PHẦN 1 Echinacoside ức chế giải phóng Glutamate bằng cách ngăn chặn sự xâm nhập ca2 + phụ thuộc vào điện áp và protein Kinase C trong các đầu dây thần kinh não chuột

Cheng Wei Lu 1,2, Tzu Yu Lin 1,2, Shu Kuei Huang 1 và Su Jane Wang 3,*

1 Khoa Gây mê, Bệnh viện Tưởng niệm Viễn Đông, Quận Pan-Chiao, Thành phố Tân Đài Bắc 22060, Đài Loan; drluchengwei@gmail.com (C.W.L.); drlin1971@gmail.com (T.Y.L.);nskh9450n@yahoo.com.tw (S.K.H.)

2 Khoa Kỹ thuật Cơ khí, Đại học Yuan Ze, Đào Viên 32003, Đài Loan

3 Trường Y, Đại học Công giáo Fu Jen, Số 510, Zhongzheng Rd., Xinzhuang Dist., Tân Đài Bắc 24205, Đài Loan.

Trừu tượng:Hệ thống glutamatergic có thể tham gia vào tác dụng của các liệu pháp bảo vệ thần kinh. Echinacoside, một loại glycoside phenylethanoid được chiết xuất từ thảo dược Trung QuốcHerba Cistanche,có tác dụng bảo vệ thần kinh. Nghiên cứu này đã điều tra tác dụng của echinacoside đối với việc giải phóng glutamate gợi lên 4-aminopyridine trong các đầu dây thần kinh não não chuột (synaptosome). Echinacoside ức chế Ca²⁺-phụ thuộc, nhưng không Ca²⁺-độc lập, giải phóng glutamate 4-aminopyridine-evoked theo cách phụ thuộc vào nồng độ. Echinacoside cũng làm giảm sự gia tăng 4-aminopyridine-evoked ca tự do tế bào chất²⁺nồng độ nhưng không làm thay đổi tiềm năng màng synaptosomal. Tác dụng ức chế của echinacoside đối với giải phóng glutamate gợi lên 4-aminopyridine đã được ngăn chặn bởi cu-conotoxin MVIIC, một chất chẹn phổ rộng của các kênh Cav2.2 (loại N) và Cav2.1 (loại P / Q), nhưng không nhạy cảm với Ca nội bào²⁺chất ức chế giải phóng dantrolene và 7-chloro-5- (2-chlorophenyl) -1,5-dihydro-4,1-benzodiazepine-2 (3H) -one (CGP37157). Hơn nữa, echinacoside làm giảm quá trình phosphoryl hóa protein kinase C do 4-aminopyridine gây ra, và các chất ức chế protein kinase C đã bãi bỏ tác dụng của echinacoside đối với việc giải phóng glutamate. Theo những kết quả này, chúng tôi cho rằng tác dụng ức chế của echinacoside đối với việc giải phóng glutamate gợi lên có liên quan đến việc giảm Ca phụ thuộc vào điện áp²⁺nhập cảnh và ức chế tiếp theo của hoạt động protein kinase C.

Từ khoá:echinacoside; giải phóng glutamate; đầu cuối dây thần kinh não tủy; Ca phụ thuộc điện áp²+ kênh; protein kinase C của bệnh Parkinson, bệnh Alzheimer và tắc động mạch não giữa[9-12]. Tuy nhiên, cơ chế mà qua đó echinacoside gây ra bảo vệ thần kinh không được hiểu đầy đủ.

Để biết thêm thông tin, vui lòng liên hệ:Joanna.jia@wecistanche.com

Echinacoside ·trong cistanche có nhiều chức năng

1. Giới thiệu

Echinacoside ·là một glycoside phenylethanoid chính có trongHerba Cistanche, một loại thuốc y học cổ truyền nổi tiếng của Trung Quốc được sử dụng để điều trị chứng hay quên, bất lực và táo bón mãn tính [1].Echinacoside ·sở hữu các hoạt tính sinh học khác nhau như chống oxy hóa, chống viêm, chống ung thư, bảo vệ gan và điều chế miễn dịch [2–4]. Đáng chú ý,echinacosidecó tác dụng bảo vệ thần kinh; ví dụ, nó có thể bảo vệ chống lại stress oxy hóa- hoặc độc tính thần kinh gây ra độc tính thần kinh trong tế bào thần kinh vỏ chuột nguyên phát, tế bào u nguyên bào thần kinh SH-SY5Y của con người và tế bào pheochromocytoma (PC12) [5–8]. Hơn nữaechinacosidelàm suy giảm tổn thương não và cải thiện chức năng nhận thức ở các mô hình động vật của bệnh Parkinson, bệnh Alzheimer và tắc động mạch não giữa [9–12]. Tuy nhiên, cơ chế thông qua đóechinacosidegây ra bảo vệ thần kinh không được hiểu đầy đủ.

