vnNgôn ngữ
Trang chủ / Kiến thức / Nội dung

Kiến thức

Kuwanon T và Sanggenon A được phân lập khỏi Morus Alba Thực hiện tác dụng chống viêm bằng cách điều chỉnh các đường dẫn tín hiệu NF-κB và HO -1 / Nrf2 trong tế bào BV2 và RAW264.7

Mar 30, 2022

Để biết thêm thông tin. tiếp xúctina.xiang@wecistanche.com

trừu tượng: Trước đây, chúng tôi đã nghiên cứu chiết xuất methanolic của vỏ cây Morus alba và đặc trưng cho 11 hợp chất từ ​​chiết xuất: kuwanon G (1), Kuwana E (2), Kuwana T (3), sanggenon A (4), sanggenon M (5), sanggenol A (6), mulberofuran B (7), mulberofuran G (8), moracin M (9), moracin O (10) và norartocarpanone (11). Ở đây, chúng tôi đã điều trachống viêmtác động của các hợp chất này lên tế bào vi mô (BV2) và đại thực bào (RAW264.7). Trong số đó, 3 và 4 ức chế rõ rệt sản xuất oxit nitric do lipopolysaccharide (LPS) tạo ra trong các tế bào này, cho thấy đặc tính chống viêm của hai hợp chất này. Các hợp chất này ức chế sản xuất prostaglandin E2, interleukin -6 và yếu tố hoại tử khối u-c, và sự biểu hiện của enzym tổng hợp oxit nitric và cyclooxygenase -2 sau khi kích thích LPS. Tiền xử lý với 3 và 4 đã ức chế sự hoạt hóa của con đường tín hiệu yếu tố nhân kappa B ở cả hai loại tế bào. Các hợp chất cũng gây ra sự biểu hiện của heme oxygenase (HO) -1 thông qua việc kích hoạt yếu tố hạt nhân erythroid 2- yếu tố liên quan 2. Ức chế hoạt động của HO -1 đảo ngược các tác dụng chống viêm gây ra bằng cách xử lý trước với 3 và 4, cho thấy rằng tác dụng chống viêm đã được điều chỉnh bởi HO -1. Tổng hợp lại, 3 và 4 là những ứng cử viên tiềm năng để phát triển các tác nhân điều trị và phòng ngừa chobệnh viêm nhiễm.

Từ khóa: Morus alba; kuwanon T; sanggenon A; BV2; RAW264,7 ô; tác dụng chống viêm

flavonoids anti-inflammatory

Bấm vào đây để tìm hiểu thêm sản phẩm

1. Giới thiệu

Morus alba, một cây thuốc thuộc họ Moraceae, đã được sử dụng để điều trị các bệnh viêm phổi trong y học cổ truyền [1]. Vỏ rễ của nó chứa các thành phần hoạt tính khác nhau như umbelliferone, scopoletin, mucin, tannin,flavonoid(morusin, mulberrin, mulberrichromene, cyclomulberrin, moracin P, moracin O, mulberrofuran Q, Kuwana E và kuwanon H) [2], 2- arylbenzofurans (moracenin D, moracin P, moracin O và mulberrofuran O), và các flavonoid tiền mã hóa (licoflavone C, cyclomulberrin, neocyclomorusin, sanggenon I, morusin, và Kuwana U) [3,4]. Các chất chiết xuất từ ​​M. alba và các hợp chất hoạt tính có thể làm giảm bớt các bệnh về phổi, như được tiết lộ bởi các nghiên cứu gần đây [5-7]. Ngoài tác dụng dược lý của M.alba trên phổi, các flavonoid isoprenyl hóa (sanggenol Q, Kuwana T, sanggenon N, mulberrofuran G, và mulberrofuran C) còn có tác dụng bảo vệ gan trong tế bào HepG2 do t-BHP gây ra [8]. Prenyl-flavonoid (kuwanon A, Kuwana C, Kuwana T, và morusin) và triterpenoids (axit betulin, avail và -sitosterol) về cơ bản ức chế sự biệt hóa của các tế bào mỡ 3T 3- L1 [9]. Morin hydrat, thành phần flavonoid chính của M. alba, làm giảm chứng suy giảm trí nhớ mãn tính không thể đoán trước do căng thẳng, cho thấy rằng hợp chất này có thể tăng cường hệ thống phòng thủ chống oxy hóa và ức chế các con đường viêm thần kinh [10]. Những nghiên cứu này cho thấy rằng các thành phần có trong M.alba là ứng cử viên tiềm năng để điều trị các bệnh khác nhau.

