Phần Ⅰ: Cistanche Tubulosa Phenylethanoid Glycosides gây ra quá trình chết của các tế bào ung thư biểu mô tế bào gan bằng các con đường phụ thuộc vào ty thể và MAPK và tăng cường tác dụng kháng u thông qua kết hợp với Cisplatin

Liên hệ: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Pengfei Yuan, Changshuang Fu, Yi Yang, Aipire Adila, Fangfang Zhou, Xianxian Wei, Weilan Zhang, Jie Lv, Yijie Li, Lijie Xia, Jinyao Li

trừu tượng

Cistanche tubulosalà một loại thảo dược của Trung Quốc và có nhiều chức năng sinh học khác nhau. Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằngCistanche tubulosa phenylethanoid glycoside (CTPG)thể hiện tác dụng chống khối u trên nhiều loại tế bào khối u. Tuy nhiên, tác dụng chống khối u của CTPG đối với tế bào ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) HepG2 và BEL -7404 vẫn còn khó nắm bắt. Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy CTPG ức chế đáng kể sự phát triển của tế bào HepG2 và BEL -7404 thông qua cảm ứng bắt giữ chu kỳ tế bào và quá trình apoptosis, có liên quan đến việc kích hoạt các con đường MAPK được đặc trưng bởi sự phosphoryl hóa có điều hòa của p38, JNK, và ERK1 / 2 và con đường phụ thuộc vào ty thể được đặc trưng bởi sự giảm điện thế màng ty thể. Việc giải phóng cytochrome c và sự phân cắt của caspase -3, -7, -9 và PARP sau đó đã tăng lên nhờ điều trị CTPG. Hơn nữa, CTPG ngăn chặn đáng kể sự di chuyển của HepG2 bằng cách giảm mức độ ma trận metalloproteinase -2 và các yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu. Điều thú vị là CTPG không chỉ tăng cường sự tăng sinh của tế bào lách mà còn làm giảm quá trình chết rụng của tế bào lách do cisplatin gây ra. Trong mô hình chuột có khối u H22, CTPG kết hợp với cisplatin tiếp tục ức chế sự phát triển của tế bào H22 và giảm tác dụng phụ của cisplatin. Kết hợp với nhau, CTPG ức chế sự phát triển của HCC thông qua tác dụng kháng u trực tiếp và tác dụng tăng cường miễn dịch gián tiếp và cải thiện hiệu quả kháng u của cisplatin.

Từ khóa

Cistanche tubulosaphenylethanoid glycoside, apoptosis, con đường MAPK, con đường phụ thuộc vào ty thể, cisplatin, tăng cường miễn dịch.

Giới thiệu

Ung thư gan được dự đoán là bệnh ung thư được chẩn đoán phổ biến thứ sáu và là nguyên nhân gây tử vong do ung thư đứng hàng thứ tư trên toàn thế giới vào năm 2018, với khoảng 841 000 ca mắc mới và 782000 ca tử vong hàng năm ở Đông Nam Á (Mông Cổ, Campuchia và Việt Nam) .1 Ở Trung Quốc, ung thư gan là nguyên nhân gây tử vong do ung thư đứng hàng thứ ba trong năm 2015.2 Hơn 90% trường hợp ung thư gan nguyên phát là ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) trên toàn thế giới. Hiện nay, cắt gan, ghép gan và cắt bỏ qua da là những phương pháp chính để điều trị ung thư biểu mô tế bào gan. Thật không may, những phương pháp điều trị này có hiệu quả đối với 30% bệnh nhân được chẩn đoán ung thư gan sớm, trong khi những bệnh nhân được chẩn đoán ung thư gan giai đoạn muộn (chiếm 40%) phải dựa vào điều trị giảm nhẹ để kéo dài thời gian sống thêm. Hóa trị động mạch là một liệu pháp giảm nhẹ quan trọng và phổ biến đối với hầu hết bệnh nhân mắc ung thư biểu mô tế bào gan giai đoạn cuối ở khu vực Châu Á - Thái Bình Dương.5 Sorafenib, được FDA phê duyệt năm 2006 để điều trị ung thư gan giai đoạn muộn, là một chất ức chế đa kinase giúp ức chế sự tăng sinh tế bào khối u và mạch máu. sản xuất và thúc đẩy quá trình apoptosis của tế bào khối u. Sorafenib kéo dài đáng kể thời gian sống của bệnh nhân từ 3 đến 5 tháng nhưng có tác dụng phụ nghiêm trọng và liên quan chặt chẽ đến sự xuất hiện của kháng thuốc.

