chuyển hóa liên hợp của quercetin tích tụ trong huyết tương người với nồng độ từ 10- 'đến 10- độ M sau khi ăn hành định kỳ trong bữa ăn trong 1 tuần [41]. Thời gian bán thải của các chất chuyển hóa quercetin khá cao, vào khoảng 11 đến 28 giờ [29]. Vì những hợp chất này đã được quan sát là dạng chính của các chất chuyển hóa quercetin liên hợp, các nghiên cứu tập trung vào hoạt tính sinh học của các flavonols sử dụng các chất chuyển hóa liên hợp này sẽ là điều cần thiết, điều này thúc đẩy chúng tôi nghiên cứu hoạt tính sinh học của một trong các chất chuyển hóa quercetin liên hợp. Một trong những chất chuyển hóa glucuronid dồi dào nhất được tìm thấy chủ yếu trong huyết tương và các mô bao gồm gan, thận và não là quercetin 3- O - - D-glucuronid (Q -3- G) (Hình 1) [31,35,40,42,43], có thể tạo ra các hoạt động tương tự, mạnh hơn hoặc yếu hơn so với các hợp chất gốc trong các mô hình khác nhau. Q -3- G được vận chuyển đến các mô đích qua huyết tương để phát huy hoạt tính sinh học của nó [39]. O -3- G cũng đã được chứng minh là chất chuyển hóa hiệu quả trong huyết tương chuột sau khi uống quercetin [43]. Trong các nghiên cứu khác, chất chuyển hóa chứa Q {44}} G được tìm thấy được tích lũy trong động mạch chủ sau khi sử dụng thực phẩm giàu quercetin và đã được xác định là nguyên tắc hoạt động được phát hiện trong máu người từ 0. {48} } μM 【44】. Ngoài ra, Q -3- G có thể được tìm thấy trong rượu vang [45] và trong các cây thuốc như Hypericum hirs đờm, Nelumbo nucifera, Oenothera biennis và đậu xanh [46-49]. Q -3- G đã được mô tả như một thành phần chống viêm trong điều kiện được kích thích bởi LPS và cho thấy các đặc tính chống oxy hóa trong huyết tương [50-52]. Tuy nhiên, so với lịch sử ứng dụng lâu dài và nghiên cứu rộng rãi về quercetin, nghiên cứu về Q -3- G vẫn còn được khám phá. Do đó, Q -3- G đã được chọn làm đại diện cho các chất chuyển hóa quercetin như một nhân tố hoạt động in vivo của quercetin. Ngoài ra, vai trò của Q -3- G đối với tác dụng bảo vệ da cũng chưa được làm sáng tỏ đầy đủ. Trong nghiên cứu này, bằng cách sử dụng các đánh giá in vitro khác nhau, chúng tôi đã nghiên cứu tác dụng bảo vệ da của Q -3- G chống lại UVBor H2O 2- gây ra căng thẳng oxy hóa và viêm, quá trình hydrat hóa da trong HaCaT (một dòng tế bào sừng ở người) tế bào và hoạt động kháng nguyên sinh trong tế bào B16F10 (một dòng tế bào hắc tố của chuột).
