Quá trình kích hoạt bổ sung qua trung gian Pentraxin -3- trong mô hình lợn bị thiếu máu cục bộ thận / chấn thương do tái tưới máu

Liên hệ: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Chiara Divella và cộng sự

TRỪU TƯỢNG

Pentraxin là một họ các phân tử nhận dạng mẫu được bảo tồn về mặt tiến hóa có vai trò quan trọng trong khả năng miễn dịch bẩm sinh và chứng viêm, chẳng hạn như loại bỏ mầm bệnh trong quá trình nhiễm vi khuẩn và vi rút. Đặc biệt, Pentraxin 3 (PTX3) từ lâu đã được chứng minh là có thể điều chỉnh một số khía cạnh của chứng viêm mô và mạch máu trong quá trình cấy ghép nội tạng rắn.

Nghiên cứu của chúng tôi đã khảo sát vai trò của PTX3 như một chất điều biến có thể xảy ra đối với sự hoạt hóa Bổ sung trong mô hình heo bị tổn thương do thiếu máu cục bộ / tái tưới máu (I / R) ở heo. Chúng tôi đã chứng minh rằng lắng đọng PTX3 sớm do chấn thương I / R gây ra ở mức độ mao mạch cầu thận và màng bụng. Kính hiển vi quét laser đồng bộ cho thấy lắng đọng PTX3 đồng bản địa hóa với CD31 cộng với các tế bào nội mô. Ngoài ra, PTX3 có liên quan đến việc thâm nhập đại thực bào (CD163), tế bào đuôi gai (SWC3a) và nguyên bào sợi (FSP1). Đặc biệt, chúng tôi đã chứng minh sự kích hoạt quan trọng qua trung gian PTX 3- của các con đường bổ sung cổ điển (qua trung gian C1q) và lectin (qua trung gian MBL). Điều thú vị là, PTX3 lắng đọng cùng khu trú với sự hoạt hóa của phức hợp bổ sung tận cùng (C5b -9) trên tế bào nội mô, cho thấy rằng sự hoạt hóa bổ thể qua trung gian PTX 3- xảy ra chủ yếu ở cấp độ mạch máu thận. Kết luận, những dữ liệu này chỉ ra rằng PTX3 có thể là một mục tiêu điều trị tiềm năng để ngăn ngừa chấn thương I / R do bổ sung.

Thư từ:Giuseppe Castellano

Từ khóa:chấn thương do thiếu máu cục bộ / tái tưới máu, hệ thống bổ thể, pentraxin 3,quả thận, con đường cổ điển

Cistanche tubulosa ngăn ngừa bệnh thận, bấm vào đây để lấy mẫu

GIỚI THIỆU

Tổn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu (I / R) đại diện cho nguyên nhân chính của cấp tínhquả thậnvết thươngsau khi cấy ghép và được đặc trưng bởi sự hoạt hóa đáng kể của hệ thống bổ thể [1, 2]. Trong trường hợp này, các tế bào nội mô (EC) đóng một vai trò quan trọng trong việc sửa chữa sai lệch sau I / R, dẫn đến xơ hóa sớm bởi quá trình chuyển đổi nội mô sang trung mô (EndMT) [3]. Trong giai đoạn tái tưới máu, Bổ sung điều phối các quá trình miễn dịch và viêm, góp phần gây ra các bệnh miễn dịch và viêm [2–5]. Các thành phần thiết yếu khác của cánh tay thể dịch của hệ thống miễn dịch bẩm sinh được đại diện bởi các pentraxin được cho là đóng một vai trò quan trọng trong sinh học mạch máu [6].

Pentraxin là một họ các protein hòa tan đa phân tử [6] được phân thành các họ ngắn và dài dựa trên cấu trúc của chúng [7]. Các protein được bảo tồn tiến hóa này là các hiệu ứng giai đoạn cấp tính, đóng vai trò như các cảm biến bắt đầu quá trình viêm và tăng nhanh trong huyết tương trong quá trình nhiễm trùng [8]. Pentraxin 3 dài (PTX3) là một phân tử nhận dạng mẫu hòa tan, rất quan trọng trong việc bảo vệ miễn dịch bẩm sinh và có thể kích hoạt hệ thống bổ thể [9-11].

Đặc biệt, PTX3 gây ra sự kích hoạt con đường cổ điển và lectin bằng cách liên kết với C1q, MBL, Ficolin -2 và có thể ảnh hưởng đến con đường thay thế qua CFH [10–12].

Ngược lại với các pentraxin khác do gan sản xuất trong máu (ví dụ CRP), PTX3 có thể được giải phóng bởi các tế bào thường trú trong vị trí viêm, ví dụ từ thực bào đơn nhân, tế bào đuôi gai, nguyên bào sợi và EC [9] hoạt động theo cơ chế nội tiết. [13]. PTX3 cũng được lưu trữ ở dạng làm sẵn trong các bạch cầu trung tính, khu trú trong các hạt cụ thể, và được tiết ra để đáp ứng với việc nhận biết các nguyên tố vi sinh vật [14]. Trong EC, sự biểu hiện của PTX3 dễ dàng được cảm ứng bởi TNF- và IL -1, tạo ra sự chuyển đổi từ kiểu hình yên tĩnh, chống viêm sang trạng thái đông máu và tiền viêm, do đó điều chỉnh mạnh mẽ chức năng vi mạch [7, 8 ]. Vì lý do đó, các mức PTX3 đã được mô tả làmãn tínhquả thậndịch bệnh, sự gia tăng nồng độ protein của PTX3 có tương quan với sự giảm GFR và các biến chứng tim mạch, tuy nhiên, người ta vẫn biết rất ít về vai trò của PTX3 trong các trường hợp ban đầu như cấp tính do I / R gây ra.quả thậnchấn thương [15, 16].

