Phenylethanoid Glycosides gây ra quá trình chết rụng tế bào ở tế bào Eca-109 thông qua con đường phụ thuộc vào ty thể

Giới thiệu

Ung thư thực quản là một trong những loại ung thư phổ biến nhất với tỷ lệ mắc bệnh cao thứ 11 và tỷ lệ tử vong cao thứ 6 trên toàn cầu và gây ra ~ 439,000 ca tử vong trong năm 2015. Tỷ lệ mắc ung thư thực quản khác nhau đáng kể giữa các khu vực khác nhau, đặc biệt là ở miền Đông Châu Á, Đông và Nam Phi có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất và Tây Phi có tỷ lệ thấp nhất trong năm 2012. Tại Trung Quốc, số ca ung thư thực quản và tỷ lệ tử vong ước tính lần lượt là 477,000 và 375,000 , vào năm 2015. Mặc dù tỷ lệ mắc bệnh ung thư thực quản đã giảm ở các quốc gia có chỉ số nhân khẩu xã hội trung bình và trung bình cao trong khoảng thời gian từ 2005 đến 2015, tỷ lệ tử vong vẫn cao do tiên lượng xấu. Sự kết hợp giữa phẫu thuật cắt bỏ với hóa trị hoặc xạ trị đã được sử dụng để điều trị ung thư thực quản, tuy nhiên, có báo cáo rằng từ năm 2003 đến năm 2014, tỷ lệ sống sót sau 5-năm vẫn duy trì<20% in China, USA and Europe. For these reasons, it is urgent to develop novel therapeutic agents to treat esophageal cancer. used to treat various cancer types, including non Traditional Chinese herbal medicine (CHM) -small cell lung cancer, colorectal cancer, and hepatocellular carcinoma. Recently, clinical trials reported that the combination of CHM with chemotherapy or radiotherapy not only demonstrated several benefits on the quality of life and alleviating side effects induced by chemotherapy or radiotherapy but also improved the survival rate of patients with non-small cell lung, liver, gastric, colorectal, nasopharyngeal or cervical cancer. However, there is conflicting evidence regarding the efficacy of CHM treatment on esophageal cancer. Numerous studies determined that several herbal medicines or components could inhibit the growth of esophageal cancer cells in vitro and in vivo, including Andrographis paniculata, Daikenchuto, icariin, Rosa Roxburghii Tratt and Fagopyrum Cymosum, Jaridonin, Marsdenia tenacissima, OP16 (a novel ent-kaurene diterpenoid), Qigesan and Tonglian decoction. Cistanche is a type of CHM and exerts various biological functions, including anti‑oxidation, anti‑inflammation, and neuroprotection. Our previous studyđã chứng minh rằngCistanche tubulosa phenylethanoid glycoside(CTPG) có thể ngăn chặn sự phát triển của tế bào F10 khối u ác tính B16- in vitro và in vivo (24). Tuy nhiên, khả năng hòa tan trong nước kém của CTPG được sử dụng trước đây đã hạn chế sự phát triển của thuốc. Do đó, CTPG hòa tan trong nước (CTPG-W) đã được sử dụng và tác dụng chống ung thư đối với tế bào ung thư thực quản (Eca-109) đã được nghiên cứu. Người ta đã xác định rằng CTPG-W có thể ức chế khả năng tồn tại của tế bào Eca-109 một cách phụ thuộc vào liều lượng thông qua việc gây ra apoptosis thông qua con đường phụ thuộc vào ty thể.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ CẢI THIỆN CHỨC NĂNG TÌNH DỤC PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Vật liệu và phương pháp

Động vật.

Chuột cái C57BL/6 (6-8 tuần, ~25 g) được mua từ Trung tâm Nghiên cứu Động vật Phòng thí nghiệm Bắc Kinh (Bắc Kinh, Trung Quốc) và được nuôi trong điều kiện được kiểm soát nhiệt độ (25˚C), được chiếu sáng theo chu kỳ (12/ 12) Cơ sở Động vật của Đại học Tân Cương (Urumqi, Trung Quốc). Tất cả động vật đều nhận được nước và thức ăn không có mầm bệnh.

Dòng tế bào và nuôi cấy.