Y học cổ truyền Trung Quốc (TCM) một mình hoặc kết hợp với các chiến lược khác đã được sử dụng để điều trị HCC và đã cho thấy những lợi ích lâm sàng bao gồm kéo dài thời gian sống sót, cải thiện chất lượng cuộc sống, giảm phản ứng có hại, v.v.Cistanchelà một TCM có chứa phenylethanoid glycoside (PhGs), iridoids, lignin và polysaccharides có các chức năng sinh học khác nhau, chẳng hạn như chống oxy hóa, chống viêm, chống lão hóa, tăng cường trí nhớ và các chức năng tăng cường miễn dịch. 9 PhG đã được coi là các thành phần hoạt động chính củaCistanchevà có nhiều chức năng bao gồm chống oxy hóa, chống viêm, chống apoptosis, bảo vệ gan và bảo vệ thần kinh. 10-12 Nhóm của chúng tôi đã báo cáo rằngCistanche tubulosa phenylethanoid glycoside(CTPG) có thể ức chế sự phát triển của tế bào u ác tính B 16- F10, tế bào ung thư biểu mô thực quản Eca -109 và tế bào HCC H22 thông qua các con đường tín hiệu bên ngoài hoặc bên trong in vitro hoặc in vivo; ngoài ra, CTPG có tác dụng kích thích miễn dịch. 13-15

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nghiên cứu tác dụng chống khối u và cơ chế của CTPG trên tế bào HepG2 và BEL -7404 trong ống nghiệm, phân tích chức năng điều hòa miễn dịch của CTPG in vitro và in vivo, đồng thời đánh giá thêm hiệu quả điều trị của CTPG kết hợp với hóa trị. thuốc cisplatin trên chuột bị u HCC H22 in vivo. Chúng tôi nhận thấy rằng CTPG có thể ức chế sự phát triển của tế bào HepG2 và BEL -7404 thông qua quá trình apoptosis phụ thuộc vào ty thể và con đường tín hiệu MAPK. CTPG ức chế đáng kể sự di chuyển của các tế bào HepG2 bằng cách giảm mức độ ma trận metalloproteinase -2 (MMP -2) ​​và yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF). Ngoài ra, CTPG thúc đẩy sự tăng sinh và kích hoạt các tế bào miễn dịch và nâng cao khả năng miễn dịch của chuột. Điều quan trọng là, CTPG kết hợp với cisplatin có thể ức chế hơn nữa sự phát triển của tế bào H22 in vivo và giảm tác dụng phụ của cisplatin.

Nguyên liệu và phương pháp

Loài vật

Khoảng 6 đến 8 tuần tuổi BALB / c đực, chuột Côn Minh và chuột cái C57BL / 6 được mua từ Trung tâm Phòng thí nghiệm Động vật, Đại học Y Tân Cương (Urumqi, Tân Cương, Trung Quốc) và được đặt trong một cơ sở động vật của Đại học Tân Cương với nhiệt độ phòng (RT) 25 ± 3 độ và khoảng thời gian sáng-tối 12/12 giờ.

Dòng tế bào và nuôi cấy tế bào

Tế bào H22 của chuột được mua từ Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Vũ Hán, Hồ Bắc, Trung Quốc) và tế bào HCC HepG2 và BEL -7404 của con người được lấy từ Phòng thí nghiệm Trọng điểm Tân Cương về Tài nguyên Sinh vật và Kỹ thuật Di truyền , Đại học Tân Cương (Urumqi, Tân Cương, Trung Quốc) và được nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640 (Gibco, Hoa Kỳ) hoặc môi trường Eagle's đã sửa đổi của Dulbecco (DMEM) (Gibco) chứa 10% huyết thanh bò thai bất hoạt nhiệt (MRC, Trung Quốc), 1% L -glutamine (100mM), 100U / mL penicillin, và 100ug / mL streptomycin ở 37 độ trong môi trường ẩm ướt 5% CO2.

Sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC)

Các hợp chất chính của CTPG (Upbio Tech Co., Ltd., Thượng Hải, Trung Quốc) đã được HPLC đủ điều kiện và định lượng như đã báo cáo trước đây.13 Một cột ZORBAX SB-C18 (25 0 × 4,6mm; 5μm) đã được sử dụng và pha động bao gồm dung dịch axit fomic 0,2% và metanol với độ dốc từ 23% đến 31%. Tổng cộng 10μL mẫu đã được tiêm và phát hiện ở bước sóng 330 nm. Các tiêu chuẩn echinacoside và acteoside (Yuanye, Thượng Hải, Trung Quốc) được sử dụng để phân tích các thành phần của CTPG.

Phân tích khả năng tồn tại của tế bào

Tác dụng chống khối u của CTPG trên tế bào HepG2 và BEL -7404 được đánh giá bằng cách sử dụng MTT (3- (4, 5- dimethyl -2- thiazolyl) -2, {{7 }} điphenyl -2- H-tetrazolium bromua). Tế bào HepG2 và BEL -7404 được mạ thành 96- tấm giếng (5 × 1 0 4 ô / giếng) và được xử lý bằng 0, 2 0 0, CTPG 400 và 600 ug / mL tương ứng trong 24 và 48 giờ sau 24 giờ ủ ở 37 độ. Khoảng 35 ug / mL cisplatin (Yuanye) đã được sử dụng như một đối chứng tích cực. Sau đó, 100 μL MTT (0,5mg / mL, được pha loãng bằng môi trường không có môi trường FBS) được thêm vào mỗi giếng và nuôi cấy trong 3 giờ ở 37 độ và 5% CO2. Sau khi ủ, các đĩa được ly tâm ở tốc độ 1200 vòng / phút trong 7 phút, môi trường được loại bỏ và 200 ug / mL DMSO được thêm vào mỗi giếng để hòa tan các tinh thể formazan đã hình thành. Các giá trị OD490 được đo bằng 96- đầu đọc vi tấm tốt (Phòng thí nghiệm Bio-Rad, CA, Hoa Kỳ). Để đánh giá tác động của CTPG trên tế bào lách, tế bào được phân lập từ chuột C57BL / 6 và được mạ vào 96- đĩa giếng với mật độ 1 × 105 tế bào / giếng. Các tế bào lách được xử lý với 0, 200, 400 và 600 ug / mL tương ứng trong 24, 48 và 72 giờ. Khả năng tồn tại của tế bào được tính theo công thức sau: Khả năng tồn tại của tế bào (phần trăm)=(ODt Xử lý / ODunt Treatment) × 100 phần trăm.

Phát hiện Ki -67

Việc phát hiện Ki {{0}} đã được thực hiện theo nghiên cứu trước đây của chúng tôi.16 Tóm lại, các tế bào BEL -7404 được xử lý với các nồng độ khác nhau (0, 200, 400 và 600ug / mL) CTPG hoặc cisplatin (35ug / mL). Sau 24 giờ, tế bào được thu hoạch và rửa sạch bằng PBS, sau đó được cố định và thẩm thấu bằng Bộ đệm nhuộm Foxp3 (eBioscience, Hoa Kỳ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Quá trình nhuộm nội bào được thực hiện bằng cách sử dụng kháng thể Ki -67 liên hợp FITC (BD Biosciences, San Jose, CA, Hoa Kỳ) trong 15 phút tại RT. Các mẫu được phân tích bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy (BD FACSCalibur, CA, USA).

