Phần Ⅰ Giá trị bổ trợ của Herba Cistanches khi được sử dụng kết hợp với Statin trong các mẫu Murine

Elaine Wat, Chun Fai Ng, Chi Man Koon, Cheng Zhang, Si Gao, Brian Tomlinson & Clara Bik San Lau

1 Viện Y học Trung Quốc, Đại học Trung Quốc Hồng Kông, Shatin, Lãnh thổ mới, Hồng Kông.

2 Phòng thí nghiệm trọng điểm của Nhà nước về Hóa thực vật và Tài nguyên Thực vật ở Tây Trung Quốc, Đại học Trung Quốc Hong Kong, Shatin, New Territories, Hong Kong.

3 Khoa Dược lâm sàng, Khoa Y và Trị liệu, Đại học Trung Quốc Hong Kong, Shatin, New Territories, Hong Kong. Elaine Wat và Chun Fai Ng đã đóng góp không kém vào tác phẩm này. Thư từ và yêu cầu tài liệu phải được gửi tới CBSL (email: claralau@cuhk.edu.hk)

Để biết thêm thông tin: emily.li@wecistanche.com

Bấm vào đây để biết thêm thông tin về Cistanche

trừu tượng

Statin được biết đến là có các vấn đề về nhiễm độc cơ.HerbaCistanches(HC) là một loại thảo mộc truyền thống của Trung Quốc được sử dụng để giảm đau ở thăn lưng và đầu gối. Nghiên cứu in vitro trước đây của chúng tôi cho thấy rằng nó có thể bảo vệ chống lại độc tính trên cơ do statin. Tuy nhiên, nó là tác dụng bảo vệ in vivo chưa bao giờ được nghiên cứu. Mục tiêu của nghiên cứu này là xác định xem chất chiết xuất từ ​​nước củaHerbaCistanche(HCE) có thể ngăn ngừa ngộ độc cơ do simvastatin ở chuột và liệu Herba Cistanche E cũng có thể phát huy tác dụng có lợi trong việc giảm tăng cholesterol máu do chế độ ăn nhiều chất béo và tăng cholesterol gan, do đó giảm liều simvastatin khi được sử dụng trong liệu pháp kết hợp. Từ kết quả của chúng tôi, Herba Cistanche E đã khôi phục đáng kể việc giảm trọng lượng cơ do simvastatin gây ra và giảm tăng creatine kinase trong huyết tương ở chuột.HerbaCistancheE cũng cải thiện việc giảm nồng độ glutathione trong cơ do simvastatin gây ra, điện thế màng ty thể của cơ và giảm viêm cơ do simvastatin. Hơn nữa, HCE có thể làm giảm trọng lượng gan, tổng mức lipid gan và mức lipid huyết tương ở những con chuột được cho ăn nhiều chất béo. Kết luận, nghiên cứu của chúng tôi đã cung cấp bằng chứng in vivo rằngHerba CistancheE có tác dụng bảo vệ tiềm tàng đối với độc tính do simvastatin gây ra ở cơ, và cũng có tác dụng có lợi đối với gan nhiễm mỡ không do rượu do chế độ ăn uống và tăng lipid máu khi được sử dụng một mình hoặc kết hợp với simvastatin ở liều giảm.

Các chất ức chế HMG-CoA reductase, còn được gọi là statin, được ghi nhận là có lợi cho bệnh nhân tăng cholesterol máu có nguy cơ mắc bệnh tim mạch trung bình và cao1. Statin, một trong những nhóm thuốc kê đơn bán chạy nhất trên thế giới, hoạt động thông qua việc ức chế sự giảm HMG-CoA thành axit mevalonic trong giai đoạn đầu của con đường mevalonat để giảm tổng hợp cholesterol nội sinh 2, 3. Mặc dù statin thường được dung nạp tốt , một trong những tác dụng ngoại ý quan trọng nhất và được biết đến trên lâm sàng là bất thường cơ xương, có thể từ đau cơ lành tính đến bệnh cơ nặng4, 5. Trong một cuộc khảo sát lớn trên 10.409 đối tượng người Pháp được thực hiện thông qua một cuộc phỏng vấn qua điện thoại, 10% bệnh nhân nhận được Điều trị bằng statin báo cáo các triệu chứng về cơ, từ đó 30% bệnh nhân có triệu chứng này dẫn đến việc ngừng điều trị6. Lực lượng Đặc nhiệm An toàn Statin của Hiệp hội Lipid Quốc gia đã đưa ra các khuyến nghị về việc quản lý các triệu chứng liên quan đến cơ ở những bệnh nhân đang điều trị bằng statin. Nói chung, người ta khuyên rằng ở những bệnh nhân có các triệu chứng nghiêm trọng như tăng creatine kinase (CK) trên 5 × ULN, nên ngừng sử dụng statin, cho đến khi mức CK bình thường trở lại5. Do sự xuất hiện của những tác dụng phụ này và không có phương pháp điều trị hiệu quả nào đối với ngộ độc cơ do statin, do đó, người ta thúc giục tìm kiếm các liệu pháp mới để kiểm soát các vấn đề về cơ do statin.

