Hiệu ứng dưỡng thần kinh và tế bào thần kinh của Echinacoside trong mô hình chuột MPTP bán cấp tính của bệnh Parkinson

Liên hệ: ali.ma@wecistanche.com

Qing Zhao, et al

trừu tượng

Nhiều thí nghiệm ủng hộ quan điểm cho rằng việc tăng cường hoạt động của các yếu tố dưỡng thần kinh (NTFS), đặc biệt là yếu tố dinh dưỡng thần kinh có nguồn gốc từ tế bào thần kinh đệm (GDNF) và yếu tố dinh dưỡng thần kinh có nguồn gốc từ não (BDNF) có thể ngăn chặn hoặc ngăn chặn sự tiến triển của quá trình thoái hóa thần kinh trongParkinsondịch bệnh(PD). Tuy nhiên, việc áp dụng NTFS làm tác nhân điều trị cho PD(Parkinsondịch bệnh)bị cản trở bởi khó khăn trong việc đưa chúng đến các vùng não cụ thể một cách an toàn và hiệu quả. Một chiến lược tiềm năng khác là kích thích sự biểu hiện nội sinh của NTFS. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã điều tra tác động củaEchinacoside(ECH), một monome được chiết xuất từ ​​thảo mộc, để cứu chức năng dopaminergic trong 1- methyl -4- phenyl -1, 2, 3, 6- tetrahydropyridine (MPTP) - những con chuột bị thương. Chúng tôi nhận thấy rằng việc uống ECH(Echinacoside)(30 mg / kg / ngày trong 14 ngày) đối với những con chuột được điều trị bằng MPTP, bắt đầu sau khi bị suy giảm hệ thống nigrostriatal, đã ngăn chặn sự giảm các tế bào thần kinh dopaminergic nigral, sợi vân, dopamine và chất vận chuyển dopamine xuống 134,24 phần trăm, 203,17 phần trăm, 147,25 phần trăm và 154,72 động vật bị MPTP tương ứng (p< 0.05).="" there="" was="" a="" relative="" elevation="" in="" the="" expression="" of="" gdnf="" and="" bdnf="" mrna="" (2.94="" and="" 3.75-fold)="" and="" protein="" (184.34%="" and="" 185.93%)="" in="" ech="" treated="" mice="" compared="" with="" vehicle-treated="" mptp-lesioned="" mice="">< 0.05).="" in="" addition,="" the="" apoptosis="" cells="" and="" bax/bcl-2="" ratio="" of="" mrna="" and="" protein="" in="" mptp-lesioned="" mice="" significantly="" increased,="" and="" these="" effects="" could="" be="" prevented="" by="" ech.="" at="" the="" 7th="" and="" 14th="" days="" of="" ech="" treatment,="" the="" gait="" disorder="" displayed="" obvious="" improvement="">< 0.05).="" these="" findings="" demonstrate="" that="" ech="" is="" probably="" a="" novel,="" orally="" active,="" a="" non-peptide="" inducer="" of="" ntfs="" and="" inhibitor="" of="" apoptosis,="" and="" they="" provide="" preclinical="" support="" for="" the="" therapeutic="" potential="" of="" this="" compound="" in="" the="" treatment="" of="">

Từ khóa: Bệnh Parkinson, MPTP, Echinacoside, GDNF, BDNF, Neurorescue

Echinacosideở Cistanche cóChất dinh dưỡng thần kinhvàthần kinhẢnh hưởng lênParkinsondịch bệnh

Nhấp để chiết xuất cistanche lợi ích cho bệnh Parkinson

1. Giới thiệu

Parkinsondịch bệnh(PD) được đặc trưng bởi sự chết tế bào thần kinh dopaminergic tiến triển ở vùng đệm, dẫn đến suy giảm vận động nghiêm trọng. Trái ngược với các chiến lược bảo vệ thần kinh, nhằm mục đích làm chậm quá trình thoái hóa và do đó phải được bắt đầu trước khi xảy ra tổn thương đáng kể, các liệu pháp phục hồi hoặc chữa bệnh thần kinh nhằm mục đích xóa bỏ sự thiếu hụt và thoái hóa tế bào thần kinh sau khi bắt đầu suy giảm. Các yếu tố dinh dưỡng thần kinh (NTFs) là các protein được tiết ra để điều chỉnh sự tồn tại, duy trì chức năng và sự phát triển kiểu hình của các tế bào thần kinh, đặc biệt, yếu tố dinh dưỡng thần kinh có nguồn gốc từ tế bào thần kinh đệm (GDNF) và yếu tố dinh dưỡng thần kinh có nguồn gốc từ não (BDNF) được công nhận rộng rãi là mạnh các yếu tố tồn tại cho các tế bào thần kinh dopaminergic và con đường nigrostriatal thoái hóa trong PD(Parkinsondịch bệnh). Trong khi các hoạt động bảo vệ thần kinh hoặc tế bào thần kinh của những LSNG này đã được chứng minh trong một số thí nghiệm in vitro và in vivo (Peterson và Nutt, 2008), ứng dụng của chúng làm chất điều trị cho PD đã bị cản trở bởi những khó khăn trong việc đưa chúng vào não vì các peptit đại phân tử không thể vượt qua hàng rào máu não (BBB). Do đó, các thử nghiệm lâm sàng thử nghiệm điều trị PD(Parkinsondịch bệnh)sử dụng phẫu thuật hoặc liệu pháp gen phải giải quyết vấn đề phân phối và biểu hiện hiệu quả của LSNG (Dietz và cộng sự, 2006; Torp và cộng sự, 2006). Để thay thế cho các phương pháp xâm lấn như vậy, một chiến lược tiềm năng là kích thích sự biểu hiện nội sinh của LSNG. Gần đây, một số chất cảm ứng NTF không peptide, chẳng hạn như XIB4035 và PYM50028, đã được chứng minh là làm giảm sự mất các tế bào thần kinh dopaminergic và có thể có tác dụng hữu ích trong điều trị PD (Tokugawa và cộng sự, 2003; Visanji và cộng sự, 2008) . Các tác nhân có trọng lượng phân tử thấp này có thể được sử dụng một cách hệ thống và do đó chúng sẽ khắc phục hầu hết các vấn đề liên quan đến hiệu quả và độ an toàn của việc đưa NTFS vào não bằng các phương pháp như cảm ứng sự biểu hiện LSNG bằng các vectơ virut hoặc sử dụng sản xuất LSNG được đóng gói tế bào (Bespalov và Saarma, 2007). Do đó, các phân tử hoặc gây ra biểu hiện nội sinh của LSNG hoặc tăng cường tín hiệu của chúng đã được chú ý ngày càng tăng như là các lựa chọn điều trị thay thế cho PD(Parkinsondịch bệnh).