Viêm, một phản ứng tự vệ phức tạp đối với các kích thích có hại, đóng một vai trò quan trọng trong việc bảo vệ miễn dịch thông qua việc kích hoạt một số tế bào miễn dịch, bao gồm đại thực bào, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu, tế bào mast và các loại tế bào khác [11]. Đại thực bào là những tế bào miễn dịch phong phú và phân bố rộng rãi nhất trong cơ thể, và microglia là đại thực bào thường trú trong hệ thần kinh trung ương (CNS) [12]. Các đại thực bào và các tế bào vi mô là những nhân tố chính trong phản ứng viêm. Chúng có thể được kích hoạt để đáp ứng với các kích thích như lipopolysaccharide (LPS), cytokine và chemokine, và gây ra các tình trạng viêm [13]. Trong điều kiện viêm, các đại thực bào và tế bào vi mô được kích hoạt quá mức gây ra sự điều hòa bất thường của chất trung gian gây viêm (nitric oxide (NO), prostaglandin E2 (PGE,), nitric oxide synthase (iNOS) và cyclooxygenase (COX)) -2 ) và các cytokine tiền viêm (interleukin (IL) -6 và yếu tố hoại tử khối u (TNF) -a), thông qua việc kích hoạt con đường tín hiệu của yếu tố nhân kappa B (NF-B) [14,15]. Mức độ gia tăng của các chất trung gian gây viêm càng làm trầm trọng thêm sự tiến triển của các bệnh viêm nhiễm, làm tăng thêm sự hoạt hóa của các yếu tố gây viêm, do đó dẫn đến một vòng luẩn quẩn [16]. Vì vậy, việc điều hòa các chất trung gian gây viêm là rất cần thiết cho việc điều trị và phòng ngừa các bệnh viêm nhiễm.

Heme oxygenase (HO) -1 là một enzym giới hạn tốc độ xúc tác sự phân hủy heme thành biliverdin, ion sắt (Fe2 cộng) và carbon monoxide (CO) [17]. Cảm ứng HO -1 được điều chỉnh bởi sự kích hoạt của yếu tố hạt nhân erythroid 2- liên quan đến yếu tố 2 (Nrf2). HO -1 có thể được tạo ra để phản ứng với stress oxy hóa và tình trạng viêm để bảo vệ các mô và duy trì cân bằng nội môi trong cơ thể [18]. Do đó, nhắm mục tiêu cảm ứng HO -1 là một trong những chiến lược tiềm năng để điều trị các bệnh viêm nhiễm.

Trong nỗ lực không ngừng của chúng tôi nhằm khám phá (các) ứng cử viên từ các sản phẩm tự nhiên để điều trị các bệnh viêm nhiễm, chúng tôi xin giới thiệu ở đâytác dụng chống viêmgồm 11l hợp chất được phân lập từ M.alba trong các tế bào BV2 và RAW264.7 do LPS gây ra.

4flavonoids anti-inflammatory

2. Kết quả

2.1 Ảnh hưởng của 11 hợp chất được phân lập từ M.alba đến khả năng tồn tại của tế bào BV2 và RAW264.7

Trong nghiên cứu trước, vỏ rễ của M.alba được chiết xuất trong dung dịch metanol, và các chất chiết thu được được phân chia liên tiếp thành EtOAc, n-BuOH và H2O2. Sắc ký cột SiO2, ODS và Sephadex LH -20 lặp lại của phần EtOAc thu được 11 hợp chất, chẳng hạn như kuwanon G (1), Kuwana E (2), Kuwana T (3), sanggenon A (4), sanggenon M (5), sanggenol A (6), mulberofuran B (7), mulberofuran G (8), moracin M (9), moracin O (10) và norartocarpanone (11) [6,19,20]. Cấu trúc hóa học của 11 hợp chất phân lập từ M.alba được minh họa trong Hình 1. Để xác định tác dụng gây độc tế bào của các hợp chất này, hãy 3- (4, 5- dimethylthiazol -2- yl) {{ 26}}. 5- Xét nghiệm diphenyltetrazolium bromide (MTT) được thực hiện, các tế bào BV2 và RAW264.7 được xử lý với nồng độ chỉ định của các hợp chất trong 48 giờ, ở nồng độ lên đến 80 μM. (Hình 2). Hợp chất 2, 3 và 4 có tác dụng độc ở 80 μM, hợp chất 5 có tác dụng độc ở 40 μM. Dựa trên kết quả đánh giá độc tính, một phạm vi nồng độ không độc hại đã được chọn cho các nghiên cứu tiếp theo về tác dụng chống viêm (hợp chất 2, 3,4 ở 40 uM, hợp chất 5 ở 200 μM và các hợp chất khác ở 80 μM） .