Dòng tế bào ung thư biểu mô thực quản ở người (Eca{0}}) được bảo tồn bởi Phòng thí nghiệm trọng điểm về Tài nguyên sinh học và Kỹ thuật di truyền Tân Cương (Trường Cao đẳng Khoa học và Công nghệ Đời sống, Đại học Tân Cương, Urumqi, Trung Quốc) và nuôi cấy trong RPMI{{1} } môi trường (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) được bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò bất hoạt do nhiệt (FBS; MRC, EN MOASAI Biology Technology Co., Ltd, Giang Tô, Trung Quốc), 1% L -glutamine (100 mM), penicillin 100 U/ml và streptomycin 100 µg/ml ở 37˚C trong môi trường ẩm có chứa 5% CO2.

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

CTPG-W (cat. no. SGJG20170410) được mua từ Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (Thượng Hải, Trung Quốc). Các hợp chất chính của CTPG đã được định lượng và định lượng bằng HPLC theo nghiên cứu trước đây của chúng tôi (24). Tóm lại, HPLC được tiến hành trên Cột ZORBAX SB‑C18 (250x4,6 mm; 5 µm) ở 30˚C và rửa giải bằng dung dịch axit formic 0,2% và gradient metanol bắt đầu từ 23%, vì cứ mỗi phút lại thêm 1 ml trong 45 phút cho đến khi đạt 31%. Tổng cộng 10 µl mẫu được tiêm và phát hiện ở bước sóng 330 nm. Tiêu chuẩn echinacoside được mua từ Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (Thượng Hải, Trung Quốc) và tiêu chuẩn Acteoside được mua từ Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmstadt, Đức). Các tiêu chuẩn được sử dụng để phân tích các thành phần của CTPG-W.

Xét nghiệm MTT.

Sự tăng sinh tế bào được đo bằng xét nghiệm MTT. Tế bào Eca{0}} được cấy vào 96-các đĩa giếng với mật độ 5x103 tế bào trong 100 µl RPMI{{5 }} môi trường/giếng và nuôi cấy ở 37˚C trong 24 giờ, sau đó được xử lý với các nồng độ khác nhau (0, 200, 400, 600 và 800 µg/ml) CTPG-W hoặc 0,4% dimethyl sulfoxide (DMSO) trong 24, 48 và 72 giờ. DMSO được sử dụng làm dung môi kiểm soát (800 µg/ml CTPG-W chứa 0,4% DMSO). Cisplatin (20 µg/ml) được sử dụng làm đối chứng dương tính. Sau đó, phần nổi phía trên được loại bỏ sau khi ly tâm ở tốc độ 225 xg trong 5 phút ở nhiệt độ phòng và thêm 100 µl dung dịch MTT (0,5 mg/ml trong môi trường RPMI{29}} không có FBS) vào từng giếng và ủ ở 37˚C trong 3 h. Các tinh thể formazan tạo thành được hòa tan trong 200 µl DMSO. Các giá trị mật độ quang (OD) được đo ở bước sóng 490 nm bằng 96-máy đọc vi bản giếng (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Khả năng tồn tại của tế bào tương đối được tính theo công thức: Khả năng tồn tại của tế bào (%)=(OD được xử lý/ODkhông được xử lý)x100%. Hình thái của các tế bào Eca-109 được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang đảo ngược (độ phóng đại, x200) (Nikon Eclipse Ti-E; Tập đoàn Nikon, Tokyo, Nhật Bản).

Để tăng sinh tế bào lách, chuột C57BL/6 đã được tiêu hủy do trật khớp cổ tử cung và lá lách được phân lập. Huyền phù tế bào đơn đã được tạo ra và tế bào lách được gieo vào 96-các đĩa giếng với mật độ 1x105 tế bào/giếng trong môi trường 100 µl RPMI-1640, sau đó được xử lý với các nồng độ khác nhau (0, 200, 400, 600 và 800 µg/ml) CTPG-W trong 24, 48 và 72 giờ ở 37˚C với 5% CO2. Sự tăng sinh của tế bào lách được đo bằng xét nghiệm MTT, theo quy trình nói trên. Chỉ số kích thích=OD được điều trị/ODkhông được điều trị.