Echinacoside(ECH, Hình 1) là một trong những thành phần chính của phenylethanoid glycoside (PhGs) được chiết xuất từ ​​một loại thuốc truyền thống nổi tiếng của Trung Quốc, Herba Cistanches (thân của cây Nhục thung dung, Cistanche salsa, hoặc Cistanche tubulosa). Nó cũng là thành phần phenolic chính trong rễ của Echinacea Angustifolia và E. pallida (Pellati và cộng sự, 2004), được sử dụng rộng rãi ở Châu Âu và Bắc Mỹ vì đặc tính điều hòa miễn dịch của chúng (Hostettmann, 2003). Là một sản phẩm tự nhiên polyphenol, ECH(Echinacoside)có các hoạt tính sinh học khác nhau, chẳng hạn như chất chống oxy hóa mạnh (Sloley và cộng sự, 2001; Dalby-Brown và cộng sự, 2005), loại bỏ gốc tự do và giảm lượng gốc NO được tạo ra bởi các đại thực bào hoạt hóa (Xiong và cộng sự, 2000). rằng nó có thể bảo vệ chống lại nhiễm độc gan (Wu và cộng sự, 2007) và tổn thương phổi cấp tính ở chuột (Zhang và cộng sự, 2007, Xiong và cộng sự, 1998). Nó cũng có tác dụng chống viêm, chống khối u, chống lão hóa và cải thiện các hoạt động ghi nhớ trong học tập (được đánh giá bởi He et al., 2009). Một số nghiên cứu đã báo cáo ECH(Echinacoside)có đặc tính chống apoptotic và bảo vệ thần kinh trong bệnh thoái hóa thần kinh, ví dụ, ECH(Echinacoside)cho thấy tác dụng bảo vệ thần kinh đáng kể trên các tế bào PC -12 bị thương do H2O2 và giải cứu các tế bào thần kinh SH-SY5Y khỏi TNF- gây ra quá trình apoptosis thông qua con đường ty thể (Kuang và cộng sự, 2009; Deng và cộng sự, 2004). Trong cơ thể sống, hợp chất này đã bảo vệ các tế bào thần kinh dopaminergic ở những con chuột có chứa 6- hydroxydopamine (6- OHDA) bằng cách làm giảm sự suy giảm dopamine (DA) và các chất trung gian của nó (Chen và cộng sự, 2007a, b). Một nghiên cứu khác báo cáo rằng ECH có tác dụng bảo vệ thần kinh và cải thiện hành vi trên mô hình chuột về tổn thương tế bào thần kinh dopaminergic do MPTP gây ra, trong khi điều tra sâu hơn cho thấy ECH gây ra sự điều hòa giảm hoạt động caspase -3 và caspase -8 trong MPP cộng với quá trình chết rụng của tế bào thần kinh hạt tiểu não (Geng và cộng sự, 2007). Nhưng những nghiên cứu này chỉ khảo sát vai trò chống apoptotic hoặc bảo vệ thần kinh của ECH bằng phương pháp điều trị trước. Các câu hỏi về việc liệu ECH có ảnh hưởng đến sự kích thích tế bào thần kinh dopaminergic khác và các yếu tố liên quan đến tử vong (chẳng hạn như NTFs và họ Bcl -2) và liệu nó có tác động đến thần kinh hay không vẫn chưa được giải quyết. Thông qua việc xem xét các tài liệu thưa thớt về cảm ứng LSNG bằng thảo mộc hoặc các hợp chất thảo dược, chúng tôi nhận thấy rằng Rehmannia glutinosa và catalpol, hai loại thảo mộc có chức năng tương tự như Cistanches theo lý thuyết y học cổ truyền Trung Quốc, có thể gây ra biểu hiện gen và protein GDNF cả in vitro và in vivo. sau đó làm giảm sự thoái hóa tế bào thần kinh do MPTP gây ra trên con đường dopaminergic nigral-thể vân (Yu và cộng sự, 2006; Xu và cộng sự, 2010). Do đó, chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng ECH cũng có thể có hiệu quả tương tự. Mặt khác, mô hình chuột MPTP bán cấp là một phác đồ khá phổ biến bao gồm một lần tiêm 30 mg / kg mỗi ngày trong năm ngày liên tục. Chế độ này gây ra apoptosis và làm cạn kiệt dopamine thể vân từ 40–50% ở chuột C57BL / 6 trẻ trưởng thành, và tổn thương dopaminergic ổn định sau 21 ngày sau khi dùng MPTP (Tatton và Kish, 1997; Jackson-Lewis và Przedborski, 2007). Vì vậy, nghiên cứu hiện tại của chúng tôi chọn mô hình này và nghiên cứu tác động của ECH lên các biểu hiện của GDNF và BDNF, hai trong số các LSNG mạnh nhất liên quan đến sự tồn tại của tế bào thần kinh dopaminergic, và nó tiếp tục chứng minh khả năng chống chết và diệt tế bào thần kinh của hợp chất này sau tổn thương MPTP bán cấp. cảm ứng trong mô hình chuột PD(Parkinsondịch bệnh).

2. Kết quả

2.1. ECH(Echinacoside)cải thiện các chức năng về dáng đi trong mô hình chuột MPTP bán cấp tính của PD(Parkinsondịch bệnh)

Chiều dài sải chân ngắn lại là một trong những đặc điểm chính của dáng đi bất thường trong PD(Parkinsondịch bệnh). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy sự sụt giảm đáng kể chiều dài sải chân trước và sau ở những con chuột bị tổn thương MPTP được điều trị bằng phương tiện (nước muối) vào ngày thứ 9 sau lần dùng MPTP cuối cùng, tức là ngày thứ 7 điều trị bằng phương tiện, so với nhóm kiểm soát bình thường (p=0. 0 23, 0.014, Hình 2A, B). Trong khi đó, độ dài sải chân của chuột trong ECH liều cao(Echinacoside)Nhóm điều trị (3 0 mg / kg / ngày) lâu hơn so với nhóm điều trị MPTP, đặc biệt đối với động vật chi sau (p=0. 024, 0,009). Hơn nữa, sự cải thiện liên quan đến ECH liều cao(Echinacoside)cũng được quan sát thấy vào ngày điều trị thứ 14 (p=0. 0 15, 0,012), mặc dù cũng có một sự phục hồi tự phát nhỏ ở những con chuột bị MPTP. Liều ECH vừa phải (20 mg / kg / ngày) và thấp (10 mg / kg / ngày)(Echinacoside)các nhóm được điều trị cho thấy xu hướng có độ dài sải chân dài hơn, tuy nhiên, sự khác biệt giữa chúng và những con chuột được điều trị bằng phương tiện MPTP là không đáng kể.

Hình 2 - ECH(Echinacoside)cải thiện tình trạng suy giảm dáng đi do tiêm MPTP bán cấp. A: Chiều dài sải chân của tay trước. Chiều dài ngón tay trước trong bài kiểm tra phân tích dáng đi cho thấy sự giảm đáng kể ở nhóm MPTP cộng với NS (nước muối) so với nhóm NS cộng với NS vào ngày thứ 7 của điều trị bằng phương tiện MPTP, nhưng những thiếu hụt này đã được ngăn chặn bằng liều ECH cao.(Echinacoside)(30 mg / kg / ngày) khi đo ở ngày thứ 7 và 14 của đợt điều trị. B: Chiều dài sải chân của thanh răng sau. Chiều dài sải chân sau của những con chuột bị tổn thương MPTP giảm rõ ràng so với những con đối chứng với nước muối vào ngày thứ 7 của phương pháp điều trị MPTP, và nó cũng được cải thiện đáng kể khi sử dụng ECH liều cao.(Echinacoside). Dữ liệu được biểu thị dưới dạng trung bình ± SEM (n =10 mỗi giá trị). * P< 0.05="" vs.="" ns+ns="" group;="" #="">< 0.05="" vs.="" mptp+ns="">

Echinacosideở Cistanche cóChất dinh dưỡng thần kinhvàthần kinhẢnh hưởng lênParkinsondịch bệnh

2.2. ECH(Echinacoside)làm giảm sự mất mát của tế bào thần kinh TH dương tính nigral và sợi trục TH dương tính thể vân ở những con chuột bị tổn thương MPTP bán cấp tính

