Làm thế nào để echinacoside ngăn ngừa bệnh Parkinson

Liên hệ: emily.li@wecistanche.com

Phần Ⅰ: Cơ chế Quy định Autophagy ở Chuột PD do MPTP gây ra Thông qua Con đường Tín hiệu MTOR của Echinacoside

Trừu tượng:

Mục tiêu: Nghiên cứu hiện tại nhằm mục đích điều tra ảnh hưởng củaechinacoside(ECH) về các chỉ số liên quan đến autophagy thông qua con đường tín hiệu mTOR, đặc biệt là ảnh hưởng đến việc thanh thải chất nền autophagy P62 và -synuclein, các sản phẩm bệnh lý cốt lõi củabệnh Parkinson(PD), để cung cấp các chiến lược mới để điều trị PD (bệnh Parkinson). Phương pháp: Một mô hình chuột của PD bán cấp tính(bệnh Parkinson)được thành lập bằng cách tiêm 1- metyl -4- phenyl -1, 2,3, 6- tetrahydropyridine (MPTP) vào màng bụng. Đầu tiên, các triệu chứng hành vi thần kinh ở chuột của mỗi nhóm được đánh giá, và chất dẫn truyền thần kinh monoamine trong thể vân ở mỗi nhóm được đo bằng pha lỏng hiệu suất cao. Phương pháp nhuộm kép miễn dịch huỳnh quang được sử dụng để quan sát sự biểu hiện của tyrosine hydroxylase (TH), - synuclein, và LC3. Kính hiển vi điện tử truyền qua được sử dụng để quan sát những thay đổi của siêu cấu trúc trong chất nền và sự hình thành của thực quản. Sau đó, các biểu hiện của TH, -synuclein, Beclin 1, LC3, P62, mTOR và protein ngược dòng AKT được phát hiện bởi Western blot. Kết quả: Khi so sánh với nhóm mô hình, chức năng hành vi thần kinh được cải thiện đáng kể trongECH (Echinacoside)nhóm (P <{{0}}. 01),="" cùng="" với="" sự="" gia="" tăng="" biểu="" hiện="" th,="" da="" và="" dopac="" trong="" não="" (p=""><0,01). bên="">ECH (Echinacoside)nhóm, trong khi biểu thức của Beclin 1 và LC 3- II tăng lên (P <0. 0 1), thì mức độ biểu hiện của P62 và -synuclein giảm đáng kể (P <0,01).ECH (Echinacoside)có thể điều chỉnh mức độ biểu hiện của tín hiệu sinh tồn p-AKT / AKT và giảm biểu hiện của mTOR. Sự kết luận:ECH (Echinacoside)có thể làm tăng autophagy bằng cách ức chế sự biểu hiện của mTOR, do đó thúc đẩy sự thanh thải -synuclein và sự suy thoái của cơ chất autophagy P62 và tạo ra tác dụng bảo vệ thần kinh.

