Phần 2: Quy định biểu sinh của gen Per1 Circadian góp phần vào những thay đổi liên quan đến tuổi tác trong bộ nhớ hải mã

Liên hệ: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Xin vui lòng nhấp vào đây để Phần 1

Knockdown của Per1 làm giảm giá trị dài hạnkỉ niệmở chuột non.Tiếp theo, để kiểm tra xem liệu sự điều tiết Per1 ở vùng hải mã lưng có cần thiết trong thời gian dài hay khôngkỉ niệmhình thành, chúng tôi đã truyền siRNA nhắm mục tiêu Per1 vào vùng hải mã lưng của chuột non 48 giờ trước khi huấn luyện OLM 10- phút. Việc truyền Per1 siRNA tạo ra sự giảm đáng kể protein PER1 trong hồi hải mã ở lưng, được đo trong 2 giờ sau phiên kiểm tra cuối cùng (Hình 4d, Hình 5 Bổ sung). Sự hạ gục tương đối khiêm tốn này của protein PER1 (~ 30 phần trăm) tạo ra sự suy giảm nghiêm trọngkỉ niệmhình thành cho OLM; những con chuột được truyền Per1 siRNA cho thấy DI không tăng đáng kể giữa quá trình huấn luyện và thử nghiệm và biểu hiện ít thích đối tượng chuyển động trong quá trình thử nghiệm hơn so với chuột đối chứng (Hình 4e) mà không ảnh hưởng đến việc khám phá tổng thể vật thể khi thử nghiệm (Hình 4f) và không có sự khác biệt về chuyển động trong các buổi tập thói quen trước khi tập luyện (Hình 8c bổ sung). Điều này chứng tỏ, lần đầu tiên, sự gián đoạn cục bộ của gen đồng hồ sinh học cốt lõi có chọn lọc trong vùng hồi hải mã có thể làm suy yếukỉ niệmsự hình thành.

Biểu hiện quá mức trên per1 được cải thiệnkỉ niệmở chuột già. Cuối cùng,để xác định xem liệu sự biểu hiện quá mức của Per1 ở vùng hải mã lưng có phù hợp để cải thiện tình trạng liên quan đến tuổi tác hay khôngkỉ niệmkhiếm khuyết, chúng tôi điều chỉnh cục bộ Per1 bằng cách sử dụng hai phương pháp bổ sung. Đầu tiên, chúng tôi sử dụng một lentivirus thể hiện Per1 kiểu hoang dã với thẻ epitope v5 (pLVX-v5Per1) (Hình 5a, Hình 6a Bổ sung). Để xác nhận rằng plasmid này biểu hiện quá mức Per1, chúng tôi đã chuyển các tế bào HT22 với pLVX-v5Per1 hoặc pLVX-EV và đo biểu hiện mRNA Per1. Ở cả 24 và 48 giờ sau khi chuyển nạp, mRNA Per1 không thể tăng lên đáng kể ở các tế bào được truyền pLVX-v5Per1 so với các tế bào được truyền plasmid đối chứng (Hình 5b). Việc truyền pLVX-v5Per1 cũng dẫn đến sự gia tăng đáng kể mRNA đối với Per2 (một thành viên thuộc họ đồng hồ tuần hoàn tương tác với Per1) ở 24 giờ (Hình bổ sung. 6b), mặc dù mức tăng này nhỏ hơn nhiều so với mức tăng được quan sát thấy ở Per1 (tại 24 giờ, Per1: tăng 466- lần so với EV, Per2: 1. 6- tăng lần so với EV). Tuy nhiên, biểu hiện quá mức Per1 không ảnh hưởng đến quá trình phiên mã của gen hạ lưu gần nhất Hes7 (Hình bổ sung. 6c).

Để xác định xem liệu biểu hiện quá mức trên Per1 có cải thiện hay khôngkỉ niệmhiệu suất ở chuột già, pLVX-v5Per1 được truyền vào vùng hải mã lưng của 18- chuột mo 2 tuần trước khi thực hiện hành vi. Chuột pLVX-v5Per1 cho thấy sự cải thiện đáng kểkỉ niệmcho OLM tại thử nghiệm liên quan đến điều khiển pLVX-EV (vectơ trống) (Hình 5c). Chỉ những con chuột pLVX-v5Per1 cho thấy sự ưa thích đối với đối tượng chuyển động ở trạng thái nghỉ không tăng lên đáng kể so với khi huấn luyện mà không có sự khác biệt nhóm nào được quan sát thấy trong tổng số thăm dò tại thử nghiệm (Hình 5d) hoặc trong chuyển động trong quá trình sinh sống (Hình 8d).

Sau hành vi, mô hồi hải mã từ một nhóm con động vật được xử lý để giải trình tự RNA để xác định sự hiện diện của các bản sao pLVX-EV và pLVX-v5Per1 trong các nhóm thích hợp in vivo (Hình bổ sung 7a, b, f, g).

Để bổ sung cho cách tiếp cận này, chúng tôi cũng sử dụng hệ thống Trung gian kích hoạt tổng hợp CRISPR / dCas9 (SAM )33 để thúc đẩy quá trình kích hoạt phiên mã của Per1 trong hồi hải mã ở lưng. Hệ thống này bao gồm ba thành phần ngoại vi: một chất xúc tácCas9 không hoạt động (dCas9) được hợp nhất với miền kích hoạt phiên mã VP64 với thẻ GFP (dCas 9- VP 64- GFP), một RNA dẫn đường đơn (sgRNA) sửa đổi nhắm mục tiêu Per1 với hai aptamers RNA MS2 có thể tuyển thành phần thứ ba, một protein dung hợp MS 2- phiên mã kép (MS 2- p 65- HSF1)(Hình 5e). Động vật đối chứng nhận được sgRNA đối chứng thiếu trình tự 20 nucleotide cần thiết để nhắm mục tiêu hệ thống SAM tới Per1 (được gọi là ctrl sgRNA). Việc lắp ráp các thành phần này tại trình thúc đẩy Per1 cho phép ba miền của trình tạo hiệu ứng (VP64, p65 và HSF1) thúc đẩy phiên mã Per1. Để xác định, hiệu quả của Hình 5 Sự biểu hiện quá mức của Per1 ở vùng hải mã lưng cải thiện các suy giảm liên quan đến tuổi tác ở vị trí đối tượngkỉ niệm. một sơ đồ cấu trúc lentivirus được sử dụng để biểu thị quá mức v {{0}} được gắn thẻ Per1 (pLVX-v5Per1) so với điều khiển vectơ trống (pLVX-EV). b mRNA trên mỗi 1 đã tăng đáng kể trong 24 và 48 giờ sau khi truyền pLVX-v5Per1 trong các tế bào HT22 so với các tế bào được truyền EV (ANOVA hai chiều: Tương tác nhóm x Thời điểm (F (1,8)=52. 8, p <{{2 0}}.="" 0="" {{4="" 0}}="" 1),="" bài="" kiểm="" tra="" post="" hoc="" của="" sidak,="" ***="" p=""><0. 001,="" n="3," 3,="" 3,="" 3).="" c="" 18-="" một="" con="" chuột="" được="" truyền="" plvx-v5per1="" vào="" hồi="" hải="" mã="" cho="" thấy="" trí="" nhớ="" thực="" sự="" tốt="" hơn="" đáng="" kể="" đối="" với="" olm="" so="" với="" những="" con="" chuột="" được="" tiêm="" vi="" rút="" kiểm="" soát="" plvx-ev="" (anova="" hai="" chiều:="" tương="" tác="" phiên="" vi="" rút="" x,="" (f="" (1,29)="" {34="" }}.="" 15,="" p=""><0,05), bài="" kiểm="" tra="" post="" hoc="" của="" sidak,="" **="" p=""><0,01, ***="" p=""><0,001, n="16," 15,="" tất="" cả="" là="" nam).="" d="" tổng="" số="" thăm="" dò="" là="" tương="" tự="" đối="" với="" cả="" hai="" nhóm="" tại="" thời="" điểm="" thử="" nghiệm="" (t="" (29)="0." 57,="" tr="0." 57).="" e="" sơ="" đồ="" hệ="" thống="" trung="" gian="" kích="" hoạt="" tổng="" hợp="" crispr="" dcas9="" (sam)="" được="" sử="" dụng="" để="" thúc="" đẩy="" phiên="" mã="" per1.="" trên="" cùng:="" các="" thành="" phần="" riêng="" lẻ="" của="" sam.="" dưới="" cùng:="" các="" thành="" phần="" được="" lắp="" ráp="" tại="" trình="" xúc="" tiến="" per1,="" thúc="" đẩy="" phiên="" mã="" per1.="" f="" per1="" mrna="" đã="" tăng="" lên="" đáng="" kể="" 48="" giờ="" sau="" khi="" chuyển="" nạp="" các="" thành="" phần="" crispr-sam="" trong="" tế="" bào="" ht22="" so="" với="" các="" tế="" bào="" được="" truyền="" với="" sgrna="" kiểm="" soát="" (anova="" hai="" chiều:="" tương="" tác="" nhóm="" x="" thời="" điểm="" (f="" (1,8)="14." 77="" ,="" p=""><0,01), bài="" kiểm="" tra="" bài="" học="" của="" sidak,="" **="" p=""><0,001, n="3," 3,3,3).="" g="" 18-="" mo="" con="" chuột="" được="" truyền="" vào="" hải="" mã="" của="" hệ="" thống="" crispr-sam="" với="" sgrna="" nhắm="" mục="" tiêu="" per1="" cho="" thấy="" rõ="" ràng="" là="" tốt="" hơn="" đáng="">kỉ niệmđối với OLM so với chuột điều khiển EV có sgRNA điều khiển (ANOVA hai chiều: Tương tác giữa virus x Phiên (F (1,3 0)=5. 83, p <0. 05)="" ,="" các="" bài="" kiểm="" tra="" post="" hoc="" của="" sidak,="" ***="" p=""><0,001, n="17," 15,="" tất="" cả="" là="" nam).="" h="" tổng="" số="" thăm="" dò="" là="" tương="" tự="" cho="" cả="" hai="" nhóm="" ở="" lần="" thử="" nghiệm="" (t="" (30)="0." 41,="" tr="0." 68).="" dữ="" liệu="" được="" trình="" bày="" dưới="" dạng="" trung="" bình="" ±="" sem="" trong="" hệ="" thống="" crispr-sam,="" chúng="" tôi="" đã="" truyền="" tế="" bào="" ht22="" với="" cả="" ba="" plasmid,="" thu="" hoạch="" tế="" bào="" 24="" hoặc="" 48="" giờ="" sau="" đó="" và="" đo="" biểu="" hiện="" mrna="" per1.="" đến="" 48="" giờ="" sau="" khi="" chuyển="" nạp,="" per1="" mrna="" đã="" tăng="" lên="" đáng="" kể="" ở="" nhóm="" được="" cung="" cấp="" per1="" sgrna="" so="" với="" nhóm="" đối="" chứng="" (hình="" 5f),="" chứng="" tỏ="" rằng="" hệ="" thống="" crispr-sam="" điều="" khiển="" hiệu="" quả="" biểu="" hiện="" mrna="" per1.="" chúng="" tôi="" quan="" sát="" thấy="" không="" có="" sự="" thay="" đổi="" trong="" biểu="" hiện="" cho="" mrna="" per2="" (hình="" bổ="" sung="" 6e)="" hoặc="" mrna="" hes7="" (hình="" bổ="" sung="" 6f),="" cho="" thấy="" rằng="" hệ="" thống="" crispr-sam="" thúc="" đẩy="" sự="" biểu="" hiện="" quá="" mức="" có="" chọn="" lọc="" của="" gen="" mục="" tiêu,="">

