Phần thứ Hai echinacoside điều trị tổn thương oxy hóa DNA và ức chế quá trình chết của tế bào như thế nào?

BẤM VÀO ĐÂY ĐỂ TỚI PHẦN MỘT

Vui lòng liên lạc để biết thêm thông tin:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche Desticola có nhiều tác dụng, click vào đây để biết thêm

3. Thực nghiệm Tiết diện

3.1. Tế bào và Hóa chất

Một dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến SW480 ở người được mua từ ATCC. Các tế bào được nuôi cấy trong môi trường Eagle's đã sửa đổi (DMEM) của Dulbecco (Gibco, Grand Island, NY, Hoa Kỳ) chứa 10% huyết thanh bò thai (FBS) (Gibco) và 1% (v/v) penicillin-streptomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ở 37 độ trong môi trường ẩm ướt chứa 5% CO2.Echinacosideđược mua từ Yuanye Biotechnology, Thượng Hải, Trung Quốc (HPLC> 98%). Dung dịch gốc được chuẩn bị trong DMSO (Sigma-Aldrich), và dung dịch làm việc được chuẩn bị trong môi trường nuôi cấy tế bào.

3.2. Thử nghiệm khả năng hoạt động của MTT

Tế bào được gieo vào 96- đĩa giếng ở 1 × 104 tế bào mỗi giếng trong 12 giờ, và sau đó được ủ với sự có mặt củaEchinacosidehoặc 0. 01 phần trăm DMSO trong 24 hoặc 48 giờ. Cuối cùng, 20 μL dung dịch MTT (3- (4, 5- dimethylthiazol -2- yl) -2, 5- diphenyl tetrazolium bromide) (5 mg / mL trong PBS, pH 7,2) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) được thêm vào mỗi giếng, và các đĩa được ủ trong 4 giờ. Sau khi loại bỏ môi trường chứa MTT, 150 μL DMSO được thêm vào mỗi giếng. Các đĩa này được ủ trên máy lắc đĩa trong 10 phút và độ hấp thụ ở bước sóng 570 nm được đo bằng đầu đọc vi tấm BioRad 680 (Hercules, CA, Hoa Kỳ). Mỗi thí nghiệm được tiến hành hai lần trong ba lần. Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm GraphPad Prism (San Diego, CA, USA).

3.3. Thử nghiệm hình thành khuẩn lạc

Tế bào được gieo hạt trong 6- đĩa giếng với mật độ 1 × 104 mỗi giếng trong 12 giờ và sau đó được ủ với sự có mặt củaEchinacosidehoặc {{0}}. 01 phần trăm DMSO trong 10 ngày. Các đĩa được rửa bằng PBS, và các tế bào được cố định bằng metanol lạnh đá và nhuộm bằng dung dịch tím pha lê (Sigma-Aldrich) (0,5% trong 25% metanol). Hình ảnh được chụp sau khi đĩa được làm khô qua đêm. Các tinh thể màu tím được hòa tan trong 70% ethanol và độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm được đo bằng đầu đọc vi tấm BioRad. Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm GraphPad Prism.

3.4. Phân tích phân mảnh DNA với DAPI Huỳnh quang Nhuộm màu

Sau khi xử lý thuốc, các tế bào trong {{0}} đĩa giếng được rửa một lần trong PBS, cố định trong đá lạnh 4% paraformaldehyde (PFA) (Sigma-Aldrich) trong PBS trong 20 phút, và sau đó được nhuộm bằng 4 , 6- diamidino -2- phenylindole (DAPI) (Sigma-Aldrich) (0,2 ug / mL) trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sau khi rửa bằng PBS, các tế bào được niêm phong trong Phương tiện Gắn VECTASHIELD (Phòng thí nghiệm Vector, Burlingame, CA, Hoa Kỳ). Hình thái hạt nhân được chụp bằng kính hiển vi huỳnh quang Olympus.

