PHẦNⅠ: Ảnh hưởng và cơ chế phân tử của axit pachymic đối với chấn thương do tái tưới máu do thiếu máu cục bộ ở thận
Mar 25, 2022
Tiếp xúc:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
GUI-PING JIANG, YUE-JUANLIAO, L-LI HUANG, XU-JIAZENG & XIAO-HUI LIAO
Giới thiệu
Chấn thương thận cấp tính (AKI)là một bệnh thường gặp trên lâm sàng do nhiều căn nguyên gây ra và có quá trình sinh lý bệnh phức tạp (1). Tỷ lệ mắc và tử vong do AKI cao ở người lớn và trẻ em, do đó, dẫn đến chi phí nhập viện đáng kể (2,3). Một phân tích tổng hợp về tỷ lệ toàn cầu của AKI Tỷ lệ mắc AKI đã cải thiện là 21,6% ở người lớn và 33,7% ở trẻ em và tỷ lệ tử vong liên quan đến AKI là 23,9% ở người lớn và 13,8% ở trẻ em (4). AKI xảy ra ở ~ 20 phần trăm bệnh nhân nhập viện, 10 phần trăm trong số đó cần điều trị thay thế thận, và tới 50 phần trăm bệnh nhân trong các đơn vị chăm sóc đặc biệt, do đó làm tăng đáng kể thời gian và chi phí nhập viện (5). giảm mạnh mức lọc cầu thận trong thời gian ngắn, kèm theo tăng creatinin huyết thanh, thiểu niệu hoặc cả hai; những thay đổi này có thể dẫn đến bệnh thận mãn tính hoặc bệnh thận giai đoạn cuối (6). Do sự biến đổi của tổn thương thận, thiếu các dấu ấn sinh học ban đầu đáng tin cậy và sự không đồng nhất của các con đường liên quan đến sinh lý bệnh, hiện nay không có phương pháp phòng ngừa và can thiệp hiệu quả nào ngoại trừ điều trị bảo tồn và liệu pháp thay thế thận (7). Do đó, việc xác định các phác đồ điều trị mới và các loại thuốc cho AKI là đặc biệt quan trọng. Thập kỷ qua đã chứng kiến nhiều nghiên cứu mở rộng quan điểm truyền thống về hoại tử. Nghiên cứu gần đây đã thách thức các quan điểm truyền thống về sự chết của tế bào bằng cách xác định các con đường mới trong đó tế bào chết theo cách có quy định, nhưng biểu hiện các đặc điểm hình thái của hoại tử (7-9). Hoại tử được điều chỉnh này có một số dạng: hoại tử, hoại tử ferroptosis, pyroptosis, hoại tử chuyển tiếp theo hướng thẩm thấu của ty thể, và parthanatos (10). Nhiễm trùng hoại tử và nhiễm trùng ferroptosis là những dạng hoại tử được nghiên cứu nhiều nhất xảy ra ở thận (11). Một nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng ức chế ferroptosis cải thiện hiệu quả AKI (12).
cistanche pharma đặc biệtvìquả thận
Ferroptosis là một kiểu chết tế bào điều hòa mới, được Dixon và cộng sự đề xuất lần đầu tiên vào năm 2012 (13). Loại tế bào chết này phụ thuộc vào sắt và đi kèm với sự tích tụ nhiều sắt và quá trình peroxy hóa lipid trong quá trình chết của tế bào (13). Ferroptosis đóng một vai trò điều tiết quan trọng trong sự xuất hiện và phát triển của một số bệnh, bao gồm khối u, bệnh thần kinh và AKI (14). Trong một nghiên cứu in vivo, ferrostatin 1 hoặc 16-86 đã được sử dụng 15 phút trước khi thiếu máu cục bộ ở chuột bị dữ dộichấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu(IRI) -AKI, và tổn thương mô thận, creatinine huyết thanh và urê đều giảm ở chuột 48 giờ sau khi thiếu máu cục bộ, do đó, cho thấy rằng ferroptosis có một vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của IRI (chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu) (15). Do đó, điều chỉnh cân bằng nội môi của sắt, chống lại quá trình peroxy hóa lipid và ức chế quá trình ferroptosis có thể cung cấp một chiến lược điều trị đầy hứa hẹn cho AKI.