Vai trò của PTX3 trong các bệnh viêm thận là hai mặt, từ một phía protein có thể kích hoạt các con đường cổ điển và lectin thúc đẩy quá trình viêm và tổn thương ban đầu [10–12]. Mặt khác, vùng tận cùng N của PTX3 điều biến kích hoạt bổ thể làm giảm sự tuyển dụng bạch cầu và ức chế xơ hóa mô kẽ trong chấn thương thận cấp tính thúc đẩy quá trình sửa chữa mô [17–20].

Bổ sung đóng một vai trò quan trọng trong sinh lý bệnh của cấp tính do chấn thương I / R gây raquả thậnvết thương[21, 22]. Trong mô hình lợn bị tổn thương I / R ở thận, chúng tôi đã chứng minh vai trò quan trọng của việc kích hoạt hệ thống bổ sung trong việc gây ra EndMT và xơ hóa sớm, với sự tham gia của cả hai con đường cổ điển và lectin [23]. Hơn nữa, chúng tôi đã chứng minh rằng việc ức chế điều trị các con đường bổ thể này bằng cách tái tổ hợp C 1- INH (rhC1INH) làm giảm đáng kể sự lắng đọng bổ thể, với việc giảm tuyển dụng các tế bào viêm thâm nhiễm và tổn thương mô kẽ [23]. Các kết quả này cũng đã được xác nhận bởi Delpech PO và cộng sự [24]; sự điều biến đáng kể trong lắng đọng cầu thận và ống thận C1q, MASP, và C4d được đánh giá sau 30 phút sau tái tưới máu cho thấy vai trò trung tâm của C 1- INH để chống lại con đường cổ điển và lectin.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nghiên cứu sự liên quan có thể có của PTX3 trong việc làm trung gian kích hoạt bổ sung sớm trong tổn thương I / R ở thận, đặc trưng cho các nguồn tế bào khác nhau của PTX3.

KẾT QUẢ

PTX3 được biểu hiện bằng các tế bào nội mô và các tế bào thâm nhiễm miễn dịch trong mô hình heo bị thương tích I / R

Đầu tiên, chúng tôi điều tra sự hiện diện của PTX3 trong mô hình lợn bị tổn thương thận do I / R ấm. Chúng tôi quan sát thấy rất hạn chế lắng đọng PTX3 trong mô bình thường (Hình 1A). Tổn thương I / R gây ra sự lắng đọng khuếch tán của PTX3 đã có ở 15 phút sau khi tái tưới máu (Hình 1B, 1C) ở khu vực kẽ thận (Hình 1E), tại các mao mạch phúc mạc (Hình 1D; mũi tên), và ở mức độ cầu thận (Hình 1D). Tiền gửi PTX3 vẫn có thể phát hiện được 1 giờ sau khi tái tưới máu ở mức độ mao mạch phúc mạc (Hình 1G). Trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi [23], chúng tôi đã chứng minh rằng các đặc điểm chính của tổn thương I / R là quá trình chết của tế bào biểu mô hình ống và việc tuyển dụng các tế bào viêm thâm nhiễm như bạch cầu đơn nhân, tế bào đuôi gai và tế bào lympho. Tuy nhiên, bằng cách đánh giá mô học thường quy (Hình bổ sung 1), chúng tôi đã chứng minh rằng 30 phút thiếu máu cục bộ ấm áp sau đó là 15 phút tổn thương kẽ ống thận sớm do tái tưới máu, đặc trưng bởi tắc nghẽn mao mạch lớn hơn và sự hút sạch tế bào chất của biểu mô ống thận, so với cơ bản tình trạng.

Để mô tả thêm tính chất định vị tế bào của các lắng đọng PTX3 và đánh giá tác dụng tiềm tàng của nó trong việc điều chỉnh phản ứng viêm và tổn thương, chúng tôi đã thực hiện phân tích kính hiển vi tiêu điểm và nhuộm miễn dịch kép. Biểu hiện protein PTX3 được phát hiện trong hầu hết EC ở mức mao mạch màng bụng (Hình 2A) và cầu thận (Hình 2B), 15 phút sau khi tái tưới máu.

Ai cũng biết rằng tổn thương I / R được đặc trưng bởi sự gia tăng hoạt hóa các đáp ứng miễn dịch bẩm sinh và thích ứng, bao gồm cả việc vận chuyển tế bào viêm vào cơ quan bị bệnh làm trầm trọng thêm tổn thương thông qua các tế bào miễn dịch và hệ thống bổ sung [25]. Trong mô hình lợn của chúng tôi, chúng tôi cũng quan sát thấy, đã 15 phút sau khi tái tưới máu, một vùng thâm nhiễm viêm dày đặc bao gồm phần lớn các đại thực bào và tế bào đuôi gai trong khu vực ống-kẽ. Chúng tôi nhận thấy rằng cả hai tế bào trình diện kháng nguyên này đều được đặc trưng bởi sự biểu hiện PTX3 tăng lên khi so sánh với T 0 vì chúng tôi quan sát thấy số lượng tăng lên của CD163 plus / PTX3 plus (Hình 2E, 2F, 2K) và SWC3a plus / PTX3 plus (Hình 2G, 2H, 2L) tế bào ở mức độ kẽ của ống tại T15.