Echinacoside trong cistanche có thể tăng cường hệ thống miễn dịch

3.5. Phân tích chu kỳ tế bào

Tế bào được gieo vào 96- đĩa giếng ở 1 × 104 tế bào mỗi giếng trong 12 giờ, và sau đó được ủ với sự có mặt củaEchinacosidehoặc {{0}}. 0 1 phần trăm DMSO trong 24 giờ. Cuối cùng, các tế bào được thu hoạch bằng trypsin (Invitrogen), rửa trong PBS hai lần, và sau đó được cố định bằng ethanol lạnh (70%) trong 2 giờ ở -20 độ. Các tế bào cố định được rửa hai lần trong PBS lạnh và tiếp tục trong 300 μL PBS mới chuẩn bị với 0,1 phần trăm Triton X -100, 0,2 mg / mL RNase A (Sigma) không chứa DNase, 10 ug / mL Propidium Iodide (PI) (Roche, Indianapolis, IN, Hoa Kỳ). Sau khi ủ ở 37 độ trong bóng tối trong 20 phút, các tế bào được lọc qua lưới nylon (Falcon, BD Bioscience, San Jose, CA, USA), được đưa vào máy đo lưu lượng FACSCalibur (BD Biosciences). Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm ModFit (Topsham, ME, USA).

3.6. Phân tích apoptosis

Tế bào được gieo vào 96- đĩa giếng ở 1 × 104 tế bào mỗi giếng trong 12 giờ, và sau đó được ủ với sự có mặt củaEchinacosidehoặc 0. 01 phần trăm DMSO trong 24 giờ. Cuối cùng, các tế bào đã được kiểm tra bằng bộ dụng cụ phát hiện Apoptosis Annexin V-FITC (Best, Shanghai, China) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tế bào được rửa hai lần bằng PBS và sau đó được tiếp tục lại trong bộ đệm liên kết. 5 μL mỗi Annexin V-FITC và Propidium Iodide (PI) (Roche) được thêm vào tuần tự và các tế bào được ủ trong 15 phút trong bóng tối ở nhiệt độ phòng. Các tế bào được đưa vào máy đo lưu lượng FACSCalibur (BD Biosciences). Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm Cell Quest (BD Biosciences).

3.7. Nhuộm huỳnh quang miễn dịch của 53BP1

Các ô SW480 được gieo hạt trên các tấm bìa tròn trong 24- đĩa giếng. Sau khi điều trị vớiEchinacosidehoặc {{0}}. 01 phần trăm DMSO trong 24 giờ, các ô được cố định với 4 phần trăm PFA trong 20 phút và bị chặn với 15 phần trăm FBS (0,1 phần trăm Triton X -100) ​​trong 1 giờ tại phòng nhiệt độ. Các tế bào cố định được ủ trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng với kháng thể kháng BP1 của thỏ (Phòng thí nghiệm Bethyl, Montgomery, TX, Hoa Kỳ) được pha loãng 1: 1000 trong dung dịch chặn, sau đó nhuộm với Cy 3- liên hợp kháng thể thứ cấp chống thỏ dê (Phòng thí nghiệm Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, Hoa Kỳ) pha loãng với tỷ lệ 1: 500 trong đệm chặn trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau khi rửa trong PBS trong 3 × 5 phút, các nắp đậy đã được niêm phong trên các lam kính trong Phương tiện lắp đặt VECTASHIELD với DAPI. Hình ảnh được chụp bởi kính hiển vi tiêu điểm Zeiss LCM 510 (Carl Zeiss, Jena, Đức).

3.8. Thử nghiệm thành lập 8- oxoG

OxoG 8- nội bào được đo bằng cách nhuộm với Alexa 488- avidin liên hợp (Invitrogen) [25]. Tế bào được tạo hạt trên các tấm bìa tròn trong 12- đĩa giếng. Sau khi điều trị vớiEchinacosidehoặc {{0}}. 0 1 phần trăm DMSO trong 24 giờ, các tế bào được cố định bằng metanol lạnh đá trong 2 0 phút sau đó được ủ trong dung dịch muối đệm Tris (TBS) (Fisher Scientific, Rockford, IL, Hoa Kỳ) với 0,1 phần trăm Triton X -100 (Sigma-Aldrich) trong 15 phút. Các mẫu được chặn trong TBS với 0,1 phần trăm Triton X -100 và 15 phần trăm FBS trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng và sau đó được nhuộm bằng avidin liên hợp Alexa 488- (0,5 ug / mL) trong dung dịch chặn trong 1 giờ ở 37 độ. Sau khi rửa trong PBS 3 × 5 phút, các tấm bìa được niêm phong trên lam kính trong Môi trường gắn VECTASHIELD với DAPI (Phòng thí nghiệm Vector). Hình ảnh được chụp và phân tích bằng kính hiển vi tiêu điểm Zeiss LCM 510.