Axit pachydermic(PA), một triterpenoid loại lanostane từ Poria cocos, có một số tác dụng dược lý, chẳng hạn như chống khối u, chống viêm, chống oxy hóa, hạ đường huyết, an thần và các hoạt động thôi miên (16-20). Một nghiên cứu trước đây đã báo cáo rằng PA(Axit pachymic)có thể cải thiện tình trạng tổn thương thận trong quá trình nhiễm trùng huyết ở chuột bằng cách ức chế các phản ứng viêm và kích hoạt các yếu tố hạt nhân có nguồn gốc từ erythroid 2 như con đường 2 (NRF2) / heme oxygenase 1 (HO -1) thông qua stress chống oxy hóa (21). Ngoài ra, axit Poricoic A tăng cường hiệu quả sự ức chế melatonin trong quá trình chuyển đổi từ bệnh thận mạn tính sang bệnh thận mạn tính sau thiếu máu cục bộ thận / chấn thương tái tưới máu (22). PA(Axit pachymic)bảo vệ chống lại AKI, tuy nhiên, cơ chế bảo vệ này vẫn đang được nghiên cứu thêm. PA(Axit pachymic)đã được báo cáo là kích hoạt NRF2in trong một nghiên cứu về tổn thương thận trong nhiễm trùng huyết (21). Đáng chú ý, hai tác nhân gây cảm ứng ferroptosis đầu tiên (RSL -3 và elastin) được xác định trong các nghiên cứu về bệnh ferroptosis bắt đầu chuỗi ferroptosis thông qua ức chế glutathione peroxidase 4 (GPX4) và hệ thống vận chuyển cystine / glutamate (xC- / xCT), tương ứng, cả hai đều là mục tiêu hạ nguồn của NRF2 (23). PA(Axit pachymic)được giả định để điều chỉnh các protein hạ lưu của nó, GPX4 và xCT bằng cách kích hoạt NRF2 và can thiệp vào quá trình ferroptosis trong AKI. Nghiên cứu này nhằm mục đích điều tra tác động của PA(Axit pachymic)về bệnh ferroptosis ở chuột bị chấn thương thận do thiếu máu cục bộ tái tưới máu và xác định cơ chế hoạt động phân tử cơ bản của nó để cung cấp những ý tưởng mới cho việc điều trị AKI lâm sàng.
Nguyên liệu và phương pháp
Thuốc thử và động vật.
PA(Axit pachymic)(bột kết tinh màu trắng có độ tinh khiết Lớn hơn hoặc bằng 99,9 phần trăm) được mua từ MedChemExpress (cat.no.HY-N0371) và được bảo quản tránh ánh sáng ở 4C. Tổng cộng 30 con chuột đực C57BL / 6 (8-10 tuần; 20-25 g trọng lượng cơ thể) đã được mua từ Đại học Y Trùng Khánh (Trùng Khánh, Trung Quốc). Các điều kiện nhà ở như sau: 12 giờ sáng / 12 giờ tối, độ ẩm ~ 60 phần trăm, 25 độ, được tiếp cận miễn phí với nước uống và thức ăn, và thay bộ đồ giường 3 ngày một lần; nước uống và vật liệu lót chuồng đã được khử trùng trước khi sử dụng. Tất cả các thí nghiệm trên động vật được thực hiện theo Hướng dẫn Chăm sóc và Sử dụng Động vật Phòng thí nghiệm, do Viện Y tế Quốc gia ban hành năm 1996 (24). Nghiên cứu hiện tại đã được Ủy ban Tổ chức Chăm sóc và Sử dụng Động vật của Đại học Y Trùng Khánh (Trùng Khánh, Trung Quốc; phê duyệt số 2018-019).
Tổn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu-Kiểu mẫu.