Đo lường apoptosis và chu kỳ tế bào. Tế bào Eca{0}} được nuôi cấy trong các đĩa 60 mm với mật độ 2,5x105 tế bào/đĩa trong 24 giờ và được xử lý với các nồng độ khác nhau ({{31} }, 200, 400, 600 và 800 µg/ml) CTPG-W hoặc 0,4% DMSO trong 24 giờ ở 37˚C với 5% CO2. Theo giao thức của nhà sản xuất, các tế bào được thu thập và nhuộm màu bằng bộ phát hiện Apoptosis của Phụ lục V-fluorescein isothiocyanate (FITC)/Propidium iodide (PI) (Công ty TNHH Công nghệ sinh học Thượng Hải Shengsheng, Thượng Hải, Trung Quốc). Các mẫu được thu thập bằng phương pháp tế bào học dòng chảy (BD FACSCalibur; BD Bioscatics, Franklin Lakes, NJ, USA) và được phân tích bởi FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA). Để phân tích ảnh hưởng của CTPG-W đến chu kỳ tế bào, các tế bào 2,5x105 Eca{24}} được gieo vào đĩa nuôi cấy 60 mm và được xử lý bằng CTPG-W (0, 100, 200 và 400 µg/ml) hoặc 0,4 % DMSO trong 24 giờ ở 37˚C với 5% CO2. Tất cả các tế bào được thu hoạch và rửa hai lần bằng PBS lạnh như đá (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), sau đó cố định trong ethanol lạnh 70% ở 4˚C trong 30 phút. Sau khi rửa hai lần bằng PBS lạnh như băng, các tế bào được treo lại trong dung dịch đệm nhuộm 300 µl PI/RNase (BD Bioscatics, San Jose, CA, USA) trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sự phân bố chu trình tế bào được phân tích bằng phần mềm ModFit LT 3.0 bằng phương pháp tế bào học dòng chảy (BD FACSCalibur).

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊNChống mệt mỏiBảo vệ gan PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Phân tích tiềm năng màng ty thể (Δψm) và các loại oxy phản ứng (ROS).Để phân tích Δψm, các tế bào Eca{0}} được xử lý bằng CTPG-W (0, 400, 600 và 800 µg/ml) hoặc 0,4% DMSO cho 24 giờ ở 37˚C với 5% CO2 và nhuộm bằng bộ xét nghiệm tiềm năng màng ty thể với JC-1 (Viện Công nghệ sinh học Beyotime, Thượng Hải, Trung Quốc), theo quy trình của nhà sản xuất, trong 20 phút ở 37˚ C. Sau khi rửa hai lần bằng dung dịch đệm rửa JC-1 (Viện Công nghệ sinh học Beyotime), các mẫu được hòa lại với 300 µl dung dịch đệm rửa JC-1 và được phân tích bằng phương pháp tế bào học dòng chảy (BD FACSCalibur). Sự phát huỳnh quang của thuốc nhuộm JC-1 trong tế bào Eca-109 cũng được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang đảo ngược (độ phóng đại, x200; Nikon Eclipse Ti-E). Để phân tích ROS, các tế bào Eca{21}} được xử lý bằng CTPG-W (0, 400, 600 và 800 µg/ml) trong 2, 4, 6, 12 và 24 giờ và nhuộm màu bằng Xét nghiệm các loài oxy phản ứng kit (Viện Công nghệ sinh học Beyotime), theo quy trình của nhà sản xuất, trong 20 phút ở 37˚C. Sau khi rửa ba lần bằng PBS lạnh như đá, các mẫu được thu thập bằng phương pháp tế bào học dòng chảy (BD FACSCalibur) và được phân tích bằng phần mềm FlowJo 7.6.

Hình 1. Bộ điều khiển đủ điều kiện của CTPG-W. Các thành phần của CTPG-W được phân tích định tính và định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao và so sánh với các chất chuẩn echinacoside và Acteoside. CTPG-W, glycosid phenylethanoid tan trong nước củaC. ống thận.

Hoạt tính dọn gốc tự do 2,2‑diphenyl‑1‑picrylhydrazyl (DPPH). Hoạt tính dọn gốc tự do của CTPG-W được xác định bằng xét nghiệm gốc tự do DPPH theo quy trình đã được công bố với một sửa đổi nhỏ, vì metanol được thay thế bằng etanol để hòa tan DPPH (25,26). Đối với các phép đo ở trạng thái ổn định, 150 µl DPPH (100 mmol/l) trong etanol được trộn với các nồng độ khác nhau của CTPG-W (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 và 600 µg/ml) trong 50 µl PBS, và ủ trong bóng tối trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm được phát hiện khi có và không có CTPG-W. Tổng cộng 50 µl Vitamin C đã được sử dụng làm đối chứng dương tính. Hoạt tính quét gốc DPPH được tính bằng công thức: Quét (%){{24}[1-(Asample-Ablank)/A0] x100, trong đó Ablank là độ hấp thụ của chất đối chứng (không có DPPH), Asample là độ hấp thụ của mẫu và A0 là độ hấp thụ của PBS với DPPH.

