PHẦN Ⅰ: Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến số Nephron
Mar 20, 2022
để biết thêm thông tin: ali.ma@wecistanche.com
PHẦN Ⅰ: Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến số lượng Nephron: Mô hình hóa bệnh ở mẹ và quy định biểu sinh trong phát triển thận
Lars Fuhrmann, Saskia Lindner, Alexander-Thomas Hauser, Clemens Höse & et al.
1. Giới thiệu
Sự phát triển của thai nhi bị ảnh hưởng bởi môi trường trong tử cung và một môi trường bất lợi có thể dẫn đến các bệnh như tăng huyết áp, bệnh tim mạch và bệnh thận mãn tính sau này [1-4]. Một loạt các rối loạn trong tử cung có thể dẫn đến giảm sản lượng nephron và suy giảm chức năng thận ở con cái. Ở loài gặm nhấm, các điều kiện dẫn đến giảm số lượng nephron khi sinh bao gồm hạn chế tăng trưởng trong tử cung (IUGR), chế độ ăn ít protein của mẹ, thuốc (bao gồm corticosteroid hoặc thuốc chống viêm không steroid), đột biến gen đơn và mức vitamin A thấp, cũng như bệnh tiểu đường ở mẹ và thiếu sắt [5-10]. Ở người, hiện không có phương pháp không xâm lấn để đo số lượng nephron. Tuy nhiên, các nghiên cứu sau khi chết đã chứng minh mối tương quan nghịch giữa số lượng nephron và huyết áp [4,11]. Ngoài ra, các tình trạng trong tử cung liên quan đến giảm số lượng nephron như IUGR được biết là có liên quan đến tăng tỷ lệ tăng huyết áp và suy thận [12].
Các thí nghiệm in vivo trong đó các tình trạng bất lợi trong tử cung được gây ra một cách nhân tạo ở động vật mang thai đã được chứng minh là vô giá đối với việc phát hiện và mô tả những thay đổi ở thận gây ra ở con non. Tuy nhiên, bất kỳ can thiệp thử nghiệm nào trong quá trình mang thai đều dẫn đến những thay đổi phức tạp về sinh lý của người mẹ, nhau thai và thai nhi, bản thân chúng có thể ảnh hưởng đến môi trường của metanephroi đang phát triển. Kỹ thuật mô hình ex vivo phá vỡ điều này bằng cách cho phép điều tra sự phát triển của thận hoàn toàn tách biệt khỏi ảnh hưởng của động vật mẹ, nhau thai hoặc các cơ quan khác của thai nhi. Việc nuôi cấy metanephroi cô lập trên bề mặt không khí trung bình được Trowell thực hiện lần đầu vào năm 1950 [13] và sau đó đã được tinh chế bằng cách nuôi cấy thận trên màng lọc [14], tạo cơ sở cho các điều kiện nuôi cấy đơn biến.
Tóm lại, ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy rằng những lời xúc phạm trước khi sinh liên quan đến số lượng nephron thấp có liên quan đến các yếu tố nguy cơ tăng huyết áp và suy thận. Để phát triển các chiến lược phòng ngừa nhằm đảm bảo cung cấp đầy đủ nephron khi sinh ra, cần phải có sự hiểu biết cơ học về các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của thận và sự hình thành thận. Trong nghiên cứu này, nuôi cấy cơ quan metanephric đã được sử dụng để mô hình hóa các khía cạnh khác nhau của quy định môi trường để nghiên cứu ảnh hưởng của chúng đối với sự phát triển của thận và những tác động có thể có đối với chức năng thận lâu dài và được sử dụng để sàng lọc các chất điều hòa biểu sinh bằng cách sử dụng các hợp chất nhỏ được FDA chấp thuận.