Trong khi một số cơ chế được đề xuất và có thể chịu trách nhiệm về các tác dụng phụ của statin, cơ chế ty thể được cho là có liên quan đến tác dụng phụ gây độc cho cơ của statin1. Mevalonate không chỉ là tiền chất cholesterol mà còn là tiền chất của các hợp chất quan trọng, chẳng hạn như selenoprotein, dolichol, và ubiquinone7, 8. Statin có thể điều chỉnh giảm selenoprotein như glutathione peroxidase (GPx), làm ảnh hưởng đến mật độ chất chống oxy hóa và góp phần gây bất lợi cho nó efects4. Statin cũng có thể dẫn đến cạn kiệt ubiquinone, gây giảm tiêu thụ oxy và tổng hợp ATP9. Hơn nữa, các nghiên cứu in vitro và in vivo ngày càng tăng đã chứng minh rằng statin cũng có thể tác động trực tiếp lên ty thể mô gây tăng các loại oxy phản ứng (ROS) và stress oxy hóa ty thể, dẫn đến chết tế bào và do đó góp phần gây tổn thương gan và cơ.

HerbaCistanches, toàn bộ cây khô củaCistanchesa mạcYC Ma (họ Orobanchaceae), là thực vật ký sinh chủ yếu mọc ở các vùng sa mạc phía bắc và đông bắc Trung Quốc12. Theo y học Trung Quốc, cây Nhục thung dung có vị ngọt, tính ấm, vị mặn. Nó là một loại thảo dược bổ dương tăng cường sinh lực của Trung Quốc được dùng chủ yếu để điều trị chứng thận hư với các triệu chứng như liệt dương, vô sinh, xuất tinh sớm. Nó cũng là một loại thảo mộc Trung Quốc theo truyền thống được kê đơn cho bệnh nhân đau ở thăn lưng và đầu gối và thường được sử dụng trong các công thức của Trung Quốc để điều trị các vấn đề về cơ. - Hoạt động mệt mỏi của chiết xuất Herba Cistanches giàu polysaccharide và phenylethanoid ở chuột sau khi tập thể dục bằng cách giảm tổn thương cơ và cải thiện lưu trữ ATP15. Bên cạnh đó, công trình nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng chiết xuất methanol của Herba Cistanches có thể tăng cường sản sinh ATP của ty thể16.HerbaCistanchescũng đã được chứng minh là một chất chống oxy hóa mạnh và loại bỏ gốc tự do trong các cơ quan khác nhau, giảm stress oxy hóa và các hoạt động ROS trong các nghiên cứu in vivo17, 18. Trong một nghiên cứu gần đây do phòng thí nghiệm của chúng tôi thực hiện, chúng tôi đã chứng minh rằngHerbaCistancheschiết xuất nước đã ngăn ngừa đáng kể độc tính do simvastatin gây ra trong các tế bào cơ xương L6, cũng như giảm sản xuất ATP trong tế bào L6 do simvastatin được phục hồi phụ thuộc vào liều lượng, cho thấy tiềm năng củaHerbaCistancheschiết xuất nước trong việc bảo vệ chống lại độc tính cơ do statin19. Tuy nhiên, bằng chứng in vivo còn thiếu.

Do đó, chúng tôi đưa ra giả thuyết rằngHerbaCistancheschiết xuất nước (HCE) có thể có tác dụng hữu ích đối với độc tính trên cơ do simvastatin gây ra. Do đó, nghiên cứu này nhằm xác định xem việc sử dụng HCE có thể làm giảm độc tính trên cơ do simvastatin bằng cách sử dụng mô hình động vật in vivo hay không, và ngoài ra, liệu HCE có thể tạo ra các tác dụng có lợi trong việc giảm tăng cholesterol máu do chế độ ăn nhiều chất béo và tăng cholesterol gan hay không. , do đó giảm liều simvastatin được sử dụng.

Nguyên liệu và phương pháp

Xác thực và chiết xuất nguyên liệu thảo dược.

Nguyên liệu thảo mộc thô củaHerbaCistanches(Cistanche Desticola, có nguồn gốc từ Nội Mông) được mua từ Zi Xin, một nhà cung cấp nổi tiếng ở Quảng Châu, Trung Quốc. Herba Cistanches đã được xác thực về mặt hóa học bằng cách sử dụng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng siêu hiệu suất phù hợp với Dược điển Trung Quốc 201013 như đã mô tả trước đây19, vớiverbascosidevàechinacoside(được mua từ Viện Kiểm soát Dược phẩm và Sinh học Quốc gia, Trung Quốc) làm chất đánh dấu hóa học. Sau khi xác thực hóa học, mẫu phiếu mua hàng thảo mộc củaHerbaCistanchesđã được gửi tại Bảo tàng của Viện Y học Trung Quốc thuộc Đại học Trung Quốc Hồng Kông, với số mẫu chứng từ 2014-3434.

HerbaCistancheschiết xuất dạng nước đã được chuẩn bị như đã mô tả trước đây19. Tóm lại, 1 kg thảo mộc thô được ngâm trong 1 giờ, tiếp theo là chiết xuất hai lần bằng cách đun nóng trong 1 giờ trong điều kiện hồi lưu ở 100 độ bằng cách sử dụng 10 lần nước cất. Các chất chiết xuất từ ​​nước (HCE) sau đó được kết hợp và lọc, và dịch lọc được cô đặc dưới áp suất giảm ở 60 độ. Dịch chiết cô đặc được đông khô đến khô. Phần trăm năng suất là 50,1 phần trăm w / w. Tất cả bột chiết xuất được đóng gói hút chân không và bảo quản cho đến khi sử dụng.