Tiếp theo, 18- con chuột mo đã được truyền vi khuẩn CRISPR-SAM lentivirus CRISPR-SAM vào trong hải mã (Hình bổ sung 6d) và được huấn luyện trong OLM 2 tuần sau đó. Theo quan sát với biểu hiện quá mức pLVX- v5Per1 của chúng tôi, biểu hiện quá mức trên Per1 qua trung gian CRISPR-SAM hầu như không được cải thiệnkỉ niệmhiệu suất ở chuột được truyền Per1 sgRNA so với động vật đối chứng (Hình 5g) mà không ảnh hưởng đến việc khám phá tổng thể (Hình 5h) hoặc chuyển động trong quá trình sinh sống (Hình 8e). Chỉ những con chuột được cung cấp Per1 sgRNA cho thấy sự ưa thích đối với đối tượng chuyển động ở trạng thái nghỉ không tăng lên đáng kể so với việc huấn luyện, cho thấy nó còn nguyên vẹnkỉ niệmcho các vị trí đối tượng (Hình 5g). Sau hành vi, mô hồi hải mã từ một nhóm con động vật được xử lý để giải trình tự RNA để xác định sự hiện diện của các bản sao CRISPR trong các nhóm thích hợp in vivo (Hình bổ sung 7c – g). Kết hợp với nhau, những kết quả này chứng minh rằng sự biểu hiện quá mức của Per1 ở vùng hải mã lưng có khả năng cải thiện những suy giảm liên quan đến tuổi tác trong bộ nhớ vị trí đối tượng trong thời gian dài. Do đó, Per1 là một gen quan trọng quan trọng đối với sự hình thành trí nhớ dài hạn, được điều chỉnh bởi HDAC3, và bị suy giảm trong não lão hóa.

Thảo luận

Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng việc xóa bỏ hoặc làm gián đoạn histone deacetylase HDAC3 có thể cải thiện tình trạng suy giảm do tuổi tác về lâu dài.kỉ niệmvà tính dẻo của khớp thần kinh. Hơn nữa, việc xóa HDAC3 sẽ khôi phục lại sự biểu hiện do kinh nghiệm gây ra của gen sinh học Per1 trong hồi hải mã ở lưng. Vì biểu hiện PER1 của hồi hải mã rất quan trọng đối với sự hình thành trí nhớ dài hạn (Hình 4) và sự biểu hiện quá mức của Per1 ở vùng hải mã cải thiện tình trạng suy giảm trí nhớ liên quan đến tuổi tác (Hình 5), PER1 là một cơ chế tiềm năng mà qua đó việc xóa HDAC3 được cải thiệnkỉ niệmvà tính dẻo của khớp thần kinh ở chuột già. Nói rộng hơn, sự gián đoạn liên quan đến tuổi tác của Per1 có thể kết nối những suy giảm liên quan đến tuổi tác trong cả trí nhớ dài hạn và nhịp sinh học, tùy thuộc vào cấu trúc.

Một mấu chốt quan trọng từ nghiên cứu hiện tại là những suy giảm liên quan đến tuổi tác trong LTP vùng hải mã có thể được cải thiện khi xóa bỏ hoặc gián đoạn HDAC3. Điều này phù hợp với nghiên cứu gần đây từ phòng thí nghiệm Sajikumar chứng minh rằng sự phong tỏa dược lý của HDAC3 cũng có thể cải thiện các suy giảm liên quan đến tuổi tác ở vùng hải mã liên quan LTP34. Điều thú vị là chúng tôi phát hiện ra rằng các lát cắt từ động vật HDAC3 fl ox / ox và HDAC3 (Y298H) cũ không đạt được mức chiết suất tương tự như các lát từ động vật HDAC3 fl ox / ox hoặc HDAC3 (Y298H) non (Hình 2c, f), gợi ý rằng não già có thể có trần dẻo thấp hơn não trẻ. Một giải thích có thể cho sự khác biệt về điện thế này là sự mất tiếp xúc khớp thần kinh liên quan đến tuổi tác trong CA122 có thể làm giảm trần độ dẻo trong hồi hải mã lão hóa, vì càng ít khớp thần kinh có sẵn sẽ trở nên bão hòa nhanh hơn so với các khớp thần kinh tương đối dồi dào ở DH trẻ. Nếu đúng như vậy, việc tăng cường giao thức kích thích hoặc cung cấp các đợt kích thích cách nhau35 không nên tăng cường thêm LTP trong vùng hồi hải mã đã lão hóa, vì không có sẵn các khớp thần kinh bổ sung. Cần phải làm thêm để xác định cơ chế tạo ra sự khác biệt này.

Kết quả giải trình tự RNA của chúng tôi đã chứng minh rằng chỉ một tập hợp con nhỏ của các gen không đáp ứng tiêu chuẩn được phục hồi trong não lão hóa bằng cách xóa HDAC3 (Hình 3e). Do đó, thay vì tập hợp lại biểu hiện gen của não trẻ, việc xóa HDAC3 trong não già đã khôi phục lại biểu hiện do kinh nghiệm gây ra của một số gen chính cực kỳ quan trọng đối với sự hình thành trí nhớ dài hạn, bao gồm cả Per1. Per1 dường như được điều chỉnh trực tiếp bởi HDAC3, vì việc xóa tiêu điểm của biểu thức Per1 do trải nghiệm gây ra đã khôi phục HDAC3 và HDAC3 bị xóa về mặt vật lý khỏi trình khởi động Per1 để đáp ứng với đào tạo OLM. Hơn nữa, biểu thức Per1 là cần thiết chokỉ niệm, vì phản ứng hạ gục protein PER1 qua trung gian siRNA trong DH bị suy giảm trong thời gian dàikỉ niệmsự hình thành ở chuột non và sự biểu hiện quá mức được cải thiệnkỉ niệmđối với OLM ở chuột già. Đáng chú ý, cả hai hệ thống virut được sử dụng để biểu hiện quá mức Per1 chỉ truyền một số lượng nhỏ tế bào trong khu vực CA1b của hồi hải mã lưng (Hình bổ sung. 6a, d), do đó cần phải xác định sự hiện diện của các cấu trúc này bằng giải trình tự ARN (xem phương pháp ). Như nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng vùng chính xác của hồi hải mã lưng là rất quan trọng đối với OLM36, điều này chứng tỏ rằng ngay cả một sự thay đổi tiêu điểm nhỏ của Per1 trong cấu trúc liên quan đến trí nhớ cũng có thể ảnh hưởng đến sự hình thành trí nhớ dài hạn. Điều này mở rộng nghiên cứu trước đó cho thấy rằng việc xóa bỏ Per1 không theo quy luật trong toàn bộ não có thể làm giảm sự hình thành trí nhớ ở chuột trẻ6,28,29. Do đó, sự ức chế bất thường HDAC 3- qua trung gian của Per1 trong não lão hóa là một sự kiện quan trọng có thể dẫn đến sự suy giảm liên quan đến tuổi tác trong cả quá trình hình thành trí nhớ dài hạn và nhịp sinh học. Mặc dù nghiên cứu này chứng minh rõ ràng rằng Per1 là một gen quan trọng mà qua đó HDAC3 điều chỉnh trí nhớ dài hạn trong não lão hóa, các gen khác rất có thể góp phần vào tác dụng tăng cường trí nhớ của việc xóa HDAC3. Các gen khác được đề xuất làm trung gian cho các tác động của HDAC3 lên tính dẻo của khớp thần kinh và trí nhớ bao gồm NF-κB34, FMRP37 và Nr4a226. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi xác định thêm ba gen (Hình 3f: Nr4a1, Egr1, Tsc22d3), giống như Per1, cho thấy biểu hiện suy giảm trong não lão hóa được cải thiện bằng cách xóa HDAC3. Làm thế nào những gen khác nhau này đóng góp một cách độc đáo vào tác dụng tăng cường trí nhớ của việc xóa HDAC3 hiện vẫn chưa rõ ràng. Đáng chú ý, tất cả các gen này giao tiếp với con đường CBP / CREB, con đường quan trọng đối với sự hình thành trí nhớ dài hạn 38,39 và cả lên và xuống của PER16,28. Vì PER1 ngược dòng với quá trình phosphoryl hóa CREB6, nên có thể sự kìm hãm qua trung gian HDAC 3- của Per1 làm giảm quá trình phosphoryl hóa CREB, cuối cùng làm suy yếu quá trình phiên mã của các gen qua trung gian CREB như Fmrp40,41 và các thành viên họ gen Nr4a là Nr4a1 và Nr4a226. Tìm hiểu động lực học phức tạp giữa HDAC3, PER1 và các chất chơi phân tử khác này sẽ là mục tiêu quan trọng của nghiên cứu trong tương lai.

Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi sử dụng hai phương pháp bổ sung để biểu hiện quá mức Per1 trong não lão hóa: biểu hiện quá mức cấu trúc cDNA Per1 có độ dài đầy đủ bằng cách sử dụng pLVX-v5Per1 và kích hoạt phiên mã Per1 nội sinh bằng hệ thống CRISPR-SAM. Mặc dù biểu hiện quá mức qua trung gian pLVX dẫn đến sự gia tăng lớn mRNA Per1 (Hình 5b), điều này đi kèm với sự gia tăng Per2, một thành viên khác trong gia đình Giai đoạn (Hình 6b). Tuy nhiên, sự biểu hiện của gen hạ lưu Hes7 không thay đổi bởi pLVX-v5Per1 (Hình bổ sung. 6c). Mặt khác, hệ thống CRISPR-SAM tạo ra sự gia tăng tinh tế hơn mRNA Per1 để tránh những cải tiến ngoài mục tiêu của biểu hiện Per2 hoặc Hes7 (Hình bổ sung. 6e – f). Khi cả hai cách tiếp cận đều được cải thiện tương tự trong dài hạnkỉ niệmở những con chuột già, không chắc rằng sự gia tăng ngoài mục tiêu trong Per2 được quan sát với pLVX-v5Per1 là nguyên nhân của sự cải thiện quan sát được trong trí nhớ dài hạn.

Ảnh hưởng của Circadian về lâu dàikỉ niệmtheo truyền thống được cho là xuất phát từ sự rối loạn điều hòa trong SCN, sau đó dẫn đến những thay đổi trong cấu trúc ngoại vi liên quan đến sự hình thành bộ nhớ, như hồi hải mã ở lưng. Người ta biết rất ít về vai trò của các gen đồng hồ sinh học riêng lẻ trong DH, mặc dù có mối liên hệ rõ ràng giữa nhịp sinh học và sự hình thành trí nhớ dài hạn. Bộ nhớ được liên kết chặt chẽ với thời gian trong ngày, vì các tầng gen liên quan đến độ dẻo cho thấy dao động sinh học3,6 vàkỉ niệmcó thể được thu nhận dễ dàng hơn vào những thời điểm nhất định của chu kỳ sinh học. Ví dụ, điều kiện sợ hãi bối cảnh được hình thành mạnh hơn vào ban ngày, khi mức độ phosphoryl hóa MAPK đạt đỉnh3. Hơn nữa, có nhiều tài liệu cho rằng lão hóa đi kèm với sự phá vỡ nhịp sinh học, có lẽ là do những thay đổi trong đồng hồ sinh học trung tâm, hạt nhân siêu sinh (SCN) (để xem xét 1). Sự gián đoạn này trong đồng hồ sinh học liên quan như thế nào đến sự suy giảm do tuổi tác trongkỉ niệmlà một câu hỏi mở. Kết quả của chúng tôi cho thấy HDAC3 hạn chế Per1 do trải nghiệm gây ra ở vùng hải mã lão hóa, có thể góp phần gây ra những suy giảm được quan sát thấy trong trí nhớ dài hạn. Do đó, sự ức chế biểu sinh của Per1 có thể đại diện cho một giao diện quan trọng giữa sự suy giảm liên quan đến tuổi tác trong nhịp sinh học và sự hình thành trí nhớ dài hạn.

Trong số các gen đồng hồ sinh học kinh điển cốt lõi, Per1 được coi là duy nhất sẵn sàng để ảnh hưởng đáng kể đến hồi hải mã về lâu dàikỉ niệm. Per1 dường như chủ yếu tham gia vào các con đường đầu ra của SCN và đóng một vai trò quan trọng trong các đồng hồ ngoại vi ở hạ nguồn của SCN, chẳng hạn như hồi hải mã42. Hơn nữa, nghiên cứu gần đây cho thấy Per1 có thể "đóng cửa" sự hình thành bộ nhớ không gian trong suốt chu kỳ ngày / đêm bằng cách kiểm soát quá trình phosphoryl hóa CREB6,28,29. Thật vậy, sự điều hòa mRNA của Per1 ở hải mã đã được quan sát thấy sau khi học theo ngữ cảnh hoặc không gian trong ít nhất ba nghiên cứu RNA-seq khác, bao gồm cả công việc ở chuột, cho thấy rằng Per1 thường được điều chỉnh sau khi học qua các loài20,43,44. Cùng với các kết quả của nghiên cứu hiện tại, công trình này chỉ ra rằng biểu hiện PER1 là cực kỳ quan trọng đối với sự hình thành trí nhớ dài hạn ở hồi hải mã; giảm PER1 xảy ra vào ban đêm29 hoặc với quá trình lão hóa có thể làm suy giảm hồi hải mãkỉ niệm. Đến nay,

nghiên cứu liên quan đến Per1 trongkỉ niệmsự hình thành đã hoàn toàn phụ thuộc vào việc loại bỏ toàn cầu làm gián đoạn biểu hiện Per1 trong đồng hồ sinh học cốt lõi và các khu vực khác ngoài các cấu trúc liên quan đến bộ nhớ như hippocampus6,28,29,45,46, khiến không thể xác định được liệu PER1 ở hồi hải mã có cần thiết cụ thể cho hình thành trí nhớ. Thật vậy, việc xóa Per1 toàn cầu ảnh hưởng đến nhịp sinh học trong một số báo cáo42. Ở đây, lần đầu tiên chúng tôi cho thấy rằng việc giảm biểu hiện PER1 trực tiếp trong hồi hải mã lưng có thể làm suy yếukỉ niệmở chuột non trong khi sự biểu hiện quá mức cục bộ của Per1 ở vùng hải mã lưng có thể cải thiện trí nhớ ở chuột già. Vì sự xóa bỏ có chọn lọc HDAC3 (điều chỉnh Per1) ở vùng hải mã lưng không ảnh hưởng đến các mô hình hoạt động sinh học trong nghiên cứu hiện tại (Hình bổ sung 4), và thậm chí các tổn thương điện giải của vùng hải mã lưng không có khả năng ảnh hưởng đến nhịp sinh học47, có vẻ như điều đó khó xảy ra. thao tác Per1 trong vùng hải mã lưng ảnh hưởng đến chức năng của đồng hồ sinh học trung tâm. Tuy nhiên, có thể sự gia tăng Per1 do kinh nghiệm gây ra hoặc sự biểu hiện quá mức qua trung gian vi rút của Per1 có thể ảnh hưởng đến hoạt động sinh học của những người chơi phân tử khác, chẳng hạn như các gen đồng hồ khác, trong tế bào thần kinh hải mã, ngay cả khi không ảnh hưởng đến mô hình hoạt động sinh học. Hiểu được cách thức hoạt động của Per1 để thay đổi sự hình thành trí nhớ, bao gồm cả việc xác định các đối tác tương tác tiềm năng này, sẽ là mục tiêu của công việc trong tương lai.

Kết hợp với nhau, những kết quả này chứng minh rằng gen đồng hồ sinh học cốt lõi Per1 đóng một vai trò quan trọng trongkỉ niệmcấu trúc để thay đổi sự hình thành bộ nhớ, một vai trò độc lập với chức năng của nó trong SCN. Nói chung hơn, điều này thách thức giả thuyết truyền thống rằng chu kỳ sinh học thay đổi trongkỉ niệmsự hình thành được thúc đẩy bởi những thay đổi trong đồng hồ sinh học cốt lõi và thay vào đó ủng hộ giả thuyết rằng các gen đồng hồ sinh học đóng một vai trò tự chủ hơn trong các tế bào vùng hải mã, có thể thúc đẩy sự hình thành trí nhớ dựa trên thời gian trong ngày6.

Phương pháp

Chuột. Chuột trưởng thành trẻ từ 2 đến 4 tháng tuổi tại thời điểm thử nghiệm và chuột già là từ 18 đến 20 tháng tuổi. Tất cả các con chuột đều là C57BL / 6J hoặc được duy trì trên nền C57BL / 6 (chuột HDAC3 plus / plus và HDAC3 fl ox / fl ox). Chuột được tiếp cận miễn phí với thức ăn và nước uống và đèn được duy trì theo chu kỳ sáng / tối 12 giờ. Tất cả các thử nghiệm hành vi đã được thực hiện trong chu kỳ ánh sáng. Tất cả các thí nghiệm đều được tiến hành theo hướng dẫn của Viện Y tế Quốc gia Hoa Kỳ về chăm sóc và sử dụng động vật và đã được Ủy ban chăm sóc và sử dụng động vật của Đại học California, Irvine phê duyệt.