Sau khi kết thúc 14 ngày điều trị bằng ECH(Echinacoside)hoặc phương tiện và hoàn thành đánh giá hành vi, một nửa số chuột trong mỗi nhóm đã bị hy sinh để phát hiện phản ứng miễn dịch Nissl và TH. Các phần trung mô tràng hoa đại diện có chứa các sợi và tế bào thần kinh TH dương tính trong chất nền (SNpc) và thể vân của chuột được thể hiện trong Hình. 3A, B, C, D. Đã có sự giảm đáng kể số lượng tế bào thần kinh Nissl dương tính (chỉ dương tính với cresyl tím) và tế bào thần kinh TH dương tính (cả hai tế bào thần kinh dương tính TH và cresyl tím) trong SNpc đối với nhóm bị tổn thương MPTP được điều trị bằng phương tiện so với chuột đối chứng không bị tổn thương (71,89% và 67,97% đối chứng nhiễm mặn, p=0. 000, 0. 000, Hình 3A, B, E) . Ở chuột được uống hàng ngày ECH liều cao(Echinacoside)số lượng tế bào thần kinh dương tính với Nissl và TH dương tính cao hơn đáng kể so với số tế bào thần kinh được điều trị bằng phương tiện MPTP (135,39 phần trăm và 134,24 phần trăm ở nhóm kiểm soát MPTP, p=0. 000) ​​và thậm chí còn gần với tỷ lệ của những con chuột đối chứng không bị tổn thương (97,34% và 91,25%). Tác dụng tương tự nhưng yếu hơn cũng được thấy ở nhóm điều trị ECH liều vừa phải (125,39 phần trăm và 124,59 phần trăm kiểm soát MPTP, p=0. 0 02, 0,004). Nhưng điều trị ECH liều thấp không mang lại hiệu quả cứu chữa đáng kể. Mặt khác, xu hướng thay đổi tương tự đối với các tế bào thần kinh dương tính Nissl và TH dương tính trong SNpc đã loại trừ sự can thiệp vào kết quả do sự điều chỉnh của enzym TH.

Kèm theo sự mất tế bào thần kinh DA trong mô hình MPTP của PD(Parkinsondịch bệnh)là sự giảm các sợi TH dương tính qua thể vân. Chúng tôi đã quan sát thấy sự phân mảnh rõ ràng của sợi trục dương tính với TH trong thể vân của động vật bị MPTP nhưng tổn thương đã được cải thiện trong ECH(Echinacoside)nhóm điều trị, đặc biệt trong trường hợp ECH liều cao(Echinacoside)(Hình 3D). Hơn nữa, phân tích mật độ quang học (OD) của các sợi dương tính TH cho thấy sự mất mát đáng kể của các đầu cuối DA trong nhóm được xử lý bằng phương tiện MPTP (47,37 phần trăm kiểm soát mặn, p=0. 001, Hình 3F). Ngược lại, một sự gia tăng tương đối rõ ràng về mật độ của các sợi TH dương tính đã được quan sát thấy ở những con chuột được tiêm ECH liều cao(Echinacoside)điều trị so với động vật đối chứng bị MPTP (203,17% đối chứng MPTP, p=0. 003, Hình 3C, F), đưa nó lên 96,24% mức đối chứng bình thường. Trong khi đó, nhóm ECH liều vừa phải cũng cho thấy tác dụng làm giảm thần kinh đáng kể nhưng yếu hơn (177,78 phần trăm kiểm soát MPTP, p=0. 022), trong khi liều thấp không cho thấy lợi ích.

2.3. ECH(Echinacoside)ức chế sự giảm DA vân trong mô hình chuột MPTP bán cấp tính của PD(Parkinsondịch bệnh)

Vào cuối thử nghiệm, hàm lượng DA trong thể vân trong mô hình MPTP được xử lý trên xe chỉ bằng 31,25 phần trăm so với đối chứng bình thường (p=0. 000, Bảng 1). Sau khi dùng ECH liều cao(Echinacoside)trong 2 tuần, hàm lượng DA tăng lên 47,97 phần trăm bình thường và cao hơn đáng kể so với những con chuột bị tổn thương MPTP (p=0. 015). Mặt khác, hàm lượng các chất chuyển hóa DOPAC giảm trong mô hình MPTP cũng được nâng lên bởi ECH(Echinacoside)so that the ratio of DOPAC/DA was not significantly changed (p>0. 05). Có vẻ như ECH(Echinacoside)không có quy định rõ ràng về sự dị hóa của DA.

2.4. ECH(Echinacoside)nâng cao protein DAT thể vân ở những con chuột bị tổn thương MPTP bán cấp tính

Phân tích Western blot cho thấy rằng MPTP gây ra một protein vận chuyển dopamine (DAT) rõ rệt trong mô thể vân so với nhóm kiểm soát nước muối 14 ngày sau lần tiêm cuối cùng (p =0. 000, Hình 4A, B ). Tuy nhiên, những động vật bị MPTP được điều trị bằng ECH liều cao và vừa phải(Echinacoside)ức chế quá trình giảm protein DAT (p {{0}}. 001, 0,046). Một liều ECH thấp cho thấy không có tác dụng làm tăng biểu hiện DAT.

2.5. ECH(Echinacoside)làm giảm các tế bào apoptosis ở phần tử của những con chuột bị MPTP bán cấp tính

Với sự hỗ trợ của kỹ thuật ghi nhãn đầu cuối dUTP-biotin qua trung gian deoxynucleotidyl transferase (TUNEL), nhiều tế bào apoptotic kết hợp các nhân nhuộm màu nâu sẫm cường độ cao và soma co lại đáng chú ý đã được phát hiện trong SNpc của những con chuột bị tổn thương MPTP bán cấp so với đối chứng bình thường ( p=0. 000, Hình 5A, B, C). Tuy nhiên, con vật được tiêm MPTP được điều trị bằng ECH liều cao và vừa phải(Echinacoside)đã chứng minh sự giảm đáng kể của các tế bào TUNEL dương tính so với mô hình MPTP được xử lý bằng nước muối (p=0. 000, 0. 003).

2.6. ECH(Echinacoside)làm tăng nồng độ mRNA và protein tương đối của GDNF và BDNF ở con chuột đáng kể bị tổn thương MPTP bán cấp tính

To define the changes in GDNF and BDNF expression at both transcriptional and protein levels after the different treatments real-time PCR and Western blot analysis were used. There were no significant differences in mRNA and protein levels of GDNF and BDNF in the ventral midbrain between the MPTP-vehicle treated animals and the saline control group at the end of the experiment (p>0. 05, Hình. 6A, B, C). Tuy nhiên, sau hai tuần điều trị bằng ECH liều cao(Echinacoside), mRNA và mức độ protein tương đối của GDNF đã tăng lên đáng kể so với những con chuột bị tổn thương MPTP được điều trị bằng phương tiện (2. {3}} lần mRNA và 184,34 phần trăm ở protein kiểm soát MPTP, p =0. {{{ 8}} 0 5, 0. 000). Những độ cao này cũng đáng kể khi so sánh với các động vật kiểm soát mặn (1. 97- lần và 142,63 phần trăm kiểm soát mặn, p=0. 003, 0,001, Hình 6A, C). Trong khi đó, ECH liều vừa phải(Echinacoside)hiển thị độ cao yếu hơn nhưng vẫn rõ ràng trong mức mRNA và protein của GDNF (2. 13- lần và 16 0. 55 phần trăm kiểm soát MPTP, p=0. 012, 0,001). Có những thay đổi tương tự trong biểu hiện của BDNF, có mức mRNA và protein tương đối cao hơn đáng kể trong ECH liều cao(Echinacoside)nhóm được điều trị so với chuột đối chứng bình thường hoặc ít MPTP (3,75 lần gấp và 185,93 phần trăm kiểm soát MPTP, p=0. 0 0 1, 0. 000; 2,33 lần và 154,39 phần trăm kiểm soát mặn, p=0. 002, 0,001, Hình 6A, C). Điều trị bằng ECH liều vừa phải(Echinacoside)tăng cả BDNF mRNA và biểu hiện protein (2,51 lần gấp và 162,69 phần trăm kiểm soát MPTP, p=0. 0 44, 0,002). Do đó ECH(Echinacoside)có thể làm tăng biểu hiện của cả mRNA và protein của GDNF và BDNF theo một số cách phụ thuộc vào liều lượng.