Từ khóa: bệnh Parkinson, MPTP,echinacoside, -synuclein, P62, autophagy, mTOR

Cistanche có thể điều trị bệnh Parkinson

Giới thiệu

Bệnh Parkinson (PD)là một bệnh thoái hóa thần kinh mãn tính và tiến triển. Một đặc điểm bệnh lý điển hình của PD(bệnh Parkinson)là sự hình thành các thể Lewy, và -synuclein và ubiquitin là thành phần chính của các thể Lewy. Ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy sự rối loạn điều hòa autophagy cuối cùng dẫn đến sự tích tụ của các protein bị gấp khúc và các cơ quan bị thương tổn.54 Con đường autophagy-lysosome không chỉ có thể phân hủy các protein không thể bị phân hủy theo con đường ubiquitin-proteasome mà còn cả con đường có thể phân huỷ -synuclein. Do đó, quy định về autophagy có thể cung cấp một chiến lược mới để điều trị PD (bệnh Parkinson). Autophagy là con đường chính dẫn đến sự suy thoái của các tập hợp nội bào, và mTOR kinase là vị trí điều tiết quan trọng đối với autophagy. Do đó, việc làm sáng tỏ mối quan hệ giữa PD(Bệnh Parkinson) và autophagy được điều chỉnh bởi đường dẫn tín hiệu mTOR. Vì sự suy thoái của -synuclein chủ yếu phụ thuộc vào hệ thống autophagy-lysosome với mục tiêu là loại bỏ các protein bất thường, sự phát triển của các loại thuốc bảo vệ thần kinh có thể điều chỉnh quá trình autophagy có thể cung cấp hướng điều trị các bệnh thoái hóa thần kinh. ECH (Echinacoside) có công thức phân tử là C35 H46 O20. Nó là thành phần chính của thuốc bắc Cistanche phenylethanoid glycosides. Lần đầu tiên nó được phân lập bởi Stoll và cộng sự từ gốc củaEchinaceaHạt Angustifolia.ECH (Echinacoside)có một loạt các tác dụng dược lý. Nó có tác dụng chống viêm, chống oxy hóa, bảo vệ thần kinh, cải thiện khả năng học tập và trí nhớ, bảo vệ gan, điều hòa miễn dịch và chống khối u. Nghiên cứu hiện tại, bắt đầu từ các cơ chế bệnh lý cốt lõi của PD(bệnh Parkinson), nhằm mục đích điều tra quy định về các tác động bảo vệ thần kinh củaECH (Echinacoside)trong một con chuột PD(bệnh Parkinson)mô hình được tạo ra bởi MPTP từ con đường tự phân lysosome.

Vật liệu và Thiết bị

Động vật thí nghiệm

Nhóm thí nghiệm bao gồm 108 con chuột đực C57BL / 6J với cấp độ SPF, tám tuần tuổi, nặng 20–22 g, bốn con chuột mỗi lồng, được giữ ở nhiệt độ 22–25 độ. Những con chuột được cung cấp bởi Trung tâm Động vật thí nghiệm Thượng Hải, Học viện Khoa học Trung Quốc, đặt tại Đại học Y khoa Nam Kinh, và những con vật được chăm sóc nhân đạo theo hướng dẫn của Viện Y tế Quốc gia, trong phòng cấp SPF với nhiệt độ 22– 25 độ, độ ẩm tương đối là 55 phần trăm và theo nhịp sinh học 12- giờ. Những con chuột được tự do có thức ăn và nước uống.

Thuốc thử chính

MPTP (Công ty Sigma), kháng thể đơn dòng kháng chuột (Công ty Sigma), kháng thể đơn dòng Alexa Fluor 555 (Viện Công nghệ sinh học Biyuntian), Kháng thể chống thỏ Alexa Fluor 488 (Viện Công nghệ sinh học Biyuntian), HRP - kháng thể thứ cấp chống dê (Viện Công nghệ sinh học Biyuntian), kháng thể đa dòng - kháng thể synuclein của thỏ (Công ty công nghệ tín hiệu tế bào), kháng thể thứ cấp chống chuột HRP (Viện Công nghệ sinh học Biyuntian),ECH(Echinacoside) (Công ty TNHH Công nghệ sinh học Chengdu Linghangzhe), kháng thể kháng p-AKT (Ser473) trên thỏ (Công ty Công nghệ Tín hiệu Tế bào), Rapamycin (Công ty Công nghệ Tín hiệu Tế bào), Chloroquine (Công ty Sigma), Wortmannin (Công ty Sigma), thỏ đa dòng Kháng thể LC3 (Công ty Abcam), kháng thể đa dòng P62 của thỏ (Công ty Enzo Life Science), kháng thể đơn dòng -actin trên chuột (Công ty Santa Cruz), kháng thể đa dòng Beclin 1 (Công ty Abcam).

