Phần 2: Một cách tiếp cận mới để tăng cường tiềm năng tái tạo của các tế bào tiền thân nội mô tuần hoàn ở bệnh nhân mắc bệnh thận giai đoạn cuối
Jun 15, 2022
Để biết thêm thông tin. tiếp xúctina.xiang@wecistanche.com
3. Kết quả
3.1. Nhân khẩu học bệnh nhân
Các đối tượng bệnh nhân kiểm soát và bệnh nhân ESKD bao gồm trong nghiên cứu này được liệt kê trong Bảng 1. Các thông số nhân khẩu học của bệnh nhân ESKD bao gồm chiều cao và cân nặng của cơ thể, quá trình lọc máu, nguyên nhân bệnh và mức tiêu thụ rượu đã được ghi lại và thu thập từ hồ sơ y tế do Monash Health lưu trữ , Clayton, Victoria, Úc.
Trong khi các mẫu cấy EPC muộn từ tất cả n {{0}} bệnh nhân khỏe mạnh đã được thu nhận thành công (từ sản lượng ~ 1,5 ± 0. Tế bào 3 × 10 độ / mL máu), dữ liệu được thu thập từ n =6-7 các mẫu cấy lấy từ bệnh nhân riêng biệt cho mỗi nhóm điều trị để hoàn thành các xét nghiệm khác nhau được tiến hành. Tuy nhiên, chỉ có năm mẫu cấy EPC trong số n =11 mẫu máu lấy từ bệnh nhân ESKD trưởng thành thành EPC muộn (từ sản lượng ~ 2,2 ± 0,3 × 10 độ tế bào / mL máu), từ đó dữ liệu được thu thập từ n =3-5 các mẫu cấy lấy từ bệnh nhân riêng biệt cho mỗi nhóm điều trị. Ngoài ra, số lượng EPCcolonies có nguồn gốc từ bệnh nhân ESKD (4,3 ± 1,9; p<0.01 vs.="" epccolonies="" derived="" from="" patients)was="" significantly="" lower="" than="" those="" obtained="" from="" healthy="" patients="" (19.3±8.6;="" n="4" samples="" per="">
Bấm vào đây để tìm hiểu về nhân sâm sa mạc cistanche
3.2. Phân tích chức năng của EPC có nguồn gốc từ bệnh nhân kiểm soát
EPCs muộn thu được và nuôi cấy từ những con đực khỏe mạnh biểu hiện thụ thể RXFP1 trên bề mặt tế bào của chúng, như được thể hiện trong Hình 1A. EPCs muộn chứng tỏ khả năng sinh sản tăng lên đáng kể (khoảng 43%) sau 24 giờ (Hình 1B); Sự hình thành ống do EPC tạo ra (được xác định bằng chiều dài ống (khoảng 45 phần trăm) và số nhánh, chỗ nối và mắt lưới (bằng ~ 60-90 phần trăm) sau 4 giờ (Hình 1C) và việc chữa lành vết thương do EPC gây ra ( ~ 60 phần trăm) sau 8 giờ (Hình 1D), so với các tế bào không được điều trị khi được kích thích bởi 10ng / mL RLX (tất cả p<0.05 vs.unstimulated="" cells),="" but="" not="" by="" 25%="" bm-msc-cm="" or="" 1="" ng/ml="">
Đáng chú ý, tác động kết hợp của 25 phần trăm BM-MSC-CM và 10 ng / ml RLX đã tăng cường thêm sự sinh sôi EPC (gấp ~ 1. 3- lần; p<0.001 vs.25%="" bm-msc-cm="" or="" 10="" ng/ml="" rlx="" alone;="" figure="" 1b),="" epc-induced="" tube="" formation="" (including="" tube="" length="" (by~65%)and="" the="" number="" of="" branches,="" junctions="" and="" meshes="" (by~1.1-2.4-fold;="" figure="" 1c)="" over="" the="" same="" time-period="" and="" epc-induced="" wound="" healing="" (by="" ~87-88%)="" after="" 4-8="" h=""><0.01 vs.25%bm-msc-cm="" after="" 8="" h;="" figure="">
Tương tự, 20% huyết thanh bò thai (đối chứng tích cực) kích thích tăng sinh EPC (khoảng 60%) sau 24 giờ (p<0.001 vs.="" unstimulated="" cells;="" figure="" 1b)="" but="" failed="" to="" stimulate="" epc-induced="" capillary="" tube="" formation="" (figure="" 1c).="" based="" on="" these="" findings="" from="" healthy="" patient-derived="" epcs,="" the="" effects="" of="" 25%="" bm-msc-cm="" and/or="" 10="" ng/ml="" rlx="" were="" then="" evaluated="" on="" eskd="" patient-derived="">