Động vật thí nghiệm.

Simvastatin được mua từ SR Pharmasolutions Ltd. Chuột đực Sprague Dawley (180–200 g) và chuột đực C57Bl / 6J (8- tuần tuổi) do Trung tâm Dịch vụ Động vật Phòng thí nghiệm, Đại học Trung Quốc Hồng Kông cung cấp. Các thí nghiệm trên động vật đã được phê duyệt bởi Ủy ban Đạo đức Thí nghiệm Động vật của Đại học Hồng Kông Trung Quốc (Tham khảo số 12/074 / MIS). Tất cả các phương pháp thử nghiệm đều được thực hiện theo các hướng dẫn đã được phê duyệt do Ủy ban Đạo đức Thử nghiệm Động vật của Đại học Hồng Kông Trung Quốc quy định. Tất cả chuột (3 con / lồng) và chuột (5 con / lồng) được nhốt trong lồng tiêu chuẩn bình thường ở nhiệt độ không đổi 21 độ với chu kỳ sáng-tối 12- h. Mỗi lồng tiêu chuẩn chứa cây dương xỉ làm vật liệu lót chuồng. Tất cả các động vật đều được phép tiếp cận với chế độ ăn uống và nước.

Nghiên cứu độc tính trên cơ do statin ở chuột cống.

Tất cả chuột được chia ngẫu nhiên thành 5 nhóm (n =5 - 1 0). Tất cả động vật đều ăn kiêng bình thường. Họ cũng được cho uống nước cất hoặc simvastatin hàng ngày, và có hoặc không điều trị HCE trong dạ dày. Đối với những động vật được yêu cầu cung cấp cả simvastatin và HCE, HCE được tiêm 3 giờ sau khi dùng simvastatin để ngăn chặn bất kỳ tương tác hóa học trực tiếp nào giữa thuốc và thảo mộc. Chiết xuất thảo dược te hoặc simvastatin được hòa tan trong 0,5% metylcellulose trong nước cất ở nồng độ đã biết. Một thể tích tính toán trước được đưa ra trong dạ dày cho mỗi con theo trọng lượng của cá thể để thể tích được tính toán chứa lượng liều đề xuất cần thiết. Chi tiết về các nhóm này như sau:

Nhóm a) Chế độ ăn bình thường chow và nước cất (nhóm đối chứng bình thường)

Nhóm b) Chế độ ăn bình thường chow chow cộng với simvastatin (640mg / kg)

Nhóm c) Chế độ ăn bình thường chow chow cộng với simvastatin (640mg / kg) cộng với HCE liều thấp (1,1 g / kg động vật)

Nhóm d) Chế độ ăn bình thường chow chow kết hợp với simvastatin (640mg / kg) cộng với HCE liều cao (2,2 g / kg con vật)

Nhóm e) Chế độ ăn bình thường chow chow cộng với HCE liều cao (2,2 g / kg động vật)

Lượng thức ăn được ghi lại hàng ngày và trọng lượng cơ thể được đo hai lần mỗi tuần. Điều trị được đưa ra trong 4 tuần. Sau đó, động vật được gây mê bằng cách sử dụng hỗn hợp ketamine (100mg / kg) và xylazine (10mg / kg) trong màng bụng. Máu đã được rút ra bằng cách chọc thủng tim và cho phép đông lại. Sau đó, huyết tương được tách ra bằng cách ly tâm (3, 000 vòng / phút trong 10 phút). Các cơ khác nhau (cơ tứ đầu, cơ bụng, cơ nhị đầu, cơ chày trước và cơ kéo dài) được cắt bỏ và lưu trữ ở -80 độ cho đến khi phân tích.

Đo creatine kinase huyết tương. Hoạt động của creatine kinase (CK) trong huyết tương được xác định bằng cách sử dụng bộ công cụ Stanbio CK Liqui-UV® (2910-430, Phòng thí nghiệm Stanbio, Hoa Kỳ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Đo glutathione peroxidase trong cơ. Glutathione peroxidase trong cơ (GPx) được đo bằng bộ kit bán sẵn trên thị trường (703102, Cayman Chemical, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tóm lại, các mô cơ được rửa bằng PBS ở pH 7,4 để loại bỏ bất kỳ tế bào hồng cầu nào, và đồng nhất trong 5–10ml đệm ly giải lạnh, sau đó chất đồng nhất được ly tâm ở 10, 000 g trong 15 phút ở 4 độ. Phần nổi phía trên sau đó được loại bỏ và kiểm tra hoạt tính GPx bằng cách sử dụng bộ dụng cụ thương mại.

Chuẩn bị phân đoạn ti thể và tế bào cơ. Các phân đoạn ti thể và tế bào từ các mẫu cơ được chuẩn bị bằng Bộ phân lập ty thể (MITOISO, Sigma-Aldrich Corporation, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tóm lại, các mẫu cơ tươi được xử lý trước bằng bơ chiết, cắt thành các miếng nhỏ và đồng nhất trong dung dịch đệm chiết. Các chất đồng nhất mô sau đó được ly tâm. Phần nổi phía trên được thu thập và dành riêng cho phân tích phân đoạn tế bào. Các viên ty thể sau đó được rửa sạch và ly tâm một lần nữa và được sử dụng để phân tích phân đoạn ty thể.

