Phần 1: Một cách tiếp cận mới để tăng cường tiềm năng tái tạo của các tế bào tiền thân nội mô tuần hoàn ở bệnh nhân mắc bệnh thận giai đoạn cuối

Để biết thêm thông tin. tiếp xúctina.xiang@wecistanche.com

trừu tượng: Các tế bào tiền thân nội mô có nguồn gốc từ tủy xương (EPC) tuần hoàn tạo điều kiện thuận lợi cho việc sửa chữa mạch máu ở một số cơ quan bao gồm cả thận nhưng bị giảm dần ở giai đoạn cuốibệnh thận(ESKD) bệnh nhân, tương quan với kết quả tim mạch và tỷ lệ tử vong liên quan. Do đó, chúng tôi xác định nếu việc tăng cường hiệu ứng phục hồi mô của tế bào mô đệm trung mô có nguồn gốc từ tủy xương người (BM-MSCs) với tác dụng sinh mạch của relaxin người tái tổ hợp (RLX) có thể thúc đẩy sự tăng sinh và chức năng của EPC. CD34 cộng với EPC được phân lập từ máu của bệnh nhân khỏe mạnh và ESKD, được nuôi cấy cho đến khi hình thành EPC muộn, sau đó được kích thích với môi trường điều kiện có nguồn gốc từ BM-MSC (CM; 25% o), RLX (1 hoặc 10ng / mL), hoặc cả hai các phương pháp điều trị kết hợp. Trong khi RLX một mình kích thích tăng sinh EPC, hình thành ống mao mạch và chữa lành vết thương trong ống nghiệm, các biện pháp này được tăng cường nhanh chóng và rõ rệt hơn nhờ tác động kết hợp của CM và RLX có nguồn gốc từ BM-MSC trong EPC có nguồn gốc từ cả bệnh nhân khỏe mạnh và ESKD. Những phát hiện này có ý nghĩa lâm sàng quan trọng, đã xác định một liệu pháp kết hợp mới có thể phục hồi và nâng cao số lượng và chức năng EPC ở bệnh nhân ESKD.

Từ khóa: tế bào tiền thân nội mô; bệnh thận giai đoạn cuối; tế bào gốc trung mô có nguồn gốc từ tủy xương; thư giãn; làm lành vết thương; hình thành mạch; sự tái tạo

Bấm vào đây để tìm hiểu thêm về cistanche để bán

1. Giới thiệu

Bệnh thận mãn tính(CKD) là một vấn đề sức khỏe toàn cầu, được định nghĩa là giảm mức lọc cầu thận （GFR） Nhỏ hơn hoặc bằng 60mL / phút / 1,73m², thường dẫn đến bệnh thận giai đoạn cuối （giai đoạn V) (ESKD; được định nghĩa là GFR Nhỏ hơn hoặc bằng 15 mL / phút / 1,73m2) [2]. Các đặc điểm bệnh lý của CKD bao gồm teo ống thận liên quan đến giảm các mao mạch thận và tế bào vỏ, phá hủy các tế bào nội mô thận, và sự phát triển củaxơ hóa thận[3,4]. Nội mạc thận bị tổn thương trong quá trình này, dẫn đến suy giảm hình thành mạch và chức năng thận [5]. Tiếp theotổn thương thận, các tế bào tiền thân nội mô có nguồn gốc từ tủy xương (EPC) được thu nhận vào các vị trí bị tổn thương để tạo điều kiện sửa chữa mô [6]. EPC đóng vai trò quan trọng trong quá trình trưởng thành và tăng sinh của các tế bào nội mô thận, tính toàn vẹn mạch máu và sửa chữa lớp nội mạc bị tổn thương. Tuy nhiên, số lượng EPC lưu hành đang giảm dần ở bệnh nhân ESKD [7-9], điều này tương quan với các kết quả bất lợi về tim mạch [9,10] và tỷ lệ tử vong lâu dài.