Phân tích quá trình chết của tế bào và chu kỳ tế bào

Tế bào HepG2 và BEL -7404 được gieo với mật độ 2,5 × 105 tế bào / đĩa và ủ ở 37 độ qua đêm. Tế bào được trypsinized và thu hoạch bằng cách ly tâm sau khi xử lý với các nồng độ CTPG khác nhau hoặc được xử lý trước bằng chất ức chế caspase (Z-VAD-FMK) hoặc caspase -3 in lội tor (Ac-DEVD-CHO) (Beyotime, Trung Quốc) cho 2 giờ trước khi điều trị CTPG. Sau 24 giờ, quá trình apoptosis được phát hiện bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy. Tóm lại, các tế bào thu thập được rửa sạch bằng PBS lạnh (Gibco) và tiếp tục được tiếp tục trong bộ đệm liên kết annexin với 2,5μL Annexin V-FITC và 5μL Dung dịch nhuộm PI-PE (Solarbio, Bắc Kinh, Trung Quốc), và sau đó tế bào được ủ tại RT trong bóng tối trong 15 phút. Để phân tích sự phân bố chu kỳ tế bào, tế bào được thu hoạch sau khi xử lý CTPG và được cố định trong etanol 70% lạnh ở 4 độ trong 30 phút. Tế bào được nhuộm bằng PI (BD Biosciences) trong bóng tối trong 30 phút. Các mẫu được phân tích bằng phương pháp lưu lượng cytom eter (BD FACSCalibur). Mức độ biểu hiện của quá trình apoptosis tế bào và các protein liên quan đến chu kỳ đã được phát hiện bởi Western blot.

Phong cách phương Tây

Western blot đã được thực hiện theo nghiên cứu trước đây của chúng tôi. 17 HCC được điều trị bằng CTPG trong 24 giờ. Sau khi rửa bằng PBS nước đá lạnh hai lần, tất cả các tế bào kết dính và nổi được thu thập và ly giải trong Đệm ly giải RIPA (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) trong 2 0 phút trên đá. Sau khi ly tâm ở 12000 vòng / phút 4 độ trong 10 phút, nồng độ protein được xác định bằng Bộ xét nghiệm axit Bicinchoninic (Thermo Fisher Scientific, Hoa Kỳ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các protein có cùng nồng độ được tách 12% SDS-PAGE và được chuyển sang màng PVDF. Sau khi rửa bằng đệm PBST (PBS với 0,05 phần trăm Tween -20), các màng được chặn bằng sữa không béo 5 phần trăm ở 37 độ trong 1 giờ và sau đó được ủ với các kháng thể chính (Công nghệ Tín hiệu Tế bào, MA, Hoa Kỳ ) ở độ pha loãng thích hợp qua đêm ở 4 độ. Sau khi rửa 3 lần bằng PBST, màng được ủ với kháng thể thứ cấp liên hợp HRP tương ứng (eBioscience) trong 2 giờ ở 37 độ. Các protein đích được phát hiện bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm ECL (Beyotime). Dữ liệu quét thang độ xám được Image J.

Phân tích tiềm năng màng ti thể (Δψm)

Δψm được xác định bằng thuốc nhuộm JC -1 thấm màng (Beyotime). Tóm lại, tế bào HepG2 và BEL -7404 được xử lý với các nồng độ CTPG khác nhau (0, 200, 400 và 600ug / mL) trong 24 giờ. Tất cả các tế bào được thu thập và rửa sạch bằng đệm giặt JC -1. Tế bào được nhuộm bằng đầu dò huỳnh quang JC -1 theo hướng dẫn của nhà sản xuất trong 20 phút ở RT. Sau khi rửa bằng PBS hai lần, tất cả các mẫu được phân tích bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy (BD FACSCalibur).

Hoechst 33342 nhuộm

Quá trình nhuộm Hoechst 33342 được thực hiện theo nghiên cứu trước đây của chúng tôi.16 Sự thay đổi hình thái của nhân được kiểm tra bằng cách sử dụng thuốc nhuộm liên kết DNA thấm qua màng Hoechst 33342 (Beyotime). Tóm lại, các tế bào được cấy vào đĩa 6- giếng ở nồng độ 1 × 105 tế bào / giếng trong môi trường 2mL. Khi đạt đến 70% đến 80% hợp lưu, các tế bào được xử lý với 200, 400 và 600ug / mL CTPG hoặc cisplatin trong 24 giờ. Các tế bào được rửa sạch bằng PBS và cố định bằng 4% paraformaldehyde trong nước đá lạnh ở 4 độ trong 10 phút. Sau khi rửa bằng PBS, các tế bào được nhuộm bằng Hoechst 33342 ở 4 độ trong 10 phút. Các mẫu được quan sát bằng kính hiển vi đảo ngược huỳnh quang (Nikon Eclipse Ti-E, Nhật Bản).