Đo lường các loài oxy phản ứng ty thể (ROS) của cơ. ROS được đo bằng giao thức được sửa đổi từ tài liệu trước đó20. Tóm lại, ROS được đo từ phần ty thể (50 µg protein / ml) bằng dung dịch DCFDA (C6827, Invitrogen, Hoa Kỳ). Hỗn hợp này được ủ ở 37 độ trong 10 phút trong bóng tối, sau đó được ủ với dung dịch cơ chất (10 mM pyruvate, 15 mM malate) để kích hoạt ảnh. Cường độ huỳnh quang được đo 5 phút một lần trong 60 phút bằng BioRad Fluostar Optima 413-101 BMG Fluorescent Microplate Reader ở bước sóng kích thích 485 nm và phát xạ 520nm. Cường độ huỳnh quang được tính toán để đo sự tạo ROS.

Điện thế màng ty thể của cơ. Điện thế màng ty thể của phần ty thể từ các mẫu cơ được xác định theo quy trình của Nhà sản xuất (MITOISO, Sigma-Aldrich Corporation, USA). Quy trình này là một thử nghiệm điểm cố định đo lường sự hấp thu của JC -1 với sự hình thành của các tập hợp J. Tóm lại, huyền phù ty thể được pha loãng để chứa 20 µg protein và được ủ với vết JC -1 trong 7 phút ở nhiệt độ phòng. 7- phút này là thời gian được Nhà sản xuất tối ưu hóa và xác nhận bằng cách sử dụng các hợp chất khác nhau (như đã nêu trong quy trình của nhà sản xuất) vì độ huỳnh quang quan sát được của dung dịch sẽ tăng lên ổn định sau 5–10 phút, sau đó là sự giảm mạnh huỳnh quang JC -1 do sự cân bằng của nồng độ JC -1 bên trong và bên ngoài ma trận ty thể. Cường độ huỳnh quang được đo bằng BioRad Fluostar Optima 413-101 BMG Fluorescent Microplate Reader ở bước sóng kích thích 490nm và phát xạ 590nm. Cường độ huỳnh quang được tính toán để đo độ dốc tiềm năng.

Mô học cơ và đánh giá tình trạng viêm. Hóa mô miễn dịch của các tế bào viêm trong cơ được đánh giá bằng phương pháp nhuộm CD68 và CD163 như đã mô tả trước đây21–23. Các đoạn parafn có kích thước 5 μm được cắt, dán vào lam kính Superfrost ™ Plus (Menzel-Gläser, Đức). Tế bào kháng thể chống chuột chính CD68, ED1 và CD163, ED2, (Bio-Rad, Hoa Kỳ) được áp dụng cho các phần ở độ pha loãng 1: 100. Nhuộm đặc hiệu được phát hiện bởi Hệ thống EnVision ™ (Dako, Đan Mạch), sử dụng kháng thể thứ cấp, IgG chống chuột liên hợp với polyme EnVision-HRP ở độ pha loãng 1: 200, và được phát hiện bằng dung dịch DAB (Dako, Đan Mạch), sau đó bằng cách đối màu với hematoxylin. Các phần sau đó được gắn trong dibutyl-phthalate trong histone (DPX). Sự hiện diện của bạch cầu trung tính trong cơ được phát hiện bằng phương pháp hóa mô miễn dịch định lượng bằng phần mềm ImageJ.

Phân tích biểu hiện gen cơ. Xét nghiệm PCR xác định các gen liên quan đến stress oxy hóa được thực hiện bằng cách sử dụng mảng PCR chống oxy hóa và chống oxy hóa của chuột (PARN -065 Z, SABiosciences, Frederick, USA). Mảng PCR được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tóm lại, RNA tổng số được phân lập bằng cách liên kết chọn lọc với màng dựa trên silica gel sau quá trình ly giải và đồng nhất các mẫu cơ trong dung dịch đệm guanidine thiocyanate biến tính (kit RNeasy, Qiagen). RNA được phiên mã ngược thành cDNA bằng cách sử dụng RT2 First Strand Kit (SABiosciences, Frederick, USA). CDNA này sau đó đã được thêm vào RT2 SYBR Green qPCR Master Mix (SABiosciences, Frederick, USA). Tiếp theo, mỗi mẫu được phân tích trên mảng PCR chống oxy hóa và chống oxy hóa của chuột (SABiosciences, Frederick, USA). Tất cả các bước được thực hiện theo quy trình của nhà sản xuất.

Nghiên cứu về chứng tăng lipid máu do chế độ ăn nhiều chất béo và nhiễm mỡ gan ở chuột.