Những con chuột được cho ăn trong điều kiện tương tự trong 1 tuần để tạo ra mô hình thậnchấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu, như đã mô tả trước đây (25). Những con chuột được gây mê bằng 50-60 mg / kg pentobarbital natri (cat.no. P3761; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) bằng cách tiêm trong phúc mạc; da tại khu vực phẫu thuật được lau bằng cồn 7 0 phần trăm. Vết rạch được định vị ở hai bên trái và phải của cột sống (0. 5 cm), và chiều dài vết rạch là 1-1. 5 cm dọc theo lưng. Thận sau đó được kéo ra khỏi vết mổ để lộ cuống thận. Một chiếc kẹp vi mạch được sử dụng để kẹp cuống phổi để chặn dòng máu đến thận và gây thiếu máu cục bộ ở thận. Thiếu máu cục bộ hoàn toàn được biểu hiện bằng sự thay đổi màu sắc của thận từ đỏ sang tím sẫm trong vòng vài giây. Sau 40 phút thiếu máu cục bộ, các đoạn vi mạch được phát hành để cho phép mỗi quả thận bắt đầu tái tưới máu, được biểu thị bằng sự thay đổi màu sắc của thận thành màu đỏ. Da cơ được khâu lại sau khi thận màu trở lại bình thường. Toàn bộ quy trình điều trị thiếu máu cục bộ ở thận được hoàn thành trên một miếng đệm ổn định nhiệt và nhiệt độ cơ thể của những con chuột được giữ cố định ở 36. 5-37 độ. Tổng cộng 0,8 ml nước muối vô trùng ấm đã được dùng trong màng bụng cho mỗi con chuột. Mỗi con vật được đặt trên một tấm đệm sưởi cho đến khi nó tỉnh lại hoàn toàn và sau đó được đưa trở lại lồng của nó. Những con chuột được hy sinh bằng cách tách cổ tử cung 24 giờ sau khi phẫu thuật, và máu được lấy từ xoang quỹ đạo. Một phần ba mô thận được sử dụng để phân tích mô bệnh học và hai phần ba còn lại được lưu trữ nhanh chóng ở -80 độ.
Các nhóm động vật.
Chuột C57BL / 6 được chia thành năm nhóm (n =6 / nhóm) theo một bảng số ngẫu nhiên, như sau: Nhóm Sham (Sham), nhóm kiểu mẫu (IRI), nhóm liều thấp (IRI cộng với PA)) , nhóm liều vừa phải (IRI cộng với PAw), và nhóm liều cao (IRI cộng với PAg). Động vật trong ba nhóm điều trị thử nghiệm được tiêm vào màng bụng với PA(Axit pachymic)với liều lượng 5, 10 và 20 mg / kg. nhưng trong 3 ngày, trước khi mô hình được cảm ứng. The sham và IRI(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu) các nhóm được tiêm cùng một khối lượng dimethyl sulfoxide trong 3 ngày trước khi khởi động mô hình. Phương pháp mô hình hóa được thực hiện như đã mô tả trước đây (25). Các cuống thận hai bên của những con chuột trong nhóm giả mạo được tiếp xúc và xử lý như đã nói ở trên, nhưng không được kẹp lại. Vết mổ được khâu lại sau 40 phút.
Phân tích sinh hóa huyết thanh.
Những con chuột bị hy sinh 24 giờ sau phẫu thuật và 0. {3}} ml máu được thu thập từ xoang quỹ đạo, để yên trong 30 phút và được ly tâm ở 900xg trong 10 phút ở 4C. Lớp huyết thanh trên được thu thập, đóng gói và bảo quản ở -80 độ. Creatinine huyết thanh (Scr; cat.no.c 011-2-1) và nitơ urê máu (BUN: cat.no.cO 13-2-1) được đánh giá bằng cách sử dụng bộ thuốc thử, theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Viện Kỹ thuật Sinh học Nam Kinh Jiancheng ).
Kiểm tra mô bệnh học.