Chemical structures of compounds 1–11 isolated from M. alba

Cytotoxic effects of compounds 1–11 isolated from M. alba on BV2 (A) and RAW264.7 (B) cells. The cells were incubated for 48 h with various concentrations of the compounds, and their viability was determined using MTT (3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay. Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01 ,*** p < 0.001 compared with the control group. Figure 2. Cytotoxic effects of compounds 1–11 isolated from M. alba on BV2 (A) and RAW

2.2 Ảnh hưởng của các hợp chất l1 được phân lập từ M. alba đối với sự biểu hiện của các yếu tố gây viêm và protein iNOS trong tế bào BV2 và RAW264.7

NO là một gốc tự do trong tim mạch, thần kinh vàhệ thống miễn dịch. Nó duy trì cân bằng nội môi trong tế bào, vận chuyển chất dẫn truyền thần kinh và điều chỉnh hoạt động chống viêm và thải độc tế bào. Tuy nhiên, khi một lượng lớn NO được tạo ra, nó có những tác động bất lợi đối với cơ thể, bao gồm giãn mạch, gây độc tế bào và tổn thương mô [21,22]. Sau đó, chúng tôi kiểm tra tác động của các hợp chất này đối với việc sản xuất nitrit trong các tế bào BV2 và RAW264.7 do LPS gây ra. Tế bào được xử lý với các nồng độ hợp chất khác nhau trong 2 giờ trước khi được kích thích với LPS （1 ug / mL） trong 24 giờ. Trong số các hợp chất, chỉ có Hợp chất 3 (kuwanonT) và 4 (sanggenon A) ức chế đáng kể việc sản xuất nitrit ở cả dòng tế bào BV2 và RAW264.7 (Hình 3). Ngoài ra, chúng tôi tiến hành một thí nghiệm bổ sung để so sánh tác dụng ức chế sản xuất nitrit giữa nhóm được xử lý bằng LPS sau khi tiền xử lý bằng hợp chất và nhóm được xử lý bằng hợp chất sau khi tiền xử lý bằng LPS. Kết quả là không có sự khác biệt về tác dụng ức chế sản xuất nitrit giữa hai nhóm thí nghiệm (Hình bổ sung S1). Do đó, trong nghiên cứu này, các thí nghiệm sau được thực hiện bằng cách sử dụng tiền xử lý với các hợp chất trong vòng 2 ~ 3 giờ trước khi xử lý LPS.

. Inhibitory effects of compounds 1–11 on nitrite production in BV2 (A) and RAW264.7 (B) cells. The cells were pretreated for 2 h with concentrations of compounds and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 µg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group

Việc sản xuất NO được tăng lên bởi các protein gây viêm cảm ứng tổng hợp oxit nitric (iNOS). Tuy nhiên, biểu hiện quá mức của iNOS làm suy yếu nghiêm trọng sinh lý bệnh của bệnh [23]. Các hợp chất 3 và 4 đã hạn chế sự biểu hiện của iNOS theo cách phụ thuộc vào nồng độ (Hình 4). Chúng tôi đã kiểm tra tác động của các hợp chất 3 và 4 đối với sự biểu hiện của các yếu tố gây viêm do LPS gây ra trong các tế bào BV2 và RAW264.7. Các tế bào được xử lý với các nồng độ khác nhau của các hợp chất 3 và 4 trong 2 giờ trước khi được kích thích bằng LPS (1 ug / mL) trong 24 giờ. Cả hai hợp chất đều ức chế đáng kể sự biểu hiện của PGE2, TNF và IL -6 do LPS gây ra trong tế bào BV2 và RAW264.7 (Hình 5). Kết quả cho thấy việc điều trị trước với hợp chất 3 và 4 đã ngăn chặn tình trạng viêm do LPS gây ra ở các tế bào BV2 và RAW264,7.

Protein expression levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with LPS (1 μg/mL). Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensities are normalized to that of β-actin (B, D). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 5. Inhibitory effects of compounds 3 and 4 on the level of PGE2 (A and D), IL-6 (B and E), and TNF-α (C and F) in BV2 and RAW264.7 cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 μg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 4. Protein expression levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with LPS (1 µg/mL). Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensities are normalized to that of β-actin (B,D). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group

Inhibitory effects of compounds 3 and 4 on the level of PGE2 (A and D), IL-6 (B and E), and TNF-α (C and F) in BV2 and RAW264.7 cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 μg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 4. Protein expression levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with LPS (1 µg/mL). Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensities are normalized to that of β-actin (B,D). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Molecules 2021, 26, x FOR PEER REVIEW 5 of 16 Figure 3. Inhibitory effects of compounds 1–11 on nitrite production in BV2 (A) and RAW264.7 (B) cells. The cells were pretreated for 2 h with concentrations of compounds and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 μg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 4. Protein expression levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with LPS (1 μg/mL). Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensities are normalized to that of β-actin (B, D). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 5. Inhibitory effects of compounds 3 and 4 on the level of PGE2 (A and D), IL-6 (B and E), and TNF-α (C and F) in BV2 and RAW264.7 cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 μg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 5. Inhibitory effects of compounds 3 and 4 on the level of PGE2 (A,D), IL-6 (B,E), and TNF-α (C,F) in BV2 and RAW264.7 cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 µg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group

effects of cistanche improve immunity (33)