2. Kết quả
2.1.Tác dụng chống viêm và chống oxy hóa của Q -3- G chống lại tia UVB hoặc H2O 2- Tế bào HaCaT được kích thích
Mô da có thể bị tổn thương do bức xạ UV. Bức xạ UV kích hoạt một số yếu tố có hại, bao gồm stress oxy hóa, tế bào apoptotic chết, viêm và lão hóa da. Để xác định các hoạt động bảo vệ tia cực tím của Q -3- G, ban đầu, chúng tôi đánh giá xem Q -3- G có bất kỳ ảnh hưởng nào đến khả năng tồn tại của tế bào sừng ở người hay không. Bằng cách sử dụng xét nghiệm 3- (4-5- Dimethylthiazol -2- yl) -2, 5- diphenyl -243 tetrazolium bromide (MTT), chúng tôi đã điều tra các tác dụng gây độc tế bào của O -3- G trong các ô HaCa. Như thể hiện trong Hình 2a, không có sự can thiệp đáng kể vào khả năng tồn tại của tế bào ở nồng độ 2. 5-20 uM bởi Q -3- G, chỉ ra rằng O -3- G không cho thấy độc tính tế bào lên đến 20 μM và không gây hại cho tế bào sừng, lớp bề mặt của tế bào da. Tiếp theo, chúng tôi đánh giá tác dụng bảo vệ da của Q -3- G trong các tế bào HaCaT tiếp xúc với tia UVB. Sau khi chiếu tia UVB ở 30 mJ / cm², Q -3- G đã bảo vệ đáng kể các HaCaTcells khỏi sự chết tế bào do tia UVB gây ra theo cách phụ thuộc vào nồng độ (Hình 2b). Phù hợp với thử nghiệm MTT, sử dụng máy ảnh được kết nối với kính hiển vi để thu hình thái của tế bào HaCaT, Q -3- G đã bảo vệ chống lại sự chết tế bào do tế bào HaCaT được chiếu xạ bằng tia UVB với nồng độ lên đến 10 μM （Hình 2c） . Số lượng tế bào HaCaT trong mỗi điều kiện là 482 đối với nhóm không được điều trị, 91 đối với UVB 30 mJ / cm-nhóm, 276 đối với UVB 30 mJ / cm² cộng thêm 5μM O -3- G và 320 đối với UVB 30 mJ / cm² cộng với 10μM Nhóm Q -3- G (Hình 2d). Những kết quả này đã xác nhận rằng Q -3- G ức chế sự phá hủy HaCaT do tia UVB gây ra và duy trì tác dụng bảo vệ da khỏi sự chiếu xạ của tia UVB.
![i-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 μM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 μM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 μM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted. (e,f) Anti-inflammatory effect of Q-3-G in HaCaT cells. The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s or incubated with H2O2 (500 μM) with or without Q-3-G (5–10 μM) and further incubated for 12 h. The mRNA expression levels of COX-2 (e) and TNF-α (f) were determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (g–j) Antioxidant effect of Q-3-G in HaCaT cells. Q-3-G (0–40 μM) was reacted with 2,2-diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) in the dark at 37°C for 30 min. The absorbance at 517 nm was measured spectrophotometrically (g). Q-3-G was reacted with 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) at different concentrations in the dark at 37°C for 30 min. The absorbance at 730 nm was measured spectrophotometrically (h). Ascorbic acid was used as a control substance. (i) The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s with or without Q-3-G (5– 10 μM) and after incubating for 12 h, the mRNA level of Nrf2 was determined by quantitative realtime PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3) and Q-3-G (0-10 μM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2, DPPH, or ABTS). 2.2. Antimelanogenesis Effect in B16F10 and Moisturizing Effect in HaCaT Cells of Q-3-G To examine the effects of Q-3-G on melanogenesis, the melanoma cells were treated with α-MSH for 48 h to secrete melanin in B16F10 cells. By employing MTT assays, we first confirmed that Q-3-G had no cytotoxicity in B16F10 cells at concentrations up to 20 μM for 48 h (Figure 3a). This result showed, for the next assessments that the effects of Q- 3-G in B16F10 were not due to cell death. Next, we evaluated B16F10 with Q-3-G and α- MSH for 48 h to determine the effects of Q-3-G on melanogenesis. As shown in Figure 3b, Q-3-G significantly inhibited melanin secretion. The positive control arbutin also significantly decreased melanin secretion. The skin moisture-related molecule is hyaluronic acid (HA). As previously mentioned, HA, distributed throughout the epidermis and dermis, is an NMF that enhances skin hydration [55]. We used a reverse transcription PCR (RT-PCR) assay to examine the transcription level of HAS-1 after 12 h with a concentration of Q-3-G of up to 30 μM. HAS promotes the accumulation of intermediate-sized HA within keratinocytes [12]. As shown in Figure 3c, the expression of HAS-1 was increased by treatment with Q-3-G up to 10 μM. In addition to the moisturizing factor, we also examined the expression of FLG and TGM- 1. We used retinol as a positive control group. The transcription levels of FLG and TGM-1 increased notably after treatment with Q-3-G at concentrations up to 10 μM (Figure 3d). Figure 2. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 µM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 µM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 µM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted.](/Content/uploads/2022842169/2022032111072748381b7599e14e8e8a252699414e284f.png "i-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 μM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 μM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 μM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted. (e,f) Anti-inflammatory effect of Q-3-G in HaCaT cells. The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s or incubated with H2O2 (500 μM) with or without Q-3-G (5–10 μM) and further incubated for 12 h. The mRNA expression levels of COX-2 (e) and TNF-α (f) were determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (g–j) Antioxidant effect of Q-3-G in HaCaT cells. Q-3-G (0–40 μM) was reacted with 2,2-diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) in the dark at 37°C for 30 min. The absorbance at 517 nm was measured spectrophotometrically (g). Q-3-G was reacted with 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) at different concentrations in the dark at 37°C for 30 min. The absorbance at 730 nm was measured spectrophotometrically (h). Ascorbic acid was used as a control substance. (i) The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s with or without Q-3-G (5– 10 μM) and after incubating for 12 h, the mRNA level of Nrf2 was determined by quantitative realtime PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3) and Q-3-G (0-10 μM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2, DPPH, or ABTS). 2.2. Antimelanogenesis Effect in B16F10 and Moisturizing Effect in HaCaT Cells of Q-3-G To examine the effects of Q-3-G on melanogenesis, the melanoma cells were treated with α-MSH for 48 h to secrete melanin in B16F10 cells. By employing MTT assays, we first confirmed that Q-3-G had no cytotoxicity in B16F10 cells at concentrations up to 20 μM for 48 h (Figure 3a). This result showed, for the next assessments that the effects of Q- 3-G in B16F10 were not due to cell death. Next, we evaluated B16F10 with Q-3-G and α- MSH for 48 h to determine the effects of Q-3-G on melanogenesis. As shown in Figure 3b, Q-3-G significantly inhibited melanin secretion. The positive control arbutin also significantly decreased melanin secretion. The skin moisture-related molecule is hyaluronic acid (HA). As previously mentioned, HA, distributed throughout the epidermis and dermis, is an NMF that enhances skin hydration [55]. We used a reverse transcription PCR (RT-PCR) assay to examine the transcription level of HAS-1 after 12 h with a concentration of Q-3-G of up to 30 μM. HAS promotes the accumulation of intermediate-sized HA within keratinocytes [12]. As shown in Figure 3c, the expression of HAS-1 was increased by treatment with Q-3-G up to 10 μM. In addition to the moisturizing factor, we also examined the expression of FLG and TGM- 1. We used retinol as a positive control group. The transcription levels of FLG and TGM-1 increased notably after treatment with Q-3-G at concentrations up to 10 μM (Figure 3d). Figure 2. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 µM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 µM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 µM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted.")
Sự xuất hiện và đợt cấp của tình trạng viêm trong cơ thể đôi khi kích hoạt các đại thực bào và giải phóng một số cytokine. Viêm là một dấu hiệu của stress oxy hóa. Chúng tôi đã nghiên cứu tác dụng chống viêm của Q -3- G chống lại chứng viêm gây ra bởi tia UVB hoặc HO {2}}. Ai cũng biết rằng UVB có thể thúc đẩy tổn thương DNA và viêm trong tế bào da. 【10】. Chúng tôi đã chiếu xạ các tế bào HaCaT với UVB 30mJ / cm² và ủ các tế bào HaCaT với H2O2 (500 uM). Chúng tôi đã thực hiện xét nghiệm PCR thời gian thực để kiểm tra biểu hiện mRNA của enzym viêm COX -2 và cytokine TNF- tiền viêm. Như được thể hiện trong kết quả trong Hình 2e, f, nồng độ 10 μM của O -3- G đã ức chế đáng kể sự biểu hiện mRNA của COX -2 và TNF-. Do đó, Q -3- G ức chế các phản ứng viêm gây ra trong tế bào HaCaT sau khi tiếp xúc với bức xạ UVB hoặc H2O2.