Hình 1: Ảnh hưởng của CM có nguồn gốc từ BM-MSC và / hoặc RLX đối với khả năng tồn tại / tăng sinh EPC từ bệnh nhân khỏe mạnh, hình thành mạch và chữa lành vết thương. Các EPC muộn CD34t từ máu của bệnh nhân nam khỏe mạnh được phát hiện biểu hiện thụ thể RLX cognate, RXFP1; vạch chia độ =50 μm （A） .EPC tăng sinh sau 24 giờ (24 giờ) từ n =7 EPC có nguồn gốc từ bệnh nhân trên mỗi nhóm (B); sự hình thành ống qua trung gian EPC (được xác định từ tổng chiều dài ống, số nhánh, số điểm nối và số mắt lưới) sau 4 giờ từ n =6 EPC do bệnh nhân tạo ra trên mỗi nhóm (C) và chữa lành vết thương qua trung gian EPC sau 4 giờ và 8 giờ từ n =6 bệnh nhân- EPC có nguồn gốc trên mỗi nhóm (D), được xác định theo phản ứng với 20 phần trăm huyết thanh bò thai (FBS; đối chứng dương tính), 25 phần trăm BM-MSC-CM (25 phần trăm CM), RLX [1 ng / mL (RLX {{26} }) hoặc 10ng / mL (RLX -10)] hoặc các hiệu ứng kết hợp của 25 phần trăm CM và RLX -1 hoặc RLX -10. Việc đóng vết thương hoàn toàn bằng EPC không được điều trị trong vòng 24 giờ. Hình ảnh đại diện về sự hình thành ống mao mạch từ EPC không được điều trị và EPC được điều trị bằng 25 phần trăm CM một mình hoặc kết hợp với RLX -10 (C) và quá trình đóng vết thương từ các EPC không được điều trị và những người được điều trị bằng 25 phần trăm CM cộng với RLX {{36} } (D) được hiển thị. Các vòng tròn màu trong mỗi cột của mỗi biểu đồ thanh đại diện cho các điểm dữ liệu riêng lẻ từ mỗi nhóm. Dữ liệu được phân tích bằng ANOVA một chiều, sau đó là bài kiểm tra sau học của Tukey để cho phép so sánh nhiều lần giữa các nhóm. * P<><><0.001 vs.untreated=""><><001, *=""><0001vs.25%cm-treated><><0.001 vs.rlx1-treated=""><><0.001 vs.rlx-10-treated=""><><0.01 y.25%cm+rlx-1-treated="">
3.3. Phân tích chức năng của EPC có nguồn gốc từ bệnh nhân ESKD
Như đã mô tả trước đây, chỉ có năm mẫu cấy EPC từ n =11 mẫu máu lấy từ bệnh nhân ESKD trưởng thành thành EPC muộn, từ đó dữ liệu được thu thập từ n =3-5 nhóm điều trị / nuôi cấy lấy từ bệnh nhân riêng biệt. Các EPC có nguồn gốc từ bệnh nhân ESKD này vẫn biểu hiện RXFP1 (cho thấy rằng chúng cũng có thể đáp ứng với điều trị RLX; Hình 2A) nhưng đã giảm khả năng tồn tại và khả năng tăng sinh (khoảng 70%; p< 0.01="" vs.="" untreated="" cells="" derived="" from="" normal="" patients)="" compared="" to="" their="" counterparts="" isolated="" and="" grown="" from="" normal="" patients="" (figure="" 2b).="" interestingly,="" the="" addition="" of="" 20%="" fbs="" (positive="" control)and="" all="" treatments="" evaluated,="" stimulated="" epc="" proliferation="" (by~1.2-1.6-fold)="" after="" 24="" h,="" almost="" back="" to="" levels="" that="" were="" measured="" from="" untreated="" epcs="" from="" normal="" patients(all="" no="" different="" from="" untreated="" cells="" derived="" from="" normal="" patients;="" figure="" 2b).10="" ng/ml="" rlx="" alone="" promoted="" epc-mediated="" tube="" length,="" number="" of="" junctions="" and="" number="" of="" meshes="" after="" 4h="" (all="" by~1-2.5-fold),="" whereas="" all="" three="" measures="" in="" addition="" to="" the="" number="" of="" branches="" were="" further="" increased="" by="" the="" combined="" treatment="" (all="" by~3.1-4.2-fold;="" all=""><0.05 vs.25%bm-msc-cm="" or="" 10ng/ml="" rlx="" alone;="" figure="" 2c).="" epc-induced="" wound="" healing="" in="" vitro="" from="" eskd="" patients="" took="" longer="" to="" achieve="" compared="" to="" that="" from="" healthy="" patients="" but="" was="" more="" rapidly="" stimulated="" by="" 10="" ng/ml="" rlx(by~54%)or="" the="" combination="" therapy="" (by="" ~63%)="" to="" almost="" complete="" closure="" after="" 24="" h="" (figure="">