Phẫu thuật. Chuột được gây mê bằng iso fl urane (gây mê, 4 phần trăm; duy trì 1,5–2. 0 phần trăm) và được đặt trong lập thể. Kim tiêm được hạ xuống đồi hải mã ở lưng với tốc độ 0. 2 mm / 15 s (AP, −2. 0 mm; ML, ± 1,5 mm, DV, - 1,5 mm so với Bregma ). Hai phút sau khi đạt đến độ sâu mục tiêu, 1. {15}} ul vi rút hoặc siRNA được truyền song phương vào DH với tốc độ 6 ul / h. Đối với dịch truyền phân tử CRISPR-SAM, một hỗn hợp của ba loại vi rút được truyền vào thể tích cuối cùng là 1,5 μL trên mỗi bán cầu với cùng tốc độ. Kim tiêm vẫn giữ nguyên vị trí trong hai phút sau khi tiêm để cho phép vi rút khuếch tán. Sau đó, các kim phun được nâng lên 0. 1 mm và để yên thêm một phút trước khi được tháo ra với tốc độ 0. 1 mm mỗi 15 s. Việc truyền virus được thực hiện 2 tuần trước khi phân tích hành vi trong khi việc hạ gục siRNA được thực hiện 2 ngày trước khi huấn luyện13. Đối với tất cả các thí nghiệm tiêm, động vật được phân ngẫu nhiên vào các điều kiện tiêm khác nhau (ngoại trừ chuột HDAC3 plus / plus và HDAC3 fl ox / ox, tất cả đều được tiêm AAV-CaMKII-Cre). Đối với tất cả các thí nghiệm về hành vi, các động vật trong mỗi tình trạng virus được phân bổ ngẫu nhiên vào các nhóm được huấn luyện / lồng trong nhà và tất cả các điều kiện (đồ vật, hộp, v.v.) đều được cân bằng giữa các nhóm.

Sản xuất AAV. AAV2. 1- CaMKII-Cre được mua từ Penn Vector Core (titer: 1,81 × 1013 GC / ml). Đối với AAV2. 1- HDAC3 (Y298H) -v5, chúng tôi khuếch đại HDAC3 kiểu hoang dã từ cDNA hồi hải mã và nhân bản sản phẩm thành một modi ed pAAV- IRES-hrGFP (Agilent) dưới sự kiểm soát của trình quảng bá CMV và intron -globin. Thẻ 3 × -FLAG, phần tử IRES và hrGFP đã bị xóa khỏi vectơ và được thay thế bằng thẻ V5, cho phép hợp nhất đầu C thành HDAC3 (plasmid MW91). Để tạo đột biến điểm, chúng tôi đã thay đổi các nucleotide để mã cho một gốc histidine thay cho tyrosine ở axit amin 298 (plasmid MW92). Đối với điều khiển vector trống, trình tự mã hóa HDAC3 không có mặt, nhưng tất cả các yếu tố khác vẫn còn (plasmid MW87). AAV được tạo ra bởi Penn Vector Core và các hiệu giá cuối cùng được xác định bằng qPCR (AAV-HDAC3 (Y298H): 6,48 × 1012 GC / ml; AAV-EV: 1,35 × 1013 GC / ml).

Sản xuất virus. Đối với hệ thống Hòa giải kích hoạt hiệp đồng CRISPR / dCas9 (SAM), plasmid ngoại vi đã được mua từ Addgene cho dCas 9- VP 64- GFP (# 61422- LVC) và MS 2- P 65- HSF 1_ Cấu trúc Hygro (# 61426- LVC) (hiệu giá Lớn hơn hoặc bằng 8 × 106 TU / ml). Đối với Per1 sgRNA, chúng tôi đã nhân bản và chèn một trình tự hướng dẫn antisense tương ứng với phần tử CRE trong promoter Per1 (AGAGGGAGGTGACGTCAAAG) vào xương sống nhân bản Addgene sgRNA (MS2) (# 61427). SgRNA đối chứng giống hệt nhau, ngoại trừ không có trình tự hướng dẫn nào được nhân bản vào plasmid. Lentivirus cho cả sgRNA Per1 (hiệu giá: 6,8 × 107 IFU / ml) và sgRNA đối chứng (3,5 × 107 IFU / ml) được sản xuất bởi Phòng thí nghiệm Lentiviral của Trường Dược phẩm USC.

Đối với cấu trúc biểu hiện quá mức pLVX-V5Per1, chúng tôi khuếch đại kiểu đại diện có độ dài đầy đủ Per1 từ plasmid Addgene pCMV-Sport 2- mPer1 (# 16203) và nhân bản sản phẩm thành một modi fi ed pLVX-EF 1 - IRES-mCherry xương sống (Takara, # 631987). Các phần tử IRES và mCherry đã bị loại bỏ và được thay thế bằng thẻ V5, cho phép hợp nhất đầu N thành PER1 (plasmid MW206). Đối với điều khiển vector trống (EV), trình tự mã hóa PER1 không có mặt nhưng tất cả các phần tử khác vẫn còn (Plasmid MW93). Lentivirus cho pLVX-v5Per1 (titer: 1,3 × 108 IFU / ml) và pLVX-EV (titer: 1,5 × 108 IFU / ml) được sản xuất bởi Phòng thí nghiệm Lentiviral của Trường Dược phẩm USC. Tất cả các cấu trúc ngoại vi đều được thể hiện dưới promoter EF1.

Xác minh nuôi cấy tế bào của pLVX-v5Per1 và CRISPR-SAM. Để xác minh rằng pLVX-v5Per1 tạo ra sự biểu hiện quá mức của mRNA Per1, các tế bào HT22 của chuột (Viện Salk, La Jolla, CA, # T09031) đã được truyền pLVX-v5Per1 hoặc pLVX-EV (Hình 5a) bằng cách sử dụng Lipofectaine LTX (Invitrogen). Tương tự, để xác minh rằng hệ thống CRISPR-SAM có thể thúc đẩy phiên mã Per1 một cách hiệu quả, các ô HT22 đã được truyền bằng dCas 9- VP64 (lenti MS 2- P 65_ HSF 1_ Blast cũ là một món quà từ Feng Zhang Addgene plasmid # 61425), MS 2- P 65- HSF1 (lenti dCAS-VP 64_ Blast là một món quà từ Feng Zhang, Addgene plasmid # 61426) và một trong hai Per1 sgRNA (Per1 sgRNA) hoặc sgRNA kiểm soát không nhắm mục tiêu (ctrl sgRNA) (lenti sgRNA (MS2) _ zeo backbone là một món quà từ Feng Zhang, Addgene plasmid # 61427) bằng cách sử dụng Lipofectamine LTX (Invitrogen). Tế bào được thu hoạch sau 24 hoặc 48 giờ, được ly giải, và mRNA được phân lập như mô tả ở trên. qRT-PCR được thực hiện như mô tả ở trên bằng cách sử dụng mồi Per1, Per2 và Hes7 và đầu dò được liệt kê trong Bảng S4.

siRNA. Đối với thử nghiệm hạ gục Per1, Accell SMARTpool các RNA can thiệp nhỏ (siRNAs; Dharmacon, GE) nhắm mục tiêu Per1 đã được pha loãng đến nồng độ tổng cuối cùng là 1 0 μM trong ddH20 và được truyền vào DH (1,0 ul / bên). Tích lũy siRNA của nhóm không nhắm mục tiêu được sử dụng làm đối chứng (tổng nồng độ, 10 μM) và được truyền theo cách tương tự. Đối với các thí nghiệm siRNA, những con chuột được xử lý và làm nơi cư trú như mô tả ở trên và phẫu thuật được thực hiện vào ngày sau ngày cuối cùng của sự sống. Những con chuột đã được phục hồi cả ngày sau khi phẫu thuật và được huấn luyện vào ngày hôm sau (~ 48 giờ sau khi phẫu thuật) để đảm bảo hạ gục mục tiêu tối đa. Để đảm bảo hạ gục, những con chuột đã được hy sinh ~ 1 giờ sau khi kiểm tra và các cú đấm từ hồi hải mã ở lưng được xử lý với các đốm màu phương tây để đảm bảo đánh gục protein PER1.

Vị trí đối tượng và nhận dạng đối tượngkỉ niệmcác nhiệm vụ. Đối với các tác vụ ghi nhớ vị trí đối tượng và nhận dạng đối tượng, chuột được xử lý trong 2 phút / ngày trong 4 ngày và sau đó tập trung vào bối cảnh trong 5 phút / ngày trong sáu ngày liên tiếp khi không có đối tượng. Trong quá trình huấn luyện, chuột được tiếp xúc với hai đồ vật giống hệt nhau (cốc 100 ml, hộp đựng gia vị hoặc giá đựng nến bằng thủy tinh) và được phép khám phá trong 10 phút. Trong quá trình kiểm tra khả năng duy trì (24 giờ sau trong thời gian dàikỉ niệmhoặc 60 m sau đối với trí nhớ ngắn hạn), chuột được phép khám phá trong 5 phút. Đối với vị trí đối tượngkỉ niệm, một trong hai đồ vật quen thuộc đã được chuyển đến địa điểm mới. Để nhận dạng đối tượngkỉ niệm, các vị trí đối tượng không đổi nhưng một trong các đối tượng đã được thay thế bằng một mục mới. Thói quen đối với bộ nhớ nhận dạng đối tượng bắt đầu ít nhất một tuần sau khi hoàn thành kiểm tra OLM và bối cảnh mới cũng như các đối tượng không quen thuộc đã được sử dụng48. Khả năng khám phá được ghi khi đầu chuột hướng về đối tượng và đến trong vòng 1 cm hoặc khi mũi chạm vào đối tượng. Tổng thời gian thăm dò được ghi lại (t) và mức độ ưa thích đối với mục mới được biểu thị dưới dạng chỉ số phân biệt (DI=(tnovel -tfamiliar) / (tnovel plus tfamiliar) x 100 phần trăm). Đối với các buổi đào tạo, đối tượng được chỉ định để di chuyển khi kiểm tra được sử dụng làm đối tượng mới để cho phép so sánh trực tiếp việc đào tạo và kiểm tra DI. Những con chuột đã khám phá cả hai đối tượng trong thời gian ít hơn 2 giây trong quá trình thử nghiệm hoặc 3 giây trong quá trình huấn luyện sẽ bị loại bỏ khỏi phân tích sâu hơn. Những con chuột tỏ ra thích một đối tượng trong quá trình huấn luyện (DI> ± 20) cũng bị loại bỏ. Các phiên giao dịch thói quen được phân tích (để xác định khoảng cách đã đi và tốc độ) bằng phần mềm phân tích hành vi ANY-mê cung (Stoelting Co). Tất cả thói quen, đào tạo, kiểm tra và cho điểm đều được thực hiện bởi những người làm thí nghiệm bị mù đối với các nhóm thí nghiệm.