Tại 24 giờ sau IRI(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu), các phần của mô thận được cố định trong 10% formalin đệm trung tính trong 24-48 giờ ở nhiệt độ phòng, được xử lý thường quy bằng cách nhúng vào parafin. Các mẫu mô cố định bằng parafin được cắt thành các đoạn dày 4 μm, được gắn trên lam kính và nhuộm bằng hematoxylin trong 10 phút ở nhiệt độ phòng và eosin trong 3 phút ở nhiệt độ phòng. Một kính hiển vi ánh sáng BX51 (Olympus Corporation) đã được sử dụng để phát hiện những thay đổi mô bệnh học thận (độ phóng đại, x200 và x400). Điểm Paller được sử dụng để phân loại tình trạng hoại tử ống thận trong IRI thận(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu)(26). Tổng cộng 10 khu vực không chồng chéo được chọn ngẫu nhiên dưới độ phóng đại cao bằng kính hiển vi ánh sáng quang học (độ phóng đại, x400), và 10 ống thận được chọn ngẫu nhiên trong mỗi trường nhìn. Các phần bệnh lý thận của ba con chuột trong mỗi nhóm thí nghiệm được chọn ngẫu nhiên để quan sát. Tổng cộng có 10 trường hình ảnh được chọn ngẫu nhiên cho mỗi phần bệnh lý, và 10 ống thận được cho điểm trong mỗi trường hình ảnh. Tổng số 100 ống thận được quan sát cho mỗi con chuột, cho tổng số 300 ống thận được quan sát thấy trong mỗi nhóm. Điểm càng cao thì mức độ tổn thương của ống thận càng nghiêm trọng.
Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM).
Mô thận được thu thập 24 giờ sau phẫu thuật. Sau khi gây mê, 1 mm² mô thượng thận được loại bỏ trong cơ thể và ngâm trong dung dịch cố định mô bao gồm 2,5% glutaraldehyde và dung dịch đệm axit photphoric (cat.no.G7776; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) trong 2 giờ ở 4 độ, mất nước trong ethanol dần dần (50-100 phần trăm) và propylene oxide, nhúng trong Epon 812 (cat. no. GP18 {{2 0}} 10; Bejing Zhongjingkeyi Technology Co.Ltd. trong 1 giờ ở 35 độ và đông đặc trong 24 giờ ở 60 độ. Các phần siêu mỏng (độ dày, 50-70 nm) được đặt lên lưới đồng 200- và được nhuộm bằng 2% uranyl axetat trong 30 phút ở nhiệt độ phòng và 0,04% chì citrat trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Các mẫu được xem dưới kính hiển vi điện tử (JEM -1400 cộng, Công ty TNHH Phòng thí nghiệm Quang học Điện tử Nhật Bản; độ phóng đại, x5, 000 và x10, {{27} }). Hình ảnh thu được bằng máy ảnh thiết bị tích hợp sạc SlowScan và phần mềm TEM analySIS5.0 (Olympus Soft Imaging Solutions GmbH).
Phát hiện glutathione chống oxy hóa (GSH) và peroxy hóa lipid malondialdehyde (MDA).
Mô thận (50-100 mg) được thu thập và dung dịch nước muối sinh lý (cat.no. B020; Viện Kỹ thuật Sinh học Nam Kinh Jiancheng) được thêm vào mô theo tỷ lệ 1: 9 trọng lượng (g): thể tích (ml). Mô được đồng nhất, để tạo ra 10% mô đồng nhất, được ly tâm ở 13.800 xg trong 15 phút ở 4 độ. Phần nổi phía trên được loại bỏ và tổng hàm lượng protein của phần nổi phía trên được xác định bằng phương pháp axit bicinchoninic (21). GSH (cat.no.A 006-2-1) và MDA (cat.no.A 003-2-2) được đánh giá bằng cách sử dụng bộ thuốc thử, theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Viện Kỹ thuật Sinh học Nam Kinh Jiancheng).
Thấm tây.