2.3 Ảnh hưởng của Hợp chất 3 và 4 đến Chuyển vị NF-xB trong tế bào BV2 và RAW264.7

NF-kB là một yếu tố phiên mã quy định sự biểu hiện iNOS [24]. NF-kB bình thường vẫn ở dạng không hoạt động bằng cách tạo phức hợp với các protein điều hòa như IKB. Tuy nhiên, khi nó được kích hoạt bởi LPS, IkBa bị phân hủy bởi quá trình phosphoryl hóa, và NF-kB (chẳng hạn như p65) được chuyển vị trí vào nhân [25], thúc đẩy gen trung gian gây viêm và gây ra sự biểu hiện của các yếu tố gây viêm [26]. Để kiểm tra thêm tác dụng ức chế của hợp chất 3 và 4 đối với việc sản xuất các yếu tố gây viêm trong các tế bào BV2 và RAW264.7 được kích hoạt LPS, chúng tôi đã nghiên cứu sự chuyển vị hạt nhân biểu hiện của p65 trong các tế bào được điều trị bằng hợp chất 3 và 4, LPS, hoặc cả hai đều sử dụng kháng thể đánh dấu FITC chống p65. DAPI được sử dụng để nhuộm hạt nhân. Trong nhóm đối chứng, biểu hiện p65 được phát hiện trong dịch bào. Tuy nhiên, trong các tế bào do LPS gây ra, sự tích tụ p65 được phát hiện trong nhân, như được chỉ ra trong hình ảnh hợp nhất của nhuộm DAPI và p65. Hơn nữa, so với các tế bào cảm ứng LPS, các hợp chất 3 và 4 làm giảm rõ rệt sự gia tăng hoạt động liên kết DNA qua trung gian LPS (p65) NF-KB (p65) (Hình 6A, B) và chuyển vị hạt nhân (Hình 6C-F). Những phát hiện này chỉ ra rằng hợp chất 3 và 4 là chất điều hòa âm tính của sự chuyển vị hạt nhân NF-kB do LPS kích thích.

Effects of compounds 3 and 4 on and NF-κB DNA-binding activity (A,B) and NF-κB (p65) localization (C–F) in BV2 and RAW264.7 cells. The cells were pretreated with compounds 3 or 4 for 2 h and stimulated with liposaccharide (LPS; 1 µg/mL) for 1 h. Experiments were performed using a commercially available enzyme-linked immunosorbent assay kit, as described in the Materials and Methods section. ** p and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group

2.4 Ảnh hưởng của Hợp chất 3 và 4 trên Lộ trình Nrf2 / HO -1 trong BV2 và RAW264.7

Tế bào Heme oxygenase -1 (HO -1) là mục tiêu của yếu tố hạt nhân E 2- yếu tố liên quan đến yếu tố 2 (Nrf2), con đường Nrf2 / HO -1 là một hệ thống tín hiệu chống oxy hóa mạnh mẽ để thúc đẩy sắt tự do trong carbon monoxide (CO), biliverdin và heme [27]. Carbon monoxide, một chất chuyển hóa dạng khí của quá trình dị hóa heme, thể hiện tác dụng điều hòa giãn mạch và các phản ứng tiền viêm [28]. Bên cạnh đó, HO -1 cũng được biết đến là đóng một vai trò quan trọng trong việc bảo vệ tế bào khỏi tình trạng viêm và stress oxy hóa và điều chỉnh sản xuất nitrit trong các đại thực bào được hoạt hóa [29]. Chúng tôi đã thực hiện Western blotting để điều tra xem các hợp chất 3 và 4 có làm tăng mức độ biểu hiện của HO -1, trong đó HO -1 chất cảm ứng protoporphyrin (CoPP) nổi tiếng được sử dụng làm chất kiểm soát tích cực làm tăng HO {{ 16}} biểu thức protein. [30]. Kết quả cho thấy hợp chất 3 và 4 cũng điều chỉnh sự biểu hiện của HO -1 (Hình 7). Chúng tôi tiếp tục khám phá xem các hợp chất 3 và 4 có điều chỉnh sự hoạt hóa của Nrf2 hay không. Sự chuyển vị của Nrf2 vào hạt nhân được tăng lên theo cách phụ thuộc vào thời gian, cho thấy rằng các hợp chất 3 và 4 đã điều chỉnh đáng kể con đường Nrf2 / HO -1 trong các tế bào BV2 và RAW264.7 (Hình 8).