Biểu hiện PTX3 có thể góp phần vào EndMT trong chấn thương I / R

Trong các quan sát trước đây, chúng tôi đã chứng minh rằng tổn thương I / R là nguyên nhân gây ra EndMT [26, 27], được đặc trưng bởi việc EC thu nhận kiểu hình trung mô với sự mất đi các dấu hiệu nội mô cụ thể và đạt được các dấu hiệu trung mô, chẳng hạn như nguyên bào sợi cụ thể protein 1 (FSP -1), cadherin tế bào thần kinh (N-cadherin) và actin cơ trơn alpha (alpha-SMA). Do đó, chúng tôi đã điều tra xem liệu biểu hiện PTX3 của EC có thể ảnh hưởng đến quá trình này hay không. Đúng như dự đoán, khi chúng tôi điều tra biểu hiện alpha-SMA, như các dấu hiệu của nguyên bào sợi được kích hoạt, chúng tôi không tìm thấy bất kỳ sự đồng địa hóa nào giữa alpha-SMA và PTX3 (Hình 2C, 2D). Ngược lại, chúng tôi quan sát thấy sự gia tăng FSP1 cộng / PTX3 mô kẽ tubulointerstitial cộng với nguyên bào sợi trong suốt thời gian quan sát (Hình 2K – 2M).

Tiền gửi PTX3 có liên quan đến việc kích hoạt hệ thống bổ sung

Cuối cùng, chúng tôi đã điều tra xem liệu các khoản tiền gửi PTX3 có liên quan đến việc kích hoạt Bổ sung hay không. Thật vậy, cũng như các thành phần khác của họ pentraxin, PTX3 có thể điều chỉnh sự hoạt hóa của con đường bổ thể cổ điển [7]. Phức hợp bổ sung, C5b -9, sử dụng kháng thể chống lại một neoepitope C 9-. Chúng tôi đã quan sát thấy sự đồng nội địa hóa đáng kể của các khoản tiền gửi PTX3 và C5b -9 (Hình 3A, 3B). Phức hợp đầu cuối bổ sung được khu trú ở mức độ phúc mạc cũng như trong các mao mạch phúc mạc cùng với lớp tế bào nội mô, như chúng tôi đã chứng minh trước đây [23, 28]. Vì PTX3 có thể kích hoạt hệ thống Bổ thể thông qua con đường cổ điển và lectin, chúng tôi đánh giá sự lắng đọng của C1q và MBL trong nhu mô thận. Điều thú vị là, trầm tích C1q (Hình 3E, 3F) và MBL (Hình 3C, 3D) chủ yếu được tìm thấy ở mức độ kẽ và mao mạch (Hình 3C đến 3F), như đã mô tả trước đây [23] và được tạo màu bằng trầm tích PTX3.

Chất ức chế C 1- cản trở liên kết PTX3 trên tế bào nội mô

Trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi [23], chúng tôi đã chứng minh rằng việc sử dụng chất ức chế C 1- dẫn đến giảm đáng kể sự lắng đọng bổ thể, với việc giảm tuyển dụng các tế bào viêm thâm nhiễm và tổn thương mô ống tuỷ. Do đó, chúng tôi đã kiểm tra mức độ biểu hiện PTX3 trong rhC 1- động vật được điều trị bằng INH. Chúng tôi nhận thấy rằng việc truyền chất ức chế C 1- làm giảm lắng đọng PTX3 ở mao mạch phúc mạc và mức độ kẽ sau 15 phút sau khi tái tưới máu (Hình 4A).

Hơn nữa, để hỗ trợ giả thuyết rằng việc giảm lắng đọng PTX3 trong rhC 1- động vật được điều trị bằng INH có liên quan đến việc ức chế tổn thương nội mô, chúng tôi đã thực hiện các thí nghiệm trong ống nghiệm và chúng tôi đánh giá liên kết rhC 1- INH và PTX3 trên nuôi cấy EC trong điều kiện bình thường hoặc khi có căng thẳng tế bào (Hình 4B). Phân tích FACS cho thấy EC trong điều kiện bình thường không ràng buộc cả rhC 1- INH và PTX3. Theo nghiên cứu trước đây của chúng tôi [26], chúng tôi đã quan sát thấy sự gia tăng liên kết tế bào của rhC 1- INH trên H2O 2- EC được kích thích so với điều kiện cơ bản. Hơn nữa, trong trường hợp không có rhC 1- INH, PTX3 có thể ràng buộc EC đã kích hoạt. Điều thú vị là khi H2O 2- kích hoạt EC được ủ với PTX3 và rhC 1- INH, chúng tôi nhận thấy rằng C1INH có thể bảo vệ EC khi chặn liên kết PTX3.

THẢO LUẬN

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chứng minh sự lắng đọng PTX3 trong giai đoạn đầu của tổn thương I / R ở thận và khả năng đóng góp của nó vào sự phát triển của EndMT. Điều thú vị là chúng tôi nhận thấy rằng sự kích hoạt Bổ sung qua trung gian PTX 3- xảy ra chủ yếu ở cấp độ mạch máu, đồng địa hóa với C1q và MBL, các phân tử nhận dạng của các con đường cổ điển và lectin của dòng Bổ sung.