Tổng số protein được chiết xuất từ các mô thận của chuột bằng cách sử dụng đệm ly giải tế bào RIPA (cat. No. WO {{0}}; Viện kỹ thuật sinh học Nam Kinh Jiancheng) và nồng độ protein được xác định thông qua xét nghiệm BCA (cat.no. A { {1}}; Viện Kỹ thuật Sinh học Nam Kinh Jiancheng）. Lượng protein tương đương （5 0 μug） được phân tách qua SDS-PAGE (Cox -2, 1 0. 0 ; NRF2,1 0. 0; xCT, 12,5; HO -1, 12,5; GPx4,15,0 phần trăm) và được chuyển sang màng PVDF (GE Healthcare Life Sciences). Các màng này sau đó đã bị chặn với 5 phần trăm sữa bột tách kem trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng và được ủ với các kháng thể chính chống lại các chất sau: Cyclooxygenase 2 (COX -2; 1: 1, 000; cat. no.ab179800; Abcam), GPX4 ( 1: 5, 000; cat.no.ab125066; Abcam), xCT (1: 2, 000; cat.no.ab175186; Abcam), HO -1 (1: 1 , 000 cat.no.101147; Gentex) và NRF2 (1: 1, 000; cat.no.D1Z9C; CST) qua đêm ở 4 độ. Membranes sau đó được rửa bằng TBST (0,1 phần trăm Tween -20) ba lần. Sau phần chính ubation, các màng được ủ với các kháng thể thứ cấp liên hợp với peroxidase của cây cải ngựa (1:10, 000; 40295G; BIOSS) trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Các màng được rửa lại ba lần bằng TBST và hiển thị bằng BeyoECLPlus (cat. Số P00185; Viện Công nghệ Sinh học Beyotime), sử dụng Hệ thống Hình ảnh Tài liệu Chemi (Phòng thí nghiệm Bio-Rad, Inc.). Cường độ của các dải protein được xác định bằng cách sử dụng Phần mềm ImageJ v1.8.0 (Viện Y tế Quốc gia). Tất cả các thí nghiệm đã được thực hiện trong ba lần.
PCR định lượng phiên mã ngược (RT-g).
RNA tổng số được chiết xuất từ thận của chuột ở các nhóm khác nhau bằng thuốc thử TRIzol (Takara Bio, Inc.) và cDNA được tổng hợp bằng cách sử dụng bộ thuốc thử PrimeScript RT với gDNA Eraser (cat.no.RR047A; Takara Biotechnology Co., Ltd.) Mức độ tương đối của các gen mục tiêu được xác định thông qua qPCR sử dụng Ultra SYBR Mixture (Takara Biotechnology Co., Ltd.). RT-qPCR được thực hiện với dung lượng 25 ul với 2 ul cDNA, 400 nM mỗi giác và lớp mồi antisense, và 12,5 ul Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix (Takara Bio, Inc. trên hệ thống ABI PRISM 7000 (Hệ thống sinh học ứng dụng; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Phản ứng được thực hiện trong 40 chu kỳ biến tính ở 95 độ trong 30 giây, ủ ở 53 độ trong 30 giây và kéo dài ở 72 độ trong 10 giây. Các trình tự mồi sau được sử dụng cho qPCR: GPX4 forward , 5'-GCCTGGATAAGTACA GGGGTT -3 'và đảo ngược, 5'-CATGCAGATCGACTAGCT GAG -3'; NRF2 tiến, 5'-TCTTGGAGTAAGTCGAGA AGTGT -3 'và ngược lại, 5'-GTTGAAACTGAGCGAAAA {28}} '; xCT tiến, 5'-GGCACCGTCATCGGATCA G -3' và đảo ngược, 5- CTCCACAGGCAGACCAGAAAA -3 '; COX -2 tiến, 5'-TGAGCAACTATTCCAAACCAGC {{ 37}} 'và đảo ngược, 5'-GCACGTAGTCTTCGATCACTATC -3'; HO -1 tiến.5'-AAGCCGAGAATGCTGAGTTCA -3 'và ngược lại, 5'-GCCGTGTAGATATGGTACAAGGA -3'; và -actin chuyển tiếp, 5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG -3 'và ngược lại, 5'-CCAGTTGGTAACAATGCC ATGT -3 '.
Giá trị trung bình của sự biểu hiện gen sau khi chuẩn hóa -actin được sử dụng làm hiệu chuẩn để xác định mức độ tương đối của các gen mục tiêu. Mức độ biểu hiện tương đối của các gen mục tiêu được tính bằng phương pháp 2- △ C (27).
Phân tích thống kê.
