Phenylethanol Glycoside từ Cistanche Tubulosa Ức chế sự kích hoạt tế bào vi sao gan và chặn sự dẫn truyền của các con đường truyền tín hiệu trong TGF -01 / smad Là tác nhân chống xơ gan tiềm tàng
Mar 05, 2022
Liên hệ: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Shu-Ping You, Long Ma, Jun Zhao, Shi-Lei Zhang và Tao Liu
Trừu tượng: Cistanche tubulosalà một loại thuốc thảo dược truyền thống của Trung Quốc được sử dụng rộng rãi để điều chỉnh khả năng miễn dịch vàphenylethanoid glycoside(CPhGs) là một trong những thành phần chính chịu trách nhiệm cho hoạt động này. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra tác dụng phòng ngừa và điều trị của CPhGs đối với bệnh xơ gan do albumin huyết thanh bò (BSA) gây ra ở chuột. Mục đích của nghiên cứu là đánh giá tác dụng chống xơ hóa gan của CPhGs và các monomeechinacosidevàacteosidebằng cách ức chế sự kích hoạt tế bào hình sao gan (HSC), ngăn chặn sự dẫn truyền của các con đường tín hiệu trong việc chuyển đổi yếu tố tăng trưởng-p1 (TGF-p1) / smad, và xác định chúng hoạt động bảo vệ gan trong ống nghiệm. Sự tăng sinh HSC rõ ràng đã bị ức chế sau khi điều trị bằng CPhGs (100,50 ^ g / mL) / echinacoside (500,250,125 ^ g / mL) / acteoside (6, 3 ^ g / mL), với giá trị IC50 là 119.125.520.345 và 6.999 g / mL, tương ứng, trong xét nghiệm MTT. Các nồng độ khác nhau của CPhGs /echinacoside/acteosidekhông ảnh hưởng đến độc tính tế bào trên HSC theo các phép đo lactate dehydrogenase (LDH). Các nồng độ khác nhau của CPhGs /echinacoside/acteosidetăng mức mRNA và biểu hiện protein của smad7 và giảm mức mRNA của smad2, smad3 và sự biểu hiện protein của smad2, phospho-smad2 (p-smad2), smad3, phospho-smad3 (p-smad3) trong HSC. Tóm lại, những kết quả này chứng minh rằng CPhGs /echinacoside/acteosidecó thể ngăn chặn sự dẫn truyền của các con đường tín hiệu trong TGF-p1 / smad, và ức chế sự hoạt hóa của HSC, cho thấy rằngC. tubulosado đó có thể là một loại thuốc thảo dược tiềm năng để điều trị xơ hóa gan.
Từ khóa: Cistanche tubulosa; phenyletanol glycoside từCistanche(CPHGs);echinacoside; acteoside; tế bào hình sao gan (HSC); TGF-p1 / smad
1. Giới thiệu
trở thành tăng sinh và tạo sợi, sau đó tích tụ ECM, và cuối cùng biệt hóa thành các tế bào giống nguyên bào sợi cơ. Yếu tố tăng trưởng biến đổi-.1 (TGF-p 1) được coi là chất trung gian tạo sợi chính. Con đường truyền tín hiệu liên quan đến TGF- & 1 là một cơ chế quan trọng của xơ hóa gan, và nó chủ yếu bao gồm tín hiệu phụ thuộc smad và không phụ thuộc vào smad, và con đường dẫn truyền tín hiệu phụ thuộc smad được cho là một kênh chính của tín hiệu TGF-p1 . Do đó, việc phong tỏa con đường truyền tín hiệu TGF-p1 / smad có thể ngăn chặn sản xuất collagen và cuối cùng làm giảm quá trình xơ hóa gan, điều này đã làm cho con đường này trở thành mục tiêu quan trọng trong nghiên cứu thuốc chống xơ hóa gan trong những năm gần đây.
Mặc dù tỷ lệ mắc bệnh xơ gan cao trên toàn thế giới, nhưng không có liệu pháp kháng xơ gan nào được chấp nhận chung [2—4]. Thuốc thảo dược cổ truyền Trung Quốc (TCHM) rất được quan tâm để điều trị rối loạn gan vì một số có thể được sử dụng làm thuốc điều trị trong việc kiểm soát và ngăn ngừa xơ hóa gan. Hiện nay, nhiều nghiên cứu đang tập trung vào các loại thuốc kháng xơ tiềm năng đã được sử dụng làm TCHM trong hàng nghìn năm [5].