Tổn thương I / R gây ra một phản ứng viêm rõ rệt, đặc trưng bởi sự hoạt hóa Bổ thể, các gốc tự do oxy và sản xuất cytokine tiền viêm, dẫn đến hoạt hóa nội mô mạch máu và bạch cầu ngoại vi [29, 30]. Trong quá trình tổn thương I / R, việc kích hoạt bổ thể dẫn đến lắng đọng các thành phần bổ thể trên màng bề mặt của EC bị tổn thương và rối loạn chức năng, với việc tạo ra đồng thời các chất độc phản vệ và khuếch đại quá trình viêm [31]. Trong quá trình viêm, PTX3 tăng lên nhanh chóng và có thể đóng vai trò trung tâm trong việc điều chỉnh phản ứng nội mô. Thật vậy, PTX3 đã được chỉ định như một dấu ấn sinh học tiềm năng của rối loạn chức năng nội mô mạch máu trong một số bệnh, bao gồm cả mãn tínhquả thậnbệnh, tiền sản giật, và một số bệnh mạch máu [7, 16, 17, 32]. Chúng tôi cũng chứng minh rằng PTX3 có liên quan đến các biến chứng mạch máu khác như suy lỗ rò động mạch ở bệnh nhân chạy thận nhân tạo [33]. Những quan sát này cho thấy rằng PTX3 có thể là cầu nối giữa phản ứng viêm và rối loạn chức năng nội mô [34]. Cùng với những nghiên cứu này, chúng tôi quan sát thấy sự lắng đọng PTX3 ở mức độ nội mô sau 15 phút sau khi tái tưới máu (Hình 2A, 2B). Kết quả của chúng tôi cũng chứng minh rằng trong giai đoạn đầu của chấn thương I / R, PTX3 được tạo màu với dấu hiệu myofibroblast, FSP -1 (Hình 2I, 2J) nhưng không phải với alpha-SMA, một dấu hiệu được biểu thị bằng myofibroblast đã hoạt hóa (Hình 2C, 2D). Tổng hợp lại, những dữ liệu này có thể gợi ý rằng rối loạn chức năng nội mô và quá trình EndMT [35], được quan sát thấy ở động vật I / R [26], lần đầu tiên xảy ra ở EC biểu hiện PTX3.

Mối liên hệ giữa PTX3 và các tế bào viêm được công nhận rộng rãi. Trong bài báo này, chúng tôi đặc biệt tập trung vào tác dụng vốn có của PTX3 trong sự xâm nhập kẽ của bạch cầu là nguồn chính của PTX3 [36]. Đặc biệt, chúng tôi tìm thấy các đại thực bào và tế bào đuôi gai, sau 15 phút sau khi tái tưới máu, biểu hiện mức PTX3 cao hơn (Hình 2E đến 2H). Những dữ liệu này phù hợp với cơ sở ngày càng tăng của bằng chứng cho thấy vai trò liên quan đối với miễn dịch bẩm sinh trong việc điều chỉnh tổn thương sớm trong chấn thương I / R [23]. Sự kích hoạt sớm của Bổ sung trong mô thận sau khi chấn thương I / R dẫn đến việc tạo ra một số chất trung gian gây viêm làm tăng việc tuyển dụng các tế bào miễn dịch [21, 23, 37, 38]. Các nghiên cứu gần đây đã xác định PTX3 là một trong những thành phần chính của mạng lưới điều phối phản ứng viêm do chấn thương I / R gây ra [39]. Trong các mô hình thực nghiệm khác nhau về tổn thương I / R, PTX3 có thể thực hiện các vai trò đối lập kép trên các mô cụ thể [40, 41]. Việc sản xuất sớm PTX3 có liên quan đến tổn thương thận vì nó gây ra biểu hiện sớm của các phân tử kết dính nội mô và các chemokine làm tăng nhanh phản ứng viêm bất lợi tại chỗ.

Ngược lại, việc sản xuất PTX3 tại chỗ kéo dài sẽ ngăn ngừa tình trạng viêm và rối loạn chức năng cơ quan quá mức [41].

PTX3 là một bộ điều chế thác bổ sung [9, 42]; điều này phù hợp với các đặc tính đa hướng của PTX3 cho thấy vai trò kép của PTX3 như một bộ điều biến hoặc bộ khuếch đại phản ứng miễn dịch bẩm sinh [39]. Ban đầu, PTX3 kích hoạt Bổ sung bằng cách liên kết C1q và MBL [43]; tuy nhiên, tình trạng viêm tăng sớm cần được giới hạn ở khu vực đích. Do đó, PTX3, bằng cách tuyển chọn yếu tố H hoặc ức chế hình thành mạch, cũng có thể làm giảm phản ứng viêm và kích hoạt bổ thể bảo vệ nhu mô thận khỏi tổn thương viêm [43]. Mặc dù sự kích hoạt bổ thể trong I / R ở loài gặm nhấm chủ yếu khu trú ở cấp độ ống [44], trong giai đoạn tái tưới máu, nội mô là mục tiêu chính của các tác nhân gây viêm khác nhau, bao gồm cả các chất trung gian bổ sung [2]. Trước đây chúng tôi đã chứng minh rằng trong mô hình lợn bị chấn thương I / R cũng như ở bệnh nhân DGF, sự hoạt hóa của hệ thống Bổ thể xảy ra trong giai đoạn đầu, trên các mao mạch phúc mạc, trong kẽ và trên nội mô cầu thận [23]. Dữ liệu của chúng tôi cho thấy sự đồng nội địa hóa rõ ràng của tiền gửi C5b -9 trên PTX3 cộng với EC sau 15 phút sau khi tái tưới máu (Hình 3A, 3B). Do đó, nội mô thận dường như là vị trí phổ biến của kích hoạt Bổ sung qua trung gian PTX 3- trong giai đoạn đầu của tổn thương I / R ở cả môi trường tiền lâm sàng và lâm sàng.