Bấm để xem các sản phẩm Cistanche herba cho chức năng thận
2. Kết quả
2.1. Sử dụng phương pháp nuôi cấy cơ quan theo phương pháp đo lường để nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường đối với sự phát triển của thận
Để mô hình hóa các điều kiện môi trường bất lợi, thận từ phôi ngày phôi (E) 12,5 được nuôi cấy ở bề mặt môi trường không khí (Hình 1A). Để thuận tiện cho việc theo dõi sự phát triển của nephron và cầu thận, Six2. Cre và Pod. Các con chuột báo cáo huỳnh quang kép Cre được sử dụng lần lượt (Hình 1B, C). Một tình trạng phổ biến khi mang thai là sốt, ảnh hưởng đến hơn 10% các trường hợp mang thai trong 16 tuần đầu tiên của thai kỳ [15] Nhiệt là một biểu hiện quái thai đặc trưng và tăng thân nhiệt trong thai kỳ đã được chứng minh là dẫn đến sẩy thai, chậm phát triển, và các khuyết tật về phát triển, chẳng hạn như thận bị lão hóa, thiểu sản và nhẹ cân ở một số loài [16-21]. Để đánh giá tác động của tình trạng tăng thân nhiệt kéo dài, trên phạm vi sốt lên sự phát triển của thận và sự hình thành nephron, thận được phân lập và duy trì ở 37 hoặc 40 độ (Hình 1D). Sau 7 ngày nuôi cấy, trung bình những quả thận được nuôi cấy ở 40C nhỏ hơn 18,36% so với những quả thận được nuôi cấy trong điều kiện sinh lý (Hình 1E). Tuy nhiên, không có sự khác biệt đáng kể về số lượng cầu thận trên mỗi thận giữa các nhóm (Hình 1F). Tuy nhiên, sự phát triển tổng thể của thận giảm cho thấy tác động tiêu cực của việc tăng nhiệt độ lên sự phát triển của hệ metan.
Ước tính có khoảng 19% phụ nữ mang thai bị thiếu máu do thiếu sắt [22], thiếu sắt là một trong những tình trạng phổ biến nhất có khả năng làm rối loạn sự phát triển của thận [23]. Dữ liệu in vivo đã chỉ ra rằng sự phát triển của thận, số lượng cầu thận và sự hấp thu sắt ở thận bị giảm trong thời kỳ mang thai bị ảnh hưởng bởi tình trạng thiếu sắt của người mẹ [24]. Để đánh giá tác động của việc giảm cung cấp sắt gắn với transferrin đối với sự phát triển của thận và sự hình thành thận, các mẫu được nuôi cấy trong môi trường chứa 50 ug / mL holo-transferrin bão hòa sắt hoặc 50 ug / mL apo-transferrin đã cạn sắt, tương ứng. Những quả thận hạn chế sắt vẫn nhỏ hơn nhiều so với những quả thận được cung cấp đủ sắt và cho thấy sự gia tăng quá trình chết rụng ở chồi niệu quản và giảm sự phân nhánh và tăng sinh chồi niệu quản (Hình 1G, Hình bổ sung S1A-F). Trong khi quần thể nephron không bị ảnh hưởng về mặt hình thái, có thể thấy sự giảm sút ở phần xa đang phát triển của nephron, cũng như các ống ở xa (Hình 1H, I, Hình bổ sung S1G-J). Những quả thận thiếu sắt trung bình có kích thước bằng 47,9% kích thước của những quả thận được nuôi cấy holo-transferrin (Hình 1) và cho thấy tổng số cầu thận trên mỗi thận giảm 69,9% sau 7 ngày nuôi cấy (Hình 1K) . Do đó, sự suy giảm sắt bởi apo-transferrin cho thấy những ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự phát triển của thận với kiểu hình tất cả các hình thành thận gần.