Phân tích thống kê được thực hiện bằng GraphPad Prism 7. 0 (GraphPad Software, Inc.) và phần mềm SPSS 23 (IBM Corp..Data được trình bày dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn của ba lần lặp lại độc lập trừ khi có quy định khác. Một chiều ANOVA tiếp theo là bài kiểm tra sau môn học của Tukey được sử dụng để so sánh sự khác biệt giữa nhiều nhóm. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Kết quả
PA(Axit pachymic)giảm chấn thương thận ở chuột với IRI(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu). Scr và BUN là hai chỉ số quan trọng của chức năng thận (5). Mức độ Scr và BUN cao hơn đáng kể trong IRI(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu)so với những người trong nhóm giả mạo (P<0.05; fig.="" 1a="" and="" b).="" treatment="" with="" mid-dose="" and="" high-dose="">(Axit pachymic)giảm thiểu đáng kể sự gia tăng creatinin và urê huyết thanh so với IRI(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu)nhóm (P<0.05); however,="" the="" levels="" of="" serum="" creatinine="" and="" urea="" did="" not="" significantly="" differ="" between="" the="" light-dose="">(Axit pachymic)nhóm điều trị và IRI(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu) group (P>0. 05; Hình 1A và B).
Như được trình bày trong Hình 1D, phương pháp nhuộm H&E của các mô thận ở nhóm giả cho thấy không có thay đổi đáng kể nào trong cấu trúc mô thận. Ngược lại, IRI(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu)nhóm chứng tỏ phù và mất tế bào biểu mô ống thận, giãn ống thận, viêm mô kẽ, thâm nhiễm tế bào viêm, lắng đọng collagen và lắng đọng vật liệu hoại tử ống (Hình 1D). Điểm Paller, một chỉ số về tổn thương mô thận (26), cao hơn đáng kể trong IRI(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu)nhóm được so sánh với nhóm giả mạo (P<0.05; fig.="" 1c).="" in="" particular,="" moderate-dose="" and="" high-dose="">(Axit pachymic)liệu pháp cải thiện đáng kể những tổn thương này, và điểm Paller thấp hơn đáng kể so với điểm trong IRI(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu)nhóm (P<0.05); however,="" there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="">(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu) model group and the low-dose group (P>0. 05; Hình 1C).
Hình 1. PA(Axit pachymic)giảm bớt tổn thương thận sau khi tái tưới máu do thiếu máu cục bộ.(A) BUN và (B) creatinine huyết thanh được đo ở chuột trong Sham, IRI(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu), IRI cộng với PAL, IRI cộng với PAM và IRI cộng với PAH (40 phút thiếu máu cục bộ ở thận sau 24 giờ tái tưới máu; n =6 / nhóm). (C) Điểm số nhỏ hơn được sử dụng để phân loại tổn thương ống thận trong các nhóm Sham, IRI, IRI cộng với PAL, IRI cộng với PAM và IRI cộng với PAH (n =3 / nhóm). (D) Hình ảnh Hematoxylin và eosin trong thận của chuột ở Sham, IRI(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu), IRI cộng với PAL, IRI cộng với PAM và IRI cộng với nhóm PAH. Thanh chia độ, 50 µm. Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. * P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="" iri="" group.="">(Axit pachymic), axit pachydermic; BUN, nitơ urê máu; IRI,chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu; L, nhóm liều thấp; M, nhóm liều vừa phải; H, nhóm liều cao.
Ảnh hưởng của PA(Axit pachymic)về những thay đổi hình thái của ty thể trong mô thận của chuột theo dõi IRI thận(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu). TEM cho thấy không có thay đổi đáng kể nào trong cấu trúc ty thể của mô thận ở nhóm giả. Trong nhóm mô hình, những thay đổi của ty thể liên quan đến quá trình ferroptosis, chẳng hạn như giảm thể tích ty thể, tăng mật độ màng, và giảm hoặc không có vết nứt ty thể, đã được quan sát thấy trong mô thận (Hình 2A). So với những người trong nhóm mô hình, ty thể của nhóm dùng liều vừa phải chủ yếu biểu hiện phù nề, và những thay đổi cụ thể đặc trưng của bệnh ferroptosis là rất hiếm (Hình 2A). Tuy nhiên, trong PA liều cao(Axit pachymic)nhóm, không có những thay đổi đặc trưng của quá trình ferroptosis được quan sát thấy trong ty thể của mô thận, và chỉ có biểu hiện phù nề nhẹ (Hình 2A). Những thay đổi trong ty thể ở nhóm dùng liều thấp cũng giống như ở nhóm mô hình (Hình 2A).