Chúng tôi đã sử dụng 2,2'-azinobis - (3- ethylbenzothiazoline -6- axit sulfonic) (ABTS) và 2, 2- diphenyl-lpicrylhydrazyl (DPPH) - các hệ thống mô hình được sử dụng rộng rãi để điều tra các hoạt động nhặt rác trong ống nghiệm của các hợp chất tự nhiên — để đánh giá đặc tính chống oxy hóa của Q -3- G ở các nồng độ khác nhau. Tế bào HaCaT được xử lý bằng Q -3- G theo cách phụ thuộc nồng độ từ 2. 5-40 μM khi có DPPH và kết quả cho thấy hoạt động thu gom đáng kể ở hơn 2,5 uM (Hình 2g) . Thử nghiệm ABTS cũng đã chứng minh đáng kể ảnh hưởng của Q -3- G đối với việc thu dọn gốc tự do theo cách cư xử phụ thuộc vào nồng độ với giá trị IC50 là 1,75 μM （Hình 2h）. Axit ascorbic （AA）, như một đối chứng tích cực, cho thấy tác dụng chống oxy hóa lớn nhất trong cả xét nghiệm DPPH và ABTS. Yếu tố hạt nhân erythroid 2- liên quan đến yếu tố 2 (Nrf2), một trong những gen phụ thuộc vào yếu tố phản ứng chống oxy hóa (ARE), đã được báo cáo để điều chỉnh các cơ chế oxy hóa bảo vệ và cơ chất nucleophilic của nó, do đó thúc đẩy các enzym chống oxy hóa để loại bỏ hư hỏng và sửa chữa các hệ thống [53]. Tiếp theo, chúng tôi kiểm tra mức độ biểu hiện của Nrf2 trong các tế bào HaCaT được chiếu tia UVB. Tăng cường các phát hiện trên, O -3- G đã nâng cao đáng kể mức độ biểu hiện của Nrf2 khi chiếu xạ tia UVB so với đối chứng theo cách phụ thuộc nồng độ, lên đến 10 uM (Hình2i), ngụ ý rằng Q -3- G thể hiện tác dụng chống oxy hóa cả về mặt hóa học và sinh học với đặc tính loại bỏ gốc tự do và làm tăng hiệu quả bảo vệ của tín hiệu ARE phụ thuộc Nrf 2- tương ứng. Hơn nữa, chúng tôi cũng thực hiện phép đo tế bào dòng chảy ROS bằng cách sử dụng dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA) trong điều kiện UV. Chất chống oxy hóa được biết đến rộng rãi để ngăn chặn các tác nhân gây căng thẳng tế bào bằng cách ức chế sản xuất ROS [54]. Kết quả cho thấy rằng điều trị với Q -3- G ở nồng độ 5 và 10 μM làm giảm mức độ ROS do tia UVB gây ra （Hình 2j）. Kết hợp lại với nhau, những dữ liệu này ngụ ý rằng Q -3- Gexerts đặc tính bảo vệ da như tác dụng chống viêm và chống oxy hóa chống lại H2O, hoặc căng thẳng oxy hóa do tia UVB và tình trạng viêm trong tế bào HaCaT.