Phân tích Western blot. Tế bào Eca{0}} được xử lý bằng CTPG-W (0, 200, 600 µg/ml) hoặc 0,4% DMSO trong 24 giờ ở 37˚C với 5% CO2. Lần rửa tiếp theo hai lần bằng PBS, tế bào 

Hình 2. Ảnh hưởng của CTPG-W đến sự phát triển của tế bào Eca-109 và tế bào lách. (A) Các tế bào Eca-109 được xử lý với các nồng độ CTPG-W khác nhau trong 24, 48 và 72 giờ, sau đó phát hiện khả năng sống sót của tế bào bằng xét nghiệm MTT. (B) Những thay đổi về hình thái của tế bào Eca-109 khi xử lý CTPG-W sau 24 giờ. (C) Tế bào lách của chuột C57BL/6 được xử lý với các nồng độ CTPG-W khác nhau trong 24, 48 và 72 giờ, sau đó sự tăng sinh được phân tích bằng xét nghiệm MTT.**P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. ống thận.

được lọc trong dung dịch đệm Lysis thử nghiệm ức chế miễn dịch phóng xạ (Bắc Kinh ComWin Biotech Co., Ltd., Bắc Kinh, Trung Quốc) trong 20 phút trên băng. Sau khi ly tâm ở tốc độ 10,000 xg trong 10 phút ở 4˚C, phần nổi phía trên được thu thập và nồng độ protein được phát hiện bằng bộ axit bicinchoninic (Thermo Fisher Scientific, Inc.) theo quy trình của nhà sản xuất. Phân tích Western blot được thực hiện theo mô tả trước đây của chúng tôi (24). Các kháng thể chống lại caspase-7 (cat. no. D120077), caspase-8 (cat. no. D155240), caspase-9 (cat. no. D220078), ung thư hạch tế bào B{ {13}} (Bcl-2)-liên kết X (Bax) (cat. no. D220073) và Bcl-2 (cat. no. D260117) và IgG-horseradish peroxidase chống chuột (HRP ) (cat. no. D111050) và anti-rabbit IgG-HRP (cat. no. D110058) đã được mua từ BBI Life Sciences (Thượng Hải, Trung Quốc). Các kháng thể chống lại caspase-3 (cat. no. E-AB-10050) và caspase hoạt động-3 (cat. no. E-AB-22115) được mua từ Elabscience ( Vũ Hán, Trung Quốc). Các kháng thể khác chống lại caspase-7 (cat. no. 9492), poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) (cat. no. 9542), cytochrome c (cat. no. AC909), c-Jun NH{ {37}}kinase đầu cuối (JNK) (cat. no. 9252S) và -actin (cat. no. 58169) được lấy từ Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA). Tất cả các kháng thể sơ cấp và thứ cấp đều được pha loãng theo tỷ lệ 1:1,000. Các kháng thể chính được ủ ở 4˚C qua đêm và các kháng thể thứ cấp được ủ ở 37˚C trong 1 giờ.

Hình 3. Quá trình tự hủy của tế bào Eca-109 do CTPG-W gây ra. Các tế bào được xử lý với nồng độ CTPG-W khác nhau trong 24 giờ. (A) Các tế bào Eca-109 chết theo chương trình và hoại tử được phân tích bằng phương pháp tế bào học dòng chảy. Bảng phía trên mô tả các ô chấm riêng lẻ và bảng phía dưới mô tả dữ liệu tóm tắt. * P<0.05 and ***P<0.001, compared with the control. (B) Total protein was isolated and the expression levels of Bax and Bcl-2 were detected with western blot analysis. Bcl-2, B-cell lymphoma-2; Bax, Bcl-2-associated X; DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. ống thận.

Theo giao thức của nhà sản xuất, các protein mục tiêu được phát hiện bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm phát quang hóa nâng cao (Viện Công nghệ sinh học Beyotime).