Bảo vệ thần kinh là một quá trình phức tạp để bảo tồn cấu trúc và chức năng tế bào thần kinh khi có những lời lăng mạ độc hại. Glutamate excitotoxicity giảm được coi là một cơ chế tiềm năng liên quan đến bảo vệ thần kinh não. Glutamate, một chất dẫn truyền thần kinh axit amin kích thích, có vai trò quan trọng trong một số chức năng của não [13]. Tuy nhiên, sự bất hoạt quá mức của các thụ thể glutamate dưới nồng độ glutamate cao gây ra tình trạng quá tải Ca2 + nội bào, rối loạn chức năng ty thể, sản xuất gốc tự do và tử vong do tế bào thần kinh [14,15]. Quá trình bệnh lý này có liên quan đến nhiều rối loạn não bao gồm thiếu máu cục bộ não, chấn thương sọ não, động kinh và bệnh thoái hóa thần kinh [16,17]. Do đó, các chất ức chế ngăn chặn lây truyền glutamatergic sinh lý bệnh được coi là thuốc bảo vệ thần kinh tiềm năng. Ví dụ đáng chú ý trong số này là các chất đối kháng thụ thể glutamate [18,19]; tuy nhiên, các thử nghiệm lâm sàng đối với các loại thuốc này đã thất bại vì ít hiệu quả hơn và tác dụng phụ không mong muốn, hoặc thậm chí gây độc tế bào [20,21]. Ngoài việc phong tỏa thụ thể glutamate trực tiếp, ức chế giải phóng glutamate có thể là một chiến lược hiệu quả để bảo vệ thần kinh. Một số chất bảo vệ thần kinh (ví dụ: memantine và riluzole) có thể làm giảm sự giải phóng glutamate trong các mô não chuột [22–24].

Xem xét vai trò của glutamate trong độc tính excitotoxicity và hồ sơ bảo vệ thần kinh củaechinacoside, nghiên cứu hiện tại đã sử dụng các đầu cuối thần kinh bị cô lập (synaptosome) được tinh chế từ vỏ não chuột để điều tra ảnh hưởng củaechinacosidevề giải phóng glutamate và khám phá thêm các cơ chế tiềm năng. Việc chuẩn bị đầu cuối thần kinh bị cô lập là một mô hình được thiết lập tốt để nghiên cứu sự điều hòa tiền ung thư giải phóng chất dẫn truyền thần kinh bằng thuốc trong trường hợp không có bất kỳ tác dụng sau synap nào [25]. Bằng cách sử dụng mô hình này, chúng tôi đã đánh giá hiệu quả củaechinacosidevề giải phóng glutamate, tiềm năng màng, dòng Ca2+ tiền synap và hoạt tính protein kinase C. Theo đánh giá của chúng tôi về các tài liệu, đây là báo cáo đầu tiên ghi lại cơ chế thông qua đóechinacosideức chế giải phóng glutamate nội sinh ở cấp độ tiền ung thư.

Echinacoside có thể chống oxy hóa

2. Kết quả

2.1.Echinacoside ·Ức chế giải phóng Glutamate 4-Aminopyridine-Evoked từ các đầu cuối thần kinh não chuột bằng cách giảm exocytosis mụn nước