![A level of Nrf2 was determined by quantitative realtime PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3) and Q-3-G (0-10 μM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2, DPPH, or ABTS). 2.2. Antimelanogenesis Effect in B16F10 and Moisturizing Effect in HaCaT Cells of Q-3-G To examine the effects of Q-3-G on melanogenesis, the melanoma cells were treated with α-MSH for 48 h to secrete melanin in B16F10 cells. By employing MTT assays, we first confirmed that Q-3-G had no cytotoxicity in B16F10 cells at concentrations up to 20 μM for 48 h (Figure 3a). This result showed, for the next assessments that the effects of Q- 3-G in B16F10 were not due to cell death. Next, we evaluated B16F10 with Q-3-G and α- MSH for 48 h to determine the effects of Q-3-G on melanogenesis. As shown in Figure 3b, Q-3-G significantly inhibited melanin secretion. The positive control arbutin also significantly decreased melanin secretion. The skin moisture-related molecule is hyaluronic acid (HA). As previously mentioned, HA, distributed throughout the epidermis and dermis, is an NMF that enhances skin hydration [55]. We used a reverse transcription PCR (RT-PCR) assay to examine the transcription level of HAS-1 after 12 h with a concentration of Q-3-G of up to 30 μM. HAS promotes the accumulation of intermediate-sized HA within keratinocytes [12]. As shown in Figure 3c, the expression of HAS-1 was increased by treatment with Q-3-G up to 10 μM. In addition to the moisturizing factor, we also examined the expression of FLG and TGM- 1. We used retinol as a positive control group. The transcription levels of FLG and TGM-1 increased notably after treatment with Q-3-G at concentrations up to 10 μM (Figure 3d). Figure 2. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 µM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 µM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 µM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted. (e,f) Anti-inflammatory effect of Q-3-G in HaCaT cells. The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s or incubated with H2O2 (500 µM) with or without Q-3-G (5–10 µM) and further incubated for 12 h. The mRNA expression levels of COX-2 (e) and TNF-α (f) were determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (g–j) Antioxidant effect of Q-3-G in HaCaT cells. Q-3-G (0–40 µM) was reacted with 2,2- diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) in the dark at 37 ◦C for 30 min. The absorbance at 517 nm was measured spectrophotometrically (g). Q-3-G was reacted with 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonic acid (ABTS) at different concentrations in the dark at 37 ◦C for 30 min. The absorbance at 730 nm was measured spectrophotometrically (h). Ascorbic acid was used as a control substance. (i) The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s with or without Q-3-G (5–10 µM) and after incubating for 12 h, the mRNA level of Nrf2 was determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) and Q-3-G (0-10 µM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2 , DPPH, or ABTS)](/Content/uploads/2022842169/202203211108455bff4d0223ef483dbe3172e2d3349d71.png "A level of Nrf2 was determined by quantitative realtime PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3) and Q-3-G (0-10 μM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2, DPPH, or ABTS). 2.2. Antimelanogenesis Effect in B16F10 and Moisturizing Effect in HaCaT Cells of Q-3-G To examine the effects of Q-3-G on melanogenesis, the melanoma cells were treated with α-MSH for 48 h to secrete melanin in B16F10 cells. By employing MTT assays, we first confirmed that Q-3-G had no cytotoxicity in B16F10 cells at concentrations up to 20 μM for 48 h (Figure 3a). This result showed, for the next assessments that the effects of Q- 3-G in B16F10 were not due to cell death. Next, we evaluated B16F10 with Q-3-G and α- MSH for 48 h to determine the effects of Q-3-G on melanogenesis. As shown in Figure 3b, Q-3-G significantly inhibited melanin secretion. The positive control arbutin also significantly decreased melanin secretion. The skin moisture-related molecule is hyaluronic acid (HA). As previously mentioned, HA, distributed throughout the epidermis and dermis, is an NMF that enhances skin hydration [55]. We used a reverse transcription PCR (RT-PCR) assay to examine the transcription level of HAS-1 after 12 h with a concentration of Q-3-G of up to 30 μM. HAS promotes the accumulation of intermediate-sized HA within keratinocytes [12]. As shown in Figure 3c, the expression of HAS-1 was increased by treatment with Q-3-G up to 10 μM. In addition to the moisturizing factor, we also examined the expression of FLG and TGM- 1. We used retinol as a positive control group. The transcription levels of FLG and TGM-1 increased notably after treatment with Q-3-G at concentrations up to 10 μM (Figure 3d). Figure 2. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 µM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 µM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 µM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted. (e,f) Anti-inflammatory effect of Q-3-G in HaCaT cells. The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s or incubated with H2O2 (500 µM) with or without Q-3-G (5–10 µM) and further incubated for 12 h. The mRNA expression levels of COX-2 (e) and TNF-α (f) were determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (g–j) Antioxidant effect of Q-3-G in HaCaT cells. Q-3-G (0–40 µM) was reacted with 2,2- diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) in the dark at 37 ◦C for 30 min. The absorbance at 517 nm was measured spectrophotometrically (g). Q-3-G was reacted with 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonic acid (ABTS) at different concentrations in the dark at 37 ◦C for 30 min. The absorbance at 730 nm was measured spectrophotometrically (h). Ascorbic acid was used as a control substance. (i) The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s with or without Q-3-G (5–10 µM) and after incubating for 12 h, the mRNA level of Nrf2 was determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) and Q-3-G (0-10 µM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2 , DPPH, or ABTS)")
2.2.Tác dụng tạo hình thành tế bào ở B16F10 và tác dụng giữ ẩm trong tế bào HaCaT của Q -3- G
Để kiểm tra tác động của O -3- G lên quá trình hình thành hắc tố, các tế bào hắc tố đã được xử lý bằng -MSH trong 48 giờ để tiết ra melanin trong các tế bào B16F10. Bằng cách sử dụng các thử nghiệm MTT, đầu tiên chúng tôi xác nhận rằng Q -3- G không có độc tính tế bào trong tế bào B16F10 ở nồng độ lên đến 20 μM trong 48 giờ (Hình 3a). Kết quả này cho thấy, đối với các đánh giá tiếp theo rằng ảnh hưởng của O -3- G trong B16F10 không phải do tế bào chết. Tiếp theo, chúng tôi đánh giá B16F10 với Q -3- Gand -MSH trong 48 giờ để xác định ảnh hưởng của Q -3- G lên sự hình thành hắc tố. Như trong Hình 3b, Q -3- G ức chế đáng kể sự bài tiết melanin. Arbutin kiểm soát tích cực cũng làm giảm đáng kể sự tiết melanin.
Phân tử liên quan đến độ ẩm của da là axit hyaluronic (HA). Như đã đề cập trước đây, HA, được phân bổ khắp lớp biểu bì và hạ bì, là một NMF giúp tăng cường dưỡng ẩm cho da [55]. Chúng tôi đã sử dụng xét nghiệm PCR phiên mã ngược (RT-PCR) để kiểm tra mức độ phiên mã của HAS -1 sau 12 giờ với nồng độ Q -3- G lên đến 30 uM. HAS thúc đẩy sự tích tụ HA có kích thước trung gian trong tế bào sừng [12]. Như trong Hình 3c, biểu hiện của HAS -1 được tăng lên khi điều trị với Q -3- G lên đến 10 μM. Ngoài yếu tố giữ ẩm, chúng tôi cũng kiểm tra sự biểu hiện của FLG và TGM {{ 13}}. Chúng tôi đã sử dụng retinol như một nhóm đối chứng tích cực. Mức độ phiên mã của FLG và TGM -1 tăng lên đáng kể sau khi điều trị với Q -3- G ở nồng độ lên đến 10 μM (Hình 3d). Những phát hiện này cho thấy Q -3- G có hoạt động dưỡng ẩm da trong các tế bào HaCaT. Hơn nữa, bằng cách sử dụng SB203580 (chất ức chế p38), SP600125 (chất ức chế JNK), UO126 (chất ức chế ERK) và Bay 11-7082 (chất ức chế NF-kB), chúng tôi đã kiểm tra sự tham gia của các đường truyền tín hiệu MAPK và NF-kB trong việc dưỡng ẩm nhân tố của Q -3- ô HaCaT được G xử lý. Dựa trên biểu hiện gen gây ra O -3- G, cả mức TGM -1 và FLG đều giảm khi điều trị với SP600125, một chất ức chế JNK (Hình 3e), cho thấy rằng JNK là cần thiết để tăng biểu hiện của TGM -1 và FLG về tác dụng dưỡng ẩm da của O -3- G. Ngoài ra, sự biểu hiện FLG cũng bị giảm bởi Bay 11-7082, một chất ức chế IKK và IkB, cho thấy rằng cơ chế dược phẩm của Q -3- G cũng có thể thuộc về con đường tín hiệu NF-kB.