Hình 1. Sử dụng mẫu nuôi cấy cơ quan metanephric để nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến sự phát triển của thận.(A) Rãnh niệu sinh dục từ phôi chuột E12.5 (bảng bên trái) được chiết xuất bằng kính hiển vi (bảng thứ hai), và thận được tách ra （bảng thứ ba） và được đặt trên chèn Transwell （bảng bên phải）. Thanh chia tỷ lệ∶ 1 mm （bảng điều khiển bên trái）, 500 μm （bảng điều khiển thứ ba）. (B) Những con chuột chuyển gen có biểu hiện kép Tomato / EGFP được sử dụng để ghi nhãn có điều kiện cho Sáu 2- tế bào dương tính và con cái của chúng bằng cách sử dụng Six2. Cre hoặc (C) tế bào dương tính với podocin bằng cách sử dụng Pod. Cre chuột. (D) Các chất nổ từ cùng một phôi được nuôi cấy trong 7 ngày ở 37 hoặc 40 độ. Thang chia vạch∶ 500 μm. （E） Diện tích bề mặt của mẫu cấy được nuôi cấy trong 7 ngày ở 37 hoặc 40 độ .n =40 cặp, thử nghiệm t được ghép nối, trung bình ± SD. (F) Số lượng cầu thận trong các nhóm mẫu sau 7 ngày.n {{ 17}} cặp, kiểm định t được ghép nối, giá trị trung bình ± SD. （G） Explants từ cùng một phôi được nuôi cấy trong 7 ngày trong môi trường chứa holo-Tf hoặc apo-Tf. Thang chia vạch∶ 500 μm. (H) Hình ảnh trường rộng của cặp mẫu cấy holo-Tf và apo-Tf được nhuộm màu với SIX2 và E-cadherin sau 48 giờ nuôi cấy cho thấy nhóm tế bào tiền thân bình thường và các khuyết tật trong hình thái nephron sớm. Thanh tỷ lệ∶100 μm. （I） Hình ảnh trường rộng của cặp mẫu cấy nuôi cấy holo-Tf và apo-T được nhuộm màu dựa trên WT1 và JAG1. Thang chia độ 100 μm. （） Diện tích bề mặt của mẫu cấy holo-Tf và apo-Tf sau 7 ngày.n =30 cặp, thử nghiệm t được ghép nối, trung bình ± SD. (K) Số lượng cầu thận trong các nhóm mẫu sau 7 ngày.n =17 cặp, thử nghiệm t được ghép nối, giá trị trung bình ± SD.
2.2. Tiếp xúc với Glucose cao Ex Vio dẫn đến những thay đổi liên quan đến bệnh thận do tiểu đường ở thận đang phát triển
Bệnh tiểu đường ở bà mẹ là một tình trạng phổ biến khác trong thời kỳ mang thai, với tỷ lệ tăng đường huyết trong thai kỳ phổ biến trên toàn cầu là ~ 17 phần trăm và hơn 20 triệu ca sinh sống mỗi năm [25]. Bệnh tiểu đường gây ra trên mô hình chuột và chuột cống đã được chứng minh là dẫn đến con cái có số nephron thấp hơn [10,26,27]. Trước đây, nuôi cấy cơ quan metanephric đã được sử dụng để nghiên cứu ảnh hưởng của glucose cao đối với sự phát triển của thận [27-29]. Trước đây, chúng tôi đã báo cáo sự giảm kích thước, số lượng nephron và sự methyl hóa DNA trong điều kiện glucose cao là 55 mM [30]. Ngược lại với dữ liệu đã công bố [28], không có ảnh hưởng đến kích thước mẫu cấy hoặc số lượng cầu thận có thể được nhìn thấy trong các mẫu của chúng tôi khi được nuôi cấy trong môi trường glucose 30 mM khác nhau so với điều kiện kiểm soát 5 mM sau 7 ngày (Hình bổ sung S2A, B). Hơn nữa, không có sự suy giảm trong quá trình methyl hóa DNA tại LINE -1 và các vị trí vệ tinh chính có thể được phát hiện (Hình bổ sung S2C, D). Ảnh hưởng của lượng glucose cao 55 mM lên sự phát triển của thận sau 7- ngày nuôi cấy đã được phân tích thêm, cho thấy sự giảm tốc độ tăng trưởng bắt đầu từ ngày thứ 3 trong quá trình nuôi cấy (Hình 2A, B). Nhuộm miễn dịch huỳnh quang cho thấy không có khuyết tật hình thái của nhóm tế bào tiền thân dương tính SIX 2- (Hình 2C) nhưng cho thấy giảm khả