Sự tương tác của các pentraxin với C1q và vai trò của nó trong việc kích hoạt con đường Bổ sung cổ điển đã được mô tả rõ ràng [45–47]. Trong bối cảnh của các phản ứng miễn dịch bẩm sinh, PTX3 có thể liên kết các thành phần Bổ sung khác nhau và điều chỉnh kích hoạt Bổ sung [43, 48]. PTX3 kích hoạt Bổ sung bằng liên kết C1q [49]. Kết quả của chúng tôi trong mô hình động vật đã chứng minh rõ ràng rằng PTX3 có thể làm trung gian cho việc kích hoạt con đường cổ điển bằng cách tương tác với C1q (Hình 3E, 3F). Hơn nữa, PTX3 cũng điều chỉnh con đường lectin của Bổ sung, như thể hiện trong Hình 3C, 3D. MBL liên kết với PTX3 thông qua miền giống như collagen của nó [45] và phức hợp MBL / PTX3 thu nạp C1q và tạo ra sự lắng đọng C3 và C4 trên bề mặt tế bào đích.

Nhìn chung, những kết quả này cho thấy vai trò trung tâm của PTX3 trong việc dàn xếpquả thậntổn thương trong chấn thương I / R, có thể có ý nghĩa quan trọng đối với các liệu pháp chỉ định bổ sung trong chấn thương I / R thận.

Trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi [26], chúng tôi đã nghiên cứu sự tham gia của bổ thể trong việc trung gian hoạt hóa EC bằng cách sử dụng dạng tái tổ hợp của C 1- INH, một chất ức chế mạnh các protease của con đường bổ thể cổ điển và lectin (C1r, C1 s, và MASP2). Trong cùng một mô hình động vật, chúng tôi đã chỉ ra (Hình 4A) rằng việc ức chế điều trị cả hai con đường bằng rhC1INH làm giảm lắng đọng PTX3 ở mao mạch phúc mạc và mức độ kẽ sau 15 phút sau khi tái tưới máu. Những dữ liệu này được xác nhận với kết quả in vitro trên EC (Hình 4B), khiến chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng rhC1INH có thể bảo vệ EC bị hỏng khi chặn liên kết PTX3. Trong y văn, có bằng chứng về sự liên kết của C 1- INH với các phân tử kết dính nội mô, thể hiện trên lớp nội mạc hoạt hóa, được gọi là selectin, đặc biệt là P và E-selectin [50, 51]. Sự gắn kết này với EC có thể cản trở sự tương tác giữa nội mô và bạch cầu trong quá trình viêm và nó đại diện cho một cơ chế chống viêm quan trọng khác [50, 51]. Do đó, chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng rh-C1INH có thể liên kết EC hoạt hóa và làm trung gian điều hòa cục bộ quá trình hoạt hóa bổ thể và quá trình viêm. Trong các nghiên cứu trước đây, chúng tôi đã chứng minh sự tham gia của bổ thể trong tổn thương I / R và các bệnh thận qua trung gian miễn dịch khác [38, 52–54]. Các cơ chế kích hoạt Bổ sung trong mô hình động vật này có thể có ý nghĩa quan trọng đối với việc giải thích dữ liệu được mong đợi trong môi trường của con người. Để phát triển thành công các can thiệp điều trị nhằm mục tiêu kích hoạt bổ sung [36, 54], điều cần thiết là phải thiết lập tính hợp lệ của dữ liệu lợn so với những gì xảy ra trong hoàn cảnh lâm sàng. Vì nghiên cứu này chỉ giới hạn trong các nghiên cứu quan sát, nên cần có các thí nghiệm sâu hơn để xác định các cơ chế liên kết giữa PTX3 và Bổ sung có thể làm nổi bật các chiến lược điều trị mới. Từ các kết quả trên, dữ liệu của chúng tôi ủng hộ giả thuyết rằng PTX3 có thể điều chỉnh nhiều khía cạnh của tổn thương I / R qua trung gian bổ sung, do đó đại diện cho một mục tiêu điều trị tiềm năng.

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Mô hình lợn tổn thương thận I / R