Bối cảnh sợ hãi để điều kiện. Để điều chỉnh nỗi sợ theo ngữ cảnh, lần đầu tiên chuột được xử lý trong 5 ngày. Trong quá trình thu nhận, chuột tiếp xúc với bối cảnh trong 2 phút 28 giây sau đó là cú sốc 2 giây (0. 75 mA), một giao thức thường tạo ra bộ nhớ dài hạn mạnh mẽ 12,20. Chuột vẫn ở trong bối cảnh thêm 30 giây trước khi bị loại bỏ. Những con chuột đã bị hy sinh 60 m sau khi huấn luyện cùng với các bộ điều khiển lồng nuôi đã được xử lý nhưng không được huấn luyện. Hành vi đóng băng được đo bằng phần mềm Ethovision 11 (Noldus) 12.

Mê cung cộng cao. Mê cung cộng được tiến hành bởi một nhà thí nghiệm mù đối với các nhóm thí nghiệm. Một tuần sau khi hoàn thành ORM, một nhóm con chuột đã được thử nghiệm trên mê cung cộng. Hai cánh tay của mê cung mở (30 × 5 cm) và hai cánh tay được bao bọc (30 × 5 × 15 cm), được nối với nhau bằng một bệ trung tâm (5 × 5 cm). Mê cung được nâng lên 40 cm so với fl oor. Các con chuột được thử nghiệm trong 5 phút trên thiết bị, bao gồm việc đặt mỗi con chuột lên bệ trung tâm đối diện với một trong các cánh tay đang mở. Giữa các đối tượng, mê cung được làm sạch bằng 70% ethanol. Tỷ lệ phần trăm thời gian ở trạng thái khép và mở đã được tính bằng cách sử dụng BẤT KỲ phần mềm mê cung nào.

Phân tích nhịp điệu Circadian. Chuột HDAC3 cộng / cộng và HDAC3 fl ox / trẻ ({0}} tháng) và già (18- tháng) được lai tạo và nuôi trong chu kỳ 12 giờ sáng / tối (LD). Hai tuần sau khi truyền AAV-CaMKII-Cre (mô tả ở trên), chuột được chuyển đến một phòng nhốt LD cách ly 12 giờ trong 7 ngày. Chuột sau đó được chuyển vào phòng phân tích hoạt động được bảo vệ bằng ánh sáng, nơi hoạt động của vận động cơ được phân tích bằng thiết bị dò chuyển động bằng chùm tia quang học (Philips Respironics). Hoạt động được theo dõi trong 2 tuần chu kỳ LD trong phòng được bảo vệ bằng ánh sáng trước khi chuột được chuyển sang bóng tối liên tục (DD) thêm 3 tuần. Theo dõi hoạt động tiếp tục trong suốt giai đoạn DD để xác định xem việc xóa HDAC3 trong DH có ảnh hưởng đến nhịp sinh học nội sinh hay không. Dữ liệu được thu thập bằng cách sử dụng Minimitter VitalView 5.0 và phần mềm Clocklab (Actimetrics) được sử dụng để xác định thời điểm bắt đầu hoạt động tự do. Giá trị Tau được tính toán bằng cách thu được độ dốc của điểm khởi đầu này và tính bình phương nhỏ nhất fi t với phần mềm Clocklab 49,50.

Hóa mô miễn dịch. Sau khi hoàn thành hành vi, những con chuột bị chết vì lệch cổ tử cung và não của chúng bị cắt bỏ và đông lạnh tro trong isopentane lạnh như băng. Các lát cắt 20 micromet được thu thập khắp khuôn viên hông lưng, được làm tan băng trên các lam và được lưu trữ ở độ −8 0. Các trang trình bày được pha trộn với 4 phần trăm paraformaldehyde (10- phút), được thẩm thấu trong 0. 0 1 phần trăm Triton X -100 trong 0,1 M PBS (5- phút) , và bị chặn trong 1 giờ với 8% huyết thanh dê bình thường (Jackson). Các slide được ủ qua đêm (4 độ) trong kháng thể của thỏ với HDAC3 (1: 250, Abcam, dòng vô tính Y415, ab32369) hoặc V5 (1: 1000, Abcam, ab9116), hoặc kháng thể của gà đối với GFP (1: 250, Aves Labs, # GFP1010). Ngày hôm sau, các phiến kính được rửa sạch và ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng bằng thuốc chống dê dê Alexa 488 (HDAC3 và V5; 1: 1000, ThermoFisher, #A -11008) hoặc thuốc chống gà dê Alexa 488 (GFP ; 1: 1000, ThermoFisher, #A -11039) trong bóng tối. Các trang trình bày sau đó được rửa bằng PBST và ủ trong 50 m trong NeuroTrace 530/615 (1:50; ThermoFisher, # N21482), một vết nissl huỳnh quang. Để dập tắt hiện tượng tự phát quang51, các lát cắt sau đó được rửa trong PBS với 0,01% Triton, rửa trong nước và ủ 10- phút trong 10 mM CuSO4 trong dung dịch đệm amoni axetat 50 mM. Lát lại được rửa trong nước, rửa trong PBS, và phủ lên trên bằng phương tiện gắn VectaShield Antifade (Phòng thí nghiệm Vector).

Tất cả hình ảnh được thu thập bằng Máy quét Olympus VS11 0 với vật kính đơn sắc 20x (khẩu độ số 0,75) với phần mềm máy quét VS110. Tất cả các nhóm điều trị được thể hiện trên mỗi trang chiếu và tất cả hình ảnh trên một trang chiếu được chụp với cùng thời gian phơi sáng trong điều kiện không làm nóng. Cường độ ghi nhãn miễn dịch được định lượng bằng ImageJ bằng cách lấy mẫu mật độ quang học của lớp tế bào trong CA1 và trừ đi một mẫu huỳnh quang nền trong cùng một hình ảnh. Đối với tất cả các thí nghiệm AAV, những động vật không biểu hiện được vi rút trong khu vực CA1 của hồi hải mã lưng đã bị loại khỏi phân tích. Hình ảnh và định lượng lượng được thực hiện bởi các nhà thí nghiệm mù với các điều kiện thí nghiệm.

Phong cách phương Tây. Để xác minh việc hạ gục PER1, chuột siRNA Per1 và chuột siRNA đối chứng được hy sinh 2 giờ sau khi thử nghiệm và não bị đông cứng. Não bộ được cắt thành từng phần và các cú đấm DH 1 mm được thu thập từ 5 lát cắt 0 0 μm. Các quả đấm được đồng nhất trong đệm T-PER (Thermo Fisher) với Halt protease và chất ức chế phosphatase (Thermo Fisher) bằng cách sử dụng bộ đồng nhất Dounce. Protein ly giải được định lượng bằng cách sử dụng xét nghiệm Bradford sửa đổi (BioRad) và 5 0 ug protein lysate tổng số được nạp vào mỗi làn của gel NuPAGE Bis-Tris 7,5% (Thermo Fisher). Gel chạy trong 50 phút ở 200 vôn và các đốm màu được chuyển qua đêm ở 15 V ở 4 độ lên màng nitrocellulose (Novexi, LC2001). Ngày hôm sau, các màng được ủ trong đệm chặn trong 1 giờ (5% sữa không béo trong nước muối đệm Tris với 0,01% Tween 20), rửa sạch (0,1% Tween 20 trong TBS) và sau đó được ủ trong kháng thể chính (1: 500, thỏ anti-Per1, Thermo Fisher #PA 1-524) trong dung dịch đệm kháng thể chính (3 phần trăm BSA trong TBS với 0,1 phần trăm Tween) qua đêm ở 4 độ. Sau đó, các màng này được rửa sạch và ủ trong kháng thể chuột liên hợp HRP với thỏ (1:10, 000, Phòng thí nghiệm Jackson, đặc điểm chuỗi nhẹ, # 211-032-171) trong 1 giờ. Màng được rửa sạch và phát triển bằng cách sử dụng Chất nền hóa phát quang Pierce SuperSignal West Pico (Pierce, 34077). Nhiều lần phơi sáng đã được sử dụng để xác minh độ tuyến tính. Các khối máu được rửa sạch và tước trong 10 m với Bộ đệm tách khối khối Tây Khôi phục (Thermo Fisher # 21059), rửa lại, sau đó được thăm dò lại qua đêm (4 độ) với kháng thể thỏ đối với GAPDH (1: 1000, Công nghệ sinh học Santa Cruz, SC25778 ). Các khối PER1 và GAPDH có chiều dài đầy đủ được thể hiện trong Hình bổ sung 5. Mật độ quang học tương đối được tính toán từ fi lm được quét bằng ImageJ (Viện Y tế Quốc gia Hoa Kỳ) bởi một người thực nghiệm mù các điều kiện thí nghiệm. Tất cả các giá trị đã được chuẩn hóa thành mức biểu thức GAPDH.

qRT-PCR. Mô được thu thập từ các cú đấm DH (mô tả ở trên) và đông lạnh ở -80 độ cho đến khi xử lý. RNA được phân lập bằng cách sử dụng RNeasy Minikit (Qiagen, # 74104) và cDNA được tạo ra bằng cách sử dụng bộ tổng hợp cDNA Transcriptor First Strand (Roche, 04379012001). Mồi và đầu dò được lấy từ Roche Universal ProbeLibrary (Bảng S4) và được sử dụng để ghép kênh trong máy Roche Light-Cycle 480 II (Roche). Tất cả các giá trị đã được chuẩn hóa thành Gapdh. Các phân tích và thống kê được thực hiện bằng cách sử dụng các thuật toán độc quyền của Roche và phần mềm REST 2009 dựa trên phương pháp Pfaf fl52,53.