Tất cả những con chuột được chia ngẫu nhiên thành 5 nhóm (n =8 - 1 0) và nhận được những thứ sau: Nhóm a) Chế độ ăn chow bình thường (Bảng 1); Nhóm từ b đến e) Chế độ ăn nhiều chất béo (chứa 21 phần trăm chất béo và 0. 15 phần trăm cholesterol) (Bảng 2). Chế độ ăn kiêng được đưa ra trong 8 tuần cho động vật gây béo phì. Sau 8 tuần, tất cả các nhóm ăn nhiều chất béo được cho uống nước cất, hoặc simvastatin hàng ngày, và hoặc điều trị HCE trong dạ dày, 3 giờ sau khi dùng simvastatin. Chiết xuất thảo dược Te hoặc simvastatin được hòa tan trong 0,5% methylcellulose (Tập đoàn Sigma-Aldrich, Hoa Kỳ) trong nước cất ở nồng độ đã biết. Một thể tích tính toán trước được đưa ra trong dạ dày cho mỗi con theo trọng lượng của cá thể để thể tích được tính toán chứa lượng liều đề xuất cần thiết. Chi tiết về các nhóm này như sau:

Nhóm a) Chế độ ăn bình thường chow và nước cất

Nhóm b) Chế độ ăn nhiều chất béo cộng với nước cất

Nhóm c) Chế độ ăn giàu chất béo cộng với simvastatin (50mg / kg)

Nhóm d) Chế độ ăn giàu chất béo cộng với HCE (4,4 g / kg)

Nhóm e) Chế độ ăn giàu chất béo cộng với simvastatin (25mg / kg) và HCE (4,4 g / kg)

Lượng thức ăn được ghi lại hàng ngày và trọng lượng cơ thể được đo hai lần mỗi tuần. Vào cuối 16- tuần nghiên cứu, tất cả các con chuột đều bị hy sinh sau khi nhịn ăn qua đêm 16- giờ. Con vật được gây mê bằng hỗn hợp ketamine (100mg / kg) và xylazine (10mg / kg) trong màng bụng. Máu đã được rút ra bằng cách chọc thủng tim và cho phép đông lại. Huyết tương được tách ra bằng cách ly tâm (3, 000 vòng / phút trong 10 phút). Gan được cắt bỏ và lưu trữ ở -80 độ cho đến khi phân tích.

Đo lipid huyết tương và gan.

Nồng độ chất béo trung tính trong huyết tương, cholesterol (11488872216 và 11489232216, Roche Diagnostics, Thụy Sĩ), nồng độ lipoprotein mật độ cao và mật độ thấp (L-Type HDL-C và L-Type LDL-C, Wako Pure Chemicals Industries, Nhật Bản) được đo bằng phương pháp enzym sử dụng bộ kit bán sẵn theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hoạt động của creatine kinase (CK) trong huyết tương được xác định bằng cách sử dụng bộ Stanbio CK Liqui-UV® (2910-430, Phòng thí nghiệm Stanbio, Hoa Kỳ). Tổng số lipid gan được xác định trọng lượng sau khi chiết xuất bằng phương pháp Bligh và Dyer24. Các lipid gan riêng lẻ được định lượng bằng enzym (như mô tả ở trên) sau khi hòa tan trong isopropanol (Sigma-Aldrich, Hoa Kỳ) 25.

Mô bệnh học gan và đánh giá tình trạng viêm. Nhuộm Hematoxylin và eosin (nhuộm H&E). Các phần tick (5 μm) của mô nhúng parafin được cắt bằng microtome và đặt trên các lam kính hiển vi SuperFrost Plus® (Thermo Scientific, Hoa Kỳ). Các phần được nhuộm H&E theo phương pháp của Harris và cộng sự. 26 và được gắn với dibutyl-phthalate trong histone (DPX) (Sigma-Aldrich, Hoa Kỳ) 25.

Nhuộm và định lượng Mac -3. Các phần dày (5 μm) của mô nhúng parafin được cắt bằng microtome và được đặt trên các lam kính hiển vi SuperFrost Plus® (Thermo Scientific, Hoa Kỳ). Việc thu hồi kháng nguyên được thực hiện, tiếp theo là ngăn chặn bằng Peroxidase Block (Dako Cytomation, Đan Mạch). Kháng thể Mac -3 chống chuột tinh khiết chính (BD Pharmingen, Hoa Kỳ) được áp dụng cho các phần ở độ pha loãng 1:50. Sự nhuộm màu cụ thể được phát hiện bằng Hệ thống EnVision ™ (Dako, Đan Mạch). Các slide được ủ với kháng thể thứ cấp, IgG kháng thỏ liên hợp với polyme EnVision-HRP ở độ pha loãng 1: 200. Mac -3 được phát hiện bằng cách sử dụng giải pháp DAB (Dako, Đan Mạch) và được chống lại bằng hematoxylin. Các phần sau đó đã được gắn trong DPX. Sự hiện diện của đại thực bào trong gan được phát hiện bằng phương pháp hóa mô miễn dịch định lượng bằng phần mềm ImageJ.

Phân tích thống kê. Sự khác biệt giữa các nhóm điều trị và nhóm chứng đã được kiểm tra bằng phân tích phương sai một chiều (ANOVA), sau đó là kiểm tra so sánh nhiều lần của posthoc Bonferroni. Tất cả các phân tích thống kê được thực hiện bằng GraphPad Prism Version 6. 0 (GraphPad, Hoa Kỳ). Một xác suất của p<0.05 would="" be="" considered="" statistically="">