Thông tin của các tài liệu:

MPTP (Mỹ, Công ty Sigma), kháng thể đơn dòng chống TH trên chuột (Mỹ, Công ty Sigma), kháng thể-nhân-nuclein đa dòng của thỏ (Mỹ, Công ty Công nghệ tín hiệu tế bào), kháng thể thứ cấp chống chuột HRP-dê (Trung Quốc, Viện Công nghệ sinh học Biyuntian ),ECH(Echinacoside) (Trung Quốc, Chengdu Linghangzhe Biotechnology Co., Ltd.), kháng thể kháng p-AKT (Ser473) trên thỏ (Mỹ, Công ty Công nghệ Tín hiệu Tế bào), Rapamycin (Mỹ, Công ty Công nghệ Tín hiệu Tế bào), Chloroquine (Mỹ, Công ty Sigma), Wortmannin (Mỹ, Công ty Sigma), kháng thể đa dòng LC3 của thỏ (Mỹ, Công ty Abcam), kháng thể P62 đa dòng của thỏ (Mỹ, Công ty Enzo Life Science), kháng thể đơn dòng - actin trên chuột (Mỹ, Công ty Santa Cruz), kháng thể đa dòng Beclin 1 ( Mỹ, Công ty Abcam).

Điều trị bằng echinacosidebệnh Parkinson

Phương pháp thực nghiệm

Phân nhóm động vật thí nghiệm

108 con chuột C57BL / 6J được chia ngẫu nhiên thành sáu nhóm, với 18 con chuột trong mỗi nhóm. Chi tiết như sau: Nhóm đối chứng bình thường (nhóm nước muối thông thường, nhóm N), nhóm mô hình (nhóm MPTP, nhóm M),ECH(Echinacoside) nhóm (MPTP cộngECH (Echinacoside), Nhóm EH), nhóm autophagy gây ra (nhóm MPTP cộng với Rapamycin, nhóm RA), nhóm ức chế autophagy A (MPTP plusECH (Echinacoside)cộng với nhóm chloroquine, nhóm CQ), nhóm ức chế autophagy B (MPTP cộngECH (Echinacoside)cộng với nhóm Wortmannin, nhóm WO). Liều MPTP là 30mg / kg / ngày, tiêm liên tục trong 7 ngày.ECH (Echinacoside) được đưa ra với liều 30mg / kg / ngày, tiêm trong dạ dày.9

Mô hình hóa động vật thí nghiệm và thuốc

Nhóm N và nhóm EH được cho uống nước muối bình thường vàECH(Echinacoside) ba ngày trước khi làm mẫu, đến bảy ngày sau khi làm mẫu. Rapamycin, 1 0 wortmannin, 11, và chloroquine đã được dùng trong bảy ngày liên tiếp sau lần tiêm MPTP cuối cùng. Liều tiêm rapamycin vào tĩnh mạch đuôi được tính là 2mg / kg / ngày. Liều tiêm chloroquine trong phúc mạc ở chuột là 50mg / kg / ngày. Liều tiêm wortmannin vào tĩnh mạch đuôi ở chuột là 0,7mg / kg / ngày (Hình 1 bổ sung).

Quan sát hành vi thần kinh

Theo tài liệu, 12 với sửa đổi nhỏ, thiết bị tự chế tạo để thử cực như sau: Thiết bị này là một ống PV dài 55 cm, đường kính 1 cm với đường kính hình cầu 2 cm ở đầu thiết bị làm điểm đính kèm cho chuột. Thiết bị được dán băng đen để ngăn chuột rơi. Mỗi con chuột được đặt trên điểm nhô ra hình cầu với đầu hướng lên trong quá trình thử nghiệm. Ghi lại thời gian từ đỉnh của thanh đã đặt đến khi quay đầu xuống (quay chữ T) và tổng thời gian từ đỉnh của thanh đặt lên đến đáy của ống để tiếp đất (tổng T).

Hoạt động tự phát

Hoạt động tự phát, còn được gọi là hoạt động trường mở, là một chỉ số phổ biến để phát hiện hoạt động hiếm gặp sau chấn thương MPTP.13 Trong nghiên cứu này, một hệ thống phân tích video thí nghiệm hiện trường mở đã được áp dụng. Các thao tác cụ thể như sau: Trước khi làm thí nghiệm, người ta cho 4 con chuột cùng nhóm vào một hộp quan sát (có chiều dài 25 cm, chiều rộng 25 cm, chiều cao là

25 cm) để thích nghi trong 30 phút. Sau đó chúng được quay video liên tục trong 30 phút. Trong cửa sổ thời gian quan sát 30- phút, số lượng chuyển động thẳng đứng (Số sắp xếp) được đếm riêng biệt trong ba khoảng thời gian không liên tục trong năm phút. Hệ thống phân tích video tự động phân tích quỹ đạo hoạt động của chuột và thu được tổng khoảng cách 30- phút (Tổng khoảng cách) làm chỉ báo về chuyển động ngang.