2.7. ECH(Echinacoside)làm giảm tỷ lệ mRNA và protein tương đối của Bax / Bcl -2 ở con chuột đáng kể bị tổn thương MPTP bán cấp tính

Ảnh hưởng của ECH(Echinacoside)về quá trình apoptosis, được biết là một yếu tố quan trọng khác liên quan đến việc mất tế bào thần kinh dopaminergic nigral trong PD(Parkinsondịch bệnh), were assessed by analyzing the Bax and Bcl-2 expression by Real-time PCR and Western Blot. The relative mRNA levels of the pro-apoptotic factor Bax increased in SN of MPTP-lesioned mice (2.14-fold of saline control, p=0.036), while those of the anti-apoptotic factor Bcl-2 were not significantly different with normal control mice (p>0. 05, Hình 7A). Tuy nhiên, tỷ lệ mRNA của Bax / Bcl -2 đã tăng lên đáng kể ở những con chuột bị tổn thương (1. 99- lần kiểm soát mặn, p =0. 002) và độ cao này có thể được đảo ngược bằng ECH liều cao(Echinacoside) after 14 days of treatment (37.12% of MPTP control, p=0.000, Fig. 7A) due to a slight down-regulation of Bax (82.71% of MPTP control, p>0. 05) và sự điều hòa rõ ràng của biểu hiện gen Bcl -2 (2. 39- lần kiểm soát MPTP, p =0. 000). Có những tác động tương tự nhưng yếu hơn đối với tỷ lệ mRNA Bax / Bcl -2 đối với ECH liều vừa phải(Echinacoside)so với những con chuột bị tổn thương MPTP được điều trị bằng phương tiện (63,88% kiểm soát MPTP, p =0. 016, Hình 7A). Bằng một cách nào đó, tỷ lệ protein của Bax / Bcl -2 đã tăng lên đáng kể ở những con chuột bị MPTP (265,97 phần trăm kiểm soát mặn, p =0. 000) và đảo ngược bởi mức cao và liều lượng vừa phải của ECH(Echinacoside)(52,33 phần trăm, 67,25 phần trăm kiểm soát MPTP, p =0. 000, 0. 001 Hình 7B, C), nhưng không bằng liều 10 mg / kg của ECH, phản ánh ảnh hưởng đến tỷ lệ Bax / Bcl -2 của mRNA.

3. Thảo luận

Trong nghiên cứu này, lần đầu tiên chúng tôi chứng minh rằng ECH(Echinacoside), một monome được chiết xuất từ ​​một loại thảo mộc truyền thống của Trung Quốc, có các hoạt động thần kinh trong mô hình chuột MPTP bán cấp của PD(Parkinsondịch bệnh)cũng như khả năng gây ra sự biểu hiện của LSNG ở cả mức độ phiên mã và protein. Sau 14 ngày uống, ECH(Echinacoside)đã chứng minh các tác dụng đa chức năng trong việc cứu vãn chức năng tế bào thần kinh dopaminergic, làm giảm sự giảm DAT, ức chế sự phát triển của một số tế bào chết rụng trong SNpc, và cải thiện chứng rối loạn dáng đi so với những con chuột bị tổn thương MPTP được điều trị bằng nước muối. Chúng tôi cho rằng các hoạt động thần kinh của ECH có liên quan ít nhất một phần đến độ cao tương đối của mRNA và biểu hiện protein của GDNF và BDNF cũng như quy định về Bax và Bcl -2, hai phân tử chính của Bcl {{3 }} họ tham gia vào quá trình apoptosis của tế bào thần kinh dopaminergic trong SN.

Mặc dù những phát hiện liên quan đến các cách điều trị khác nhau từ nhiều loại PD in vitro và in vivo(Parkinsondịch bệnh)các mô hình đầy hứa hẹn, bảo vệ thần kinh trong PD(Parkinsondịch bệnh)vẫn là một mục tiêu khó nắm bắt. So với các chiến lược bảo vệ thần kinh đã được xác định, hầu như luôn luôn yêu cầu điều trị trước (tức là dùng thuốc trước khi bị thương), các chiến lược phục hồi hoặc hồi phục thần kinh phù hợp hơn với phương thức can thiệp dược lý lâm sàng ở giai đoạn đầu của PD. Trong nghiên cứu của chúng tôi, ECH(Echinacoside)việc dùng thuốc được bắt đầu sau khi bị tổn thương MPTP, khác với nghiên cứu trước đó, và nó cho thấy những lợi ích rõ ràng. Một mục đích khác của việc điều trị bắt đầu muộn là để đảm bảo rằng bất kỳ tác dụng nào quan sát được đều không phải do hợp chất can thiệp vào việc chuyển đổi MPTP thành chất chuyển hóa có hoạt tính MPP cộng với nó, một phản ứng do MAO-B làm trung gian cũng như chức năng DAT được điều chỉnh nhanh tiềm ẩn và sau đó chặn sự hấp thu của MPP plus (Sagi và cộng sự, 2007; Lai và cộng sự, 2009).