Thử nghiệm di chuyển

Sự di chuyển của tế bào HCC được phát hiện thông qua xét nghiệm chữa lành vết thương. Tóm lại, các tế bào HepG2 (2 × 1 0 4 / giếng) đã được gieo hạt trong một đĩa giếng 24-. Sau khi đạt đến 8 0 phần trăm hợp lưu, tâm của mỗi giếng bị xước một lần bằng đầu pipet 20μL. Sau khi rửa bằng PBS, các tế bào được xử lý bằng cisplatin (35ug / mL) hoặc các nồng độ khác nhau (0, 200, 400 và 600ug / mL) CTPG ở 37 độ. Sau 24 giờ, hình ảnh của mỗi mẫu được chụp dưới kính hiển vi (Nikon Eclipse Ti-E). Khoảng cách di chuyển tế bào trung bình được phân tích bằng Hình ảnh J. Tỷ lệ chữa lành vết thương được tính theo phương trình: chữa lành vết thương (phần trăm)=(1-diện tích vết xước tại thời điểm được chỉ định / diện tích vết xước tại 0 giờ) × 100 phần trăm . Mức độ biểu hiện của các protein liên quan đến di chuyển tế bào MMP -2 và VEGF đã được phát hiện bởi Western blot.

Tăng sinh và apoptosis của Splenocytes

Để phân tích sự tăng sinh, tế bào lách được phân lập từ 3 con chuột C57BL / 6 và nhuộm bằng CFSE (eBioscience). Các tế bào được đánh dấu CFSE được cấy vào 24- đĩa giếng với mật độ 2 × 106 tế bào trong môi trường 1 mL cho mỗi giếng và được xử lý với các nồng độ CTPG khác nhau (200, 400 và 600 ug / mL) hoặc kết hợp với 35 ug / mL cisplatin trong 72 giờ. Phân tích lưu lượng tế bào được thực hiện sau khi nhuộm bằng CD 3- APC và CD 19- PE (BD Biosciences). Để phân tích quá trình apoptosis, tế bào lách được cấy vào 24- đĩa giếng với mật độ 2 × 106 tế bào trong môi trường 1 mL cho mỗi giếng và được xử lý với các nồng độ CTPG khác nhau (200, 400 và 600 ug / mL) hoặc kết hợp với cisplatin trong 24 giờ. Phân tích lưu lượng tế bào được thực hiện sau khi nhuộm với 2,5 μL Annexin V-FITC và 5 μL PI-PE Solution.

Đánh giá an toàn và các hoạt động kích thích miễn dịch của CTPG In Vivo

Để đánh giá các hoạt động kích thích miễn dịch in vivo của CTPG, chuột Côn Minh đực từ 6 đến 8 tuần được chia ngẫu nhiên thành 7 nhóm (5 chuột / nhóm). Tiêm dưới da (sc, 200, 400 mg / kg), tiêm trong phúc mạc (ip, 200, 400 mg / kg), và tiêm trong dạ dày (ig, 200, 400 mg / kg) được áp dụng 2 ngày một lần tổng cộng 7 lần , trong khi nhóm đối chứng không nhận được bất kỳ sự điều trị nào. Những con chuột đã được cân mỗi ngày và tình trạng của những con chuột được quan sát hàng ngày. Sau khi điều trị bằng CTPG, nội tạng của những con chuột được tách ra và cân. Chỉ số nội tạng được tính theo công thức: chỉ số nội tạng=trọng lượng nội tạng (mg) / trọng lượng cơ thể (g). Các tế bào lách được thu thập, đếm và nhuộm bằng anti-CD 3- APC, anti-CD 19- PE, anti-CD49b FITC hoặc anti-CD 4- APC, anti-CD {{ 22}} PE, chống CD 8- FITC (BD Biosciences). Các mẫu được phát hiện bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy (BD FACSCalibur).