Cistanche tubulosa W (họ Orobanchaceae) fa thực vật ký sinh, được trồng rộng rãi ở khu vực phía nam Tân Cương, Trung Quốc [6]. Người ta sử dụng nó để bổ thận, dưỡng huyết, thư giãn ruột và làm chậm lão hóa mà không có tác dụng phụ, và được chính thức liệt kê trong Dược điển Trung Quốc [7]. C. tubulosa chứa nhiều thành phần hoạt tính, bao gồm glycoside phenylethanoid (CPhGs), iridoids và polysaccharid. Trong số rất nhiều thành phần hoạt tính trong C. tubulous, CPhGs, có một số hoạt tính sinh học (chống oxy hóa, chống mệt mỏi, điện trở bức xạ, v.v.) là thành phần đặc trưng chính của loài Pie này. Trong những năm gần đây, có thông tin cho rằng CPhGis có tác dụng bảo vệ gan Hent vượt mức, và có thể quét các gốc cây, bảo vệ màng gan và thể hiện tác dụng điều hòa miễn dịch, ức chế quá trình chết, ức chế sự biểu hiện của kháng nguyên bề mặt viêm gan B (HBs Ag) và viêm gan B Hoạt động sao chép DNA của kháng nguyên e (HBeAg) a thứ hai của virus viêm gan B (HBV), v.v. Mức độ HBV DNA là chỉ số đáng tin cậy nhất phản ánh trực tiếp hoạt động sao chép của virus, là yếu tố quan trọng trong việc xác định tiền sử tự nhiên của nhiễm HBV mãn tính, theo dõi hiệu quả của liệu pháp kháng vi-rút oP, và đánh giá tiên lượng của nhiễm trùng HBV cấp tính và mãn tính. Các chỉ số phát hiện huyết thanh học của HBV chủ yếu bao gồm HBsAg, HBeAg, v.v. [8—11]. Tuy nhiên, có rất ít báo cáo tài liệu về tác dụng chống xơ hóa gan của CPhGs. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra tác dụng phòng ngừa và điều trị của CPhGs đối với bệnh xơ gan do albumin huyết thanh bò (BSA) gây ra ở chuột, nhưng hoạt tính kháng nguyên sinh của CPhGs và các đơn phân chính của nó (echinacoside và acteoside, Hình 1) chưa bao giờ được đánh giá trong ống nghiệm.
Cistanche tubulosa hữu cơ
2. Kết quả
2.1. Xác định định lượng CPhGs
CPhG trongC. tubulosachứa IT hai phenylethyl alcohol glycoside: echinacoside và acteo side và hàm lượng của chúng trong CPhGs được phát hiện bằng phân tích HPLC (Hình 1) là 42,71 phần trăm 土 0. 42 phần trăm và 14,27 phần trăm 土 0. 18 phần trăm, tương ứng.
2.2. Hoạt động ức chế củaCPhGs, Echinacoside và Acteoside trên HSC-T6
CPhGs, echinacoside và acteoside (62. 5-500 卩 g / mL) ức chế khả năng tồn tại của tế bào HSC theo cách phụ thuộc vào nồng độ. CPhGs và acteoside cho thấy hoạt động ức chế đáng kể trên tế bào HSC, với giá trị ức chế 50% hoạt động tăng trưởng tế bào (IC50) lần lượt là 119.125 昭 / mL và 6.999 昭 / mL. Echinacoside thể hiện hoạt tính ức chế trung bình (IC50.520.345 昭 / mL; Bảng 1 và Hình 2).
2.3. Độc tính tế bào của CPhGs, Echin acoside a nd Acteorida trên HSC
Lactate dehydrogenase (LDH), một loại enzyme tế bào chất có trong tất cả các tế bào, nhanh chóng được cho vào dịch nuôi cấy tế bào khi màng sinh chất bị tổn thương. Hoạt động của enzym trong phần nổi của môi trường nuôi cấy tương quan với tỷ lệ các celfs được ly giải [12]. Như được trình bày trong Bảng 2, khi được điều trị với các nồng độ khác nhau: C PhGs, echinacoside và acteoside, mặc dù hoạt tính LDH cho thấy có tăng nhẹ so với nhóm coirtrol tế bào, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p> 0. 05 ), chỉ ra rằng hầu hết các màng tế bào duy trì tính toàn vẹn của chúng và sự ức chế CPhGs, echinacoside và acteoside trên HSC không phải do độc tính tế bào không đặc hiệu.