Ai cũng biết rằng sự tồn tại của tế bào thần kinh đòi hỏi sự hỗ trợ dinh dưỡng. GDNF và BDNF là những yếu tố dinh dưỡng hứa hẹn nhất trong việc điều trị phục hồi hoặc chữa lành các bệnh thoái hóa thần kinh, đặc biệt là trong PD(Parkinsondịch bệnh). Cho đến nay, một số thử nghiệm lâm sàng đã được thực hiện để nghiên cứu việc cung cấp các yếu tố dinh dưỡng, đặc biệt là GDNF, trực tiếp đến não PD, nhưng chúng mang lại kết quả khác nhau. Vấn đề có thể do vị trí và phương pháp phân phối, cụ thể là sự phân bố GDNF sau các kỹ thuật tiêm hoặc truyền khác nhau (Lang và cộng sự, 2006; Morrison và cộng sự, 2007; Nutt và cộng sự, 2003; Slevin và cộng sự. , 2007). Trong các phương pháp điều trị sử dụng hệ thống phân phối dựa trên tế bào hoặc liệu pháp gen được áp dụng với các vectơ virut, sự biểu hiện quá mức của gen và protein GDNF có thể thúc đẩy khả năng tồn tại của tế bào trong tế bào thần kinh não giữa dopaminergic và cải thiện triệu chứng của chuột với 6- tổn thương OHDA và những con khỉ được điều trị với MPTP (Andereggen và cộng sự, 2009; Kong và cộng sự, 2008). Tuy nhiên, những liệu pháp này vẫn còn những vấn đề quan trọng liên quan đến ứng dụng lâm sàng của chúng do những câu hỏi về hiệu quả và tính ổn định của việc chuyển gen và khả năng đáp ứng miễn dịch (Mochizuki, 2009).
Mặc dù đã có những nỗ lực để khắc phục các vấn đề trong liệu pháp tế bào hoặc gen liên quan đến việc sinh nở thông qua phẫu thuật thần kinh, nhưng hiện nay người ta đang ngày càng chú ý đến các chiến lược gây ra sự biểu hiện của các yếu tố dinh dưỡng nội sinh hoặc tăng cường tín hiệu của chúng như là các lựa chọn điều trị thay thế cho PD(Parkinsondịch bệnh)(Chen và cộng sự, 2007a, b; Saavedra và cộng sự, 2008). Trong nghiên cứu này, lần đầu tiên chúng tôi báo cáo rằng ECH(Echinacoside)có tác dụng chữa bệnh thần kinh và dưỡng chất thần kinh trong PD(Parkinsondịch bệnh)mô hình chuột, và những tác động này có liên quan đến việc điều chỉnh tăng GDNF và BDNF ở mức mRNA và protein. Sự khác biệt đáng kể về số lượng sợi trục hoặc sợi trong ECH(Echinacoside)những con chuột được điều trị so với những con chuột bị tổn thương MPTP được điều trị bằng phương tiện đã chứng minh rằng hợp chất này thúc đẩy sự phát triển và tái tạo thần kinh. Đáng chú ý, mật độ sợi ở những con chuột được điều trị đã đạt đến mức bình thường không bị thương (∼96,24 phần trăm đối với ECH liều cao). Một lời giải thích tiềm năng cho số lượng tế bào thần kinh dương tính với TH rõ ràng cao hơn ở những con chuột bị tổn thương được điều trị bằng ECH là ECH bắt chước hoặc nâng cao vai trò của GDNF và BDNF, đặc biệt là GDNF có thể điều chỉnh mạnh mẽ khả năng tồn tại và biểu hiện kiểu hình của các tế bào thần kinh trung gian não dopamine và có thể bù đắp cho sự mất mát của tế bào (Palfi và cộng sự, 2002). Nói cách khác, có thể ECH điều chỉnh quá trình phiên mã của gen TH, tương tự như GDNF (Xiao và cộng sự, 2002). Do đó, nghiên cứu của chúng tôi không chỉ khẳng định ECH có lợi như một loại thuốc tự nhiên có trọng lượng phân tử thấp trên mô hình chuột MPTP mà còn chứng minh các cơ chế tiềm năng cho những tác động này phù hợp với sự điều hòa của các yếu tố dinh dưỡng.

EchinacosideTrongCistanchecóChất dinh dưỡng thần kinhvàthần kinhẢnh hưởng lênParkinsondịch bệnh

Một phát hiện thú vị khác trong nghiên cứu của chúng tôi là không có dấu hiệu kích hoạt rõ ràng nào đối với con đường sống sót MAPK / ERK1 / 2 hoặc Ras-PI3K-Akt đã được báo cáo là góp phần vào tác dụng chữa bệnh thần kinh của LSNG (Yu et al., 2006; Sagi et al. ., 2007). Vì p-ERK1 / 2 (dạng phosphoryl hóa hoạt hóa của MAPK) và p-Akt (dấu hoạt hóa của con đường Ras-PI3K-Akt) không được phát hiện thông qua phân tích Western blot trong não giữa của động vật bị tổn thương MPTP được điều trị bằng ECH liều cao (dữ liệu không được hiển thị). Một trong những lời giải thích có thể là thời gian phát hiện bị trễ vì hoạt động ERK thường tăng nhanh sau khi kích thích bằng thuốc (Hisaoka và cộng sự, 2007) và một xác suất khác là sự không tiến triển của các đường truyền tín hiệu này đối với hiệu ứng thần kinh hoặc dưỡng chất thần kinh của ECH trong mô hình chuột MPTP bán cấp. của PD(Parkinsondịch bệnh)mà cần được điều tra thêm.

Trong nghiên cứu của chúng tôi, phác đồ MPTP bán cấp trong PD(Parkinsondịch bệnh)Mô hình chuột gây ra apoptosis và các tổn thương dopaminergic ổn định sau 21 ngày sau khi dùng MPTP, phù hợp với ghi nhận của các tài liệu trước đây (Jackson-Lewis và Przedborski, 2007). Ức chế quá trình apoptosis có thể bảo vệ tế bào thần kinh chống lại các tổn thương từ thiếu hụt yếu tố dinh dưỡng đến các kích thích bệnh lý (Yuan và Yankner, 2000). Ngoài ra, LSNG có thể bảo vệ tế bào thần kinh chống lại quá trình chết rụng do ty thể xảy ra do sự kích hoạt con đường phosphatidylinositol -3- kinase (Toth và cộng sự, 2002). Được biết, quá trình apoptosis được điều chỉnh bởi một số con đường. Nghiên cứu trước đây liên quan đến các protein Bcl -2 ủng hộ quan điểm rằng các thành viên gia đình pro-apoptotic như vậy tham gia vào quá trình chết tế bào thần kinh trong nhiều loại PD(Parkinsondịch bệnh)mô hình (Levy và cộng sự, 2009). Các protein thúc đẩy quá trình apoptosis, bao gồm Bax, hoạt động trên cytochrome trong màng ti thể trong khi các protein ngăn chặn quá trình apoptosis, chẳng hạn như Bcl -2, hoạt động bằng cách dị đồng hóa với protein Bax và ngăn chặn hoạt động của chúng. Do đó, tỷ lệ Bax / Bcl -2 được biết đến để xác định một số tế bào sẽ sống hay chết (Tanaka và cộng sự, 2004). Nghiên cứu trước đây từ phòng thí nghiệm của chúng tôi đã chứng minh vai trò bảo vệ thần kinh và chống apoptotic tiềm năng của ECH(Echinacoside)trên các tế bào SH-SY5Y do MPP cộng với tạo ra thông qua phương pháp đo tế bào dòng chảy và các xét nghiệm khác liên quan đến quá trình apoptosis (Wang và cộng sự, 2007). Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành phân tích cơ sở phân tử của các tác động chống apoptotic của ECH(Echinacoside)in vivo trong nghiên cứu này. Chúng tôi nhận thấy rằng liều lượng điều trị ECH cao và vừa phải ức chế sự gia tăng cả về số lượng tế bào chết theo phương pháp TUNEL dương tính trong SNpc và tỷ lệ Bax / Bcl -2 ở mức độ gen và protein so với nhóm bị tổn thương MPTP. Những quan sát này cung cấp một số manh mối về cơ chế chống apoptotic tiềm năng của ECH bên ngoài tác động lên các họ caspase. Mặc dù nghiên cứu sơ bộ của chúng tôi chưa xác định được kiểu hình của các tế bào apoptotic, nghiên cứu trước đó cho thấy rằng các tế bào thần kinh TH dương tính trải qua quá trình thoái hóa apoptotic và mất hoạt động TH nhưng không phải tế bào thần kinh đệm trong mô hình chuột MPTP không cấp tính của PD (Novikova et al., 2006) . Ngoài ra, nghiên cứu của chúng tôi xác nhận thêm sự tham gia của các thành viên trong gia đình Bcl -2 trong cơ chế bệnh sinh của mô hình chuột PD bán cấp do MPTP gây ra.(Parkinsondịch bệnh). Vẫn chưa rõ liệu có những con đường chung liên quan đến mối quan hệ giữa các thành viên trong gia đình Bcl -2 và LSNG hay không. Tuy nhiên, kết quả hiện tại của chúng tôi cho thấy rằng việc tăng mức GDNF và / hoặc BDNF nội sinh và điều chỉnh các biểu hiện của các thành viên gia đình pro-apoptotic Bcl -2 có thể là một chiến lược hữu ích cho liệu pháp tái tạo tế bào thần kinh