Phân tích thống kê. Ý nghĩa thống kê được tính toán bằng phân tích phương sai một chiều bằng bài kiểm tra hậu kiểm của Tukey và kết quả được phân tích bằng phần mềm GraphPad Prism 5.{2}} (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) giữa các nhóm điều trị và đối chứng. Tất cả dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn. P<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

CHIẾT XUẤT CISTANCHE TUBULOSA ĐỂ CẢI THIỆN CHỨC NĂNG THẬN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Kết quả

CTPG‑W ngăn chặn sự phát triển của tế bào Eca-109.

Các thành phần của CTPG-W đã được xác định chất lượng và định lượng bằng HPLC (Hình 1), được so sánh với các tiêu chuẩn của echinacoside và Acteoside. Theo thời gian lưu pic và diện tích pic, CTPG-W chứa 39,16% echinacoside và 2,44% Acteoside. Đầu tiên, ảnh hưởng của CTPG-W đến khả năng tồn tại của tế bào Eca-109 được xác định bằng xét nghiệm MTT. CTPG-W được hòa tan trong DMSO ở nồng độ 200 mg/ml và được pha loãng với môi trường RPMI{11}} chứa 10% FBS bất hoạt nhiệt đến nồng độ được chỉ định. Các tế bào Eca{14}} được xử lý bằng CTPG-W và khả năng sống sót của tế bào được phân tích bằng xét nghiệm MTT tại các thời điểm được chỉ định. Việc xử lý CTPG‑W làm giảm đáng kể khả năng tồn tại của tế bào Eca{16}} theo cách phụ thuộc vào liều lượng và thời gian (P<0.001; Fig. 2A). The morphology of Eca-109 cells was observed with an inverted fluorescence microscope (magnification, x200) following CTPG‑W treatment for 24 h, which changed notably in a dose-dependent manner, with the cells shrinking and becoming round following CTPG-W treatment (Fig. 2B). These results indicate that CTPG-W suppresses the growth of Eca-109 cells. The effect of CTPG-W on the proliferation of splenocytes was also detected with an MTT assay. CTPG-W significantly promoted the proliferation of splenocytes in a dose-dependent manner (Fig. 2C), indicating that it has no cytotoxic effect on splenocytes. 

Hình 4. Ảnh hưởng của CTPG-W đến sự phân bố chu kỳ tế bào trong các tế bào Eca-109. Các nồng độ CTPG-W khác nhau được sử dụng để xử lý tế bào Eca-109 trong 24 giờ và sự phân bố chu kỳ tế bào được phân tích bằng phương pháp tế bào học dòng chảy. * P<0.05 and **P<0.01, compared with the control. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. ống thận.

CTPG‑W gây ra apoptosis trong tế bào Eca-109. Để tìm hiểu xem liệu CTPG-W có ngăn chặn sự phát triển của tế bào Eca-109 thông qua việc gây ra apoptosis hoặc hoại tử hay không, các tế bào được xử lý bằng các nồng độ CTPG-W khác nhau. Sau 24 giờ, quá trình chết theo chương trình và hoại tử của tế bào Eca-109 được phát hiện bằng phương pháp nhuộm Annexin V/PI. Như được mô tả trong Hình 3A, các tế bào Phụ lục V- /PI+ được phân loại là tế bào hoại tử và các tế bào Phụ lục V+ /PI+ và Phụ lục V+ /PI- được phân loại là tế bào apoptotic. CTPG-W chủ yếu gây ra hiện tượng tự chết theo chương trình của các tế bào Eca-109 theo cách phụ thuộc vào liều lượng, mặc dù các tế bào Eca-109 hoại tử cũng tăng đáng kể khi điều trị ở liều CTPG-W 600 và 800 µg/ml (P<0.001 at 600 µg/ml and P<0.05 at 800 µg/ml). Consistently, the levels of pro-apoptotic Bax and anti-apoptotic Bcl-2 in Eca-109 cells were upregulated and downregulated, respectively, upon CTPG-W treatment (Fig. 3B). The results indicated that CTPG-W primarily inhibited the growth of Eca-109 cells through the induction of apoptosis.