ffects of compounds 3 and 4 on heme oxygenase (HO)-1 expression in BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were treated with compounds 3 or 4 or CoPP (10 μM) for 12 h. Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensity was normalized to each total form expression (B and D). * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the control group. Figure 7. Effects of compounds 3 and 4 on heme oxygenase (HO)-1 expression in BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were treated with compounds 3 or 4 or CoPP (10 µM) for 12 h. Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensity was normalized to each total form expression (B,D). * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the control group.

Effects of compounds 3 and 4 on Nrf2 activation in BV2 (A,C) and RAW264.7 (B,D) cells. The cells were treated with compounds 3 or 4 for 0.5, 1, and 1.5 h. Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensity was normalized to each β-actin or PCNA. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, # p < 0.05, ## p < 0.01, and ### p < 0.001, compared with the control group

Effects of compounds 3 and 4 on Nrf2 activation in BV2 (A,C) and RAW264.7 (B,D) cells. The cells were treated with compounds 3 or 4 for 0.5, 1, and 1.5 h. Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensity was normalized to each β-actin or PCNA. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, # p < 0.05, ## p < 0.01, and ### p < 0.001, compared with the control group

Để kiểm tra thêm liệu tác dụng chống viêm thần kinh và chống viêm của hợp chất 3 và 4 có tương quan với biểu hiện HO -1 trong tế bào BV2 và RAW264.7 hay không, chúng tôi đã thực hiện một bộ thí nghiệm với thiếc protoporphyrin-IX (SNPP) là chất ức chế hoạt động chọn lọc của HO -1. Sử dụng SNPP có thể điều chỉnh giảm sự biểu hiện của HO -1, chúng tôi đã cố gắng xác định xem HO -1 có làm trung gian cho tác dụng ức chế của các hợp chất trên đối với phản ứng viêm do LPS 【31】 gây ra hay không. Sau khi xử lý các tế bào với 20 μM hợp chất 3 và 4 trong 2 giờ có hoặc không có SNPP 50 uM, chúng được xử lý bằng LPS trong 24 giờ. Mặc dù hợp chất 3 và 4 làm giảm sản xuất nitrit trong tế bào BV2 và RAW264.7 do LPS gây ra, tác dụng chống viêm của chúng đã bị đảo ngược khi điều trị SNPP (Hình 9). Chỉ riêng SNPP không ảnh hưởng đến sản xuất oxit nitric (NO) sau khi kích thích LPS, cho thấy rằng tác dụng chống viêm của các hợp chất 3 và 4 được điều chỉnh bởi sự biểu hiện HO -1.

image

Inhibitory effects of compounds 3 and 4 on nitrite production through the regulation of HO-1 activity in BV2 (A,C,E) and RAW264.7 (B,D,F) cells. The cells were treated with 50 µM of tin protoporphyrin-IX (SnPP) or compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 µg/mL). Data are presented as mean ± standard deviation of three independent experiments. ** p < 0.01 and *** p < 0.001

3. Thảo luận

Nghiên cứu hiện tại đã chứng minh rằng Kuwana T và sanggenon A có tác dụng ức chế tình trạng viêm do LPS gây ra ở các tế bào BV2 và RAW264.7. Các hợp chất này ức chế sản xuất NO, PGE2 và các cytokine gây viêm do LPS gây ra, bao gồm IL -6 và TNF-, cũng như sự biểu hiện của iNOS và COX -2 ở cả BV2 và RAW264.7cells. Những kết quả này chỉ ra rằng Kuwana T và sanggenon A phát huy tác dụng chống viêm bằng cách bất hoạt đường truyền tín hiệu NF-kB. Ngoài ra, các hợp chất này gây ra sự biểu hiện HO -1 thông qua sự kích hoạt Nrf2. hoạt động chống viêm.