Phân tích dáng đi

Phân tích dáng đi: Theo tài liệu, 14 thiết bị phân tích dáng đi tự tạo đã được sử dụng. Thiết bị này như sau: Một lối đi bằng gỗ (với chiều dài 42 cm, chiều rộng là

4,5 cm và cao 12 cm), một đầu để hở, đầu kia dẫn vào lồng sóc. Lồng sóc được phủ một tấm vải đen. Mực xanh đã được nhúng dưới chân chuột. Sau đó, con chuột được đặt ở đầu mở của lối đi. Con chuột tự nhiên di chuyển đến cuối lồng sóc được che bằng vải đen. Ba sải chân dài nhất của chi trước và chi sau được đo tương ứng và lấy các giá trị trung bình.

Kiểm tra Rotarod

Con chuột được đặt trên một rotarod có tốc độ thay đổi, với tốc độ của rotarod được điều chỉnh để tăng từ bốn vòng / phút lên 40 vòng / phút trong vòng năm phút. Thời gian từ khi bắt đầu quay rotarod cho đến khi chuột thả chuột khỏi rotarod mỗi lần được ghi lại là độ trễ để giảm. Xác định nội dung của chất dẫn truyền thần kinh Monoamine trong Striatum bằng phát hiện điện hóa sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC-ECD)

Lấy mẫu và Xử lý

Những con chuột bị chết, và thể vân nhanh chóng được tách trên băng và cân. Theo tỷ lệ 1 mL axit pecloric 5% với 0. 1 g óc (trọng lượng ướt), mẫu vật của mỗi nhóm được cho vào thủy tinh có chứa thể tích axit pecloric tương ứng và đồng nhất trong một ống bùn . Chất đồng nhất được ly tâm ở nhiệt độ thấp với 13 000 r / min trong 2 0 phút. Phần nổi phía trên được lấy, và quá trình ly tâm được lặp lại. Phần nổi phía trên được đặt trong tủ lạnh nhiệt độ thấp để phát hiện thêm. Các điều kiện cho HPLC-ECD là như sau. Sắc ký điện hóa Couloehemlll 53 0 0 đã được thông qua. Phương tiện phát hiện là các ô 5020 và 504 lb, với cột sắc ký MD -150 (3,0 * 150 mm; 3 um), pha động của MDTM -2 và độ nhạy 2uA. Tốc độ dòng được đặt thành 0,6 mL / phút, điện thế của điện cực được đặt thành 220mV và nhiệt độ cột được đặt thành 30 độ. Thể tích tiêm là 20 ul (pha loãng 10 lần đầu tiên).

Nội dung của các chất dẫn truyền thần kinh sau đã được phát hiện Dopamine (DA), axit Dihydroxyphenylacetic (DOPAC), Axit vanillic cao (HVA), Norepinephrine (NE), {{0}} Hydroxytryptamine (5- HT), 5- Axit hydroxyindoleacetic (5- HIAA). Nhuộm huỳnh quang miễn dịch của TH, -Synuclein, LC3, và p62 Những con chuột (n=6 mỗi nhóm) được gây mê khi gây mê sâu (5 phần trăm chloral hydrate) và được tưới bằng 0. 9 phần trăm natri clorua, tiếp theo là 4% paraformaldehyde qua tâm thất trái. Não nhanh chóng được lấy ra và cố định trong 24 giờ, sau đó được chuyển sang nước muối đệm phosphat (PBS) chứa 3 0 phần trăm sucrose ở 4 độ C cho đến khi chúng chìm xuống. Mô được nhúng trong parafin, và các phần tràng hoa (30 µm) được cắt qua các ống phân tích nhỏ (SNc; −2,8 đến −3,8 mm đuôi so với vành khăn) bằng cách sử dụng một micro-tome. Các phần được khử sáp và ngậm nước, và peroxidase nội sinh được dập tắt bằng 0,3% H2O2 trong 30 phút. Sau khi thu hồi kháng nguyên bằng nhiệt, các phiến kính được ủ với 0,5% Triton-X100 sau đó 5% albumin huyết thanh bò trong 30 phút mỗi phiến. Sau đó, các phần này được ủ với kháng thể kháng - - synuclein, kháng thể kháng TH, kháng thể kháng LC3, kháng thể kháng p62 và các kháng thể thứ cấp phát huỳnh quang tương ứng qua đêm ở 4 độ C. Sau ba lần rửa 5 phút trong PBS , các phần được ủ trong kháng thể thứ cấp được đánh dấu biotin trong một giờ, tiếp theo là phức hợp avidin-biotin trong 30 phút. Hoạt động của peroxidase được hình dung với 3. 3- diaminobenzidine.