CTPG‑W gây ra sự dừng chu kỳ tế bào ở pha S trong tế bào Eca‑109. Sự xáo trộn chu kỳ tế bào ung thư sẽ ngăn chặn sự phát triển của tế bào và thúc đẩy quá trình tự hủy (27). Sự phân bố chu kỳ tế bào trong các tế bào Eca-109 được phát hiện bằng nhuộm PI sau khi xử lý CTPG-W trong 24 giờ. Người ta quan sát thấy rằng các tế bào ở pha S tăng lên và các tế bào ở pha G0/G1 cho thấy tổng thể có sự giảm đáng kể khi điều trị bằng CTPG‑W (P<0.05;Fig. 4), indicating that CTPG-W arrests the Eca-109 cell cycle at the S phase.

CTPG‑W giảm Δψm và tạo ra sự giải phóng cytochrome c. Apoptosis có thể được gây ra bởi con đường phụ thuộc vào ty thể (28,29). Các thành viên ủng hộ và chống apoptotic của họ protein BCL-2 đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh tính toàn vẹn của màng ty thể (30,31). Sau khi xử lý CTPG-W trong 24 giờ, Δψm được đánh giá bằng phương pháp nhuộm JC‑1. Tập hợp JC‑1 (phát huỳnh quang màu đỏ được phát hiện trong FL-2) sẽ phân hủy thành monome (huỳnh quang màu xanh lá cây được phát hiện trong FL-1) khi Δψm đang giảm (32). Như được mô tả trong Hình 5A, tần số của các tế bào FL-1+ FL-2-/+ tăng đáng kể theo cách phụ thuộc vào liều lượng, cho thấy rằng Δψm của các tế bào Eca-109 đã giảm. Những thay đổi huỳnh quang trong tế bào Eca-109 cũng được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang đảo ngược (Hình 5B). Với nồng độ CTPG‑W ngày càng tăng, huỳnh quang màu đỏ giảm và huỳnh quang màu xanh lá cây tăng lên, điều này phù hợp với dữ liệu từ phương pháp đo tế bào dòng chảy. Người ta cũng quan sát thấy rằng mức độ cytochrome c trong bào tương tăng lên đáng kể (Hình 5C), là kết quả của việc giảm Δψm. Điều này củng cố kết luận rút ra từ số lượng tế bào FL-1+ FL-2-/+ tăng lên mà Δψm giảm do điều trị CTPG-W. Đã có báo cáo rằng JNK có thể điều chỉnh việc kích hoạt họ protein BCL-2 gây ra sự giải phóng cytochrome c (33-35). Người ta cũng xác định rằng mức độ JNK đã được điều chỉnh tăng đáng kể sau khi điều trị bằng CTPG-W (Hình 5C). Kết quả chỉ ra rằng CTPG-W có thể tạo ra quá trình tự hủy của tế bào Eca-109 thông qua con đường phụ thuộc vào ty thể.

Hình 5. Sự giảm Δψm và sự điều hòa tăng của cytochrome c và JNK. Tế bào Eca-109 được xử lý với các nồng độ CTPG-W khác nhau trong 24 giờ. (A) Δψm được phát hiện bằng phương pháp nhuộm JC-1 và các mẫu được phân tích bằng phương pháp tế bào học dòng chảy. Các ô chấm riêng lẻ mô tả những thay đổi trong huỳnh quang JC-1. Tần số của các ô FL-1+ FL-2-/+ được mô tả ở bảng bên dưới. ***P<0.001, compared with the control. (B) The changes in JC‑1 fluorescence were observed with an inverted fluorescence microscope. (C) The levels of cytochrome c and JNK were detected with western blot analysis. The different bands of JNK represent 54 and 46 kDa proteins. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; JNK, c-Jun NH2-terminal kinase.

Hình 6. Nồng độ ROS trong tế bào Eca-109 khi xử lý CTPG-W và hoạt tính chống oxy hóa của CTPG-W. (A) Các tế bào Eca-109 được xử lý với các nồng độ CTPG-W khác nhau và nồng độ ROS được phân tích bằng phương pháp tế bào học dòng chảy tại các thời điểm được chỉ định. * P<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. (B) The free radical scavenging activity of CTPG-W was determined with a 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl assay. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; ROS, reactive oxygen species; MFI, mean fluorescence intensity.