Kết quả

Ảnh hưởng củaHerbaCistancheE về độc tính trên cơ do simvastatin ở chuột. Cân nặng cơ và đo creatine kinase huyết tương. Năm loại cơ khác nhau (cơ tứ đầu, cơ ức đòn chũm, cơ duy nhất, cơ chày trước, và cơ dây thần kinh kéo dài) được phân lập từ tất cả những con chuột được điều trị. Ảnh hưởng của các phương pháp điều trị khác nhau lên trọng lượng cơ được thể hiện trong Hình 1a. Simvastatin (640mg / kg) làm giảm trọng lượng đáng kể trên cơ tứ đầu, cơ ức đòn chũm và cơ chày trước ở chuột, trong khi những giảm này được HCE phục hồi đáng kể trên cơ tứ đầu và cơ ức đòn chũm phụ thuộc vào liều lượng. Mặc dùHerbaCistancheE đã thực hiện một xu hướng phục hồi trọng lượng của cơ trước xương chày ở chuột được điều trị bằng simvastatin, không có nhóm nào trong số các nhóm điều trị này đạt được ý nghĩa thống kê. Không có ảnh hưởng đáng kể nào của việc điều trị HCE đơn độc lên trọng lượng cơ khi so sánh với chuột đối chứng (Hình 1a).

Hình 1b cho thấy tác động của các phương pháp điều trị khác nhau đối với nồng độ creatine kinase (CK) trong huyết tương ở chuột. Simvastatin gây ra sự gia tăng đáng kể hoạt động của creatine kinase ở chuột, điều này đã giảm đáng kể khi đồng điều trị với HCE ở cả hai liều. Cũng không có ảnh hưởng đáng kể của việc điều trị HCE đơn độc lên mức CK so với nhóm chứng. Vì dạ dày có vẻ nhạy cảm với điều trị simvastatin và nó là cơ lớn nhất được phân lập theo khối lượng, do đó, chúng tôi đã chọn cơ này để phân tích sâu hơn bao gồm đo glutathione peroxidase ở cơ (GPx), đo MMP và ROS của ty thể, mô học cơ và đánh giá viêm .

Đo glutathione peroxidase (GPx) trong cơ. Mức độ peroxidase glutathione trong cơ được đo và thể hiện trong Hình 2a. Sử dụng simvastatin gây ra xu hướng giảm đo glutathione peroxidase (GPx) trong cơ ở chuột. Tuy nhiên, HCE có xu hướng cải thiện việc giảm GPx cơ do simvastatin gây ra ở cả hai liều 1,1 g / kg và 2,2 g / kg. Cũng không có ảnh hưởng đáng kể nào của việc điều trị HCE đơn thuần đối với mức GPx của cơ so với chuột đối chứng bình thường.

Đo tiềm năng màng ty thể (MMP) và ROS. Điều trị bằng simvastatin (640mg / kg) làm giảm đáng kể MMP ở cơ (Hình 2b). Sự giảm này được cải thiện phụ thuộc vào liều lượng ở những con chuột được điều trị đồng thời HCE và simvastatin (Hình 2b). Mặt khác, điều thú vị là nhóm điều trị đơn độc simvastatin đã giảm đáng kể mức ROS ty thể ở cơ so với nhóm đối chứng bình thường (Hình 2c). Tuy nhiên, điều trị HCE cho chuột được điều trị bằng simvastatin có xu hướng phụ thuộc vào liều lượng để khôi phục mức ROS ty thể cơ về mức bình thường. Cũng không có tác dụng đáng kể của việc điều trị HCE đơn độc ở chuột so với nhóm đối chứng bình thường đối với cả phép đo MMP và ROS ty thể.

Mô học cơ và đánh giá tình trạng viêm. Các cơ dạ dày ruột từ những con chuột được điều trị khác nhau đã được phân tích thêm về mặt mô học và các phần nhuộm màu đại diện được thể hiện trong Hình 3a. Các động vật thuộc nhóm đối chứng đã chứng minh các phần mô học của các cơ bình thường. Ngược lại, các phần H&E của động vật được điều trị bằng simvastatin cho thấy sự xâm nhập của các dấu hiệu viêm (mũi tên màu vàng), điều này đã giảm đáng kể ở các phần cơ đó của chuột khi kết hợp simvastatin và HCE. Các phân tích hóa mô miễn dịch cũng được thực hiện đối với sự hiện diện của đại thực bào CD68 và CD163 tương ứng trong Hình 4a và 5a, với định lượng của các đại thực bào tương ứng được trình bày trong Hình 4b và 5b. Phân tích hóa mô miễn dịch của các phần cơ cho thấy sự hiện diện của đại thực bào (CD68) ở chuột được điều trị bằng simvastatin (màu nâu), giảm đáng kể ở chuột được đồng điều trị HCE ở cả hai liều (Hình 4b). Cũng không có tình trạng viêm đáng kể nào được quan sát thấy ở động vật được điều trị HCE một mình. Tương tự, phân tích hóa mô miễn dịch của các phần cơ cho thấy sự hiện diện của đại thực bào dương tính CD 163- ở chuột được điều trị bằng simvastatin (màu nâu), giảm đáng kể ở chuột được đồng điều trị HCE ở 2,2 g / kg (Hình 5b ). Cũng không có tình trạng viêm đáng kể nào được quan sát thấy ở động vật được điều trị HCE một mình.