RNA sequencing. RNA was isolated from dorsal hippocampus punches as described above, using the RNeasy Minikit (Qiagen, 74104). RNA quality was assessed by Bioanalyzer and samples with an RNA integrity number >9 đã được đưa vào phân tích của chúng tôi. Thư viện cDNA cho mỗi nhóm được chuẩn bị theo Hướng dẫn Chuẩn bị Mẫu TruSeq RNA (Illumina). Hai trăm nanogram tổng số nanogram RNA từ mỗi con chuột được tinh chế bằng các hạt từ tính gắn poly-T oligo và phân mảnh nhiệt. Sau đó cDNA sợi đầu tiên và sợi thứ hai được tổng hợp và tinh chế. Sau khi các đầu mút bị cùn, đầu 3 ′ đã được adenyl hóa để ngăn chặn sự nối khuôn trong quá trình thắt bộ chuyển đổi. Đối với mỗi nhóm, một bộ tiếp hợp duy nhất đã được thêm vào các đầu của cDNA và các thư viện được khuếch đại bằng PCR. Chất lượng của thư viện được đánh giá bằng Bioanalyzer và định lượng bằng cách sử dụng qRT-PCR với đường cong chuẩn được chuẩn bị từ thư viện giải trình tự thương mại (Illumina). Các mẫu được ghép lại, với mỗi nhóm hành vi được đại diện trong mỗi ô của bộ trình tự. 10 nM của mỗi thư viện được gộp lại trong bốn thư viện ghép kênh và được giải trình tự trên một thiết bị Illumina HiSeq 2500 trong quá trình giải trình tự 50 bp đọc một lần, do Cơ sở Thông lượng Cao Genomic tại Đại học California, Irvine điều hành. Dữ liệu giải trình tự kết quả cho mỗi thư viện được xử lý sau để tạo ra FastQ fi les. Dữ liệu sau đó được phân kênh và lọc bằng phần mềm Illumina CASAVA 1.8.2 cũng như phần mềm nội bộ. Các lần đọc chất lượng kém (không đạt được các bài kiểm tra chất lượng tiêu chuẩn của Illumina) và các lần đọc đối chứng được căn chỉnh thành công với bộ gen kiểm soát PhiX đã bị loại bỏ khỏi các phân tích. Chất lượng của các trình tự còn lại được đánh giá thêm bằng cách sử dụng điểm chất lượng PHRED được tạo ra trong thời gian thực trong bước gọi cơ sở của quá trình chạy trình tự (Hình bổ sung. 3a).

Sự phù hợp với bộ gen tham chiếu và bộ phiên mã. Các lần đọc từ mỗi thí nghiệm được căn chỉnh riêng biệt với bộ gen tham chiếu và bộ phiên mã tương ứng bằng cách sử dụng các bộ ký hiệu đọc ngắn ELAND v2e (Illumina) và Bowtie24. Các số đọc được căn chỉnh duy nhất bằng cả hai công cụ tới các điểm nối exon hoặc mối nối đã biết với không quá hai điểm không khớp trên bất kỳ đoạn 25 bp nào của bài đọc được đưa vào bảng mã. Các số đọc được căn chỉnh duy nhất, nhưng có hơn hai điểm không khớp trên bất kỳ đoạn 25 bp nào của bài đọc đã bị xóa khỏi phân tích. Tương tự, các lần đọc khớp với một số vị trí trong bộ gen tham chiếu đã bị xóa khỏi phân tích. Tỷ lệ phần trăm số lần đọc được gán cho bộ gen tham chiếu và bộ phiên mã sử dụng giao thức này được báo cáo cho mỗi nhóm sao chép (Hình 3b bổ sung). Điều này dẫn đến trung bình khoảng 30 triệu lượt đọc cho mỗi mẫu.

Để xác minh sự hiện diện của plasmid pLVX và CRISPR-SAM sau khi truyền nội vi rút, chúng tôi đã chạy trình tự RNA trên các mẫu hải mã từ một nhóm con gồm ba động vật cho mỗi nhóm theo hành vi. Vì số lượng tế bào bị nhiễm vi khuẩn lentivirus in vivo quá ít để có thể phát hiện một cách đáng tin cậy sự hiện diện của các bản sao thích hợp bằng cách sử dụng RT-qPCR (Hình bổ sung. 6a, d), chúng tôi đã sử dụng RNA-seq như một phương pháp nhạy hơn để phát hiện sự hiện diện trong số các bảng điểm này. Phiên bản cập nhật của lắp ráp bộ gen và chú thích bộ gen đã được xây dựng bằng cách thêm các trình tự và chú thích của cấu trúc plasmid vào bộ gen chuột mm10 ban đầu và tương ứng với chú thích bộ gen chuột mm10. Sử dụng công cụ căn chỉnh lần đọc TopHat trong Tuxedo Suite54, các lần đọc được ánh xạ tới bộ gen và chỉ những lần truy cập duy nhất đối với bản sao plasmid so với bộ gen tham chiếu chuột nội sinh mới được coi là "lần đọc khớp" với cấu trúc plasmid. Số lần đọc phù hợp đó sau đó được định lượng hóa cho mỗi cấu trúc cho mỗi mẫu.

Sự biểu hiện gen và phân tích khác biệt. Mức độ biểu hiện gen được tính toán trực tiếp từ kết quả điều chỉnh đọc cho mỗi lần lặp lại. Giá trị RPKM tiêu chuẩn55, số lần đọc trên mỗi kilobase của mô hình exon trên một triệu lần đọc được ánh xạ) được trích xuất cho mỗi gen được bao phủ bởi dữ liệu giải trình tự và mỗi bản sao được sử dụng trong nghiên cứu này.

Các phân tích phiên mã khác biệt được thực hiện bằng cách sử dụng Cyber ​​T56,57 trên mỗi cặp nhóm (lồng ngực so với 6 0 m sau khi huấn luyện) để xác định các gen được điều chỉnh tăng hoặc giảm sau OLM. Ngoài những con chuột HDAC3 plus / plus và HDAC3 fl ox / 18- tháng tuổi được huấn luyện cho nghiên cứu hiện tại, dữ liệu trình tự RNA được xử lý giống hệt nhau từ những con chuột hoang dã C57 {{1 0}} tháng tuổi ( homecage và OLM được đào tạo theo cách tương tự như nghiên cứu hiện tại) từ một nghiên cứu trước đây20 được sử dụng cho các phân tích khác biệt. Số lượng động vật (lặp lại sinh học) cho mỗi nhóm là: HDAC trẻ cộng / cộng với HC: 6, HDAC3 trẻ cộng / cộng với OLM: 6, HDAC3 cũ cộng / cộng với HC: 6, HDAC3 cũ cộng / cộng với OLM: 6, Già HDAC3 fl ox / fl ox HC: 8, HDAC3 cũ fl ox / fl ox OLM: 8. Không có bản lặp kỹ thuật nào được sử dụng. Ngưỡng giá trị p được sử dụng để xác định biểu thức vi phân là 0,05 cho tất cả các nhóm. Tỷ lệ phát hiện sai (FDR) được đo bằng giá trị q của Benjamini & Hochberg (BH) được sử dụng để sửa cho nhiều thử nghiệm, với ngưỡng FDR là 0,15. Các bộ gen được điều chỉnh sau khi trải nghiệm (so với lồng tại nhà) cho 3 nhóm này (kiểu dại trẻ, HDAC cộng / cộng già, hoặc HDAC3 fl ox / ox già) được giao nhau để xác định gen chung cho hai hoặc nhiều nhóm. Sự phong phú của mỗi nhóm đối với biểu hiện đặc trưng mô, các thuật ngữ Bản thể học gen58 và các lộ trình KEGG 59,60 được đánh giá bằng cách sử dụng DAVID61, dựa trên các gen biểu hiện khác biệt sau hành vi. Trực quan hóa dữ liệu được thực hiện bằng cách sử dụng "matplotlib" cho python và "ggplot" cho R.