Hiệu quả chống khối u của CTPG kết hợp với Cisplatin trong Chuột mang khối u H22

Những con chuột đực BALB / c khoảng 6 đến 8 tuần tuổi được tiêm dưới da các tế bào H22 (1. 0 × 106 cho mỗi con chuột trong 100 μL PBS). Khi thể tích khối u đạt khoảng 60mm3, những con chuột mang khối u được chia ngẫu nhiên thành 4 nhóm (6 chuột / nhóm) và được điều trị bằng cisplatin (4mg / kg), CTPG (400mg / kg), cisplatin (4mg / kg) cộng với CTPG ( 400mg / kg), hoặc không cần điều trị (nhóm chứng), tương ứng. Những con chuột có khối u được tiêm CTPG trong phúc mạc lần lượt vào các ngày thứ 5, 7, 9, 11 và 13. Cisplatin được tiêm tĩnh mạch vào ngày thứ 7 và 11. Thể tích khối u và trọng lượng cơ thể được đo cách ngày. Thể tích khối u được tính như sau: Thể tích khối u (V)=a × b2 / 2, trong đó a và b đại diện cho đường kính dài nhất và ngắn nhất của khối u được đo bằng thước cặp vernier, tương ứng. Vào ngày thứ 20, các cơ quan và khối u đã được phân lập và cân. Các tế bào lách được thu thập, đếm và nhuộm bằng chất chống CD 3- APC và anti-CD 19- PE hoặc anti-CD 4- FITC và anti-CD 8- APC hoặc anti-CD11b-PE và anti-Gr -1- APC hoặc anti-CD 4- FITC, anti-CD 25- APC và anti-Foxp 3- PE (BD Biosciences) . Sau đó, tần số và số lượng tế bào được phân tích bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy (BD FACSCalibur).

Phân tích thống kê

Tất cả dữ liệu được biểu thị dưới dạng sai số trung bình ± chuẩn của giá trị trung bình (SEM). Phân tích thống kê được thực hiện bằng cách sử dụng phân tích phương sai một / hai chiều (ANOVA) bằng phần mềm Prism5. 0. P<.05 was="" considered="" statistically="">

Kết quả

CTPG ngăn chặn sự phát triển của tế bào HCC trong ống nghiệm

Các thành phần của CTPG đã được HPLC kiểm định và định lượng bằng cách sử dụng các tiêu chuẩn echinacoside và acteoside (Hình 1A bổ sung), là các thành phần chính của phenylethanoid glycoside từ Cistanche. 18 Theo thời gian lưu giữ đỉnh và diện tích đỉnh, CTPG chứa 28% echinacoside và 9,9% acteoside. Bên cạnh đó, hàm lượng polysaccharid trong CTPG là 34,8% theo phương pháp axit phenol-sulfuric.19 Thử nghiệm MTT cho thấy CTPG làm giảm đáng kể khả năng tồn tại của các tế bào BEL -7404 và HepG2 theo cách phụ thuộc vào liều lượng và thời gian ( Hình 1A). Nhất quán, sự tăng sinh của các tế bào BEL -7404 bị ức chế đáng kể khi xử lý CTPG, được phân tích bằng phương pháp nhuộm Ki -67 (Hình 1B). Ảnh hưởng của CTPG đến sự tăng sinh của tế bào lách trong ống nghiệm cũng được phân tích bằng xét nghiệm MTT. Chúng tôi quan sát thấy rằng CTPG tăng cường sự gia tăng của tế bào lách một cách phụ thuộc vào liều lượng (Hình 1C).