năng nhuộm podocalyxin của podocalyxin đánh dấu podocyte (PODXL, Hình 2D). Các cầu thận được phát hiện có chứa chất nền cầu thận dày lên, có thể nhìn thấy được bằng phương pháp nhuộm mô học (Hình 2E). Những phát hiện tương tự cũng được thực hiện trong kính hiển vi điện tử, cho thấy sự gia tăng độ dày màng đáy cầu thận (Hình 2F), một trong những dấu hiệu sớm nhất của tiền đái tháo đường và bệnh thận đái tháo đường (DN) [31,32], ở 5 trong số 6 thận và không có thận nào. của bảy thận kiểm soát lứa tuổi. Để làm sáng tỏ thêm những thay đổi trong hệ thống phiên mã, phân tích biểu hiện gen khác biệt theo cặp (DGE) của các mẫu cấy ghép thận từ ba lứa đã được thực hiện, với một quả thận của mỗi phôi được nuôi cấy với lượng đường cao và quả thận còn lại với môi trường kiểm soát và thận được gộp lại để phân tích ( n =3). DGE đã xác nhận sự điều hòa của các thành phần chất nền ngoại bào là quá trình sinh học điều hòa chính (Bảng bổ sung S1). Các gen điều hòa chủ yếu tham gia vào quá trình hoạt hóa tế bào (miễn dịch) và xuất / tiết tế bào (Bảng bổ sung S1). Bản thể học kiểu hình động vật có vú chỉ ra hình thái vỏ thận và tiểu thể thận bất thường do các gen điều hòa giảm như Pdgfb, Podxl, Ren, Ptpro, Mafb và Vegfa (Bảng bổ sung S1). Biểu hiện trên thận của một số gen, chẳng hạn như Angptl4, Spon2 (Mindin), Pappa và Txnip, đã được chứng minh là có khả năng điều chỉnh trong bệnh thận do đái tháo đường [33-36], được phát hiện là tăng lên trong điều kiện tăng đường huyết. Để so sánh hồ sơ biểu hiện gen nuôi cấy thận glucose cao với DN của con người, dữ liệu DGE được đối sánh với dữ liệu của con người từ các cầu thận và ống thận bị cắt vi mô từ sinh thiết bệnh nhân mắc bệnh thận do tiểu đường từ Ngân hàng cDNA thận châu Âu (ERCB). Từ 216 gen quy định khác biệt được so khớp sau khi phân tích hàng loạt, 94 gen được điều hòa khác biệt tương ứng trong các phân đoạn cầu thận và / hoặc ống thận (Hình 2G). Sự trùng lặp giữa mô hình của chúng tôi và DNgenes của con người cho thấy 40 trong số 95 gen được điều chỉnh trong cầu thận và 34 gen trong ống (25 gen chung) (Hình 2H). Các gen hầu hết liên quan đến tổ chức nền ngoại bào (COL4A5, COL4A6, COL8A2, LAMB3, LAMC3) và sự kết dính tế bào (ITGBL1, CLDN15). Ngoài ra, các gen liên quan đến bệnh tiểu đường như TXNIP, SPON2 và PAPPA đã được điều chỉnh. Trong số 120 gen điều hòa giảm từ quá trình nuôi cấy thận, 22 gen cũng được điều hòa ở cầu thận và 39 gen cũng được điều hòa ở ống thận (16 gen ở com-mon (Hình 2I). Những gen này liên quan đến phản ứng với kích thích nội sinh (BMP2, KLF15, JUNB, CTSB), sự phát triển biểu mô nephron (PTPRO, PODXL, VEGFA) và điều hòa tích cực hóa chất điều hòa tế bào nội mô (LGMN, P2RX4, VEGFA). Ngoài ra, các gen liên quan đến bệnh tiểu đường như RASGRP3, SIRPA, GATM và ESM1 đã được điều hòa [ 37-39]. Các gen được điều chỉnh khác biệt không trùng lặp với dữ liệu ERCB cũng phản ánh những thay đổi liên quan đến bệnh tiểu đường, chẳng hạn như chất nền ngoại bào (ANGPTL4, TNN, DPT, COL9A2) hoặc bệnh tiểu đường thai kỳ (LAT2, HP, CXCL10, CD {{76} }, CD68, REN, SLC2A3, VCAM1). Do đó, sự phát triển của thận trong điều kiện glucose cao cho thấy những điểm tương đồng đáng chú ý với bệnh thận do đái tháo đường ở người trưởng thành.