Nitric oxide synthase (NOS) has three isoforms: neuronal NOS (nNOS; NOS1), iNOS (NOS2), and endothelial eNOS (NOS3)[32]. iNOS is an inducible form that is upregulated in response to various stimuli, including LPS, cytokines, chemokines, and stress, while nNOS and eNOS are constitutive forms that catalyze continuous NO secretion at basal concentrations J33]. Similar to iNOS, COX-2 is also an inducible form upregulated by various inflammatory stimuli, such as cytokines, growth factors, tumor promoters, and bacterial LPS[34]. Its other isoform, COX-1, is constitutively expressed in most tissues under normal physiological conditions [35].COX-2 exerts an enzymatic effect on the conversion of prostaglandin H2 (PGH2), which converts arachidonic acid to PGE, prostaglandin 12(PGI2), prostaglandin F2a (PGF>.), và thromboxan A2 (TXA,) [361. Trong điều kiện viêm, mức iNOS và COX -2 tăng lên, dẫn đến sản xuất quá mức NO và PGE2 tương ứng và dẫn đến đợt cấp của các rối loạn viêm [37]. Trong nghiên cứu này, lần đầu tiên chúng tôi đánh giá 11 hợp chất được phân lập từ M.alba để xác định liệu sản xuất NO có bị ức chế trong các tế bào BV2 và RAW264.7 được kích thích bằng LPS hay không. Kết quả của chúng tôi cho thấy kuwanon T và sanggenon A có tác dụng ức chế mạnh nhất ở cả tế bào BV2 và RAW264.7 (Hình 3). họa tiết. Tuy nhiên, vì mỗi tế bào có các đặc điểm khác nhau, các hoạt động khác nhau có thể xuất hiện ngay cả với cùng một cơ chế J38]. Do đó, như trong kết quả của bài báo này, đã xác nhận rằng moracin M không có hoạt tính chống viêm trong tế bào BV2 và RAW264.7 cho đến nồng độ điều trị. Do đó, kuwanon T và sanggenon A đã được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.

Cytokine có ảnh hưởng điều tiết phức tạp đối với các phản ứng viêm và miễn dịch [39]. Sự hoạt hóa của các đại thực bào và các tế bào vi mô giúp tăng cường bài tiết các cytokine tiền viêm J40, và sự tăng tiết này dẫn đến việc giải phóng thêm cytokine [41]. IL -6 là một trong những cytokine chính và là chất trung gian hòa tan chịu trách nhiệm về viêm, đáp ứng miễn dịch và tạo máu [42]. Tín hiệu IL -6 được điều chỉnh thông qua hai cơ chế khác nhau, bao gồm liên kết với thụ thể IL -6 liên kết màng (mblL6R) và nhận biết thụ thể IL -6 hòa tan (sIL6R) [43]. Cả hai cơ chế đều liên quan đến sự hoạt hóa glycoprotein (GP) 130, dẫn đến việc kích hoạt các phân tử tín hiệu xuôi dòng, bao gồm bộ chuyển tín hiệu Janus kinase (IAK) / và chất kích hoạt kinase phiên mã (STAT), phosphoinositide 3- kinase (PI3K ), và protein kinase hoạt hóa mitogen (MAPK) [44]. IL -6 được sử dụng để dự đoán và đánh giá mức độ viêm ở bệnh nhân ung thư, nhiễm trùng, bệnh tự miễn dịch, bệnh tuyến tụy và bệnh tim mạch.

TNF-, một cytokine chính khác, cũng đóng một vai trò quan trọng trong nhiều quá trình miễn dịch và viêm, chẳng hạn như tăng sinh tế bào miễn dịch, apoptosis, hoại tử và tồn tại. Các tác dụng sinh học của TNF- được điều chỉnh bằng cách gắn vào hai thụ thể khác nhau, thụ thể yếu tố hoại tử khối u (TNFR) 1 và TNFR2. TNFR1 là chất trung gian chính của hoạt động TNF- trong hầu hết các tế bào, vì TNFR2 có ái lực liên kết ít hơn với TNF-, dẫn đến TNF- phân ly dễ dàng hơn từ TNFR2 so với TNFR1. Sự bất thường trong tín hiệu TNF- và sản xuất quá mức TNF- dẫn đến sự phát triển của nhiều bệnh, bao gồm viêm khớp dạng thấp, bệnh vẩy nến, bệnh Crohn, xơ vữa động mạch, nhiễm trùng huyết, tiểu đường và béo phì [45,46. Vì vậy, điều quan trọng là phải ức chế sản xuất các cytokine tiền viêm để ngăn chặn và ngăn chặn các phản ứng viêm và sự phát triển của các bệnh viêm nhiễm. Trong nghiên cứu này, kuwanon T và sanggenon A đã ức chế sản xuất IL -6 và TNF- do LPS gây ra ở cả tế bào BV2 và RAW264.7.