2.4. Ảnh hưởng củaCPhGs, Echinacoside và Acteosde đối với sự gia tăng HSC do TGF- ^ i gây ra
Sự tăng sinh, hoạt hóa và biệt hóa của HSC được điều chỉnh bởi nhiều yếu tố. Trong số các yếu tố khác nhau liên quan đến xơ hóa gan, TGF {{0}} được coi là quan trọng nhất, vì nó có thể kích hoạt HSC, thúc đẩy sự biệt hóa nguyên bào sợi, tăng tổng hợp ECM và ức chế sự phân hủy ECM, đồng thời giải phóng chemokine và các cytokine tham gia vào quá trình xơ hóa gan [13]. Trong nghiên cứu này, ngoại trừ đối chứng, HSC cố định được kích thích bằng TGF-P1 trong ống nghiệm để mô phỏng sự hình thành xơ hóa gan sớm và để khảo sát ảnh hưởng của CPhGs, echinacoside và acteoside trên TGF-p 1- gây ra sự tăng sinh HSC. Như trong Bảng 3, so với nhóm đối chứng, nhóm TGF -61 đã thúc đẩy đáng kể sự gia tăng của HSC (p <0. 0="" 1).="" so="" với="" nhóm="" tgf-p1,="" tgf-p1="" cộng="" với="" cphgs="" (tc)="" (5="" 0,="" 1="" 0="" 0="" 卩="" g="" ml,="" p=""><0,05), tgf="" {{18}="" }="" cộng="" với="" echinacoside="" (te)="" (125,="" 250,="" 500="" 卩="" g="" ml,="" p=""><0,05), tgf-p1="" cộng="" với="" acteoside="" (ta)="" (3,0,="" 6,0="" 卩="" g="" ml,="" p=""><0,05) tất="" cả="" đều="" ức="" chế="" đáng="" kể="" sự="" gia="" tăng="" của="" hsc="" do="" tgf-|3="" 1="" gây="" ra="" ở="" các="" mức="" độ="" khác="">
2.5. Các biểu hiện của mRNA smad2) smad3 và smad7 sau khi can thiệp CPhGs, ochmacoside và acteaside trên HSC
Smad3 và smad2 là tác nhân chính của con đường truyền tín hiệu TTGF-p [14,15], và smad7 là chất ức chế tín hiệu smad. Về mặt lý thuyết, sự biểu hiện tăng lên của smad7 hoặc giảm sự biểu hiện của smad2 / smad3 có thể ngăn chặn sự dẫn truyền của các con đường tín hiệu trong TGF-p 1 / smad. Như thể hiện trong Hình 3, phân tích PCR lượng tử theo thời gian thực cho thấy biểu hiện mRNA của smad2 và smad3 cho thấy mức thấp hơn, trong khi smad7 cho thấy mức cao hơn trong nhóm đối chứng, so với nhóm TGF-|31. Trong nhóm TC (25, 5 0, 75,1 0 0|dg / mL), mức mRNA của smad2 (p <0. {{37="" }}="" 5)="" và="" smad3="" (p=""><0,01) đã="" giảm="" đáng="" kể="" so="" với="" nhóm="" tgf-pf="" và="" thậm="" chí="" tương="" tự="" với="" nhóm="" đối="" chứng;="" tôi="" đáng="" kể,="" mức="" mrna="" của="" smad7="" đã="" tăng="" lên="" đáng="" kể="" ở="" nhóm="" tc="" (50,="" 75,100="" 卩="" g="" ml)="" (p=""><0,05, p=""><0,05, p=""><0,01, tương="" ứng).="" tuy="" nhiên;="" biểu="" thức="" smad7="" cho="" thấy="" xu="" hướng="" tăng="" dần="" ở="" nhómtc="" 25="" 卩="" g="" ml="" so="" với="" nhóm="" tgf-p1="" (hình="">
Hile trung bình, ngang bằng với nhóm TGF-p1, sự biểu hiện của mRNA smad2 và smad3 giảm đáng kể trong TE (62,5, 125, 25 0, 5 0 0 卩 g / mL) nhóm (p <0. 0="" 1)="" và="" biểu="" hiện="" của="" mrna="" smad7="" đã="" tăng="" lên="" đáng="" kể="" trong="" nhóm="" te="" (125,="" 250.500="" 昭="" ml)="" (p=""><0,01) (hình="" 4)="" .="" tương="" tự,="" nhóm="" ta="" (0,75,1,5,="" 3,0,="" 6,0="" ^="" g="" ml)="" cũng="" cho="" thấy="" xu="" hướng="" tương="" tự="" (hình="">
2.6. Ảnh hưởng của eosid CPhGs, Echinacoside và Ac) đến T GF- ^ i / smad Lộ trình tín hiệu trong HSC
Lộ trình tín hiệu TGF-p 1 / smad phụ thuộc vào smad2, smad3, phospho-smad2 (p-smad2), phospho-smad3 (p-smad3) và smad7, trong đó p-smad2, p-smad3 là các dạng hoạt hóa của smad2 và smad3. Trong nghiên cứu này, mức độ protein của omad2, smad3, p-smad2, p-smsd3 và smad7 đã được phân tích. Phân tích Western blot đã phát hiện ra sự gia tăng nồng độ smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 bởi TGF-p1, và sự ức chế những sự gia tăng này bởi CPhGs, ec hinacoside và acteoside; trong khi đó, phân tích wesiern blot cho thấy mức độ smad7 được điều chỉnh bởi CPhGs, echinacoside và acteoside. (Fi gures 6—8).