Hình 1 minh họa tác dụng phụ thuộc vào nồng độ củaechinacosidetrên 4-aminopyridine-evoked glutamate giải phóng từ các synaptosome chuột tinh khiết não. Trong các synaptosome được ủ với 1 mM CaCl2, 1 mM 4-aminopyridine gợi lên sự giải phóng glutamate là 7,4 ̆ 0,1 nmol / mg / 5 phút, giảm 1, 5, 10, 30 và 50 μMechinacosideđến 6,5 ̆ 0,2, 5,8 ̆ 0,3, 4,8 ̆ 0,2, 4,1 ̆ 0,1 hoặc 2,3 ̆ 0,4 nmol / mg / 5 phút, tương ứng (F (5,24) = 67,1, p = 0,000). Giá trị IC50 choechinacoside- ức chế qua trung gian giải phóng glutamate gợi lên 4-aminopyridine, có nguồn gốc từ đường cong đáp ứng liều, là 24 μM. Hơn nữa, sự giải phóng glutamate được gợi lên bởi 1 mM 4-aminopyridine trong dung dịch không chứa Ca2 + ngoại bào chứa 300 μM ethylene glycol bis (β-aminoethyl ether) -N, N, N1, N1 -tetraacetic acid (EGTA) là 2,1 ̆ 0,2 nmol / mg / 5 phút (F (2,12) = 310,65, p = 0,000) và thành phần độc lập Ca2 + này của bản phát hành glutamate 4-aminopyridine-evoked không bị ảnh hưởng bởi 20 μMechinacoside(1,8 ̆ 0,2 nmol/mg/5 phút; p = 0,58; Hình 1). Trong các synaptosome được điều trị bằng 0,1 μM bafifilomycin A1, một chất ức chế vận chuyển mụn nước [26], giải phóng glutamate gợi lên 4-aminopyridine đã giảm đáng kể (2,2 ̆ 0,2 nmol / mg / 5 phút; F (2,12) = 249,518, p = 0,000). Với sự hiện diện của bafifilomycin A1, 20 μM echinacoside không thể ức chế đáng kể sự giải phóng glutamate (2,1 ̆ 0,2 nmol / mg / 5 phút; p = 0,94; Hình 1). Ngược lại, 10 μM DL-threo-beta-benzyl-oxyaspartate (DL-TBOA, một chất ức chế tái hấp thu glutamate) [27], tăng giải phóng glutamate gợi lên 4-aminopyridine-evoked glutamate lên 11,8 ̆ 0,4 nmol / mg / 5 phút (t (8) = '11,31, p = 0,000). Ngay cả khi có DL-TBOA, 20 μMechinacosideức chế giải phóng glutamate 4-aminopyridine-evoked signifificantly (7,7 ̆ 0,2 nmol/mg/5 phút; F(2,12) = 87,23, p = 0,000; Hình 1)

2.2. Echinacoside ·Giảm Cytosolic Ca²+Nồng độ nhưng không làm thay đổi synaptosomal

Mem brane tiềm năng

Khử cực synaptosome gây ra bởi 1 mM 4-aminopyridine làm tăng Ca²+ nồng độ(trang= 0,000; Bảng 1). Ứng dụng của 20 |vMechinacosidekhông ảnh hưởng đáng kể đến baral Ca²+ nồng độ (t(8) = 0,06,p= 0,95) nhưng làm giảm đáng kể sự gia tăng 4-aminopyridine do iia Ca²+ nồng độ (t(10)= 6,16,p =0.000). Ngoài ra, 1 mM 4-aminopyridine tăng trong 3 ', 3 ', 3'-dipropylthiadicarbocyanine iodide [DiSC₃(5)] huỳnh quang (p= 0,000). Sự bổ sung o⁽20 fdM echinacoside không làm thay đổi tiềm năng của màng nghỉ ngơi (t (8) = 0,976,p= 0,36) hoặc thay đổi đáng kể sự gia tăng diSC qua trung gian 4-aminopyridine₃(5) huỳnh quang (t(8) = —0,014,p= 0,99; Bảng 1).

Cistanche ·echinacosidecó thể điều trị bệnh thận

2.3.Giảm- CO2+Dòng chảy qua các kênh Cav2.2 (N-Type) và Cav2.1 (P / Q-Type) có thể liên quan đến việc ức chế giải phóng Glutamate 4-Aminopyridine-Evoked bởiEchinacoside ·

Hình2cho thấy 2 cu-conotoxin MVIIC, một N-và Ca loại P / Q²+ trình chặn kênh,

giảm giải phóng glutamate gợi lên 4-aminopyridine từ 7,4 土 0,2 xuống 2,0 土 0,1 nmol / mg / 5 phút (t(9) = 25,35,p= 0,000). Với sự hiện diện của cu-conotoxin MVIIC, tác dụng của 20 pM echinacoside đối với việc giải phóng glutamate 4-aminopyridine-evoked là không đáng kể (1,8 土 0,2 nmol / mg / 5 phút;t(8) = 1,06,p= 0,32). Dantrolene (10 ^M), một chất ức chế Ca nội bào²+ giải phóng Crom mạng lưới nội chất [28], giảm giải phóng glutamate gợi lên 4-aminopyridine(5,6 土 0,3 nmol/mg/5 phút; F (2,14) = 104.95,p= 0,000). Tuy nhiên, với sự hiện diện của dantrolene, 20 pJMechinacosidevẫn có thể ức chế giải phóng glutamate đáng kể (3,3 土 0,2 nmol / mg / 5 phút;p= 0,000). Kết quả tương tự đã được quan sát thấy bằng cách sử dụng 100 pM 7-chloro-5- (2-chloropheny) -1,5-dihydro-4,1-benzothiazepin-2 (3H) -one (CGP37157), một màng-permeaWe blocker của ty thể Na⁺/Ca²+ trao đổi. Trong năm chế phẩm synaptosomal được kiểm tra, 20 pMechinacosidekết hợp với 100 pM CGP37157 giảm giải phóng glutamate 4-aminopyridine-evoked bởi 48,3% 土 5,2% (F (2,13) = 136,79,p= 7.000), tương tự như sự ức chế chỉ bằng echinacoside (46,2% 土 2,3%;p= 0,89;