3.9. Phong cách phương Tây Phân tích

Tế bào được nuôi cấy và xử lý trong đĩa giếng {{0}} được cạo trong đệm RIPA (15 0 mM NaCl, 1. 0 phần trăm IGEPAL CA -630, {{12 }}. 5% natri deoxycholat, 0,1% SDS và 50 mM Tris, 1 mM PMSF, pH 8,0) (Sigma). Nồng độ protein tổng số được đo bằng bộ BCA (Dingguo, Changchun, China) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các mẫu được biến tính ở 95 độ trong 10 phút, được tách trên gel SDS-PAGE 4% –12%, và sau đó được chuyển sang màng PVDF (Millipore, Billerica, MA, USA). Các màng được chặn trong sữa không có chất béo 5% trong TBST trong 2 giờ và được ủ với các kháng thể chính (Bcl -2, sc -492, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA; Bax, Santa Cruz , sc -493; tới c, Santa Cruz, sc -7159; p21, ab109520, Abcam, Cambridge, MA, USA; caspase 3, Abcam, ab32042; PARP, Bioss, bs -2318 R; 53BP1, Phòng thí nghiệm Bethyl, A 300-272 A) qua đêm ở 4 độ. Sau khi rửa bằng PBS, màng được ủ với các kháng thể thứ cấp liên hợp với HRP (Phòng thí nghiệm Jackson ImmunoResearch) và được hiển thị bằng bộ phát hiện ECL Western blotting (Transgen Biotech, Changchun, Trung Quốc). Ảnh được chụp và phân tích bởi một Imager (Tanon, Thượng Hải, Trung Quốc).

3.10. Đo lường di động ROS

ROS nội bào được đo bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy sử dụng bộ xét nghiệm ROS dựa trên tế bào (Công nghệ sinh học Beyotime, Haimen, Trung Quốc; S0033). Ở cuối củaEchinacosidexử lý, các tế bào được rửa hai lần bằng PBS và ủ với 10 μM dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) trong 30 phút ở 37 độ. Sau đó, các tế bào được trypsinized và phân tích bằng máy đo lưu lượng tế bào FACSCaliber (BD Biosciences). Mức ROS nội bào được biểu thị bằng cường độ huỳnh quang DCF trung bình của tế bào.

3.11. Đo màng ty thể Tiềm năng

Điện thế màng ty thể được đo bằng cách sử dụng thuốc nhuộm JC -1 (Công nghệ sinh học Beyotime, C2006) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Điều khiển vàEchinacoside-tế bào được xử lý được ủ với JC -1 trong 20 phút và sau đó được kiểm tra bằng kính hiển vi huỳnh quang Olympus.

3.12. Phân tích thống kê

Phân tích thống kê được thực hiện bằng Phần mềm GraphPad Prism. Mức độ đáng kể được tính toán bằng cách sử dụng phân tích phương sai một chiều (ANOVA) vàp < 0.05="" was="" considered="" statistically="" significant.="" results="" were="" expressed="" as="" mean="" ±="">

EchinacosideTrongcistanche: Bảo vệ thần kinhcác hiệu ứng

4. Kết luận

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã kiểm tra tác động củaEchinacosidetrên nhiều dòng tế bào ung thư ở người. Thật ngạc nhiên, chúng tôi thấy rằng