Mô hình động vật về tổn thương I / R thận đã được phát triển như đã mô tả trước đây [23]. Sau khi được ủy ban đạo đức của Bộ Y tế phê duyệt, 4- lợn cái lớn màu trắng cái tháng tuổi (n =8, n =4 cho nhóm, 2 0 kg) đã trải qua thử nghiệm quy trình phẫu thuật mở dưới gây mê toàn thân. Các con vật nhịn ăn trong 24 giờ trước khi bắt đầu gây mê. Điện tâm đồ, nhịp tim, độ bão hòa oxy trong hemoglobin, thành phần khí hô hấp, nhịp hô hấp, thể tích thủy triều, áp lực đường thở, huyết áp động mạch tâm thu và áp lực tĩnh mạch trung tâm liên tục được theo dõi và ghi lại tự động (Ohmeda Modulus CD; DatexOhmeda, Helsinki, Phần Lan) . Động mạch thận trái và tĩnh mạch đã được cô lập và một vòng mạch được định vị xung quanh động mạch thận bằng một kẹp góc bên phải. Sinh thiết thận được thực hiện trước khi thiếu máu cục bộ (T0). Sau đó, giai đoạn thiếu máu cục bộ được tạo ra (30 phút) bằng cách kéo vòng mạch. Nhiều sinh thiết sau đó được thực hiện ở 15, 30 và 60 phút sau khi tái tưới máu; động vật đã được hy sinh 24 giờ sau khi tiến hành phẫu thuật. Một phần của mỗi mẫu sinh thiết được đông lạnh nhanh trong môi trường nhiệt độ cắt tối ưu (Tissuetek, Pittsburgh, PA) và được bảo quản trong nitơ lỏng. Một phần khác được cố định trong formalin đệm (4%) trong 12 giờ và được nhúng vào parafin theo quy trình tiêu chuẩn.

Nghiên cứu kính hiển vi

Các mẫu thận nhúng parafin từ sinh thiết thận được sử dụng để nhuộm mô học thông thường (H&E, axit tuần hoàn-Schiff). Hình ảnh được thu thập bởi thiết bị Aperio ScanScope CS2 (Aperio Technologies, Vista, CA, USA). Tổn thương ống-kẽ và cầu thận được đánh giá bằng cách sử dụng phân tích định tính bởi hai quan sát viên (CD, MR), những người không biết về nguồn gốc.

Kháng thể

Các kháng thể chính được sử dụng trong nghiên cứu này đã công nhận các kháng nguyên sau: PTX3 (MNB4: trực tiếp chống lại vùng đầu cuối N-PTX3, Exira Life Sciences In., Larsen, Thụy Sĩ); CD163 (bạch cầu đơn nhân / đại thực bào, Sinh học Hoa Kỳ, Swampscott, MA); SWC3a (tế bào đuôi gai, [55] 74-22-15 A, BD Biosciences); FSP1 (protein cụ thể nguyên bào sợi 1, Abcam, Cambridge, Vương quốc Anh); actin cơ trơn alpha (Công ty Công nghệ sinh học Santa Cruz; Santa Cruz, CA, Hoa Kỳ); C1q (R9 / 2, AbDSerotec; Kidlington, Vương quốc Anh); MBL (3E7: trực tiếp chống lại miền nhận dạng carbohydrate MBL, công nghệ sinh học Hycult, Uden, Hà Lan) và C9 neoantigen (aE11, công nghệ sinh học Hycult). Phản ứng chéo được xác nhận bằng cách ủ trước các kháng thể cụ thể, trước khi sử dụng, với các peptit của người được sử dụng để nuôi dưỡng chúng. Quá trình ủ trước loại bỏ hiện tượng nhuộm màu cụ thể trên mô lợn.

Kính hiển vi quét laser đồng tiêu và miễn dịch huỳnh quang mô

Đặc tính và khu trú của tín hiệu PTX3 đã được khảo sát trên mô đông lạnh có trong môi trường OCT (Tissue-Tek). Các phiến kính được ủ với 5% huyết thanh thỏ trong 1 giờ ở 37 độ C. Các phiến kính sau đó được ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng với các kháng thể đặc hiệu. Sau ba lần rửa trong PBS, các phiến kính sau đó được ủ với các kháng thể thứ cấp thích hợp (Alexa Flour 488 và 555, Molecular Probes, Eugene, OR). Tất cả các phần đều được so sánh với TO-PRO -3 (Đầu dò phân tử). Đối chứng âm tính được chuẩn bị với các kháng thể không liên quan. Các phần được phân tích bằng kính hiển vi quét laser đồng thời Leica TCS SP2 (Leica, Wetzlar, Đức). Số lượng ô xâm nhập được đo trong ít nhất 10 trường / phần công suất cao (x630) bởi hai quan sát viên độc lập bị mù về nguồn gốc của các trang trình bày. Các số liệu cuối cùng là giá trị trung bình của hai phép đo. Không có trường hợp nào, độ biến thiên giữa máy chủ quan sát cao hơn 20 phần trăm.