Các tế bào mô đệm trung mô (MSC) đã được báo cáo là thúc đẩy quá trình hình thành mạch bằng cách kích thích chương trình EPC. Tuy nhiên, trong khi MSCs đã được đánh giá trong nhiều thử nghiệm lâm sàng khác nhau [13], khả năng tạo điều kiện tái tạo nội mô thận của chúng vẫn chưa được nghiên cứu. Các nghiên cứu gần đây từ phòng thí nghiệm của chúng tôi đã xác định tiềm năng điều trị nâng cao của việc kết hợp MSCs được xác định từ tủy xương người (BM) với tác nhân chống xơ hóa, cụ thể là relaxin người (gen -2) tái tổ hợp (serelaxin; RLX [14) trong việc cải thiện tổn thương thận,viêmvà xơ hóa trong các mô hình tiền lâm sàng của bệnh. Trong khi RLX một mình có thể kích thích tăng sinh EPC có nguồn gốc từ máu người và sản xuất oxit nitric (NO) trong ống nghiệm, và tạo mạch ở chuột in vivo [18], vẫn chưa rõ liệu tác dụng kết hợp của nó với BM-MSC có thể tăng tốc và / hoặc tăng cường EPC- tạo mạch có nguồn gốc và chữa lành vết thương. Do đó, nghiên cứu này đã đánh giá tiềm năng điều trị của việc kết hợp môi trường điều hòa có nguồn gốc RLX và BM-MSC (CM) trên sự tăng sinh EPC có nguồn gốc từ bệnh nhân khỏe mạnh so với ESKD, hình thành mạch và chữa lành vết thương trong ống nghiệm.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1 Cô lập và nuôi cấyEPC từ máu ngoại vi

Sau khi nhận được biểu mẫu đồng ý của bệnh nhân đã ký, khoảng {{{0}} mL máu từ các đối chứng nam khỏe mạnh đã được Dịch vụ máu Chữ thập đỏ Úc thu thập. Ngược lại, chỉ tối đa ~ 5 mL máu của bệnh nhân nam ESKD được lấy từ Trung tâm Y tế Monash do tình trạng sức khỏe của họ. Tất cả các mẫu máu được xử lý trong vòng 24 giờ sau thời gian thu thập. Tất cả các mẫu máu được pha loãng với dung dịch muối cân bằng 1 × Hank (HBSS; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) đến tổng thể tích là 2 0 mL. Sau đó, máu được phân lớp cẩn thận trên 15 mL Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare, Uppsala, Thụy Điển) vào một ống Falcon 5 0 ml (BD Biosciences, San Jose, CA, Hoa Kỳ) và ly tâm ở 400 × g trong 40 phút ở nhiệt độ phòng để tách lớp sơn bóng khỏi các thành phần khác bằng cách sử dụng phương pháp tách gradient mật độ như đã mô tả trước đây [19,20]. Sau sự phân tách gradient, lớp trên chứa huyết tương và tiểu cầu được loại bỏ bằng cách cẩn thận đưa một pipet huyết thanh vào, để lại lớp áo đệm chứa các tế bào đơn nhân từ máu ngoại vi (PBMC) không bị xáo trộn, bao gồm các tế bào tiền thân nội mô (EPC). Viên thuốc này được trộn lại trong 2 ml Môi trường tăng trưởng tế bào nội mô (EGM) -2 Bộ dụng cụ viên đạn siêu nhỏ (MV) (sản phẩm #CC -3162, Lonza, Hayward, CA, Hoa Kỳ); bổ sung 5 phần trăm huyết thanh bò thai (FBS), 0,04 phần trăm hydrocortisone, 0,4 phần trăm yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi ở người (hFGF) và 0,1 phần trăm yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF), R 3- yếu tố tăng trưởng giống insulin (IGF ) -1, axit ascorbic, yếu tố tăng trưởng biểu bì ở người (hEGF) và gentamicin sulfate / amphotericin (GA -1000), để nuôi cấy EPC được phân lập. Các tế bào được đếm bằng Máy đếm tế bào tự động CountessM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) trước khi chúng được cấy vào đĩa / bình nuôi cấy phủ fibronectin.