Con đường tín hiệu protein kinase được kích hoạt bởi mitogen (MAPK) đóng một vai trò quan trọng trong sự tồn tại, biệt hóa và kháng thuốc của các tế bào ung thư ở người. của tế bào HCC, mức độ phosphoryl hóa của các protein khác nhau từ con đường tín hiệu MAPK được phân tích trong tế bào HepG2 sau khi điều trị bằng CTPG ở các nồng độ khác nhau và các mốc thời gian khác nhau. Sự phosphoryl hóa của JNK (P-JNK) và p38 (P-p38) được tăng cường tùy thuộc vào liều lượng bằng cách xử lý CTPG. Quá trình phosphoryl hóa ERK (P-ERK) được điều chỉnh giảm khi xử lý CTPG 200 và 400ug / mL, trong khi P-ERK được điều chỉnh tăng trong điều trị CTPG 600ug / mL (Hình 1D). Hơn nữa, các mức P-JNK, P-p38 và P-ERK được điều chỉnh theo cách phụ thuộc vào thời gian (Hình 1D). Những kết quả này gợi ý rằng CTPG có thể ức chế sự gia tăng của tế bào HCC thông qua con đường tín hiệu MAPK

Bắt giữ chu kỳ tế bào HCC gây ra CTPG ở pha S

Chúng tôi đã phân tích thêm liệu CTPG có ức chế sự tăng sinh tế bào HCC thông qua cảm ứng bắt giữ chu kỳ tế bào hay không. Sau khi điều trị bằng CTPG, sự tích tụ của các tế bào BEL -7404 ở pha S được quan sát theo cách phụ thuộc vào liều lượng. Tương tự, CTPG cũng gây ra bắt giữ chu kỳ tế bào HepG2 ở pha S và tần số tăng từ 40,66% ở nhóm chứng lên 61,90% ở nhóm được điều trị CTPG 600ug / mL (Hình 2A). Cyclin và các kinase phụ thuộc cyclin (CDK) đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát và phát triển phân chia tế bào, 21 trong số đó có liên quan đến giai đoạn G2 / M.22 Mức độ biểu hiện của Cyclin D1 giảm phụ thuộc vào liều lượng khi điều trị CTPG nhưng thúc đẩy G1 lên Diễn biến pha S. Mức độ biểu hiện của Cyclin B1, CDK1 và CDK2 cũng bị giảm; các protein này được liên kết với pha G2 / M (Hình 2B). Những kết quả này cho thấy CTPG ngăn chặn sự tăng sinh tế bào HCC bằng cách gây ra sự bắt giữ chu kỳ tế bào.

CTPG Con đường tự chết phụ thuộc vào ty thể được kích hoạt trong tế bào HCC

Chúng tôi cũng phát hiện liệu CTPG có gây ra quá trình chết rụng ở các tế bào HCC hay không và nhận thấy rằng CTPG gây ra quá trình tự chết ở các tế bào HepG2 và BEL -7404 theo cách phụ thuộc vào liều lượng (Hình 3A). Ngoài ra, mức độ biểu hiện của Bax và Bcl -2 được tăng và giảm khi điều trị CTPG phụ thuộc vào liều lượng, tương ứng (Hình 3B). Quá trình apoptosis của tế bào HepG2 được xác định thêm bằng phương pháp nhuộm Hoechst 33342 sau khi điều trị bằng CTPG trong 24 giờ. Hình thái hạt nhân được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang ngược. Như trong Hình 3C, các tế bào HepG2 đối chứng được nhuộm màu đồng nhất trong khi các tế bào HepG2 được xử lý bằng CTPG cho thấy sự ngưng tụ và phân mảnh nhiễm sắc theo cách phụ thuộc vào liều lượng, tương tự như các tế bào HepG2 được điều trị bằng cisplatin. Những kết quả này chỉ ra rằng CTPG gây ra quá trình apoptosis của các tế bào HCC.

Tính toàn vẹn của màng ngoài ty thể được điều chỉnh chặt chẽ bởi họ Bcl -2 và sự giảm Δψm thúc đẩy sự giải phóng cytochrome c kích hoạt dòng thác caspase để tạo ra quá trình apoptosis.23,24 Khi Δψm giảm, JC {{ 3}} polyme (huỳnh quang đỏ) phân hủy thành monome (huỳnh quang xanh lục) .25 Do đó, Δψm của tế bào HCC được phát hiện bằng phương pháp nhuộm JC -1 sau khi xử lý CTPG trong 24 giờ. Như thể hiện trong Hình 4A, cường độ phát huỳnh quang màu xanh lục của kênh FL -1 được tăng lên tùy thuộc vào liều lượng khi xử lý CTPG trong khi cường độ huỳnh quang đỏ của kênh FL -2 được giảm phụ thuộc vào liều lượng ở cả hai Tế bào BEL -7404 và HepG2. Quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang ngược cho kết quả tương tự (Hình 4B), cho thấy CTPG làm giảm Δψm của tế bào HCC. Sau đó, chúng tôi quan sát thấy rằng mức độ cytochrome c đã tăng lên ở cả tế bào BEL -7404 và tế bào HepG2 sau khi điều trị bằng CTPG (Hình 4C), điều này càng khẳng định sự giảm Δψm trong các tế bào HCC được điều trị bằng CTPG.