Sự phát hiệnProtein của Western Blot

Protein SNc được chiết xuất (n {{0}} con chuột mỗi nhóm), được tách ra bằng cách sử dụng 12–15 phần trăm SDS – PAGE, và chuyển sang màng PVDF. Các màng được chặn bằng sữa không béo 5% trong 1,5 giờ ở nhiệt độ phòng và ủ với các kháng thể chống lại TH, synuclein, p62, Beclin 1, LC3, p-AKT, AKT, p-mTOR, mTOR và GAPDH ở 4 độ C qua đêm . Ngày hôm sau, các màng được rửa bằng nước muối đệm tris chứa 0,1% Tween 20 và được lai với các kháng thể thứ cấp tương ứng trong 1,5 giờ. Protein được hình dung bằng cách sử dụng phát quang hóa học tăng cường và các dải phản ứng miễn dịch được phân tích bằng phần mềm phân tích hình ảnh (Gel Doc 1000- UV; Bio-Rad, Richmond, CA) để tính toán mật độ quang học của -synuclein và dải TH được chuẩn hóa thành GADPH.

Thông tin về kháng thể: kháng thể LC3 đa dòng của thỏ: 1: 1000. Kháng thể P62 đa dòng của thỏ: 1: 1000. Kháng thể đa dòng Beclin 1: 1: 1000. Kháng thể đơn dòng kháng TH của chuột: 1: 1000. Kháng thể-nuclein đa dòng của thỏ: 1: 1000.

Quan sát siêu cấu trúc của Substantia Nigra bằng Kính hiển vi điện tử truyền qua

Các con chuột (n=6 mỗi nhóm) được tử cung bằng 5 phần trăm chloral hydrat và được tưới qua tâm thất trái với PBS lạnh băng, tiếp theo là 4 phần trăm paraformaldehyde và 1 phần trăm glutaraldehyde trong PBS. Não được loại bỏ và cố định trong 2,5% glutaraldehyde ở 4 độ C trong sáu giờ. SNc được cắt thành các khối khoảng 1 mm3 và cố định trong PBS chứa 2,5% glutaraldehyde và được bảo quản ở 4 độ C để chế biến tiếp. Các mảnh này được cố định trong 1 phần trăm osmium tetroxide trong cùng một dung dịch đệm, được khử nước thông qua rượu phân loại, và được nhúng vào Epon 812 (Shell Chemical Co., Houston, TX). Các phần siêu mỏng (50 nm) được cắt bằng máy siêu nhỏ, nhuộm bằng uranyl axetat và chì citrat, và được phân tích dưới phạm vi vi điện tử truyền qua (Leica TCS SP2CLSM, Trung tâm hiển vi điện tử của Trường Y, Đại học Fudan).

Phân tích thống kê

Tất cả dữ liệu đo lường trong nghiên cứu này được thể hiện dưới dạng trung bình ± sai số tiêu chuẩn và phân tích thống kê được xử lý bằng phần mềm GraphPad Prism 5. 0 (GraphPad Software Inc, San Diego, CA). P<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" one-way="" analysis="" of="" variance="" (one-way="" anova)="" was="" used="" to="" test="" the="" statistical="" differences,="" and="" the="" comparison="" between="" multiple="" groups="" was="" analyzed="" by="" tukey's="" multiple="" group="">

BẤM VÀO ĐÂY ĐỂ THAM GIA Ⅱ