The yield of EPC varied significantly between the uncomplicated control and ESKD patients. More specifically EPC yield was significantly lower in ESKD patient samples compared to control and this observation was consistent with previous studies reported in our laboratory[19]. EPCs isolated from healthy controls were directly seeded into T-75 flasks(1-10 × 10'cells per sample), which were supplemented with 10 mL of pre-warmed endothelial growth media-2(EGM-2).In contrast, due to the low yield of EPCs from the ESKD patient samples, the cells were seeded at a density of 1 × 10°cells per well into 12 well plates, with the addition of pre-warmed EGM-2, giving a total volume of 2 mL per well. Due to the large variability in the yield of EPCs isolated from ESKD patients, cells were plated in one well of a 12-well plate if the cell yield was less than 1 ×10°cells. The media was changed every second day until outgrowth endothelial cells (OECs, also known as late EPCs) were observed. These late EPCs were identified by their cobble-stone appearance under light microscopy (Olympus CK-X41, USA). A maximum period of 30 days was allowed for late EPCs to be detected, which were further cultured until~80% confluency was reached. The cells were then passaged 1-2 times to obtain the desired number of cells for all functional assays including proliferation, tube formation, and wound-healing assays as detailed below. Cellular morphological characteristics were further assessed by the ability of the EPC cultures in both control and ESKDpatients to form a number of colonies (>50 tế bào / khuẩn lạc) bằng cách sử dụng xét nghiệm đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU).

2.2. Chuẩn bị môi trường điều hòa (CM) từ BM-MSC nuôi cấy

Vì việc bổ sung BM-MSCs vào các nền văn hóa EPC sẽ làm ảnh hưởng đến các điểm cuối liên quan đến EPC được đo lường, người ta quyết định rằng sẽ tốt hơn nếu phân tích tác động của CM có nguồn gốc từ BM-MSC đối với chức năng của EPC, như đã được sử dụng trước đây để phân tích. của các điểm cuối khác [19]. Tóm lại, BM-MSCs được phát triển trong Alpha-Minimum Essential Media (-MEM; Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Úc), được bổ sung 16% huyết thanh bò thai (FBS) và 1% 2 0 0 mM L-glutamine, và 1 phần trăm penicillin / streptomycin. Khi các tế bào đạt đến độ hợp lưu ~ 80 phần trăm, BM-MSCs được tiếp tục nuôi cấy phụ và mạ vào đĩa 12- giếng ở mật độ ~ 0,5 × 10 độ trên mỗi giếng và được duy trì trong môi trường nuôi cấy trong 24-48 h để đảm bảo gắn kết tế bào. Để chuẩn bị môi trường điều hòa (CM) từ BM-MSCs, các tế bào được rửa một thời gian ngắn ba lần với 1 mL 1 × HBSS đã được làm ấm trước. Sau các bước rửa, 500 μL huyết thanh và môi trường nền tế bào nội mô không có yếu tố tăng trưởng （EBM; Sản phẩm #CC -3121. Lonza, Hayward, CA, Hoa Kỳ) đã được thêm vào tế bào và duy trì trong môi trường nuôi cấy ở 5% CO, 37 độ trong 24 giờ nữa. Vào cuối giai đoạn ủ này, CM sau đó được thu thập và ly tâm ở 400 × g trong 10 phút để loại bỏ bất kỳ mảnh vụn tế bào nào. CM tính bằng 500 μL được lưu trữ ở -80 độ cho đến khi sử dụng trong tương lai.

2.3. Thử nghiệm chức năng

2.3.1. Điều trị EPC muộn được nuôi cấy

Sau khi thu hoạch EPC muộn, các xét nghiệm chức năng được thực hiện. Tất cả các thử nghiệm đã được tiến hành trong các đoạn 3-6. Các thử nghiệm chức năng được thực hiện để điều tra ảnh hưởng của (i) 25 phần trăm BM-MSC môi trường có điều kiện (25 phần trăm CM) [20]; (ii) 1 [RLX -1] hoặc 10 [RLX -10 ] ng / mL [18] RLX (đại diện cho mức độ tuần hoàn của H2 relaxin được tìm thấy ở phụ nữ mang thai [21]); hoặc (i) tác động kết hợp của 25 phần trăm CM và 1 hoặc 10 ng / mL RLX; (iv) 20 phần trăm FBS được sử dụng như một biện pháp kiểm soát tích cực đối với khả năng tăng sinh và hình thành ống (tạo mạch) của EPCs muộn bắt nguồn từ bệnh nhân đối chứng . Các nhóm điều trị được so sánh với các tế bào không được điều trị.