Như thể hiện trong Hình 6, so với nhóm c on2rol (biểu hiện protein của smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 đã tăng lên đáng kể, và biểu hiện protein smad7 đã giảm ở nhóm TGF-p1. Ở TC (25 , 5 0, 75, 1 0 0 昭 / mL) nhóm thuốc, smad / (Hình 6A), p-smad2 (Hình 6B), smad 3 (Hình 6C), p -smad3 (Hình 6D) biểu hiện thấp hơn đáng kể so với nhóm TGF-p1 (卩 <0,01), và biểu hiện protein smad7 (Hình 6E) cao hơn so với nhóm TGF-S1 (p <0,01) (Hình 6).
Đồng thời, các biểu hiện ot smad 2, smad3, p-smad2, p-smad3 và smad7 protein được đo sau khi can thiệp echinacoside và acteoside trên HSC. Như thể hiện trong Hình 7 và 8, mức độ biểu hiện của protein smad2, smad3, p-smad2 và p-smad3 đã bị ức chế đáng kể (p <0. 0="" 5="" hoặc="" p=""><0. 01="" ),="" mức="" độ="" biểu="" hiện="" protein="" smad7="" đã="" tăng="" lên="" (p=""><0,01), so="" với="" nhóm="" tgf-p="" 1="" (hình="" 7="" và="">
3. Thảo luận
Xơ hóa gan là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây ra bệnh tật và tử vong trên toàn thế giới, nhưng các lựa chọn điều trị rất hạn chế hiện có sẵn cho tình trạng này, do đó, điều rất quan trọng là chúng ta phải tìm kiếm các mục tiêu tiềm năng để can thiệp điều trị nhằm ngăn chặn sự phát triển của) xơ hóa gan [ 16]. Gần đây, các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra rằng các loại thuốc thảo dược khác nhau có tác dụng bảo vệ gan đối với việc chống xơ hóa. Nhiều thuốc TCHM như thuốc Fufang Biejia Ruangan [17] và thuốc sắc Xiao-chai-hu (shosaiko ở Nhật Bản) [18,19] đã được sử dụng rộng rãi để điều trị xơ gan ở Trung Quốc, Hàn Quốc và Nhật Bản trong hàng nghìn năm. C. tubulosa chứa nhiều thành phần hoạt động bao gồm CPhGs, iridoids và polysaccharid. Là một trong những cơ sở vật chất hiệu quả của C. tubulosa, CPhGs có hoạt tính bảo vệ gan tuyệt vời, nhưng có rất ít thông tin về tác dụng chống xơ hóa của GPhC và các hợp chất liên quan của nó. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nghiên cứu cách CPhGs, echinacoside và acteoside ức chế HSC activati trên và blo ck th e signalin g pa thway cond uctio n trong TGF-p1 / snaad như là các tác nhân gây xơ hóa tic chống hep a tic trong ống nghiệm.
Tổn thương gan do bất kỳ căn nguyên nào cuối cùng sẽ dẫn đến kích hoạt HSC, chúng trải qua quá trình chuyển biệt hóa thành các tế bào giống như nguyên bào sợi của myofibrogenic [20]. Điều đó có nghĩa là nguyên bào sợi cơ
có nguồn gốc từ sự hoạt hóa và tăng sinh của HSCss [21], và nó được coi là chất trung gian của sự hình thành xơ hóa gan. Vì lý do này, chúng tôi đã thực hiện các nghiên cứu trong ống nghiệm để so sánh tỷ lệ sống sót của tế bào của HSC tiếp xúc với CPhGs, echinacoside và acteoside. Kết quả cho thấy tác dụng ức chế của acteoside đối với HSC là mạnh nhất và tác dụng của CPhGs tốt hơn của echinacoside. CPhGs, echinacoside và huyết thanh y học acteoside đều ức chế sự tăng sinh HSC theo cách phụ thuộc vào liều lượng.