Phân tích biểu hiện gen cơ. Để xác định tác động của simvastatin và HCE lên các gen liên quan đến stress oxy hóa trong cơ, xét nghiệm PCR xác định cấu hình gen liên quan đến stress oxy hóa đã được thực hiện bằng cách sử dụng mảng PCR chống oxy hóa Rat Oxidative Stress và Antioxidant Defense. Các gen bị ảnh hưởng đáng kể khi điều trị bằng simvastatin được phân tích và trình bày trong Hình 6. Đối với cấu trúc biểu hiện của gen quy định chất chống oxy hóa, chuột được điều trị bằng simvastatin (640mg / kg) làm tăng sự biểu hiện của gen điều hòa chất chống oxy hóa. Tese bao gồm glutathione peroxidases (GPx) GPx1 và GPx7, và các peroxidase khác bao gồm Serpinb1b và câu lạc bộ (Hình 6a). HCE ở cả hai liều (1,1 hoặc 2,2 g / kg) làm giảm sự gia tăng GPx do simvastatin và các peroxidase khác xuống mức bình thường. Mặt khác, điều trị HCE đơn thuần đã làm tăng đáng kể mức độ biểu hiện của GPx1. Về sự biểu hiện của các gen điều hòa chuyển hóa ROS, simvastatin gây ra sự biểu hiện đáng kể của các gen chuyển hóa superoxide khác, bao gồm Cyba, Ncf1, Ncf2, Scd1 và Ucp2. Tương tự, HCE ở cả hai liều đều làm giảm đáng kể sự gia tăng này (Hình 6b). Hơn nữa, simvastatin gây ra biểu hiện của các gen đáp ứng với stress oxy hóa bao gồm Apoe, Ccl5 và Txn1, trong khi những biểu hiện này giảm đáng kể ở động vật được đồng điều trị HCE ở cả hai liều (Hình 6c). Mặt khác, simvastatin làm giảm đáng kể sự biểu hiện gen của Txnip. Không có ảnh hưởng đáng kể nào của HCE đối với việc giảm biểu hiện gen Txnip do simvastatin gây ra (Hình 6c). Simvastatin cũng làm tăng đáng kể sự biểu hiện của các gen điều hòa các chất vận chuyển oxy bao gồm Slc38a1 và Vim. Đồng điều trị HCE làm giảm sự biểu hiện của các gen này ở cả hai liều (Hình 6d).

Ảnh hưởng của việc sử dụng kết hợp Simvastatin và HCE đối với lượng thức ăn và trọng lượng cơ thể ở chuột. Hình 7a cho thấy lượng thức ăn hàng ngày của chuột đối với tất cả các nhóm điều trị. Chế độ ăn giàu chất béo làm tăng đáng kể lượng thức ăn hàng ngày của động vật so với động vật được cho ăn thức ăn tinh (p<0.001). there="" was="" however="" no="" significant="" effect="" of="" the="" herb="" or="" drug="" treatments="" among="" all="" high-fat-fed="" groups="" (fig.="">

Đo trọng lượng cơ thể hàng tuần. Sau 16 tuần cho ăn nhiều chất béo, động vật được cho ăn HF tăng trọng hơn đáng kể so với động vật được cho ăn thức ăn tinh (Hình 7b). Tuy nhiên, không có ảnh hưởng đáng kể giữa những con chuột được nuôi bằng HF và tất cả các nhóm được điều trị được nuôi bằng HF. Cũng không có sự khác biệt đáng kể giữa những con chuột được cho ăn HF nhận đồng điều trị với simvastatin và HCE so với những con chuột được cho ăn HF được điều trị HCE hoặc chỉ điều trị simvastatin (Hình 7b).

Ảnh hưởng của việc sử dụng kết hợp Simvastatin và HCE đối với chứng tăng lipid máu và nhiễm mỡ gan ở chuột. Đo hoạt động lipid và creatine kinase trong huyết tương. Mức lipid huyết tương của tất cả các con chuột được thể hiện trong Hình 8. So với những con chuột được nuôi bằng thức ăn chow bình thường, những con chuột được cho ăn HF có mức cholesterol toàn phần trong huyết tương (TC) cao hơn đáng kể, giảm đáng kể ở tất cả các nhóm điều trị (Hình 8a) . Những con chuột được nuôi bằng HF được điều trị bằng simvastatin và HCE có TC huyết tương thấp hơn đáng kể so với những con HF được chỉ dùng simvastatin hoặc những con HF được dùng HCE một mình (p<0.001 and=""><0.01, respectively)="" (fig.="" 8a).="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" between="" hf-fed="" mice="" receiving="" hce="" alone="" vs="" simvastatin="" alone="" treatment="" group,="" suggesting="" hce="" has="" comparable="" effects="" as="" simvastatin.="" besides,="" hf-fed="" mice="" also="" had="" significantly="" higher="" plasma="" triglyceride="" (tg)="" levels="" compared="" to="" mice="" given="" a="" normal="" chow="" diet=""><0.05) (figure="" 8b).="" there="" was="" a="" trend="" for="" a="" reduction="" in="" simvastatin="" treatment="" alone="" group="" on="" plasma="" tg="" in="" hf-fed="" animals,="" though="" this="" did="" not="" reach="" statistical="" significance.="" however,="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment="" significantly="" reduced="" plasma="" tg="" compared="" to="" control="" hf-fed="" animals=""><0.001 and=""><0.01, respectively).="" when="" comparing="" between="" simvastatin="" treatment="" alone="" group="" with="" simvastatin="" co-treatment="" with="" hce="" group,="" hce="" co-treatment="" with="" simvastatin="" had="">