2.3.2 Thử nghiệm khả năng sống và sự gia tăng

Khả năng tồn tại và tiềm năng sinh sôi của các EPC muộn được xác định bằng cách sử dụng {{{0}} (4, 5- dimethythiazol -2- yl) -2, 5- xét nghiệm diphenyl tetrazolium bromide (MTT) theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC, Australia). Tóm lại, ~ 5 × 103 tế bào mỗi giếng được gieo vào 96- đĩa giếng (BD Falcon, North Ryde, NSW, Australia), sau đó, các tế bào được xử lý bằng CM có nguồn gốc BM-MSC, RLX (10 ng / mL), hoặc kết hợp giữa CM và RLXat 1 hoặc 10ng / mL trong 24 giờ. Vào cuối giai đoạn ủ, 10 μL thuốc thử ghi nhãn MTT được thêm （0,5 mg / mL, Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC, Australia) và ủ ở 37 độ C 5% CO2 trong 4 giờ nữa. Các tế bào được hòa tan bằng cách bổ sung 100 μL dung dịch Solubilization （Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC Australia), và khả năng tăng sinh của EPCs muộn được xác định bằng cách đo độ hấp thụ của mỗi mẫu ở bước sóng 590 nm bằng Micro-plate người đọc (Bio-strategy, Balwyn North, VIC, Australia) và phân tích bằng phần mềm SoftMax Pro cho Windows OS (Phiên bản 7.3, Molecular Devices LLC, CA, USA). Mỗi nhóm điều trị được thực hiện và phân tích trong sáu lần lặp lại.

2.3.3. Thử nghiệm hình thành ống

Hiệu quả của các phương pháp điều trị khác nhau nhằm thúc đẩy tiềm năng tạo mạch của EPCs muộn, sử dụng xét nghiệm hình thành ống được xác định bằng xét nghiệm tạo mạch μ （Abidi, Fitchburg, WI, Hoa Kỳ）. Một cách ngắn gọn, 10 μL yếu tố tăng trưởng giảm （GFR） Matrigel （Product # 356231, Corning, Tewksbury, MA, USA） đã được thêm vào giếng bên trong μ-Slide của bộ xét nghiệm hình thành mạch (Abidi, Fitchburg, WI, USA ). Các mẫu cấy hợp lưu của EPCs muộn được cấy vào các tế bào được phủ và xử lý bằng CM có nguồn gốc từ BM-MSC, RLX (10 ng / mL), hoặc kết hợp giữa CM và RLX ở 10 ng / mL. Tổng thể tích 50 μL huyền phù tế bào chứa ~ 1 × 104 tế bào được áp dụng cho mỗi giếng. Hình ảnh được chụp ngay lập tức và được gắn nhãn là thời điểm 0- giờ. Khả năng của các tế bào trong các phương pháp điều trị khác nhau để

các ống mẫu đã được quan sát và hình ảnh được chụp ở 2-24 giờ sau khi tế bào gieo hạt bằng kính hiển vi ánh sáng. Số lượng ống, chiều dài ống và số điểm phân nhánh được xác định bằng cách sử dụng phần mềm ImageJ.

2.3.4 Thử nghiệm chữa lành vết thương

Ảnh hưởng của các phương pháp điều trị khác nhau đối với tiềm năng tái tạo của EPCs muộn được xác định bằng cách sử dụng xét nghiệm làm lành vết thương. Để thực hiện thử nghiệm, ~ 1 × 10 tế bào được treo trong môi trường tăng trưởng 50 μL và được gieo vào 2 silicon tốt trong đĩa 35 mm để làm xét nghiệm chữa lành vết thương (Abidi Inc., Fitchburg, WI, USA). Vết thương nhân tạo trong đĩa được tạo ra bằng cách nhẹ nhàng loại bỏ các giếng silicone bằng nhíp vô trùng (khoảng cách khe hở =500 ± 100μm）. Đĩa được bổ sung 2 mL 50% EGM -2, với việc bổ sung nhiều phương pháp điều trị bao gồm CM có nguồn gốc từ BM-MSC, RLX (10 ng / mL) hoặc kết hợp giữa CM và RLX ở 1 hoặc 10ng / mL. Số lượng tế bào di chuyển để đóng vết thương được đánh giá bằng cách sử dụng kính hiển vi ánh sáng. các tế bào đã di chuyển được ghi lại ở 0-24 giờ sau xử lý. Phần trăm vùng thu hẹp khoảng trống được xác định bằng phần mềm Image].