Hình 2. Phơi nhiễm glucose cao trong ex vivo dẫn đến những thay đổi liên quan đến bệnh thận do đái tháo đường ở thận đang phát triển.(A) Thận phôi từ Pod.Cre; Động vật cà chua / EGFP được nuôi trong 7 ngày ở điều kiện đường thấp (LG, 5,5 mM -D-glucose, 55 mM mannitol) hoặc glucose cao (HG, 55 mM -D-glucose). Thanh tỷ lệ: 500 um. (B) Diện tích bề mặt thận của điều kiện HG và LG. *, P =0. 0474; *, p =0. 0052; *, p<0.0001.paired t-test,="" mean="" ±="" sd.(c)="" confocal="" immunofluorescent="" stainings="" of="" day="" 7="" kidney="" cultures="" against="" six2="" and="" (d)="" podocalyxin="" with="" pan-cytokeratin="" and="" hoechst.scale="" bar:="" 100="" um.="" (e)="" stainings="" of="" 6="" um="" sections="" from="" day="" 7="" kidney="" cultures.="" scale="" bar:="" 20="" um.="" (f)transmission="" electron="" microscopy="" of="" sections="" from="" day="" 7="" kidney="" cultures.="" glomerular="" basement="" membranes="" are="" thickened="" in="" kidneys="" exposed="" to="" high="" glucose="" conditions.="" left="" column:="" magnification="" showing="" podocyte="" foot="" processes.="" scale="" bars:="" 500="" nm="" (left="" panels),100="" nm="" (right="" panels).(g)="" fold="" change="" of="" rna-seq="" data="" from="" hg="" compared="" to="" lg="" kidneys="" and="" ercb="" diabetic="" nephropathy="" (dn)patient="" microarray="" data="" from="" microdissected="" glomeruli="" and="" tubules="" showing="" differentially="" expressed="" genes.="" (h)="" genes="" upregulated="" in="" the="" kidney="" cultures(kc)overlapping="" with="" ercb="" dn="" patient="" data="" and="" selected="" genes="" highlighted.="" (i)genes="" downregulated="" in="" the="" kidney="" cultures="" (kc)="" overlapping="" with="" ercb="" dn="" patient="" data="" and="" selected="" genes="">
2.3. Ex Vivo tiếp xúc với glucose cao ảnh hưởng đến sự hình thành bộ nhớ dài hạn thông qua quá trình methyl hóa DNA
Để hiểu thêm về những thay đổi phân tử qua trung gian của môi trường tăng đường huyết, các mẫu thận được nuôi cấy ở điều kiện glucose cao trong 3,5 ngày và sau đó chuyển sang điều kiện glucose thấp trong cùng một khoảng thời gian (Hình 3A). Đáng chú ý, việc ủ trong điều kiện sinh lý sau thời gian ủ ngắn hơn trong môi trường glucose cao đã không đảo ngược sự giảm sinh trưởng sau 7 ngày nuôi cấy với các mẫu cấy phát triển với tốc độ tương tự như khi xử lý glucose cao liên tục (Hình 3B). Hơn nữa, quá trình methyl hóa DNA cho thấy quá trình hypomethyl hóa của phần tử LINE -1 và các locus vệ tinh chính (Hình 2C, D), cũng như sự siêu methyl hóa DNA bền vững của promoter Ppargcla, trong cả điều kiện glucose cao và điều kiện đảo ngược (Hình 3E), cho thấy hình thành bộ nhớ trao đổi chất thông qua sự methyl hóa DNA do các điều kiện môi trường bất lợi trước đó như một phương tiện lập trình bào thai.
Hình 3. Phơi nhiễm với lượng glucose cao trong ex vivo ảnh hưởng đến sự hình thành trí nhớ dài hạn thông qua quá trình methyl hóa DNA.(A) Hình ảnh thận E12,5 huyết thanh từ ngày 0 đến ngày thứ 7 trong môi trường glucose thấp (5,5 mM), môi trường glucose cao (55 mM) hoặc môi trường glucose cao trong 3,5 ngày và đảo ngược sang môi trường glucose thấp cho những ngày còn lại. thanh tỷ lệ: 500 um. (B) Diện tích bề mặt thận trên 7 ngày. Trung bình ± SD. n =36 thận. LG, điều trị glucose thấp; HG, điều trị glucose cao; HG đến LG, 3,5 ngày điều trị glucose cao và 3,5 ngày. ***, LG-HG (thử nghiệm t không ghép đôi): p =0. 0004; **, LG-HG to LG (thử nghiệm t ghép đôi ):P<0.0001.(c) analysis="" of="" the="" dna="" methylation="" at="" line-1="" and(d)major="" satellite="" loci="" shows="" continuous="" dna="" hypomethylation="" in="" high="" glucose="" treated="" conditions.**,p-value="0.0022.*,p-value=0.0357.(E)" analysis="" of="" the="" dna="" methylation="" at="" the="" ppargcla="" locus="" shows="" continuous="" dna="" hypermethylation="" in="" high="" glucose="" conditions.="" mean="" ±="" sd.="" *,p-value="">