2.4.Echinacoside ·Inhibcts 4-Aminopyridine-Evoked (Giải phóng Glutamate bằng cách báo hiệu qua Protein Kinase C

Như được minh họa trong Hình 3, 10 ° jlM 2- [1- (3-dimethylaminopropyl) indol-3-yl] -3- (indol-3-yl) maleimide (GF109203X), một chất ức chế gen er al protein kinase C [29], giảm giải phóng glutamate gợi lên 4-aminopyridine (F (2,13) = 19,46, p = 0,000). Trong các synaptosome được điều trị bằng GF109203X, 20 pM echinacoside làm giảm giải phóng glutamate 4-aminopyridine-evoked chỉ 5,5% 土 1,8% (p = 0,89), ít hơn so với chỉ bằng echinacoside (42,4% 土 2,3%; p = f.000). Kết quả tương tự đã thu được với 5,6,7,13-tetrahydro-13-methyl-5-oxo-12H-indolo [2,3-a] pyrrolo [3,4-c] carbazole-12-propanenitrile (Go6976), một chọn lọc cho các đồng dạng protein kinase C phụ thuộc Ca2 + (a, |3I, |3II, y) [29]. Với sự hiện diện của 3 pM Go6976, 20 pMechinacosidegiảm giải phóng glutamate 11,9% 土 2,9% (p = 0,59), cho thấy sự giảm đáng kể so với chỉ riêng echinacoside (42,4% 土 2,3%; p = 0,000; Hình 3). Ngược lại, rottlerin 3 pM, một chất ức chế protein kinase C6 độc lập ca2 +, [30], không làm thay đổi đáng kể giải phóng glutamate gợi lên 4-aminopyridine (1 mM) (p = 0,45). Tuy nhiên, với sự hiện diện của rottlerin, 20 pM echinacoside có hiệu quảt gây ra sự ức chế trung bình 37,1% 土 5,6% của bản phát hành (F (2,13) = 19,72, p = 0,000), tương tự như chỉ bằng echinacoside (p = 0,41; Hình 3). Ngoài ra, chất ức chế protein kinase hoạt hóa mitogen 2- (2-amino-3-methoxyphenyl) -4H-1-benzopyran-4-one) (PD98059) (50 pM) và protein kinase Một chất ức chế N- [2 - (p-bromocinnamylamino) ethyl] -5-isoquinolinesulfonamide (H89) (100 pM) làm giảm giải phóng glutamate gợi lên 4-aminopyridine (p = 0,000). Ngay cả khi có PD98059 hoặc H89, 20 pMechinacosidegiảm hiệu quả việc phát hành (F (2,13) = 52, 3, p = 0, 000; Hình 3).

Hình 4 cho thấy tha11 mM 4-aminopyridine làm tăng quá trình phosphoryl hóa protein kinase C trong synaptosome (t(4) = —6.871,p= 0,002). Khi các synaptosome được điều trị trước bằng 20 pM echinacoside trong 10 phút trước khi bổ sung 4-aminopyridine, quá trình phosphoryl hóa protein kinase C gây ra 4-aminopyridine đã giảm đáng kể (F (2_một6) = 29,202,p= 0,00 1).

Echinacoside ·trongcistanchecó thể thúc đẩyhệ thống miễn dịch

2.5.Echinacoside ·-Ức chế qua trung gian giải phóng Glutamate không liên quan đến axit Gamma-Aminobutyric loại A (GAB³Một_Một) Thụ thể

Trong Hình 5, tác dụng của echinacoside đối với việc giải phóng glutamate gợi lên 4-aminopyridine khi không có hoặc có SR95531 (một chất đối kháng của GABA_Mộtthụ thể) đã được so sánh. Ngoài ra, 100 pM SR95531 không làm thay đổi đáng kể giải phóng glutamate gợi lên 4-aminopyridine (1 mM). Trong trang

Các synaptosome được điều trị bằng SR95531, sử dụng 20 pM echinacoside dẫn đến ức chế 43% giải phóng glutamate gợi lên 4-aminopyridine (F (2,12) = 42,63,p= 0,000), không khác biệt đáng kể so với sự ức chế được tạo ra bởi riêng echinacoside (40%;p= 0,000). Một kết quả tương tự đã thu được với một chất đối kháng thụ thể GABAa khác, bicuculline (50 pM). Sự phát hành được đo bằng sự hiện diện của bicuculline và