2.3.5 Phân tích hình ảnh

Tất cả các phân tích hình ảnh cho các xét nghiệm chức năng được thực hiện bằng ImageJ cho MacOS (Phiên bản 1.8, Viện Y tế Quốc gia, Bethesda, MD, Hoa Kỳ). Đối với tiềm năng hình thành ống của EPCs muộn, các hình ảnh được phân tích bằng cách sử dụng plugin xét nghiệm tạo mạch, và bốn thông số khác nhau được ghi lại bao gồm tổng chiều dài, số mắt lưới, số điểm nối và số nhánh. Đối với xét nghiệm chữa lành vết thương, vùng đóng vết thương được phân tích bằng cách đánh dấu vùng không có tế bào theo cách thủ công tại mỗi thời điểm. Tất cả các phép đo được thực hiện ít nhất 3 lần để kiểm soát sự thay đổi.

2.3.6. Miễn dịch huỳnh quang

Vị trí protein của Relaxin Family Peptide Receptor 1 (RXFP1; cognate RLX receptor) trong EPCs muộn được nuôi cấy được xác định bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang. Đầu tiên, các tế bào độ ~ 1 × 1 {{2 0}} độ được phát triển trên một tấm bìa thủy tinh 13 mm (phủ poly-D-lysine) trong một tấm giếng 12- được cố định trong 4 phần trăm PFA cho 15 phút ở nhiệt độ phòng. Các tế bào cố định bị chặn để liên kết với protein không đặc hiệu bằng cách sử dụng 1% albumin huyết thanh bò (BSA) trong 60 phút ở nhiệt độ phòng. Vào cuối thời kỳ ủ bệnh, các tế bào được rửa trong PBS trong 5 phút (3 lần) và được ủ với kháng thể RXFP1 đa dòng ở thỏ (aa 609-624; A 9227; 1: 2000; Immunodiagnostic AG, Bensheim, Đức ) trong 0,01 phần trăm BSA qua đêm ở 4 độ. Các tế bào được rửa sạch bằng PBS và ủ với kháng thể thứ cấp chống thỏ Alexa-fluor 594 của dê (1: 500; Invitrogen, Scoresby, Victoria, Australia) trong 0,01% BSA trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Phản xạ hạt nhân được thực hiện bằng cách thêm 40 μL DAPI trong môi trường gắn Vectashield (Phòng thí nghiệm Vector, Burlingame, CA, Hoa Kỳ) và được che phủ. Protein RXFP1 có hoạt tính miễn dịch được hình dung bằng kính hiển vi huỳnh quang ở độ phóng đại × 40 (Olympus BX51) và các hình ảnh được hợp nhất bằng phần mềm ImageJ.

2.4. Phân tích thống kê

Tất cả dữ liệu được hiển thị dưới dạng giá trị trung bình ± SEM và tất cả các phân tích thống kê được thực hiện bằng GraphPad Prism'M (Ver. 9; GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Một cách-ANOVA đã được sử dụng để so sánh hiệu quả của các phương pháp điều trị khác nhau đối với khả năng tăng sinh (xét nghiệm MTT) và tiềm năng tạo mạch (xét nghiệm hình thành ống) của EPCs muộn, sau đó là một thử nghiệm sau khi học của Tukey để cho phép so sánh nhiều lần giữa các nhóm điều trị. Một biện pháp lặp lại - hai chiều-ANOVA được sử dụng để so sánh hiệu quả của các phương pháp điều trị khác nhau đối với việc đóng vết thương của EPCs muộn theo thời gian, sau đó là thử nghiệm sau khi học của Tukey để so sánh từng nhóm điều trị. Giá trị p nhỏ hơn 0. 05 được coi là có ý nghĩa thống kê.