Hình 2. Ảnh hưởng của CM có nguồn gốc từ BM-MSC và / hoặc RLX đối với khả năng tồn tại / tăng sinh EPC từ bệnh nhân ESKD giai đoạn V, hình thành mạch và chữa lành vết thương. Các EPC muộn có nguồn gốc từ máu của nam bệnh nhân ESKD cũng được phát hiện có biểu hiện RXFP1; thanh thang đo=50 um (A). Sự gia tăngEPC sau 24 giờ (24 giờ) được xác định từ n =4 EPC có nguồn gốc từ bệnh nhân trên mỗi nhóm phản ứng với 20 phần trăm FBS (kiểm soát tích cực), 25 phần trăm BM -MSCCM (25 phần trăm CM), RLX [10 ng / mL (RLX -10)] hoặc tác động kết hợp của 25 phần trăm CM cộng với RLX -10. Dữ liệu từ các EPC không được điều trị lấy từ bệnh nhân nam khỏe mạnh (được trình bày trong Hình 1B) cũng được đưa vào để so sánh (B). Sự hình thành ống qua trung gian EPC (được xác định từ tổng chiều dài ống, số nhánh, số điểm nối và số mắt lưới) sau 4 giờ từ n=3 EPC có nguồn gốc từ bệnh nhân trên mỗi nhóm (C) và việc chữa lành vết thương qua trung gian EPC sau 24h từ n =5 EPC có nguồn gốc từ bệnh nhân trên mỗi nhóm (D), được xác định theo 25 phần trăm BM-MSC-CM (25 phần trăm CM), RLX [10 ng / mL (RLX -10)] hoặc các hiệu ứng kết hợp của 25 phần trăm CM cộng với RLX -10. Hình ảnh đại diện của sự hình thành ống (C) và đóng vết thương (D) từ mỗi nhóm trong số bốn nhóm được phân tích được hiển thị. Các vòng tròn màu trong mỗi cột của mỗi biểu đồ thanh đại diện cho các điểm dữ liệu riêng lẻ từ mỗi nhóm; trong khi tỷ lệ phần trăm tích lũy chữa lành vết thương đóng lại từ mỗi nhóm điều trị được nghiên cứu trong 24 giờ được hiển thị (C). * p<><><0001 vs="" untreated=""><><001 vs.25%cm-treated="" cells;=""><0.05,><0.01 vs.rlx-10-treated="">
4. Thảo luận
Các nghiên cứu trước đây đã báo cáo rằng số lượng EPC giảm ở bệnh nhân ESKD, điều này có liên quan đến sự gia tăng đáng kể tỷ lệ tử vong do bệnh gây ra. Cũng có báo cáo rằng chạy thận nhân tạo dài hạn, được coi là liệu pháp chính cho ESKD, cũng có thể góp phần làm tăng tình trạng mất EPC do ESKD gây ra ở bệnh nhân. Tuy nhiên, các nghiên cứu khác cũng báo cáo rằng chạy thận nhân tạo ở bệnh nhân ESKD không khôi phục được khả năng tăng sinh và di chuyển của EPC đơn thuần trong ống nghiệm so với chạy thận nhân tạo ở bệnh nhân khỏe mạnh. Những phát hiện kết hợp này đã cung cấp cơ sở lý luận tại sao các tác nhân có thể cải thiện chức năng và sự tăng sinh EPC là cần thiết. Vì việc mở rộng EPCyield cho các phương pháp điều trị gây dị ứng đã được chứng minh là hơi khó khăn và tốn thời gian, nghiên cứu của chúng tôi đã đề xuất một phương pháp điều trị mới bằng cách kết hợp CM có nguồn gốc BM-MSC và RLX để tăng cường sự gia tăng EPC và các khả năng chức năng của EPC tăng lên trong ống nghiệm, với một chính tập trung vào việc cung cấp một nghiên cứu chứng minh khái niệm cho quá trình dịch lâm sàng trực tiếp trong việc điều chỉnh khả năng tái tạo của EPCs in vivo. Lần đầu tiên, nghiên cứu này đã chứng minh tiềm năng điều trị của việc kết hợp BM-MSC-CM với RLX như một phương tiện thúc đẩy khả năng tồn tại, khả năng tăng sinh và tái tạo của các EPC ở người.