2.4. Màn hình tổng hợp nhỏ Ex Vivo xác định các cơ quan điều chỉnh biểu sinh của sự phát triển thận
Kết quả của nghiên cứu này cũng như các công trình trước đây cho thấy rằng các cơ chế biểu sinh đóng một vai trò trong sự phát triển của thận [30, A 40-45]. Do đó, chúng tôi muốn đánh giá một cách có hệ thống ảnh hưởng của các chất điều biến biểu sinh của các lớp enzym khác nhau đối với sự phát triển của thận. Đối với điều này, chúng tôi đã chọn một thư viện gồm 22 hợp chất nhỏ được FDA chấp thuận với hoạt tính ức chế đã được chứng minh [46-56] (Hình 4A). Sử dụng chuột Six2.Cre-report để đánh giá sự phát triển của nephron, các cấu trúc thận được nuôi cấy trong 3 ngày với các chất ức chế trong môi trường. Kích thước tăng lên theo thời gian so với các cơ quan kiểm soát lứa đẻ, và hình thái được kiểm tra để phát hiện những bất thường trong quá trình phát triển (Hình 4B). Một số chất ức chế có thể can thiệp vào sự phát triển bình thường của thận ex vivo. Chất ức chế HDAC entinostat, một chất ức chế benzamide histone deacetylase có ái lực cao với HDAC1,2 và 3 [57], cho thấy sự giảm tăng trưởng nhất quán và thiếu sự biệt hóa và tăng sinh sau 3 ngày (Hình 4C) .TH39 được phát triển như một chất ức chế HDAC8 chọn lọc (IC50 HDAC 8 88 nM, 26- chọn lọc lần so với HDAC1, 28- lần chọn lọc so với HDAC6 [56]), cho thấy sự ức chế tăng trưởng nghiêm trọng tương tự so với các cơ quan kiểm soát lứa đẻ. Hơn nữa, thuốc thải sắt và chất ức chế JmJC deferasirox và deferoxamine cho thấy sự giảm tăng trưởng tương tự như môi trường thiếu sắt. Ngoài ra, cyproheptadine của chất ức chế SET7 / 9 [58,59] cho thấy sự giảm tăng trưởng và thiếu biệt hóa và tăng sinh so với thận kiểm soát (Hình 4D) nhưng cũng có vẻ cản trở tín hiệu Wnt (Hình phụ S3). Các chất ức chế HDAC, HAT, HDM và HMT khác và chất ức chế DNMT 5- azacytidine không cho thấy sự giảm tăng trưởng hoặc các dị thường về phát triển trong khung thời gian đã đo (Hình 4A).
Hình 4. Màn hình hợp chất nhỏ Ex vivo xác định các yếu tố điều biến sự phát triển của thận.(A) Danh sách các hợp chất nhỏ, mục tiêu biểu sinh của chúng và nồng độ được sử dụng cho thấy sự giảm tăng trưởng ở thận với entinostat, TH39, deferasirox, deferoxamine và cyproheptadine ở mức Lớn hơn hoặc bằng 3 thí nghiệm độc lập sau 3 ngày nuôi cấy. Các mẫu cấy đối chứng được xử lý bằng DMSO. ***, giá trị p<0.0001. (b)examples="" of="" two="" sets="" of="" embryonic="" kidney="" cultures="" with="" pictures="" taken="" from="" day="" 0="" until="" day="" 3="" showing="" growth="" reduction="" and="" morphological="" differences="" in="" kidneys="" treated="" with="" th39,="" deferasirox,="" and="" deferoxamine="" compared="" to="" littermate="" control="" kidneys.="" scale="" bar∶="" 500="" μm.="" (c）entinostat="" showed="" growth="" reduction="" at="" 5="" and="" 10="" μm="" concentrations,="" no="" nephron="" differentiation,="" and="" lack="" of="" proliferation="" after="" 3="" days="" (d)cvproheptadine="" showed="" growth="" reduction="" at="" 100="" and="" 50="" μm="" concentrations,="" lack="" differentiation,="" ureter="" dilation,="" and="" lack="" of="" proliferation="" after="" 3="" days="" in="" culture.="" scale="" bar:="" 500="" um.="" panck,="" pan-cytokeratin.="" cc3,="" cleaved="" caspase-3.="" pcna,="" proliferating="" cell="" nuclear="">