Cistanchesa mạc có nhiều tác dụng, bấm vào đây để biết thêm

ức chế sự gia tăng của tế bào ung thư vú SK-HEP -1 ung thư vú, MCF -7 ở người và tế bào ung thư đại trực tràng SW480. Các phân tích sâu hơn cho thấy Echinacoside bắt giữ các tế bào SW480 ở pha G1 và gây ra quá trình chết rụng phụ thuộc caspase bằng cách kích hoạt con đường tự chết nội tại liên quan đến ty thể. Quá trình bắt giữ chu kỳ tế bào có liên quan đến sự điều hòa của chất ức chế tổng hợp G1 / S-CDK và chất ức chế tổng hợp DNA CDKN1B (p21), và quá trình apoptosis có liên quan đến sự điều hòa giảm của protein chống apoptotic Bcl -2 và điều hòa của pro-apoptotic Bax, cũng như mất điện thế màng ty thể. Sự gia tăng đáng kể dạng oxy hóa nội bào của guanin, 8- oxoG, cho thấy rằng đã có sự gia tăng oxy hóa các dNTP và / hoặc các phân tử DNA, có thể gây ra quá trình bắt giữ chu kỳ tế bào và quá trình apoptosis ở các tế bào ung thư SW480. Trong khi các cơ chế cơ bảnEchinacosideTác dụng của quá trình oxy hóa và quá trình apoptosis vẫn còn được đặc trưng, ​​những kết quả này hỗ trợ Echinacoside như một giá thể hóa học mới để phát triển các loại thuốc chống ung thư.

Sự nhìn nhận

Các nghiên cứu này được hỗ trợ bởi một khoản tài trợ từ tỉnh Cát Lâm (số tài trợ: 20130101120JC) và một quỹ nghiên cứu từ Đại học Cát Lâm (số dự án: 450091099029).

Sự đóng góp của tác giả

Liwei Dong thực hiện hầu hết các công việc thử nghiệm, phân tích dữ liệu và viết bản thảo; Debin Yu và Nuoting Wu đã thực hiện thử nghiệm MTT và sự hình thành khuẩn lạc; Hongge Wang và Jiajing Niu đã thực hiện các thí nghiệm nhuộm màu miễn dịch và Western blot; Ye Wang đã giúp thực hiện các thí nghiệm về chu kỳ tế bào và quá trình apoptosis; và Zhihua Zou đã phát triển khái niệm, phân tích dữ liệu và giám sát việc thực hiện nghiên cứu này và việc viết bản thảo. Tất cả các tác giả đã chấp thuận bản thảo được gửi.

Xung đột lợi ích

Các tác giả tuyên bố không có xung đột lợi ích.

EchinacosideTrongcistanchecó thểchống viêm

Người giới thiệu

1. Giang, Y; Tu, PF Phân tích các thành phần hóa học ở các loài Cistanche.J. Chromatogr.2009,

1216, 1970–1979.

2. Vương, T.; Zhang, X. .; Xie, W.Cistanche DesticolaYC Ma, "nhân sâm sa mạc": Đánh giá.Là. J. Chin. Med.2012, 40, 1123–1141.

3. Freeman, C.; Spelman, K. Một đánh giá quan trọng về tương tác thuốc vớiEchinacea spp.

Mol Nutr. Thực phẩm Res.2008, 52, 789–798.

4. Hudson, JB Các ứng dụng của phytomedicineEchinacea purpurea(Purple Coneflower) trong các bệnh truyền nhiễm.J. Sinh học. Công nghệ sinh học.2012, 2012, 769896.

5. Zhang, D.; Li, H.; Wang, JB Echinacoside ức chế sự rung hóa amyloid của HEWL và bảo vệ chống lại độc tính thần kinh do A.Int. J. Biol. Macromol.2015, 72, 243–253.

6. Ngô, Y; Li, L.; Đi.; Li, YQ Tác dụng bảo vệ của echinacoside đối với độc tính trên gan do carbon tetrachloride gây ra ở chuột.Độc chất học2007, 232, 50–56.

7. Li, X.; Gou, C.; Yang, H.; Qiu, J .; Ruột.; Wen, T. Echinacoside cải thiện D-galactosamine cộng với tổn thương gan cấp tính do lipopolysaccharide gây ra ở chuột thông qua việc ức chế quá trình apoptosis và viêm.Scand. J. Gastroenterol.2014, 49, 993–1000.

8. Xie, H.; Zhu, H.; Cheng, C.; Lương, Y .; Wang, Z. Echinacoside làm chậm quá trình lão hóa tế bào của tế bào nguyên bào sợi của người MRC -5.Pharmazie2009, 64, 752–754.

9. Vương, S.; Zheng, G.; Tian, ​​S.; Zhang, Y. Shen, L.; Pak, Y. Thần, Y .; Qian, J. Echinacoside cải thiện chức năng tạo máu ở 5- chuột suy tủy do FU gây ra.Khoa học đời sống.2015, 123, 86–92.