Nuôi cấy tế bào và phân tích dòng chảy tế bào

Tế bào nội mô tĩnh mạch rốn người (HUVEC, EC) được mua từ Bộ sưu tập Văn hóa Loại Mỹ (Tiêu chuẩn ATCC-LGC, Sesto San Giovanni, Ý). EC được trồng trong môi trường khuyến nghị của họ, EndoGro (Merck Millipore, Darmstadt, Đức). EC được mạ ở mật độ 1 {{1 0}}, 000 tế bào / cm2 và được kích thích bằng xử lý H2O2 (3 phần trăm, 1 giờ). Sau đó, EC cơ bản và kích thích được rửa hai lần bằng PBS và được loại bỏ bằng PBS-EDTA 2mM và trypsin 0. 001 ×. Sau đó, các tế bào được tiếp tục lại trong PBS và được ủ tương ứng với PTX3 (PTX3 tái tổ hợp của người, Sigma-Aldrich, Merck, Đức) (1ug / ml) hoặc / và với rhC 1- INH (Ruconest®, Pharming) (2.5ug / ml) trong 60 phút. Sau khi rửa ba lần bằng PBS 1X, các tế bào được gắn lại trong dung dịch đệm đo dòng chảy (FACS) (nước muối đệm phosphat, pH 7,2, 0,2% albumin huyết thanh bò và 0,02% natri azit) và được ủ với thuốc thử chặn FCR (Miltenyi Biotec) để 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sau khi ngăn chặn, ECs được ủ với C {30}} INH chống người ở thỏ (do Giáo sư M. Daha, Đại học Leiden cung cấp, độ pha loãng 1 // 100) hoặc / và với chất chống PTX3 của chuột (MNB4, Exira Life Sciences In., Độ pha loãng 1/20) ở nhiệt độ phòng trong 30 phút và rửa bằng đệm FACS. Sau đó, các tế bào được ủ với IgG PE chống thỏ dê (Đầu dò phân tử, pha loãng 1/100) hoặc / với IgG FITC chống chuột (Đầu dò phân tử, pha loãng 1/100) ở nhiệt độ phòng trong 30 phút và rửa ba lần. Tế bào được phân tích bằng phần mềm FC500 (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) và Kaluza. Khu vực tích cực được xác định bằng cách sử dụng mAb đối sánh đồng phân, và tổng cộng, 104 sự kiện cho mỗi mẫu đã được thu thập. Ba thí nghiệm độc lập đã được thực hiện.

Phân tích thống kê

Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (SD) và được so sánh bằng cách sử dụng phân tích phương sai hoặc kiểm định t Student được ghép nối, nếu thích hợp. Sự khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi giá trị p nhỏ hơn 0. 0 5. Dữ liệu được phân tích bằng gói phần mềm Statview (phiên bản 5.0) (SAS Inc. Co., Cary, NC, USA). Đồ thị được hiển thị bằng GraphPad Prism Software 5.

Các từ viết tắt

I / R: thiếu máu cục bộ / tái tưới máu; EC: tế bào nội mô; PTX3: pentraxin 3; FSP -1: protein đặc hiệu nguyên bào sợi 1; N-cadherin: cadherin thần kinh; alpha-SMA: alpha-actin cơ trơn.

SỰ ĐÓNG GÓP CỦA TÁC GIẢ

CD điều phối nghiên cứu, tham gia đánh dấu miễn dịch và kính hiển vi đồng tiêu của các phần thận, và soạn thảo bản thảo. AS và RF đã tham gia vào việc thiết kế nghiên cứu, đóng góp vào việc phân tích dữ liệu, thực hiện các thí nghiệm trong ống nghiệm và sửa đổi nghiêm túc bản thảo. MR và GSN thực hiện phân tích hình ảnh mô bệnh học. LL, FS, AMC đã thực hiện mô hình động vật về chấn thương do Thiếu máu cục bộ-Tái tưới máu và giúp chỉnh sửa bản thảo. GL, PD và MB đã tiến hành tất cả các quy trình phẫu thuật trên mô hình lợn và giúp chỉnh sửa bản thảo. MRD, P.vdP., C.vK. và FS đã sửa đổi bản thảo.

PP, ER, GG, GS và LG đã sửa đổi bản thảo một cách nghiêm túc. GC đã cung cấp các công cụ phân tích mới, thiết kế và giám sát nghiên cứu. CD, AS và RF đóng góp như nhau cho nghiên cứu này. Tất cả các tác giả đã đóng góp cho bài báo và chấp thuận phiên bản đã gửi.

SỰ NHÌN NHẬN

Chúng tôi cảm ơn Claudia Curci từ Đơn vị Ghép thận, Lọc máu và Ghép tạng, Khoa Cấp cứu và Ghép tạng,

Đại học Bari cho sự hỗ trợ kỹ thuật tuyệt vời.

XUNG ĐỘT LỢI ÍCH

Các tác giả tuyên bố rằng họ không có xung đột lợi ích.

KINH PHÍ

Nghiên cứu này được hỗ trợ bởi Đại học Bari "Aldo Moro", Bộ Y tế Ý (GR 2016- 02362239 "Một phương pháp dựa trên bảng điểm để xác định các yếu tố dự đoán và mục tiêu điều trị cho chức năng ghép chậm trongquả thậnngười nhận ghép tạng ", Bando di Ricerca Finalizzata 2016, CD đã nhận được học bổng về dự án này) và Fondo Sociale Europeo, Azione I.2" Attrazione e Mobilità Internazionale dei Ricercatori "- AIM -1810057- hoạt động 2 được cấp cho AS

NGƯỜI GIỚI THIỆU

1. Bonventre JV, Yang L. Sinh lý bệnh tế bào của thiếu máu cục bộ cấp tínhquả thậnvết thương. J Clin Đầu tư. 2011; 121: 4210–21.

2. Jang HR, Rabb H. Đáp ứng miễn dịch bẩm sinh trong cấp tính thiếu máu cục bộquả thậnvết thương. Clin Immunol. Năm 2009; 130: 41–50.

3. Ricklin D, Hajishengallis G, Yang K, Lambris JD. Bổ sung: một hệ thống quan trọng để giám sát miễn dịch và cân bằng nội môi. Nat Immunol. Năm 2010; 11: 785–97.

4. Thurman JM, Holers VM. Vai trò trung tâm của con đường bổ sung thay thế trong bệnh ở người. J Immunol. Năm 2006; 176: 1305–10. PMID: 16424154

5. Franzin R, Stasi A, Fiorentino M, Stallone G, Cantaluppi V, Gesualdo L, Castellano G. Hệ thống viêm và bổ sung: Liên kết giữa cấp tínhQuả thậnThương tật và Thiệt hại Mảnh ghép mãn tính. Immunol phía trước.