Cuối cùng là ảnh hưởng của ECH(Echinacoside)về việc làm giảm suy giảm dáng đi trong mô hình chuột MPTP minh họa tiềm năng của nó là thuốc điều trị triệu chứng tập trung vào các mục tiêu nondopaminergic, hiện đang là trọng tâm của cuộc điều tra đầy hứa hẹn trong các thử nghiệm lâm sàng. Trong PD(Parkinsondịch bệnh), các triệu chứng vận động như rối loạn vận động và cứng khớp đáp ứng tốt với thuốc thay thế dopamine. Các vấn đề về thăng bằng và dáng đi cũng có thể được đảo ngược bởi các tác nhân dopaminergic sớm trong quá trình bệnh, nhưng chúng thường trở nên kháng thuốc khi bệnh tiến triển (Meredith và Kang, 2006). Trong nghiên cứu của chúng tôi, sử dụng ngắn hạn (7 ngày) với liều cao ECH(Echinacoside)đã có tác động tích cực đến chiều dài sải chân của chuột, cho thấy rằng nó có thể là một chất bổ sung đầy hứa hẹn cho các loại thuốc thay thế dopamine.

Cần lưu ý rằng nghiên cứu của chúng tôi cũng khảo sát sự biểu hiện của tế bào thần kinh đệm bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang, nhưng không quan sát thấy sự thay đổi biểu hiện tế bào thần kinh đệm hoặc vi hoạt hóa ở những con chuột bị tổn thương MPTP được điều trị bằng ECH.(Echinacoside)khi so sánh với chuột MPTP được xử lý bằng nước muối (dữ liệu không được hiển thị). Mặc dù vậy, chúng tôi có thể gợi ý rằng tác động của ECH(Echinacoside)không bị giới hạn ở các cực trên của hệ thống dopaminergic, và các nghiên cứu tiếp theo sẽ được yêu cầu để xác định vai trò đầy đủ của ECH và các cơ chế trong các mô hình động vật gặm nhấm hoặc linh trưởng của PD(Parkinsondịch bệnh).

Tóm lại, nghiên cứu hiện tại chứng minh rằng ECH(Echinacoside)thể hiện tác dụng của neurorescue đối với việc mất tế bào thần kinh dopaminergic dopaminergic gây ra bởi MPTP và sợi cơ in vivo cũng như suy giảm hành vi. Những tác dụng này dường như có liên quan đến các hoạt động đa yếu tố của hợp chất này, bao gồm giảm độc tính MPTP đối với DAT, tăng cường biểu hiện của các yếu tố dinh dưỡng thần kinh GDNF / BDNF và ngăn chặn quá trình chết rụng bất thường ở não giữa bụng của chuột bị tổn thương MPTP bán cấp thông qua cơ chế điều hòa Bcl {{ 1}} thành viên gia đình. Kết hợp với kết quả từ nghiên cứu trước đây của chúng tôi về tác dụng bảo vệ thần kinh của ECH(Echinacoside)trong ống nghiệm, chúng tôi cho rằng hợp chất này có khả năng không chỉ làm chậm sự tiến triển của PD(Parkinsondịch bệnh)mà còn để đảo ngược tổn thương thoái hóa thần kinh hiện có và thậm chí để cải thiện các triệu chứng. Cùng với đó, những dữ liệu này cho thấy rằng ECH(Echinacoside)là một cách tiếp cận đầy hứa hẹn, có thể áp dụng lâm sàng để điều trị PD(Parkinsondịch bệnh).

4. Quy trình thí nghiệm

4.1. Giao thức động vật

Tất cả các quy trình đã được phê duyệt bởi Ủy ban Đạo đức Động vật của Bệnh viện Trung Sơn Đại học Fudan và được thực hiện theo Hướng dẫn của Viện Y tế Quốc gia về Chăm sóc và Sử dụng Động vật Phòng thí nghiệm.

Thí nghiệm được tiến hành trên những con chuột đực C57BL / 6 mua từ Công ty Động vật Phòng thí nghiệm Slac Thượng Hải (Thượng Hải, Trung Quốc) lúc 10 tuần tuổi và nặng 24–26 g. Các con vật được duy trì trong điều kiện tiêu chuẩn (chu kỳ sáng - tối 12 ⁄ 12 giờ, 21 ± 2 độ và độ ẩm tương đối là 40 phần trăm) và được phép tiếp cận với thức ăn và nước uống.

4.2. Quản lý MPTP

Chuột được tiêm phương tiện (nước muối) hoặc MPTP (30 mg / kg / ngày; Sigma, Mỹ) vào phúc mạc hàng ngày hòa tan trong nước muối sinh lý trong 5 ngày liên tiếp để gây bệnh Parkinson. Mỗi nhóm điều trị bao gồm mười con chuột. ECH được mua từ Chengdu Push Bio-Technology Co. Ltd (Tứ Xuyên, Trung Quốc). Dịch chiết phù hợp với Tiêu chuẩn Doanh nghiệp và đã được kiểm nghiệm bởi HPLC Greater hơn hoặc bằng 98 phần trăm. ECH(Echinacoside)đã được hòa tan trong nước muối sinh lý và điều chỉnh độ pH đến 7,4 trước khi nó được đưa ra bằng cách đưa vào dạ dày (tức là). Ảnh hưởng của ECH(Echinacoside)về bệnh parkinson do MPTP đã được nghiên cứu ở các nhóm thí nghiệm sau: Nhóm I, NS (nước muối, ip) cộng với NS (ig); Nhóm II, MPTP (ip) cộng với NS (ig); Nhóm III, MPTP (ip) cộng với ECH 10 mg / kg / ngày (ig); Nhóm IV, MPTP (ip) cộng với ECH 20 mg / kg / ngày (ig); Nhóm V, MPTP (ip) cộng với ECH 30 mg / kg / ngày (ig); Nhóm VI, NS (ip) cộng với ECH 30 mg / kg / ngày (ig).

Động vật trong Nhóm I – VI được uống nước muối hoặc MPTP (ip) hàng ngày trong 5 ngày; phương tiện (nước muối) hoặc ECH(Echinacoside)Điều trị (tức là) được bắt đầu trong 72 giờ sau lần dùng MPTP cuối cùng và dùng hàng ngày trong 14 ngày. Chuột bị giết do trật cổ tử cung hoặc truyền dịch sau lần quan sát hành vi và phương tiện cuối cùng hoặc ECH.