NF-KB là yếu tố phiên mã phổ biến nhất [47] và tín hiệu NF-kB đóng một vai trò quan trọng trong việc biểu hiện các gen liên quan đến phản ứng viêm, bao gồm các gen mã hóa iNOS, COX -2 và các cytokine gây viêm [ 48]. Ở trạng thái bất hoạt, các tiểu đơn vị NF-kB tồn tại trong tế bào chất liên kết với protein ức chế của nó, chất ức chế kappa B (kB) -. Một số kích thích, bao gồm LPS và cytokine, gây ra sự phosphoryl hóa và thoái hóa IkB-, cho phép giải phóng và chuyển vị trí của các tiểu đơn vị NF-kB vào trong nhân. Các tiểu đơn vị được chuyển vị trí liên kết với các vị trí kB của các gen đích trong DNA, dẫn đến cảm ứng phiên mã các gen mã hóa chất trung gian tiền viêm [49]. Do đó, sự bất hoạt của con đường NF-kB có thể là mục tiêu điều trị cho các bệnh viêm nhiễm. Trong nghiên cứu này, tiền xử lý với kuwanon T và sanggenon A đã ức chế sự hoạt hóa của tín hiệu NF-kB do LPS gây ra bằng cách ức chế hoạt động liên kết DNA và sự chuyển vị nhân của các tiểu đơn vị NF-kB (Hình 6). Những kết quả này cho thấy rằng tác dụng chống viêm của kuwanon T và sanggenon A được thực hiện thông qua sự điều chỉnh của con đường tín hiệu NF-kB.

Trong điều kiện bình thường, Nrf2 liên kết với protein 1 liên kết với ECH giống Kelch (Keap1) trong tế bào chất. Tuy nhiên, nó phân ly khỏi Keapl, chuyển vị vào nhân và liên kết với các vị trí phần tử phản ứng chống oxy hóa (ARE) trên DNA, dẫn đến sự biểu hiện của các gen chống oxy hóa khác nhau, bao gồm cả những gen mã hóa HO -1, NAD (P) H : quinone oxidoreductase 1 (NQO1), peroxiredoxin (Prx), và thioredoxin (Trx) [50]. Đặc biệt, HO -1 được biết là có liên quan đến tác dụng chống viêm và hoạt tính của nó được thể hiện bằng mức CO, một trong ba sản phẩm phụ được tạo ra từ heme bởi hoạt động của enzym HO {{12 }} [51]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi phát hiện ra rằng biểu hiện HO -1 do kuwanon T và sanggenon A gây ra bằng cách kích hoạt Nrf2 (Hình 7 và 8). Ngoài ra, chúng tôi đã xác minh mối tương quan giữa tác dụng chống viêm của kuwanon T với biểu hiện sanggenon A và HO -1 bằng cách sử dụng SNPP, một chất ức chế chọn lọc hoạt động của HO -1. Tác dụng ức chế của kuwanon T và sanggenon A đối với sản xuất NO và TNF- và hoạt hóa NF-kB đã bị đảo ngược một phần khi đồng xử lý với SNPP (Hình 9). Những kết quả này cho thấy rằng tác dụng chống viêm của kuwanon T và sanggenon A được điều chỉnh bởi sự biểu hiện HO -1.

effects of cistanche improve immunity (11)

4. Vật liệu và Phương pháp

4.1. Vật liệu

Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) và huyết thanh bò thai đã được mua từ Gibco BRL Co. (Grand Island, NY, USA). Tất cả các hóa chất đều được lấy từ Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Các kháng thể chính chống iNOS, chống - - actin, anti-p65 và anti-HO -1 được mua từ Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA); và các kháng thể thứ cấp chống thỏ và chống chuột từ Millipore

(Billerica, MA, Hoa Kỳ). Bộ xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym (ELISA) cho PGE, IL -6 và TNF- đã được mua từ R & DSystems Inc. (Minneapolis, MN, Hoa Kỳ). Việc phân lập và xác định cấu trúc của 11 hợp chất từ ​​Morus alba đã được mô tả ở phần khác [19-21].

4.2. Thử nghiệm nuôi cấy tế bào và khả năng tồn tại

Tế bào BV2 và RAW264.7 được cấy với mật độ 5 × 105 tế bào / mL trong RPMI 1640 được bổ sung 1% kháng sinh (penicilin-streptomycin) và 10% FBS bất hoạt nhiệt. Các tế bào được nuôi cấy ở 37 độ trong môi trường 5% CO được làm ẩm, với 95% khí quyển, theo một phương pháp đã được mô tả trước đây [52].

4.3. Đo lường sản xuất KHÔNG

Việc sản xuất nitrit, một sản phẩm cuối cùng ổn định của quá trình oxy hóa NO, được đo như một chỉ số về sự sản sinh NO trong tế bào. Tóm lại, nồng độ nitrit trong môi trường điều hòa được xác định bằng phương pháp dựa trên phản ứng Griess [53]. Các chi tiết của thử nghiệm đã được mô tả trước đây [54].