TG huyết tương thấp hơn so với chuột được nuôi bằng HF được điều trị bằng simvastatin đơn thuần (p<0.01) (fig.="" 8b).="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" between="" hf-fed="" mice="" receiving="" hce="" alone="" vs="" the="" simvastatin="" treatment="" group,="" though="" hce="" had="" a="" slightly="" better="" reduction="" in="" tg="" levels.="" in="" addition,="" high-fat-diet-induced="" significant="" increase="" in="" plasma="" high-density="" lipoprotein="" (hdl)="" cholesterol="" and="" plasma="" low-density="" lipoprotein="" (ldl)="" cholesterol="" in="" mice="" compared="" to="" normal="" chow-fed="" animals="" (fig.="" 8c="" and="" d).="" simvastatin="" treatment="" alone="" significantly="" reduced="" both="" lipids="" in="" high-fat-fed="" mice.="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment="" also="" significantly="" reduced="" both="" types="" of="" plasma="" lipids="" compared="" to="" mice="" given="" hf="" diet="" alone.="" there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" both="" lipids="" among="" all="" treatment="" groups.="" figure="" 8e="" showed="" the="" effect="" of="" different="" treatments="" on="" plasma="" creatine="" kinase="" (ck)="" levels.="" interestingly,="" hf="" diet-induced="" significant="" increase="" in="" plasma="" ck="" levels="" in="" mice="" compared="" to="" normal-chow-fed="" mice="" (fig.="" 8e).="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" the="" co-treatment="" of="" simvastatin="" significantly="" reduced="" plasma="" ck="" levels="" compared="" to="" mice="" given="" hf="" diet="" alone=""><0.01 and=""><0.01, respectively).="" simvastatin="" treatment="" alone="" also="" significantly="" reduced="" the="" high-fat="" diet-induced="" increase="" in="" plasma="" ck="" levels.="" there="" was="" also="" no="" significant="" difference="" in="" plasma="" ck="" levels="" among="" all="" active="" treatment="" groups="">iver đo lipid.

Tác động của các nhóm điều trị khác nhau đối với chứng gan to do HF gây ra (gan to) có liên quan đến việc giảm đáng kể tổng hàm lượng lipid trong gan, được biểu thị bằng miligam lipid mỗi gan (Hình 9a). Tổng hàm lượng lipid trong gan cao hơn đáng kể ở những con chuột được cho ăn HF so với những con chuột được cho ăn chow bình thường (cao hơn 3. 0- lần, p<0.001). simvastatin="" exerted="" no="" significant="" effect="" on="" the="" high-fat="" diet-induced="" increase="" in="" total="" liver="" lipid.="" interestingly,="" hce="" significantly="" reduced="" such="" a="" diet-induced="" increase="" in="" liver="" lipid=""><0.05). on="" the="" other="" hand,="" simvastatin="" co-treatment="" with="" hce="" exerted="" a="" trend="" to="" reduce="" the="" liver="" lipid="" content="" though="" did="" not="" reach="" statistical="" significance="" (p="0.15)." however,="" when="" comparing="" the="" liver="" lipid="" content="" among="" all="" treatment="" groups,="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" among="" all="">

Như được thể hiện trong Hình 9b và c, phép đo tổng số cholesterol trong gan (TC) và triglycerid ở gan (TG) cho thấy rằng những con chuột được cho ăn HF có mức độ cao của cả hai loại lipid so với những con chuột được chow chow bình thường (tức là 3. {{4} } tăng gấp lần TC, p<0.001; and="" 3.4-fold="" increase="" in="" tg,=""><0.001). simvastatin="" treatment="" significantly="" reduced="" liver="" total="" cholesterol="" levels=""><0.05) but="" not="" triglyceride="" levels.="" on="" the="" other="" hand,="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment,="" significantly="" reduced="" both="" liver="" total="" cholesterol="" and="" triglyceride="" levels="" in="" high-fat-fed="" mice.="" when="" comparing="" the="" effects="" among="" all="" groups,="" we="" observed="" no="" significant="" difference="" in="" liver="" total="" cholesterol,="" but="" there="" was="" a="" significant="" reduction="" in="" liver="" tg="" for="" the="" hce="" treatment="" group="" as="" compared="" to="" the="" simvastatin="" treatment="" group="" (fig.="" 9b="" and="">

Đánh giá tình trạng viêm gan. Nhuộm hóa mô miễn dịch được thực hiện để nhuộm màu cho sự hiện diện của đại thực bào (Mac -3) (Hình 10a). Phân tích hóa mô miễn dịch của các phần gan cho thấy sự hiện diện của Mac -3 ở cả chuột được cho ăn nhiều chất béo và chow chow bình thường (màu nâu). Tình trạng viêm này tiếp tục gia tăng ở những động vật được điều trị bằng simvastatin, mặc dù sự gia tăng như vậy không đạt được ý nghĩa thống kê. Điều thú vị là điều trị HCE, có hoặc không cùng điều trị với simvastatin đã làm giảm đáng kể tình trạng viêm ở những con chuột được cho ăn nhiều chất béo. Khi so sánh giữa tất cả các nhóm điều trị, điều trị HCE, có hoặc không đồng điều trị với simvastatin cũng có mức độ viêm thấp hơn đáng kể so với nhóm điều trị simvastatin (p<0.001 and=""><0.001, respectively).="" these="" data="" are="" also="" presented="" as="" percentage="" areas="" in="" fig.="">

Tiếp tục đọc ...