Tác dụng của CTPG‑W đối với việc tạo ra ROS nội bào.ROS có thể giảm Δψm để gây ra apoptosis (36). Để tìm hiểu xem CTPG-W có thể tăng sản xuất ROS hay không, các tế bào Eca-109 đã được xử lý với các nồng độ CTPG-W khác nhau. Các tế bào được thu thập tại các thời điểm được chỉ định và nhuộm màu bằng DCFH-DA. Việc sản xuất ROS nội bào trong tế bào Eca-109 được xác định bằng phương pháp tế bào học dòng chảy. Như được mô tả trong Hình 6A, 800 µg/ml CTPG-W đã tăng đáng kể việc sản xuất ROS từ 2-6 giờ và giảm từ 12-24 giờ. Ngoài ra, 400 µg/ml CTPG‑W đã tăng đáng kể việc sản xuất ROS từ 12-24 giờ. Hơn nữa, 200 µg/ml CTPG-W không làm thay đổi đáng kể việc sản xuất ROS. Những thay đổi năng động trong quá trình sản xuất ROS có thể liên quan đến quá trình apoptosis của tế bào Eca{15}}. Người ta cũng xác định rằng CTPG-W có hoạt tính nhặt gốc tự do (Hình 6B), điều này có thể liên quan đến việc giảm sản xuất ROS trong các tế bào Eca{18}} được xử lý bằng 800 µg/ml CTPG-W sau 12 giờ.

Hình 7. Mức độ cleaved-caspase và cleaved-PARP sau khi xử lý CTPG-W. Các protein được phân lập từ các tế bào Eca-109 được xử lý bằng CTPG-W trong 24 giờ và mức độ phân tách-caspase và cleaved-PARP đã được phát hiện bằng phân tích Western blot. DMSO, dimetyl sulfoxit; CTPG-W, glycosid phenylethanoid tan trong nước củaC. ống thận; PARP, poly (ADP-ribose) polymerase.

CTPG‑W điều chỉnh lại hoạt động của caspase-3, caspase-7, caspase-9 và PARP. Việc giải phóng cytochrome c do giảm Δψm có thể kích hoạt các protease caspase để gây ra apoptosis (29,30,37). Sau khi xử lý CTPG-W trong 24 giờ, việc kích hoạt caspase-3, 7, 8, 9 và PARP đã được phát hiện bằng phân tích Western blot. So với đối chứng, các mức cleaved-caspase-9, cleaved-caspase-7, cleaved-caspase-3 và cleaved-PARP, nhưng không phải là các mức cleaved-caspase{{20 }}, đã được điều chỉnh lại bằng cách xử lý CTPG theo cách phụ thuộc vào liều lượng (Hình 7). Những kết quả này chỉ ra rằng CTPG-W đã giảm Δψm và thúc đẩy giải phóng cytochrome c để kích hoạt các caspase gây ra quá trình tự hủy của tế bào Eca-109.

Cuộc thảo luận

CHM truyền thống có thể gây ra apoptosis của các tế bào ung thư thực quản thông qua các con đường khác nhau, bao gồm cả thụ thể tử vong bên ngoài, và các con đường căng thẳng nội tại của ty thể và lưới nội chất (29). Nghiên cứu trước đây của chúng tôi đã chứng minh rằng CTPG, với tư cách là thành phần chính của C. tubulosa, đã ức chế sự phát triển của tế bào khối u ác tính B16-F1{23}} thông qua việc gây ra apoptosis thông qua con đường phụ thuộc vào ty thể (24). Trong nghiên cứu hiện tại, tác dụng chống ung thư của CTPG-W trên tế bào Eca-109 đã được nghiên cứu và người ta xác định rằng CTPG-W ngăn chặn sự phát triển của tế bào Eca-109, gây ra apoptosis và ngừng chu kỳ tế bào, giảm Δψm, tăng giải phóng cytochrome c và các caspase được kích hoạt. CTPG và CTPG-W có thể gây ra apoptosis và ngăn chặn chu kỳ tế bào trong tế bào ung thư. Tuy nhiên, cơ chế chính xác là khác nhau do các thành phần khác nhau của CTPG (26,64% echinacoside, 10,19% Acteoside và 1,71% isoacteoside) và CTPG-W (39,16% echinacoside và 2,44% Acteoside). CTPG đã bắt giữ các tế bào B16-F10 ở pha G0/G1, nhưng CTPG-W đã bắt giữ các tế bào Eca-109 ở pha S (24). Việc sản xuất ROS được tăng lên tùy theo liều lượng bởi CTPG, nhưng nó cho thấy sự thay đổi theo cách phụ thuộc vào thời gian khi sử dụng CTPG‑W liều cao, tăng đáng kể khi bắt đầu điều trị CTPG-W (2-6 h) và giảm đáng kể sau 12 giờ so với đối chứng. Nguyên nhân có thể là do thành phần chính của CTPG-W là echinacoside. Một số nghiên cứu báo cáo rằng echinacoside có thể ức chế sản xuất ROS và quá trình apoptosis do ROS gây ra để phát huy tác dụng bảo vệ thần kinh và chống lão hóa (38-40). Tương tự, hoạt động nhặt gốc tự do đã được quan sát trong nghiên cứu này. Do đó, người ta đã suy đoán rằng một số thành phần, bao gồm verascoside, iso-verbascoside và salidroside trong CTPG-W liều cao có thể ngay lập tức tạo ra ROS để gây ra hiện tượng apoptosis của tế bào Eca-109 (41,42), và sau đó ROS đã được nhặt sạch bởi echinacosid. Một lý do có thể khác dẫn đến sự khác biệt trong sản xuất ROS của CTPG và CTPG-W là các dòng tế bào khác nhau đã được sử dụng trong nghiên cứu này và nghiên cứu trước đó (24). Dong và cộng sự (43) đã báo cáo rằng echinacoside có thể gây ra quá trình tự hủy của tế bào ung thư đại trực tràng SW480 ở người thông qua việc tạo ra tổn thương DNA oxy hóa mà không làm tăng mức ROS.