4.3. Kiểm tra dáng đi

Kiểm tra dáng đi được thực hiện theo các phương pháp đã được công bố trước đây (Fernagut và cộng sự, 2002; Fleming và cộng sự, 2004; Tillerson và cộng sự, 2002) với một sửa đổi nhỏ. Thiết bị bao gồm một đường băng, 4,5 cm (chiều rộng) × 40 cm (chiều dài) × 12 cm (chiều cao) được chiếu sáng bằng đèn (60 W) và một hộp gỗ màu đen, 20 cm (chiều rộng) × 17 cm (chiều dài) × 10 cm (chiều cao) đặt ở một đầu của đường băng. Bàn chân trước và sau của các con vật bị ướt bằng mực xanh bút chì và chúng được phép chạy lon ton trên một dải giấy (chiều rộng 4,5 cm, chiều dài 40 cm) xuống đường băng sáng rực về phía khung thành tối. Độ dài sải chân được đo thủ công là khoảng cách giữa hai bản in chân. Ba độ dài sải chân dài nhất (tương ứng với vận tốc tối đa) được đo từ mỗi lần chạy. Các dấu chân được thực hiện ở đầu (7 cm) và ở cuối (7 cm) của đường chạy đã bị loại trừ do vận tốc thay đổi. Các lần chạy trong đó người thử nghiệm quan sát thấy những con chuột dừng lại hoặc giảm tốc độ rõ ràng đã bị loại khỏi phân tích. Đánh giá hành vi được thực hiện 3 ngày trước khi tiêm MPTP đầu tiên và vào ngày thứ 7 và 14 của ECH(Echinacoside)hoặc phương tiện điều trị.

4.4. Truyền dịch và xử lý mô

Vào cuối thử nghiệm, một nửa số động vật (n {{0}}) trong mỗi nhóm đã bị hy sinh dưới 1 0 phần trăm quá liều chloral hydrate gây mê (36 0 mg / kg ) sau đó được truyền qua truyền trong tim với nước muối (0,9 phần trăm), tiếp theo là 4 phần trăm paraformaldehyde (PFA), pH7,4. Sau khi tưới máu trong tim, não được thu thập và cố định sau trong 4% PFA trong 24 giờ ở 4 độ, nhúng trong parafin, và cắt thành các phần tràng hoa 5 µm bao gồm toàn bộ phần nhỏ gọn cơ bản (SNpc) và thể vân (ST) (trước ruột mức: Bregma −2,92 mm đến − 3,64 mm và cộng 0,02 đến cộng 0. 86 mm) với sự hỗ trợ của tập bản đồ não chuột (Franklin và Paxinos, 1996).

5 con vật khác trong mỗi nhóm bị giết do trật cổ tử cung và mô của não giữa bụng và thể vân của chúng bị mổ xẻ nhanh chóng trên băng (Jackson-Lewis và Przedborski, 2007) được đông lạnh trong nitơ lỏng và được bảo quản ở -80 độ cho đến khi sử dụng.

EchinacosideTrongCistanchecóChất dinh dưỡng thần kinhvàthần kinhẢnh hưởng lênParkinsondịch bệnh

4.5. Hóa mô miễn dịch Tyrosine hydroxylase và Nissl

Hóa mô miễn dịch của các mô não đã được thực hiện như đã mô tả trước đây (He và cộng sự, 2 0 0 8; Yokoyama và cộng sự, 2 0 0 8) với những sửa đổi nhỏ. Tóm lại, một tập hợp các phần qua SNpc (bao gồm 14–15 phần) đã được chuẩn bị để nhuộm Nissl (cresyl tím) bằng cách sử dụng các quy trình thông thường trong khi một bộ khác qua SNpc và một bộ qua ST (gồm 15–16 phần) đã được xử lý đối với hóa mô miễn dịch tyrosine hydroxylase (TH). Các phần sau được ủ với 0. 3 phần trăm hydrogen peroxide (H2O2) trong 1 0 phút ở nhiệt độ phòng để loại bỏ hoạt tính peroxidase nội sinh và sau đó được đặt trong bộ đệm chặn có chứa 1 0 phần trăm huyết thanh dê với 0. 2 phần trăm Triton X -100 trong 0,01 M PBS (pH 7,2) trong 30 phút ở 37 độ. Trong mỗi lần xử lý, các phiến kính được rửa ít nhất ba lần với 0,01 M PBS, mỗi lần trong 5 phút. Sau đó, chúng được ủ ở 4 độ qua đêm với kháng thể đơn dòng kháng TH của chuột (Sigma, Hoa Kỳ) ở độ pha loãng 1: 2000 trong 0,01 M PBS chứa 1% huyết thanh dê và 0,2% Triton X -100. Vào ngày thứ hai, các phần được xử lý trong 30 phút với IgG chống chuột được đánh dấu biotin và sau đó được xử lý bằng phức hợp streptavidin-peroxidase (ABC kit, Vector, USA). Phản ứng peroxidase được hình dung bởi 0,05% diaminobenzidine (DAB) với 0,03% H2O2 trong đệm Tris – HCl. Các phần thông qua SNpc được đánh dấu bằng cresyl violet (Sigma, Hoa Kỳ) cũng như để tham khảo giải phẫu. Đối với các đối chứng, các phần được xử lý như mô tả ở trên, ngoại trừ việc không có kháng thể chính được sử dụng. Các phần kiểm soát là phản ứng miễn dịch

4.6. Định lượng các tế bào thần kinh và sợi có hoạt tính miễn dịch TH

Mỗi phần thứ 10 (tổng số 14–15 phần) qua SNpc tương ứng với Bregma −2,92 mm đến −3,64 mm được phân tích bằng kính hiển vi Olympus BX51 với máy ảnh DP71 (Olympus, Hoa Kỳ). Sau khi xác định SNpc ở độ phóng đại thấp (vật kính 4 ×) theo tập bản đồ não chuột, các tế bào phản ứng miễn dịch nhuộm Nissl và TH ở phía bên phải được đếm bởi hai quan sát viên bị mù khi điều trị ở độ phóng đại cao hơn (vật kính 20 ×) . Cả hai tế bào có nhân đều được đếm TH dương tính (TH và cresyl tím dương tính) và nhuộm Nissl (cresyl tím dương tính) để đảm bảo rằng tác dụng điều trị có liên quan đến sự gia tăng tế bào TH chứ không phải là sự điều chỉnh tăng của enzym. Lưu ý rằng các phân tích về cấu hình phản ứng miễn dịch TH bị hạn chế đối với SNpc và do đó loại trừ vùng tegmental bụng.

Mật độ quang học (OD) của sợi dopaminergic thể vân được phân tích trên máy tính bằng phần mềm Image-Pro Plus, theo phương pháp tách quang học được mô tả trước đây (Burke, et al., 199 0; Wu et al., 2 { {5}} 02). Việc ghi nhãn trung bình cho mỗi khu vực được tính toán trên năm phần não khớp tự động của cùng một con vật tương ứng với Bregma cộng 0,38 mm– cộng thêm 0,50 mm trong tập bản đồ não chuột (n=5 mỗi nhóm). Mặt bên phải của hình ảnh vân được thu được ở cùng một độ phóng đại (vật kính 10 ×) và OD của màu do đó được đánh giá tự động cho toàn bộ khu vực của các mặt cắt. Các cường độ nền được lấy từ callosum thể không có nhuộm TH đã được trừ khỏi mọi phép đo.

4.7. Thử nghiệm TUNEL

Các phần vỏ não nối tiếp qua SNpc tương ứng với Bregma −2,92 mm đến −3,64 mm được thu thập với sự hỗ trợ của tập bản đồ não chuột (Franklin và Paxinos, 1996). Theo hướng dẫn và tài liệu của nhà sản xuất có sửa đổi nhỏ (Novikova et al., 2006; He et al., 2008). Các đối chứng âm tính được thực hiện song song mà không có deoxynucleotidyl transferase tận cùng. Các phần cuối cùng được nhuộm bằng hematoxylin. Tổng số tế bào dương tính TUNEL trên một trang chiếu (tổng số 14–15 phần, phía bên phải) từ mỗi con vật được đếm mù dưới kính hiển vi ánh sáng ở độ phóng đại vật kính 20 × trong ranh giới giải phẫu của SNpc.