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chứng minh việc phân lập thành công và xác định đặc điểm của EPC sớm và muộn từ máu của những bệnh nhân khỏe mạnh và ESKD được thu thập từ một thể tích máu nhỏ (khoảng 5-40 mL). Hầu hết các nghiên cứu trước đây đã sử dụng khoảng 50 mL máu ngoại vi làm thể tích ban đầu để phân lập EPC [24-26]. Một số nghiên cứu không nêu thể tích máu ban đầu cần thiết để phân lập EPC. Hơn nữa, các EPC muộn được xác định theo hình thái cũng như khả năng sinh sôi cao và khả năng hình thành khuẩn lạc của chúng, từ 20 mL máu ngoại vi, cho thấy rằng cần tối thiểu 20 mL máu ngoại vi để có được EPC có thể sinh sôi. . Trong nghiên cứu này, mặc dù số lượng mẫu cho bệnh nhân ESKD là từ một nhóm nhỏ so với đối tượng kiểm soát, với thể tích ban đầu là ~ 5 mL máu ngoại vi, chúng tôi xác định rằng sản lượng EPC không chỉ thấp mà không phải lúc nào cũng có thể tiến triển biệt hóa thành khuẩn lạc EPC muộn. Hơn nữa, các EPC ban đầu được quan sát thấy từ các đối chứng khỏe mạnh vào những ngày 6-10 nuôi cấy, trong khi các EPC muộn xuất hiện sau 14-28 ngày nuôi cấy. Những quan sát này phù hợp với các báo cáo trước đây [25]. Một số yếu tố có thể góp phần vào sự phân biệt hoặc chuyển đổi PBMCs thành EPCs sớm và muộn.
Trong khi chỉ BM-MSCs có thể tạo ra các tác dụng phục hồi trong thận thông qua các tác dụng chống viêm, chống apxe, chống oxy hóa, tiền tạo mạch và kích thích EPC, thì hiệu quả điều trị của các tế bào gốc này bị ảnh hưởng nghiêm trọng ở những cơ sở bệnh mãn tính 30. BM-MSCs cũng đã được chứng minh là có tác dụng cải tạo lớn hơn trong nhiều mô hình thử nghiệm khác nhau và hiện đang được đánh giá trong các thử nghiệm lâm sàng khác nhau [31]. Mặc dù vậy, ít nghiên cứu đã điều tra vai trò tạo mạch của MSCs trong các mô hình xơ sợi củabệnh thận. Một nghiên cứu đã báo cáo về tác động của MSC đối với hệ mạch của thận, trong đó môi trường điều hòa từ BM-MSC được làm giàu với các yếu tố tăng trưởng, chẳng hạn như VEGF, HGF và IGF -1 có thể tăng cường sự phát triển EC động mạch chủ và sự sinh sôi nảy nở. Hơn nữa, một nghiên cứu trong mô hình tiền lâm sàng của bệnh Alport (một tình trạng di truyền được đặc trưng bởi các bất thường vi mạch thận và suy chức năng), quan sát thấy rằng những con chuột được điều trị bằng MSC-CM biểu hiện mức độ cao của mRNA VEGFR trong thận, nhưng không ở lưu thông, và cũng được tăng cườngthậnTăng sinh EC trong ống nghiệm.
Một nghiên cứu trước đây cho thấy rằng các cytokine và các yếu tố tăng trưởng trong CM của dây rốn-MSC làm tăng đáng kể số lượng ống và tỷ lệ hồi phục vết thương của tế bào nội mô mạch máu rốn ở người (HUVECs) trong ống nghiệm. Cơ chế cơ bản của đặc tính này được xác định thông qua sự biểu hiện gia tăng của các cytokine SDF -1- CXCR4 và MCP -1, giúp tăng cường tốc độ di chuyển của HUVEC để đóng vùng vết thương được tạo ra trong các xét nghiệm chữa lành vết thương được tiến hành . Tuy nhiên, dựa trên các nghiên cứu trước đây của chúng tôi đã chứng minh rằng chỉ riêng BM-MSC-CM 100% có thể kích thích đáng kể các biện pháp tăng sinh EPC, hình thành ống mao mạch, hình thành mạch và chữa lành vết thương, trong khi việc chuẩn độ BM-MSC-CM xuống 25% đã làm giảm những , nghiên cứu hiện tại đã sử dụng 25% BM-MSC-CM để có thể xác định một cách tối ưu các hiệu ứng hiệp đồng tiềm năng của 25% CM và RLX.