Kết tủa miễn dịch nhiễm sắc thể. ChIP được thực hiện trên các cú đấm DH dựa trên giao thức từ bộ Millipore ChIP 11,12,62. Mô được liên kết chéo với 1 phần trăm formaldehyde (Sigma), được ly giải và tạo âm, và chất nhiễm sắc được kết tủa miễn dịch qua đêm với 2 ul kháng H4K8Ac (Millipore # 17-10099) hoặc 4 ul kháng HDAC3 (Millipore # {{ 13}}) hoặc một lượng tương đương Huyết thanh thỏ bình thường (đối chứng âm tính H4K8Ac, Millipore) hoặc IgG chống chuột (đối chứng âm tính HDAC3, Millipore). Sau khi rửa, chất nhiễm sắc được rửa giải khỏi các hạt và liên kết chéo ngược với sự có mặt của proteinase K trước khi tách cột của DNA. Trình tự mồi cho các trình tự khởi động của mỗi gen được thiết kế bởi chương trình Primer 3 (Bảng S4). Năm ul đầu vào, kháng thể IgG kháng H4K8Ac / kháng HDAC3, hoặc kết tủa miễn dịch IgG kháng thỏ / chuột từ mỗi con vật được kiểm tra hai lần. Để chuẩn hóa dữ liệu ChIP-qPCR, chúng tôi đã sử dụng phương thức nhập phần trăm. Mẫu đầu vào được điều chỉnh thành 100 phần trăm và cả mẫu IP và IgG đều được tính theo phần trăm của đầu vào này bằng công thức 100 * AE ^ (đầu vào đã điều chỉnh - Ct (IP)). Sau đó, sự làm giàu gấp được tính theo tỷ lệ giữa ChIP với IgG trung bình. Đường cong chuẩn trong tấm xác định hiệu suất khuếch đại (AE).

Chuẩn bị và ghi chép lát cắt. Chuột trẻ (khoảng 3- tháng) và chuột già (18- tháng) đã được truyền vi rút theo phương pháp lập thể. Đối với thí nghiệm đầu tiên, chuột HDAC3 plus / plus và HDAC3 fl ox / ox trẻ và già được truyền AAV-CaMKII- Cre song phương vào DH. Đối với thí nghiệm thứ hai, chuột C57 kiểu hoang dã trẻ và già được truyền AAV-HDAC3 (Y298H) vào DH của một bán cầu và kiểm soát AAV-EV vào bán cầu còn lại. Hai tuần sau khi tiêm truyền (để cho phép sự biểu hiện của virus tối ưu) 2, các lát cắt hồi hải mã ngang (320 μm) được đặt trong một buồng ghi giao diện với uid dịch não tủy (31 ± 1 độ) đã được làm nóng trước (124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 1,5 mM MgSO4, 2,5 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 và 10 mM D-glucozơ). Các lát cắt được tưới máu liên tục với tốc độ 1,75–2 ml mỗi phút trong khi bề mặt của các lát tiếp xúc với nhiệt độ ấm, ẩm với 95 phần trăm O2 / 5 phần trăm CO2. Quá trình ghi bắt đầu sau ít nhất 2 giờ ủ.

Điện thế sau synap kích thích trường (fEPSP) được ghi lại từ radiatum tầng CA1b bằng cách sử dụng một pipet thủy tinh đơn (2–3MΩ) tẩm NaCl 2 M. Các xung kích thích (0. 0 5 Hz) được đưa tới các phép chiếu phụ-ủy ban Schaffer bằng cách sử dụng một điện cực kích thích lưỡng cực (dây nichrome xoắn, 65 μm) được đặt trong CA1c. Cường độ dòng điện đã được điều chỉnh để có được 50 phần trăm phản ứng fEPSP tối đa. Sau khi đường cơ sở ổn định được thiết lập, LTP được tạo ra với một nhóm các cụm tự động duy nhất, trong đó mỗi cụm (bốn xung ở tần số 100 Hz) được phân phối cách nhau 200 ms (tức là ở tần sốta). Cường độ kích thích không tăng trong quá trình TBS. Dữ liệu được thu thập và số hóa bởi Hệ thống thu thập dữ liệu thần kinh NAC 2.0 (Theta Burst).

Phân tích thống kê. Các phân tích thống kê được thực hiện như được chỉ ra trong văn bản và truyền thuyết bằng cách sử dụng Prism 6 (GraphPad). Các phương pháp phân tích của chúng tôi dựa trên công việc đã xuất bản trước đây12,2 0, 63,64. Không có phương pháp thống kê nào được sử dụng để xác định trước kích thước mẫu, nhưng kích thước mẫu của chúng tôi tương tự như các kích thước mẫu thường được sử dụng trong lĩnh vực này, bao gồm cả những kích thước đã được báo cáo trong các ấn phẩm trước 12,20,64,65. Phân phối dữ liệu được giả định là bình thường, với phương sai tương tự được quan sát giữa các nhóm, nhưng điều này không được kiểm tra chính thức. Khi một thí nghiệm có hai nhóm để so sánh, các bài kiểm tra t của Sinh viên hai phía được sử dụng. Khi hai yếu tố được so sánh, (chẳng hạn như tuổi và kiểu gen hoặc phiên và nhóm), dữ liệu được phân tích với ANOVA hai chiều, sau đó là nhiều phép so sánh của Sidak sau các bài kiểm tra học. Tất cả các phân tích đều có hai mặt, với giá trị 0,05 được yêu cầu cho dấu hiệu phân tích. Các thanh lỗi trong tất cả các thiết bị đại diện cho SEM. Đối với tất cả các thí nghiệm, các giá trị ± 2SD từ giá trị trung bình của nhóm được coi là giá trị ngoại lệ và bị loại bỏ khỏi các phân tích.

Tính khả dụng của dữ liệu. Dữ liệu hỗ trợ kết luận của nghiên cứu này có sẵn từ tác giả tương ứng theo yêu cầu hợp lý. Dữ liệu giải trình tự RNA đã được gửi vào Omnibus Biểu hiện gen của NCBI và có thể truy cập được thông qua số gia nhập Dòng GEO GSE94832.

Người giới thiệu

1. Deibel, SH, Zelinski, EL, Keeley, RJ, Kovalchuk, O. & McDonald, RJ Những thay đổi biểu sinh ở nhân siêu vùng và hồi hải mã góp phần vào sự suy giảm nhận thức do tuổi tác. Oncotarget 6, 23181–23203 (2015).

2. Nhịp điệu Gerstner, JR & Yin, JC Circadian và hình thành trí nhớ. Nat. Rev. Neurosci. 11, 577–588 (2010).

3. Eckel-Mahan, KL và cộng sự. Dao động tuần hoàn của hoạt động MAPK hồi hải mã và cAmp: ý nghĩa đối với sự bền bỉ của trí nhớ. Nat. Tế bào thần kinh. 11, 1074– 1082 (2008).

4. Chaudhury, D. & Colwell, CS điều chế Circadian về khả năng học tập và trí nhớ ở những con chuột mắc chứng sợ hãi. Behav. Brain Res. 133, 95– 108 (2002).

5. Kondratova, AA & Kondratov, RV Đồng hồ sinh học và bệnh lý của não lão hóa. Nat. Rev. Neurosci. 13, 325–335 (2012).

6. Rawashdeh, O., Jilg, A., Maronde, E., Fahrenkrug, J. & Stehle, JH Period1 kiểm soát quá trình điều biến sinh học của tín hiệu liên quan đến bộ nhớ trong hồi hải mã của chuột bằng cách điều chỉnh quá trình đóng hạt nhân của CREB kinase pP90RSK. J. Hóa chất thần kinh. 138, 731–745 (2016).

7. Penner, MR, Roth, TL, Barnes, CA & Sweatt, JD Một giả thuyết biểu sinh về rối loạn chức năng nhận thức liên quan đến lão hóa. Tế bào thần kinh lão hóa phía trước. 2, 9 (2010).

8. Peleg, S. và cộng sự. Quá trình acetyl hóa histone bị thay đổi có liên quan đến chứng suy giảm trí nhớ phụ thuộc vào tuổi ở chuột. Khoa học 328, 753–756 (2010).

9. Snigdha, S. và cộng sự. Sự ức chế H3K9me3 giúp cải thiện trí nhớ, thúc đẩy sự hình thành cột sống và tăng mức BDNF ở vùng hải mã già. J. Tế bào thần kinh. 36, 3611–3622 (2016).

10. Spiegel, AM, Sewal, AS & Rapp, PR Đóng góp của biểu sinh vào quá trình lão hóa nhận thức: làm xáo trộn nhịp độ tâm trí và tuổi thọ. Tìm hiểu Mem. 21, 569–574 (2014).

11. Malvaez, M. và cộng sự. Chất ức chế chọn lọc HDAC 3- tăng cường sự ngăn chặn hành vi tìm kiếm cocaine một cách dai dẳng. Proc. Natl Acad. Khoa học. Hoa Kỳ 110, 2647–2652 (2013).

12. Kwapis, JL và cộng sự. Sự sợ hãi về bối cảnh và thính giác được điều chỉnh một cách khác biệt bởi hoạt động HDAC3 trong hạt nhân bên và dưới cơ sở của hạch hạnh nhân. Neuropsychopharmacology 42, 1284– 1294 (2017).

13. McQuown, SC và cộng sự. HDAC3 là một chất điều chỉnh tiêu cực quan trọng đối với sự hình thành trí nhớ dài hạn. J. Tế bào thần kinh. 31, 764–774 (2011).

14. Bieszczad, KM và cộng sự. Sự ức chế histone deacetylase thông qua RGFP966 giải phóng phanh đối với độ dẻo của vỏ não cảm giác và thành phố cụ thể của sự hình thành trí nhớ .J. Tế bào thần kinh. 35, 13124– 13132 (2015).

15. Lahm, A. và cộng sự. Làm sáng tỏ hoạt động xúc tác tiềm ẩn của lớp IIa histone deacetylases của động vật có xương sống. Proc. Natl Acad. Khoa học. Hoa Kỳ 104, 17335– 17340 (2007).

16. Sun, Z. và cộng sự. Chức năng không phụ thuộc vào Deacetylase của HDAC3 trong quá trình phiên mã và chuyển hóa đòi hỏi bộ cảm biến lõi của thụ thể hạt nhân. Mol. Ô 52, 769–782 (2013).