Việc xử lý CTPG-W làm giảm Δψm và gây ra sự giải phóng cytochrome c, chất này thúc đẩy sự phân cắt caspase-9 (28). Một cách nhất quán, mức độ cleaved-caspase-9 đã được điều chỉnh tăng lên bằng cách xử lý CTPG-W. Sau đó, caspase-9 đang hoạt động có thể kích hoạt caspase-3 để gây ra apoptosis (44). Mức độ cleaved-caspase-3 cũng được điều chỉnh tăng lên bằng cách xử lý CTPG-W. Tuy nhiên, caspase{12}} không được kích hoạt bởi CTPG-W, cho thấy con đường thụ thể tử vong bên ngoài không liên quan đến quá trình chết theo chương trình do CTPG-W gây ra. Những quan sát này chỉ ra rằng CTPG-W gây ra quá trình tự hủy của tế bào Eca{16}} thông qua việc kích hoạt con đường phụ thuộc vào ty thể.

PARP đóng vai trò quan trọng trong sự ổn định của bộ gen và có thể bị phân cắt bởi các caspase hoạt động, đặc biệt là caspase-3 và -7 (45). Người ta xác định rằng phương pháp xử lý CTPG-W đã kích hoạt caspase-3 và -7, có thể tách PARP để ức chế quá trình sửa chữa DNA và gây ra apoptosis.

CTPG-W cũng ức chế sự phát triển của tế bào BEL-7404 ung thư biểu mô tế bào gan ở người một cách phụ thuộc vào liều lượng và thời gian (dữ liệu chưa được công bố). Mặc dù CTPG-W ức chế sự phát triển của tế bào Eca-109 và BEL-7404, nhưng nó thúc đẩy sự tăng sinh của tế bào lách, điều này có thể là do hàm lượng polysaccharides (~50%) trong CTPG-W (46 ). Tương tự, một số nghiên cứu đã báo cáo rằng polysaccharide có thể thúc đẩy sự tăng sinh của tế bào lách (46-49). Trong mô hình chuột, người ta xác định rằng CTPG‑W làm tăng đáng kể chỉ số lá lách so với nhóm đối chứng, nhưng không ảnh hưởng đến trọng lượng cơ thể và các chỉ số cơ quan khác bao gồm tim, gan, thận và phổi (dữ liệu chưa được công bố), chỉ ra rằng CTPG-W không có tác dụng gây độc tế bào đối với tế bào bình thường.

Nói chung, dữ liệu chỉ ra rằng CTPG-W ức chế sự phát triển của tế bào Eca-109 bằng cách gây ra hiện tượng apoptosis thông qua con đường phụ thuộc vào ty thể

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ CẢI THIỆN CHỨC NĂNG TÌNH DỤC PHGS75% ECH 30% ACT 12%