Ảnh hưởng của PA(Axit pachymic)về biểu hiện GSH và MDA trong IRI thận(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu). GSH là một đồng yếu tố cần thiết cho chức năng GPX4. Tổng hợp GSH ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt động GPX4.MDA là sản phẩm của quá trình oxy hóa lipid, phản ánh mức độ peroxy hóa lipid nội bào và phản ánh gián tiếp sự xuất hiện của ferroptosis (28,29). Như được trình bày trong Hình 2B, các mô thận có mức GSH thấp hơn đáng kể trong IRI(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu)nhóm so với nhóm giả. Trong số các nhóm điều trị bằng thuốc, biểu hiện GSH cao hơn đáng kể ở nhóm IRI cộng với PA và IRI cộng với PAn so với IRI(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu)nhóm người mẫu (P<0.05). however,="" gsh="" expression="" did="" not="" significantly="" differ="" between="" the="" iri+pa,="" and="" iri="" groups(p="">0. 05). Ngược lại, như được trình bày trong Hình 2C, quá trình peroxy hóa lipid ở mô lớn hơn (dựa trên mức MDA) trong IRI(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu)nhóm so với nhóm giả. Trong số các nhóm điều trị bằng thuốc, mức MDA thấp hơn đáng kể ở nhóm IRI cộng với PA và IRI cộng với PAu so với IRI(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu)nhóm (P<0.05). notably,="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" in="" the="" levels="" of="" mda="" between="" the="" iri+pa,="" and="" iri="" groups="" (p="">0.05).
Hình 2. PA(Axit pachymic)giảm ferroptosis trong IRI(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu)Chấn thương thận cấp tính.(A) Hình ảnh hiển vi điện tử truyền qua trong Sham, IRI(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu), IRI cộng với nhóm PAL, IRI cộng với PAM, và IRI cộng với PAH (40 phút thiếu máu cục bộ ở thận sau 24 giờ tái tưới máu). Độ phóng đại, x20, 000; vạch chia độ, 1 µm. Các mũi tên màu đen chỉ ra rằng thể tích ti thể giảm, mật độ màng tăng và giảm, hoặc các vết nứt ti thể biến mất được quan sát thấy trong mô thận. Các mũi tên màu xanh biểu thị sự phù nề của ty thể. Mức độ (B) GSH và (C) MDA trong các mô thận được đánh giá (n =6 / nhóm). Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. * P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu)tập đoàn. PA(Axit pachymic), axit pachydermic; IRI,chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu; L, nhóm liều thấp; M, nhóm liều vừa phải; H, nhóm liều cao; GSH, glutathione; MDA, malondialdehyde.
PA(Axit pachymic)điều chỉnh sự biểu hiện của các protein liên quan đến quá trình ferroptosis trong IRI thận(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu). Trong nghiên cứu này, mức độ biểu hiện của các protein liên quan đến ferroptosis GPX4, xCT và HO -1 được phát hiện thông qua phân tích Western blotting (Hình 3A và B) và RT-qPCR (Hình 3C). Kết quả chứng minh rằng mức protein GPX4, xCT và HO -1 đã được điều chỉnh giảm đáng kể trong IRI(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu)nhóm so với nhóm giả mạo (P<0.05)(fig.3a and="" b).="" similar="" results="" were="" demonstrated="" following="" rt-qpcr="" analysis.="" in="" addition,="" treatment="" with="" moderate-dose="" and="" high-dose="">(Axit pachymic)đã tăng đáng kể mức độ biểu hiện protein và mRNA của GPX4, xCT và HO -1 so với IRI(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu)nhóm (P<0.05). however,="" no="" significant="" differences="" in="" protein="" and="" mrna="" expression="" levels="" of="" gpx4.xct="" and="" ho-1="" were="" observed="" between="" the="">(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu)và PA liều thấp(Axit pachymic) treatment groups (P>0. 05; Hình 3B và C).