17. Alaghband, Y. và cộng sự. Các vai trò riêng biệt đối với miền deacetylase của HDAC3 trong vùng đồi hải mã và vỏ não trung gian trước trán trong việc hình thành và xóa sổ trí nhớ. Neurobiol. Học. Mem. 145, 94– 104 (2017).

18. Nott, A. và cộng sự. Histone deacetylase 3 liên kết với MeCP2 để điều chỉnh FOXO và hành vi xã hội. Nat. Tế bào thần kinh. 19, 1497– 1505 (2016).

19. Norwood, J., Franklin, JM, Sharma, D. & D'Mello, SR Histone deacetylase 3 cần thiết cho sự phát triển não bộ thích hợp. J. Biol. Chèm. 289, 34569–34582 (2014).

20. Vogel-Ciernia, A. và cộng sự. Tiểu đơn vị điều hòa chất nhiễm sắc BAF53b của nơ-ron cần thiết cho sự dẻo dai của khớp thần kinh và trí nhớ. Nat. Tế bào thần kinh. 16, 552–561 (2013).

21. Alberini, CM Các yếu tố phiên mã trong trí nhớ dài hạn và tính dẻo của khớp thần kinh. Physiol. Rev. 89, 121– 145 (2009).

22. Barnes, CA Sức mạnh lâu dài và bộ não lão hóa. Philos. Dịch. R. Soc. Luân Đôn. B 358, 765–772 (2003).

23. Speir, ML và cộng sự. Cơ sở dữ liệu UCSC Genome Browser: Bản cập nhật năm 2016. Axit nucleic Res. 44, D717 – D725 (2016).

24. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M. & Salzberg, SL Sự liên kết nhanh chóng và trí nhớ của các chuỗi DNA ngắn với bộ gen người. Genome Biol. 10, R25 (2009).

25. Rowe, WB và cộng sự. Các phân tích biểu hiện hồi hải mã cho thấy mối liên hệ có chọn lọc của các con đường sinh tủy ngay lập tức, năng lượng thần kinh và gây suy giảm nhận thức ở chuột già. J. Tế bào thần kinh. 27, 3098–3110 (2007).

26. McNulty, SE và cộng sự. Vai trò khác biệt của Nr4a1 và Nr4a2 trong vị trí đối tượng so với bộ nhớ dài hạn nhận dạng đối tượng. Tìm hiểu Mem. 19, 588–592 (2012).

27. Vecsey, CG, Park, AJ, Khatib, N. & Abel, T. Ảnh hưởng của việc thiếu ngủ và lão hóa lên trí nhớ dài hạn và từ xa ở chuột. Tìm hiểu Mem. 22, 197–202 (2015).

28. Rawashdeh, O. và cộng sự. PERIOD1 điều phối nhịp điệu hải mã và xử lý bộ nhớ với ban ngày. Hippocampus 24, 712–723 (2014).

29. Jilg, A. và cộng sự. Động thái thời gian của biểu hiện gen đồng hồ hồi hải mã của chuột hỗ trợ quá trình xử lý bộ nhớ. Hippocampus 20, 377–388 (2010).

30. Các dao động Eckel-Mahan, KL Circadian trong vùng hải mã hỗ trợ sự hình thành và tính bền bỉ của trí nhớ. Mol trước. Tế bào thần kinh. 5, 46 (2012).

31. Guzowski, JF, Setlow, B., Wagner, EK & McGaugh, JL Biểu hiện gen phụ thuộc vào kinh nghiệm ở hồi hải mã chuột sau khi học theo không gian: so sánh các gen ban đầu ngay lập tức Arc, c-fos và zif268. J. Tế bào thần kinh. 21, 5089–5098 (2001).

32. Các cation Kouzarides, T. Chromatin modi và chức năng của chúng. Ô 128, 693–705 (2007).

33. Konermann, S. và cộng sự. Kích hoạt phiên mã quy mô gen bởi phức hợp CRISPR-Cas9 được thiết kế. Nature 517, 583–588 (2015).

34. Sharma, M., Shetty, MS, Arumugam, TV & Sajikumar, S. Sự ức chế histone deacetylase 3 thiết lập lại việc gắn thẻ synap và bắt giữ trong quá trình lão hóa thông qua việc kích hoạt yếu tố hạt nhân kappa B. Sci. Rep. 5, 16616 (2015).

35. Kramar, EA và cộng sự. Bằng chứng tiếp hợp cho khả năng học tập cách nhau. Proc. Natl Acad. Khoa học. Hoa Kỳ 109, 5121–5126 (2012).

36. Barrett, RM và cộng sự. Sự loại bỏ khu trú hồi hải mã của CBP ảnh hưởng đến các mô thức histone cụ thể, tiềm năng dài hạn và trí nhớ dài hạn. Neuropsychopharmacology 36, 1545– 1556 (2011).

37. Franklin, AV, Rusche, JR & McMahon, LL. Neurobiol. Học. Mem. 114, 193– 197 (2014).

38. Silva, AJ, Kogan, JH, Frankland, PW & Kida, S. CREB và trí nhớ. Annu. Rev. Neurosci. 21, 127– 148 (1998).

39. Kida, S. & Serita, T. Vai trò chức năng của CREB như một chất điều hòa tích cực trong việc hình thành và tăng cường trí nhớ. Brain Res. Bò đực. 105, 17–24 (2014).

40. Smith, KT, Nicholls, RD & Reines, D.. Axit nucleic Res. 34, 1205– 1215 (2006).

41. Wang, H. và cộng sự. Vai trò của CREB trong việc điều hòa FMRP bởi các thụ thể glutamate siêu nguyên dưỡng nhóm I trong vỏ não. Mol. Brain 5, 27 (2012).

42. Cermakian, N., Monaco, L., Pando, MP, Dierich, A. & Sassone-Corsi, P. Nhịp điệu hành vi đã thay đổi và biểu hiện gen đồng hồ ở chuột có đột biến mục tiêu ở gen Period1. EMBO J. 20, 3967–3974 (2001).

43. Halder, R. và cộng sự. Sự thay đổi methyl hóa DNA trong các gen dẻo đi kèm với sự hình thành và duy trì trí nhớ. Nat. Tế bào thần kinh. 19, 102– 110 (2016).

44. Duke, CG, Kennedy, AJ, Gavin, CF, Day, JJ & Sweatt, JD Tái tổ chức biểu sinh phụ thuộc vào kinh nghiệm ở vùng hải mã. Tìm hiểu Mem. 24, 278–288 (2017).

45. Sakai, T., Tamura, T., Kitamoto, T. & Kidokoro, Y. Một gen đồng hồ, chu kỳ, đóng một vai trò quan trọng trong việc hình thành trí nhớ dài hạn ở Drosophila. Proc. Natl Acad. Khoa học. Hoa Kỳ 101, 16058– 16063 (2004).

46. ​​Abarca, C., Albrecht, U. & Spanagel, R. Sự nhạy cảm và phần thưởng của cocaine phụ thuộc vào gen và nhịp sinh học. Proc. Natl Acad. Khoa học. Hoa Kỳ 99, 9026–9030 (2002).

47. Phan, TX, Chan, GC, Sindreu, CB, Eckel-Mahan, KL & Storm, DR Sự dao động trong ngày của MAP (protein kích hoạt mitogen) kinase và adenylyl cyclase hoạt động trong hải mã phụ thuộc vào nhân siêu vi. J. Tế bào thần kinh. 31, 10640– 10647 (2011).

48. Vogel-Ciernia, A. & Wood, MA Kiểm tra vị trí đối tượng và bộ nhớ nhận dạng đối tượng ở chuột. Curr. Protoc. Tế bào thần kinh. 69, 1–17 (2014).

49. Orozco-Solis, R. và cộng sự. Đồng hồ sinh học ở vùng dưới đồi não thất kiểm soát việc tiêu thụ năng lượng theo chu kỳ. Siêu thị di động. 23, 467–478 (2016).

50. Eckel-Mahan, K. & Sassone-Corsi, P. Định kiểu nhịp sinh học ở chuột. Curr. Protoc. Chuột Biol. 5, 271–281 (2015).

51. Schnell, SA, Staines, WA & Wessendorf, MW Giảm lượng lipofuscin giống như tự phát huỳnh quang trong mô được dán nhãn trơn. J. Mômen hóa. Cytochem. 47, 719–730 (1999).

52. Pfaf fl, MW Một mô hình toán học mới cho định lượng lượng tử tương đối trong RT-PCR thời gian thực. Axit nucleic Res. 29, e45 (2001).

53. Pfaf fl, MW, Horgan, GW & Demp fl e, L. Công cụ phần mềm biểu thức tương đối (REST) ​​để so sánh nhóm khôn ngoan và phân tích thống kê các kết quả biểu thức tương đối trong PCR thời gian thực. Axit nucleic Res. 30, e36 (2002).

54. Trapnell, C. và cộng sự. Phân tích biểu hiện gen và phiên mã khác biệt trong các thí nghiệm RNA-seq với mực TopHat và Cuf fl. Nat. Protoc. 7, 562–578 (2012).

55. Mortazavi, A., Williams, BA, McCue, K., Schaeffer, L. & Wold, B. Lập bản đồ và định lượng các bản sao mã của động vật có vú bằng RNA-Seq. Nat. Phương pháp 5, 621–628 (2008).

56. Máy chủ web Kayala, MA & Baldi, P. Cyber-T: phân tích khác biệt của dữ liệu thông lượng cao. Axit nucleic Res. 40, W553 – W559 (2012).

57. Baldi, P. & Long, AD Một khuôn khổ Bayesian để phân tích dữ liệu biểu hiện microarray: kiểm tra t chính quy và các suy luận thống kê về những thay đổi gen. Tin sinh học 17, 509–519 (2001).