4.4. PGE2 Ass4y /

Nồng độ PGEz trong mỗi mẫu được đo bằng kit ELISA có bán trên thị trường, theo phương pháp đã mô tả trước đây [55].

4.5.Đo lường mức IL -6 và TNF-a

Môi trường nuôi cấy được thu thập để xác định mức IL -6 và TNF- bằng cách sử dụng một bộ kit bán sẵn trên thị trường (BioLegend, San Diego, CA, USA). Thử nghiệm được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tóm lại, các tế bào BV2 và RAW264.7 được gieo vào 24- đĩa nuôi cấy giếng với mật độ 20 × 10 tế bào / giếng. Sau khi ủ, phần nổi phía trên được thu thập và sử dụng để đo nồng độ IL -6 và TNF- bằng bộ dụng cụ ELISA.

4.6. Phân tích Western Blot

Các tế bào BV2 và RAW264.7 được tạo viên được rửa bằng PBS và ly giải trong đệm RIPA. Lượng protein bằng nhau được định lượng bằng cách sử dụng chất cô đặc thuốc thử xét nghiệm protein thu được từ Phòng thí nghiệm Bio-Rad (# 5000006; Hercules, CA, Hoa Kỳ), trộn trong dung dịch đệm tải mẫu và được tách ra bằng SDS-PAGE. Các protein được tách ra sau đó được chuyển lên màng nitrocellulose. Liên kết không đặc hiệu với màng đã bị chặn lại khi ủ trong dung dịch sữa tách béo. Màng được ủ với các kháng thể chính (tất cả đều được sử dụng ở tỷ lệ 1: 1000) ở 4 độ qua đêm và sau đó phản ứng với kháng thể thứ cấp liên hợp với peroxidase của cây cải ngựa (tất cả đều được sử dụng ở tỷ lệ 1: 5000) (Millipore) [ 31].

4.7 Phân tích bản địa hóa và miễn dịch huỳnh quang.NF-xB

Để nghiên cứu sự định vị của các tế bào NF-kB, BV2 và RAW264.7 đã được nuôi cấy trên các lam trong buồng Lab-Tek II và được xử lý với các nồng độ hợp chất khác nhau trong 2 giờ trước khi kích thích LPS (0. 5 ug / mL) cho 1 h. Sau đó, các tế bào được cố định trong formalin và thấm bằng aceton lạnh và được thăm dò bằng kháng thể kháng p65 (1: 200), tiếp theo là ủ với kháng thể thứ cấp đánh dấu huỳnh quang isothiocyanate (1: 1000) (Alexa Fluor 488, Invitrogen). Để hình dung hạt nhân, các tế bào được xử lý bằng 1 ug / mL 4 '6- diamidino -2- phenylindole （DAPI trong 30 phút, rửa bằng PBS trong 5 phút và xử lý bằng 50 μL VectaShield (Phòng thí nghiệm Vector, Burlingame, CA, Hoa Kỳ). Các tế bào nhuộm màu được quan sát và thu nhận hình ảnh bằng kính hiển vi huỳnh quang Zeiss (Provis AX70; Olympus Optical Co., Tokyo, Nhật Bản). [31].

4.8. Phân tích thống kê

Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn của ba thí nghiệm độc lập. Phân tích phương sai một chiều, theo sau là kiểm tra so sánh nhiều lần của Tukey, được sử dụng để so sánh sự khác biệt giữa ba nhóm. Các phân tích thống kê được thực hiện bằng phần mềm GraphPad Prism (phiên bản 5.01, GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA),

5. Kết Luận

Kuwanon T và sanggenon A có tác dụng chống viêm ở các tế bào BV2 và RAW264,7 do LPS gây ra bằng cách ức chế sản xuất NO, PGE2, IL -6 và TNF- và sự biểu hiện của iNOS và COX {{8} }. Kết quả của chúng tôi đã chứng minh rằng những tác dụng ức chế này được trung gian thông qua việc bất hoạt con đường NF-KB bằng cách xử lý với kuwanon T và sanggenon A. Ngoài ra, những hợp chất này gây ra sự biểu hiện của HO -1 bằng cách kích hoạt sự chuyển vị của Nrf2 vào nhân . Các phát hiện của chúng tôi đã chứng minh rằng biểu hiện HO -1 do kuwanon T và sanggenon A gây ra có liên quan đến tác dụng ức chế chống lại chứng viêm do LPS gây ra. Tổng hợp lại, kết quả của chúng tôi cung cấp bằng chứng rằng Kuwana T và sanggenon A được phân lập từ M. Albu có thể là ứng cử viên cho việc phát triển các tác nhân điều trị và phòng ngừa các bệnh viêm thần kinh như bệnh Alzheimer và bệnh Parkinson.


Bạn cũng có thể thích