Hình 3. PA(Axit pachymic)làm tăng mức độ biểu hiện của các protein liên quan đến ferroptosis, GPX4, xCT và HO ‑ 1.(A) Western blotting được thực hiện để phát hiện mức độ biểu hiện của các protein liên quan đến ferroptosis, GPX4, xCT và HO ‑ 1 trong IRI(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu)Chuột bị thương thận cấp tính (n =3). (B) Biểu thức tương đối của các giá trị màu xám cho GPX4, xCT và HO ‑ 1. (C) Phân tích PCR định lượng phiên mã ngược được thực hiện để phát hiện mức độ biểu hiện mRNA của các protein liên quan đến quá trình ferroptosis (n =3). Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. * P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu)tập đoàn. PA(Axit pachymic), pachydermic acid; GPX4, glutathione peroxidase 4; xCT, hệ thống vận chuyển glutamate; HO ‑ 1, heme oxygenase 1; IRI,thiếu máu cục bộ-tái tưới máuy; L, nhóm liều thấp; M, nhóm liều vừa phải; H, nhóm liều cao.
Kết quả chứng minh rằng mức protein và mRNA của protein peroxy hóa lipid liên quan đến ferroptosis, COX -2 đã được điều chỉnh đáng kể trong IRI(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu)(Hình 4). Điều trị bằng PA liều trung bình và liều cao(Axit pachymic)giảm đáng kể biểu thức COX -2 so với IRI(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu)nhóm (P<0.05), and="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" between="" the="">(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu)và PA liều thấp(Axit pachymic) treatment groups (P>0. 05; Hình 4).
Hình 4. PA(Axit pachymic)làm giảm mức độ biểu hiện của protein liên quan đến quá trình ferroptosis, COX ‑ 2.(A) Western blotting được thực hiện để phát hiện mức độ biểu hiện của protein đánh dấu peroxy hóa lipid ferroptosis, COX ‑ 2 ở chuột bị thương thận cấp IRI. (B) Biểu thức tương đối của các giá trị xám đối với COX ‑ 2. (C) Phân tích PCR định lượng phiên mã ngược được thực hiện để phát hiện biểu hiện mRNA COX ‑ 2 (n =3). Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. * P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu)tập đoàn. PA(Axit pachymic), axit pachydermic; COX ‑ 2, xiclooxygenaza 2; IRI,chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu; L, nhóm liều thấp; M, nhóm liều vừa phải; H, nhóm liều cao.
PA(Axit pachymic)thúc đẩy sự hoạt hóa của con đường tín hiệu NRF2 trong IRI thận(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu).Để khảo sát ảnh hưởng của PA(Axit pachymic)trên con đường tín hiệu NRF2, mức protein và mRNA của NRF2 được đánh giá (Hình 5). Kết quả chứng minh rằng biểu hiện NRF2 thấp hơn đáng kể trong IRI(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu)nhóm so với nhóm giả. Ngoài ra, biểu hiện NRF2 cao hơn đáng kể trong nhóm IRI cộng với PAw và IRI cộng với PAH so với IRI(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu)nhóm (P<0.05); however,="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" between="" the="" iri+pa,="" and="" iri="" groups(p="">0. 05). Hơn nữa, điều trị bằng PA(Axit pachymic)cũng tăng biểu hiện NRF2 theo cách phụ thuộc vào liều lượng (Hình 5).
Hình 5. PA(Axit pachymic)kích hoạt lộ trình báo hiệu NRF2.(A) Western blotting được thực hiện để phát hiện biểu hiện protein NRF2 trong IRI(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu)Chuột bị thương thận nặng. (B) Biểu thức tương đối của các giá trị màu xám cho NRF2 (n =3). (C) Phân tích PCR định lượng phiên mã ngược được thực hiện để phát hiện biểu hiện mRNA NRF2 (n =3). Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. *P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu)tập đoàn. PA(Axit pachymic), axit pachydermic; NRF2, nhân tố nhân hồng cầu có nguồn gốc từ 2 như 2; IRI,chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu; L, nhóm liều thấp; M, nhóm liều vừa phải; H, nhóm liều cao.