10. Giả, Y; Quan, Q.; Guo, Y. Du, C. Echinacoside kích thích sự tăng sinh tế bào và ngăn chặn quá trình chết rụng của tế bào trong các tế bào MODE-K biểu mô ruột bằng cách điều chỉnh sự biểu hiện của yếu tố tăng trưởng biến đổi - 1.J. Pharmacol. Khoa học.2012, 118, 99–108.

11. Morikawa, T.; Ninomiya, K .; Imamura, M.; Akaki, J .; Fujikura, S .; Pan, Y .; Nhân dân tệ, D.; Yoshikawa, M.; Jia, X. .; Li, Z;et al.Phenylethanoid glycoside acylated, echinacoside và acteoside từCistanche tubulosa, cải thiện khả năng dung nạp glucose ở chuột.J. Nat. Med.2014, 68, 561–566.

12. Dương, X.; Li, F.; Yang, Y. Shen, J .; Zou, R .; Zhu, P.; Zhang, C.; Yang, Z .; Li, P. Hiệu quả và độ an toàn của echinacoside trên mô hình chuột rút xương.Sống động. Bổ sung dựa trên cơ sở. Altern. Med.2013, 2013, 926928.

13. Kuang, R .; CN, Y .; Zheng, X. Sự ức chế oxit nitric liên quan đến tác dụng bảo vệ của echinacoside đối với H2O 2- gây ra tổn thương tế bào PC12.Nat. Sản phẩm. Commun.2010, 5, 571–574.

14. Xiong, Q.; Kadota, S .; Tani, T.; Namba, T. Tác dụng chống oxy hóa của phenylethanoids từ

Cistanche Desticola. Biol. Dược phẩm. Bò đực.1996, 19, 1580–1585.

15. Zhang, Y.; Du, Y.; Lê, W .; Vương, K.; Kieffer, N. .; Zhang, J. Kiểm soát oxy hóa khử đối với sự tồn tại của các tế bào khỏe mạnh và bị bệnh.Chất chống oxy hóa. Tín hiệu oxy hóa khử.2011, 15, 2867–2908.

16. Russo, MT; Blasi, MF; Chiera, F.; Fortini, P.; Degan, P.; Macpherson, P.; Furuichi, M.; Nakabeppu, Y. Karran, P.; Aquilina, G.;et al.Nhóm deoxynucleoside triphosphate bị oxy hóa là một yếu tố góp phần đáng kể vào sự mất ổn định di truyền trong các tế bào thiếu khả năng sửa chữa không phù hợp.Mol Tế bào. Biol.2004, 24, 465–474.

17. Ventura, tôi; Russo, MT; de Luca, G.; Bignami, M. Các nucleotide purine bị oxy hóa, mất ổn định bộ gen và thoái hóa thần kinh.Thịt cừu. Res.2010, 703, 59–65.

18. Rajendran, P.; Nandakumar, N. .; Rengarajan, T.; Palaniswami, R .; Gnanadhas, EN; Lakshminarasaiah, U .; Gopas, J.; Nishigaki, I. Chất chống oxy hóa, và các bệnh ở người.Clin. Chim. Acta2014, 436, 332–347.

19. Rai, P.; Onder, TT; Trẻ, JJ; McFaline, JL; Pang, B.; Dedon, PC; Weinberg, RA Loại bỏ liên tục các nucleotide bị oxy hóa là cần thiết để ngăn chặn sự khởi phát nhanh chóng của quá trình lão hóa tế bào.Proc. Natl. Acad. Khoa học. Hoa Kỳ2009, 106, 169–174.

20. DeNicola, GM; Karreth, FA; Humpton, TJ; Gopinathan, A.; Ngụy, C.; Frese, K .; Mangal, D.; Yu, KH; Yeo, CJ; Calhoun, ES;et al.Phiên mã Nrf2 do gen gây ra thúc đẩy quá trình giải độc ROS và tạo khối u.Thiên nhiên2011, 475, 106–109.

21. Santos, MA; Faryabi, RB; Ergen, AV; Ngày, giờ sáng; Malachowski, A.; Canela, A.; Onozawa, M.; Lee, JE; Callen, E.; Gutierrez-Martinez, P.;et al.Sự biệt hóa do tổn thương DNA của các tế bào bạch cầu như một hàng rào chống ung thư.Thiên nhiên2014, 514, 107–111.