Năm 2020; 11: 734.PMID: 32457738

6. Deban L, Jaillon S, Garlanda C, Bottazzi B, Mantovani A. Pentraxin trong miễn dịch bẩm sinh: bài học từ PTX3. Mô tế bào Res. 2011; 343: 237–49.PMID: 20683616

7. Cieślik P, Hrycek A. Pentraxin 3 (PTX3) dài dưới ánh sáng của cấu trúc, cơ chế hoạt động và ý nghĩa lâm sàng của nó. Quyền tự trị. Năm 2012; 45: 119–28.PMID: 21988562

8. Kunes P, Holubcova Z, Kolackova M, Krejsek J. Pentraxin 3 (PTX 3): một chất điều biến nội sinh của phản ứng viêm. Người trung gian Viêm. Năm 2012; 2012: 920517.PMID: 22577258

9. Garlanda C, Bottazzi B, Bastone A, Mantovani A. Pentraxin ở ngã tư giữa miễn dịch bẩm sinh, viêm nhiễm, lắng đọng ma trận và khả năng sinh sản của nữ giới. Annu Rev Immunol. Năm 2005; 23: 337–66.115756PMID: 15771574

10. Bottazzi B, Garlanda C, Cotena A, Moalli F, Jaillon S, Deban L, Mantovani A. Pentraxin PTX3 dài như một thụ thể nhận dạng mẫu dịch thể nguyên mẫu: tương tác với miễn dịch bẩm sinh tế bào. Immunol Rev. 2009; 227: 9–18.PMID: 19120471

11. Ma YJ, Doni A, Hummelshøj T, Honoré C, Bastone A, Mantovani A, Thielens NM, Garred P. Sức mạnh tổng hợp giữa ficolin -2 và pentraxin 3 làm tăng khả năng nhận biết miễn dịch bẩm sinh và lắng đọng bổ thể. J Biol Chem. Năm 2009; 284: 28263–75.PMID: 19632990

12. Netti GS, Lucarelli G, Spadaccino F, Castellano G, Gigante M, Divella C, Rocchetti MT, Rascio F, Mancini V, Stallone G, Carrieri G, Gesualdo L, Battaglia M, Ranieri E. PTX3 điều chỉnh miễn dịch trong khối u môi trường vi mô và là yếu tố tiên lượng cho bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào thận tế bào rõ. Lão hóa (Albany NY). Năm 2020; 12: 7585–602.PMID: 32345771

13. Souza DG, Amaral FA, Fagundes CT, Coelho FM, Arantes RM, Sousa LP, Matzuk MM, Garlanda C, Mantovani A, Dias AA, Teixeira MM. Pentraxin PTX3 dài rất quan trọng đối với chứng viêm mô sau khi

thiếu máu cục bộ đường ruột và tái tưới máu ở chuột. Là J Pathol. Năm 2009; 174: 1309–18.PMID: 19286566

14. Jaillon S, Peri G, Delneste Y, Frémaux I, Doni A, Moalli F, Garlanda C, Romani L, Gascan H, Bellocchio S, Bozza S, Cassatella MA, Jeannin P, Mantovani A. Thụ thể nhận dạng mô hình thể dịch PTX3 được lưu trữ trong các hạt bạch cầu trung tính và khu trú trong các bẫy ngoại bào. J Exp Med. Năm 2007; 204: 793–804.PMID: 17389238

15. Tong M, Carrero JJ, Qureshi AR, Anderstam B, Heimbürger O, Bárány P, Axelsson J, Alvestrand A, Stenvinkel P, Lindholm B, Suliman ME. Pentraxin 3 huyết tương ở bệnh nhân mãn tínhquả thậnbệnh tật: liên quan đến chức năng thận, protein-năng lượng, suy mòn, bệnh tim mạch và tỷ lệ tử vong. Clin J Am Soc Nephrol. Năm 2007; 2: 889–97.PMID: 17702732

16. Witasp A, Rydén M, Carrero J. PLoS Một. 2013; 8: e63493.PMID: 23658833

17. Presta M, Camozzi M, Salvatori G, Rusnati M. Vai trò của thụ thể nhận dạng mẫu hòa tan PTX3 trong sinh học mạch máu. J Ô Mol Med. Năm 2007; 11: 723–38.PMID: 17760835

18. Bottazzi B, Inforzato A, Messa M, Barbagallo M, Magrini E, Garlanda C, Mantovani A. Các pentraxin PTX3 và SAP có khả năng miễn dịch bẩm sinh, điều hòa phản ứng viêm và tái tạo mô. J Hepatol. 2016; 64: 1416–27.

19. Xiao Y, Yang N, Zhang Q, Wang Y, Yang S, Liu Z. Pentraxin 3 ức chế xơ hóa mô kẽ do chấn thương thận cấp thông qua việc ức chế con đường IL -6 / Stat3. Tình trạng viêm nhiễm. 2014; 37: 1895–901.PMID: 24854162

20. Inforzato A, Reading PC, Barbati E, Bottazzi B, Garlanda C, Mantovani A. Mặt "ngọt ngào" của pentraxin dài: cách glycosyl hóa ảnh hưởng đến chức năng của PTX3 trong miễn dịch bẩm sinh và viêm. Immunol phía trước. 2013; 3: 407. PMID: 23316195