2.3. Các đường dẫn tín hiệu liên quan đến di chuyển của Q -3- G thông qua Kích hoạt AP -1 và NF-kB
Dựa trên kết quả mRNA trước đó, chúng tôi đã giả thuyết rằng sự tham gia của tín hiệu AP -1 và NF-kB đối với hiệu ứng hydrat hóa của Q -3- G cũng có thể xảy ra ở mức protein. Sử dụng xét nghiệm Western blot, chúng tôi đã kiểm tra quá trình phosphoryl hóa các phân tử ngược dòng của AP -1 và NF-kB. Đầu tiên, trong con đường AP -1, sự phosphoryl hóa c-Jun được tăng lên sau khi ủ tế bào HaCaT với Q -3- G trong 24 giờ (Hình 4a). Mức p-INK cũng tăng lên sau khi điều trị bằng Q -3- G ở nồng độ 2,5,5 và 10 μM. Dạng tổng thể của JNK không thay đổi (Hình 4b). Chúng tôi đã kiểm tra thêm sự phosphoryl hóa của MKK4 và TAK -1, là những chất điều chỉnh ngược dòng của JNK. Như trong Hình 3c, sau khi xử lý các tế bào HaCaT bằng O -3- G, mức protein của p-MKK4 và p-TAK1 cũng được điều chỉnh.
Ngoài tín hiệu NF-kB, Q -3- G làm tăng quá trình phosphoryl hóa p50 và p65, một tiểu đơn vị của NF-kB (Hình 4c). Hơn nữa, chúng tôi đã đánh giá sự kích hoạt của IKK và IkBa, chúng cũng được tăng Q -3- G lên đến 10 uM so với nhóm đối chứng (Hình 4d). Cuối cùng, chúng tôi xác định được sự hoạt hóa của các phân tử ngược dòng tham gia vào lộ trình tín hiệu NF-kB. Quá trình phosphoryl hóa Src và Akt (Ser473) được tăng cường nhờ xử lý O -3- G (Hình 4e). Nhìn chung, những dữ liệu này chỉ ra rằng tác dụng bảo vệ da của việc kích hoạt TAK1 và Src đích Q -3- G bằng cách tăng mức protein, do đó điều chỉnh hoạt động của AP -1 và NF-kB tương ứng.
2.4 Ảnh hưởng của Q -3- G đối với việc kích hoạt phiên mã của AP -1 và NF-kB
Chúng tôi đã điều tra độc tính tế bào của Q -3- G trong tế bào HEK293T của dòng tế bào thận phôi người bằng xét nghiệm MTT (Hình 4f). Khả năng tồn tại của các tế bào HEK293T không bị ảnh hưởng đáng kể sau khi điều trị bằng Q -3- G （2. 5-20 μM） so với các tế bào không được điều trị.
Chúng tôi đã thực hiện xét nghiệm luciferase để xác định xem Q -3- G có thể điều chỉnh các xét nghiệm trình khởi tạo NF-kB và AP -1 hay không. Chúng tôi xác nhận rằng O -3- G làm tăng hoạt động luciferase qua trung gian AP -1- (Hình 4g) và hoạt động luciferase qua trung gian NF-kB (Hình 4h) theo cách phụ thuộc vào nồng độ. Những kết quả này xác thực rằng kích hoạt AP -1 và kích hoạt NF-KB là các mục tiêu dược lý quan trọng của Q -3- G.
Nhấp vào liên kết để biết thêm thông tin:https://www.xjcistanche.com/news/part-2-anti-inflammatory-antioxidant-moistu-55118278.html