22. Sayin, VI; Ibrahim, MX; Larsson, E.; Nilsson, JA; Lindahl, P.; Bergo, MO Chất chống oxy hóa đẩy nhanh sự tiến triển của ung thư phổi ở chuột.Khoa học. Bản dịch. Med.2014, 6, 221–215.

23. Harris, IS; Treloar, AE; Inoue, S.; Sasaki, M.; Guerrini, C.; Lee, KC; Yung, KY; Brenner, D.; Knobbe-Thomsen, CB; Cox, MA;et al.Con đường chống oxy hóa glutathione và thioredoxin hiệp lực để thúc đẩy sự khởi phát và tiến triển của ung thư.Tế bào ung thư2015, 27, 211–222.

24. Wong, HS; Ko, KM Herba Cistanches kích thích chu trình oxy hóa khử glutathione tế bào bằng các loại oxy phản ứng được tạo ra từ quá trình hô hấp của ty thể trong tế bào cơ tim H9c2.Dược phẩm. Biol.2013, 51, 64–73.

25. Thanh chống, L.; Patel, R.; Clark, J .; Thomas, S. Phát hiện trực tiếp 8- oxo deoxyguanosine và 8- oxoguanine bằng avidin và các chất tương tự của nó.Hậu môn. Hóa sinh.1998, 255, 20–31.

26. Cầu, G.; Rashid, S.; Martin, SA Sửa chữa không phù hợp DNA và tổn thương DNA bị oxy hóa: Ý nghĩa đối với sinh học và điều trị ung thư.Ung thư2014, 6, 1597–1614.

27. Caldecott, KW Sửa chữa đứt sợi đơn và bệnh di truyền.Nat. Rev. Genet. 2008, 9, 619–631.

28. Phường, IM; Minn, K. van Deursen, J.; Chen, J. p53 Protein liên kết 53BP1 cần thiết cho các phản ứng tổn thương DNA và ức chế khối u ở chuột.Mol Tế bào. Biol.2003, 23, 2556–2563.

29. Nakabeppu, Y. Mức tế bào của 8- oxo guanin trong DNA hoặc vùng nucleotide đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh ung thư và sự tồn tại của tế bào ung thư.Int. J. Mol. Khoa học.2014, 15, 12543–12557.

30. Colussi, D.; Brandi, G.; Bazzoli, F.; Ricciardiello, L. Các con đường phân tử liên quan đến ung thư đại trực tràng: Ý nghĩa đối với hành vi và phòng ngừa bệnh.Int.J. Mol Khoa học.2013, 14, 16365–16385.

31. Satelli, A. .; Mitra, A. .; Brownlee, Z .; Xia, X.; Bellister, S.; Overman, MJ; Kopetz, S.; Ellis, LM; Meng, QH; Li, S. Chụp tế bào khối u tuần hoàn chuyển tiếp biểu mô-trung mô để phát hiện sự tiến triển của khối u.Clin. Ung thư Res.2015, 21, 899–906.

32. Liao, X.; Lochhead, P.; Nishihara, R .; Morikawa, T.; Kuchiba, A. .; Yamauchi, M.; Imamura, Y. Qian, ZR; Baba, Y .; Shima, K .;et al.Sử dụng aspirin, đột biến PIK3CA của khối u và khả năng sống sót của ung thư đại trực tràng.N. Engl. J. Med.2012, 367, 1596–1606.

33. Domingo, E.; Nhà thờ, DN; Sieber, O .; Ramamoorthy, R .; Yanagisawa, Y. Johnstone, E.; Davidson, B.; Kerr, DJ; Tomlinson, IP; Midgley, R. Đánh giá đột biến PIK3CA như là một yếu tố dự đoán lợi ích từ điều trị bằng thuốc chống viêm không steroid trong ung thư đại trực tràng.J. Clin. Oncol.2013, 31, 4297–4305.

34. Ahmed, D.; Eide, PW; Eilertsen, IA; Đanielsen, SA; Eknaes, M.; Hektoen, M.; Lind, GE; Lothe, RA Đặc điểm biểu sinh và di truyền của 24 dòng tế bào ung thư ruột kết.Sinh sản2013, 2, doi: 10.1038 / oncsis.2013.35.