Việc giải phóng cytochrome c có thể kích hoạt caspase khởi động -9 để gây ra quá trình chết rụng.26 Kết quả của xét nghiệm Western blot cho thấy rằng các mức caspase phân cắt -3, -7 và {{4} } được tăng lên trong khi mức caspase phân cắt -8 không bị thay đổi (Hình 5). Caspase được kích hoạt -3 có thể phân cắt enzyme sửa chữa DNA của poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) để ngăn chặn quá trình sửa chữa DNA và tích lũy tổn thương DNA.27 Chúng tôi cũng quan sát thấy mức độ PARP bị phân cắt được điều chỉnh cao hơn. Vai trò của dòng caspase trong quá trình chết rụng tế bào HCC do CTPG gây ra đã được xác định thêm bằng cách sử dụng chất ức chế caspase (Z-VAD-FMK) và chất ức chế caspase -3 (Ac-DEVD-CHO) tương ứng. Z-VAD-FMK đã đảo ngược đáng kể quá trình apoptosis của tế bào BEL -7404 và HepG2 do CTPG gây ra (Hình 1B bổ sung). Tương tự, Ac-DEVD-CHO cũng đảo ngược đáng kể quá trình apoptosis của tế bào HepG2 do CTPG gây ra (Hình 1C bổ sung). Kết quả chứng minh rằng CTPG gây ra quá trình apoptosis của tế bào HCC bằng con đường phụ thuộc vào ty thể.

CTPG bị ức chế di chuyển tế bào HCC trong ống nghiệm

Sự di chuyển của tế bào ung thư được coi là một trong những quá trình quan trọng trong quá trình di căn của khối u. Để xác định liệu CTPG có ảnh hưởng đến sự di chuyển của tế bào HCC hay không, hoạt động của tế bào HepG2 đã được đánh giá bằng xét nghiệm làm lành vết thương. Như thể hiện trong Hình 6A và B, sự di chuyển của tế bào HepG2 bị ức chế đáng kể khi điều trị bằng CTPG phụ thuộc vào liều lượng. Họ MMP và VEGF đóng vai trò quan trọng trong sự di chuyển của các tế bào khối u.28 Sau khi điều trị CTPG trong 24 giờ, mức MMP -2 và VEGF đã giảm đáng kể (Hình 6C), cho thấy rằng CTPG có thể ngăn chặn sự xâm lấn và di căn của HCC.

CTPG tăng cường khả năng miễn dịch của chuột

Người ta đã báo cáo rằng polysaccharides Cistanche Desticola có chức năng điều hòa miễn dịch bao gồm thúc đẩy tăng sinh tế bào lympho và kích hoạt đại thực bào. 29 Tế bào T và tế bào B là tế bào lympho chính, tương ứng làm trung gian cho các phản ứng miễn dịch tế bào và dịch thể. CTPG chứa 34,8% hàm lượng polysaccharide. Do đó, chúng tôi đã kiểm tra tác động của CTPG đối với sự tăng sinh của tế bào T và tế bào B. Như được thể hiện trong Hình 2A Bổ sung, CTPG làm tăng đáng kể sự tăng sinh của tế bào T và tế bào B theo cách phụ thuộc vào liều lượng, ngay cả khi có mặt cisplatin. Điều thú vị là CTPG ức chế đáng kể quá trình chết rụng của tế bào lách do cisplatin gây ra (Hình 2B bổ sung), cho thấy CTPG có thể cải thiện tác dụng phụ của cisplatin trên hệ thống miễn dịch của chuột.

Tiếp tục đọc, đến phần Ⅱ ...