RLX thể hiện tiềm năng tạo mạch của nó bằng cách gây ra VEGF và yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi cơ bản (bFGF) tại các vị trí vết thương ở chuột. Ngoài ra, RLX đã được chứng minh là làm tăng NO nội bào có nguồn gốc từ tủy xương của con người-EPC và sự di chuyển ở chuột, cho thấy RLX có thể thúc đẩy quá trình hình thành mạch in vivo. Tuy nhiên, người ta quan sát thấy RLX không liên kết trực tiếp với EC, mà là gây ra sự hình thành mạch thông qua khả năng thúc đẩy các yếu tố tăng trưởng có vai trò trong việc chữa lành vết thương. Ngược lại, nghiên cứu này đã chứng minh rằng khả năng tồn tại / tăng sinh, hình thành ống và khả năng chữa lành vết thương của EPC được tăng cường đáng kể khi sử dụng 10 ng / mL RLX, phù hợp với các phát hiện trước đó [18]. Ngoài ra, quan sát thấy rằng cả EPC sớm và muộn đều biểu hiện thụ thể RXFP1, điều này cho thấy RLX sẽ có thể liên kết trực tiếp với thụ thể của nó trên EPC để thúc đẩy tăng sinh EPC và hình thành mạch do EPC gây ra trong ống nghiệm.
Các nghiên cứu trước đây từ phòng thí nghiệm của chúng tôi đã chứng minh rằng việc kết hợp BM-MSCs và RLXmore có hiệu quả làm suy giảm hoặc đảo ngược cơ quanviêmvà xơ hóa trong các mô hình chuột của bệnh thận tắc nghẽn [15], tăng huyết ápSuy thận, hoặc bệnh đường hô hấp dị ứng mãn tính (AAD) [37] in vivo. Các phát hiện của nghiên cứu này hiện đã mở rộng những phát hiện đó để chứng minh rằng tác động kết hợp của CM và RLX có nguồn gốc từ BM-MSC có thể nâng cao khả năng tồn tại và tỷ lệ tăng sinh của EPC có nguồn gốc từ bệnh nhân ESKD ở người trong ống nghiệm (đến mức được đo ở bệnh nhân bình thường), và khả năng thúc đẩy hình thành mạch của các tế bào này. Điều này đã được chứng minh bằng khả năng tăng cường của liệu pháp kết hợp để thúc đẩy sự hình thành ống mao mạch do EPC gây ra và chữa lành vết thương so với chỉ dùng CM. Trong bối cảnh này, có thể tác dụng sinh mạch qua trung gian NO của RLX dẫn đến tăng số lượng EPC do RLX (ở 10ng / mL) gây ra và chữa lành vết thương qua trung gian EPC, được tăng cường hiệp đồng bởi tác dụng thúc đẩy EPC của Các chất trung gian tạo mạch (như VEGF và bFGF) được tiết ra bởi BM-MSC-CM và được kích thích bởi RLX. Mặc dù bản chất ex vivo của nghiên cứu này và số lượng thấp các mẫu cấy EPC có nguồn gốc từ bệnh nhân ESKD được phân tích, các lợi ích hiệp đồng của liệu pháp phối hợp được đánh giá là rất rõ ràng.
5. Kết Luận
Vì việc mở rộng sản lượng EPC từ các phương pháp trị liệu toàn sinh đã được chứng minh là khó khăn và tốn thời gian, liệu pháp mới này có thể có nhiều hứa hẹn như một phương pháp điều trị cho những người bị ESKD. Nhìn chung, các phát hiện từ nghiên cứu này có ý nghĩa lâm sàng cao, đặc biệt đối với bệnh nhân ESKD, trong đó việc mất số lượng EPC lưu hành góp phần làm suy giảm sự phát triển và hình thành mạch, các kết cục bất lợi về tim mạch và tử vong liên quan. Hơn nữa, vì bệnh nhân ESKD thường chết vìbệnh mạch máu(xơ vữa động mạch, đột quỵ, bệnh mạch máu ngoại vi) [40], liệu pháp phối hợp này có thể cung cấp một phương pháp mới để làm chậm sự tiến triển của bệnh mạch máu ở những bệnh nhân này. Hơn nữa, việc phát triển một liệu pháp mới có thể làm chậm sự tiến triển của CKD sẽ tiết kiệm cho hệ thống chăm sóc sức khỏe hàng tỷ đô la trong liệu pháp thay thế thận. Vì cả MSC và RLX đều đã được đánh giá lâm sàng, các chiến lược mới kết hợp liệu pháp kết hợp này có thể được theo dõi nhanh chóng cho các thử nghiệm trên người.