4.8. HPLC

Mô vân được thử nghiệm để tìm mức độ DA và các chất chuyển hóa của nó bằng cách sử dụng hệ thống sắc ký lỏng áp suất cao (HPLC) Coulochem III với phát hiện điện hóa (ESA Inc., Chelmsford, MA) như được mô tả trước đó với một sửa đổi nhỏ (Petroske và cộng sự, 2 {{ 4}} {{1 0}} 1; Schneider và cộng sự, 2006). Một cách ngắn gọn, thể vân được tách ra và cân (mặt trái), đặt trong các ống nhựa, đồng nhất bằng sóng siêu âm trong 10 s trong axit perchloric 0,4 M, và ly tâm ở tốc độ 15, 000 vòng / phút trong 20 phút ở 4 độ. Các chất nổi phía trên được chuyển qua bộ lọc milipore 0. 2- μm. Pha động, bao gồm 100 mM NaH2PO4, 50 mM axit xitric, 6% metanol, 1,7 mM 1- axit sulphonic trị số octan, 50 μM EDTA, 10% axetonitril, được phân phối với tốc độ dòng 0,6 ml / phút ở 25 độ so với cột pha đảo ngược. Phần lớn 20 ul của dung dịch nổi trên được bơm vào bằng thiết bị lấy mẫu tự động HPLC với mô-đun làm mát được đặt ở 4 độ. Dữ liệu đã được hiệu chuẩn với một tiêu chuẩn bên ngoài. Mức dopamine và các chất chuyển hóa của nó được tính toán và biểu thị bằng ng / mg trọng lượng mô ướt.

4.9. PCR thời gian thực

RNA tổng số được phân lập bằng cách đồng nhất mô đông lạnh của não giữa bụng (bên trái) trong 1 ml thuốc thử Trizol (Invitrogen, Hoa Kỳ) sau đó là kết tủa isopropanol (n=5). Viên nén được rửa bằng 70% ethanol và lơ lửng trong nước không có RNase, và nồng độ RNA được xác định bằng máy tính GeneQuant RNA / DNA (Amersham Biosciences, NJ). RNA (1 ug) được lấy làm mẫu và tổng hợp cDNA được thực hiện bằng Kit thuốc thử PrimeScriptTM RT (Takara, Nhật Bản). Khuếch đại SYBR Green PCR được thực hiện trong thiết bị PCR thời gian thực Realplex4 S (Eppendorf, Đức; Premix Ex TaqTM, Takara). Là một chất kiểm soát nội sinh, -actin được dán nhãn bằng thuốc nhuộm phóng thích. Các điều kiện cấu hình vòng quay nhiệt như sau: biến tính ban đầu 95 độ 3 phút, sau đó 40 chu kỳ biến tính 95 độ 15 giây, ủ 61 độ 15 giây, với độ giãn cuối cùng là 72 độ 45 giây. Sự thay đổi nếp gấp tương đối được xác định bằng phương pháp 2− ΔΔCt như đã mô tả trước đây (Livak và Schmittgen, 2001). Trình tự mồi như sau trong Bảng 2. Tất cả các mồi được thiết kế theo các tài liệu liên quan và được tổng hợp bởi Genemed Company.

4.10. phong cách phương Tây

Đối với phân tích Western blot, các mô cô lập từ thể vân (đối với xét nghiệm DAT và -actin) hoặc não giữa bụng (đối với xét nghiệm GDNF, BDNF, Bax, Bcl -2 và -actin) được đồng nhất trong đệm RIPA (5 {{9} } mM Tris pH 7,4, 15 0 mM NaCl, 1 phần trăm NP – 40, 0,5 phần trăm natri deoxycholat, 0,1 phần trăm SDS và natri orthovanadat, natri florua, EDTA, leupeptin) và được ly tâm ở 13, 000 vòng / phút ở 4 độ trong 5 phút. Tổng hàm lượng protein trong phần nổi được xác định bằng cách sử dụng Bộ xét nghiệm protein BCA với máy quang phổ, và nó được pha loãng đến nồng độ cuối cùng thích hợp với dung dịch đệm đồng nhất và dung dịch hòa tan protein. Mẫu được đun sôi trong 3 phút và 20 ul (chứa 30 ug protein) của mỗi mẫu được áp dụng với gel SDS polyacrylamide (10%) để điện di. Gel được chạy ở 80 V trong 2 giờ sau đó được chuyển điện di sang màng nitrocellulose trong đệm chuyển bằng cách sử dụng Trans-Blot SD (Bio-Rad) ở 20 V trong 1,5 giờ, sau đó được khóa lại bằng cách ngâm trong TBST chứa 1 phần trăm BSA trong 4 giờ. ở RT và ủ ở 4 độ qua đêm với các kháng thể chính tương ứng: thỏ chống DAT (1: 200, Chemicon International Inc, USA), chuột chống GDNF, BDNF (1: 200, Santa Cruz Biotechnology, USA), chuột chống Bax, Bcl -2, -actin (1: 1000, Santa Cruz). Sau khi rửa ba lần trong TBST trong 10 phút, các đốm màu được ủ trong 2 giờ ở RT với liên hợp IgG-peroxidase chống thỏ (1: 2000, Santa Cruz). Hoạt động miễn dịch được hình dung bằng hệ thống phát hiện huỳnh quang ECL (GE, Hoa Kỳ). Các đốm màu được quét bởi KODAK In-Vivo Multispectral Imaging Systems FX (Carestream Health, USA) trong thời gian phơi sáng 5 phút và ảnh được CCD thu nhận tự động. Cường độ của các dải protein được đo bằng phương pháp đo mật độ và được biểu thị bằng tỷ lệ trên cường độ -actin để đảm bảo rằng sự thay đổi mức protein không chỉ do sự khác biệt về lượng tải mẫu (Matsunaga và cộng sự, 2006)

4.11. Phân tích thống kê

Tất cả dữ liệu được biểu diễn dưới dạng trung bình ± SEM. ANOVA một chiều theo sau là phân tích hậu kỳ về bài kiểm tra so sánh nhiều lần HSD và Student– Newman – Keuls của Tukey được thực hiện cho mục đích thống kê. Một giá trị của p< 0.05="" was="" considered="" statistically="">

Sự nhìn nhận

Công việc này được hỗ trợ bởi Chương trình Hỗ trợ Khoa học và Kỹ thuật, Bộ Khoa học và Công nghệ Trung Quốc (số 2006BAI04A 11-3), và Sự tài trợ của Lãnh đạo Y tế bởi Chính quyền Thành phố Thượng Hải (Số 2007- 057). Chúng tôi cảm ơn Giáo sư Fang Huang và Giáo sư Danian Zhu đã hướng dẫn họ về các thí nghiệm và bản thảo.

EchinacosideTrongCistanchecóChất dinh dưỡng thần kinhvàthần kinhẢnh hưởng lênParkinsondịch bệnh

Từ: 'Tác dụng dưỡng thần kinh và chữa bệnh thần kinh củaEchinacosidetrong mô hình chuột MPTP phụ củaParkinsondịch bệnh' quaQing Zhao, et al

--- BRAIN RESEARCH 1346 (2010) 224-236