LDH là một enzym tế bào chất trong tế bào sống, và nó không thể xuyên qua màng tế bào trong những trường hợp bình thường. Khi tế bào bị tổn thương, tính thấm của màng tăng lên và LDH được giải phóng ra bên ngoài tế bào. Thông thường, LDH có thể phát hiện mức độ tổn thương tế bào [{{0}}]. Điều tra cho thấy hoạt tính LDH của CPhGs, echinacoside và huyết thanh y học acteoside chỉ tăng nhẹ so với nhóm kiểm soát tế bào và sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05), cho thấy rằng hầu hết các màng tế bào duy trì tính toàn vẹn của chúng. , và sự ức chế HSCs bởi CPhGs, echinacoside và acteoside không phải do độc tính tế bào không đặc hiệu.
Khi tổn thương gan xảy ra, các tế bào gan được hoạt hóa có thể giải phóng TGF-pi, từ đó kích hoạt HSC-T6, do đó, TGF-pi có mối quan hệ chặt chẽ với quá trình xơ hóa [25-27]. Trong nghiên cứu này, CPhGs, echinacoside và acteoside có thể được coi là một chiến lược điều trị hấp dẫn để ức chế sự tăng sinh HSC sau khi HSC được kích thích bằng wTGF-pi in vitro. Chúng tôi suy đoán rằng CPhGs, echinacoside và acteoside có thể được sử dụng như một loại điều trị và / hoặc phòng ngừa xơ hóa gan, và ức chế sự hình thành xơ hóa gan sớm. Sự hình thành xơ gan là một quá trình phức tạp có sự tham gia của đa nhân tố và đa bào. Trong quá trình bệnh lý này, các tương tác giữa tế bào, tế bào và chất nền tế bào tạo thành một mạng lưới cồng kềnh. Trong mạng lưới này, sự phát triển của xơ hóa gan có thể được điều chỉnh bởi các con đường và phương tiện truyền tín hiệu khác nhau. TGF-pi là chất hoạt hóa cổ điển của HSC và là chất trung gian chính trong cơ chế bệnh sinh của xơ hóa gan [28]. CPhGs, echinacoside và acteoside có thể ức chế sự biểu hiện của mRNA và protein liên quan đến con đường TGF-pi / smad trong HSCs.
TGF-pi tác động lên tế bào của nó thông qua con đường tín hiệu nhỏ, và nó được coi là chất trung gian chính trong sự phát triển của chứng xơ hóa và viêm gan. Khi gắn TGF-pi vào thụ thể TGF-p-type II, thụ thể kinase loại II sẽ phosphoryl hóa vùng GS của thụ thể TGF-p type I, dẫn đến kích hoạt thụ thể type I [29]. Thông qua hoạt động của p-smad2 và p-smad3 tại hai gốc serine trong mô-típ SSXS của đầu cuối C của chúng, các phản ứng ở hạ nguồn của con đường tín hiệu smad được kích hoạt bằng cách kích hoạt thụ thể loại I [30]. P-smad2 và p-smad3 tạo thành phức hợp oligomeric với smad4, sau đó đi vào nhân và thực hiện hoạt động phiên mã sinh học của chúng. Do đó, các protein smad truyền tín hiệu trực tiếp từ kinase thụ thể đến nhân [3i]. Mặt khác, smad7 kết hợp chắc chắn với thụ thể TGF-pi, dẫn đến việc smad 2/3 không thể được kích hoạt cũng như ức chế các con đường dẫn truyền tín hiệu [32]. Smad7 có thể hoạt động để ức chế p-smad2 và p-smad3, chuyển vị hạt nhân của phức hợp smad đã hoạt hóa và hoạt hóa (CAGA) (9) -MLP-Luc, dẫn đến giảm biểu hiện collagen I và ức chế hoàn toàn quá trình truyền tín hiệu TGF-p [33,34]. Kết quả của chúng tôi cho thấy CPhGs, echinacoside và acteoside có thể làm giảm biểu hiện mRNA smad2 và smad3, đồng thời tăng biểu hiện mRNA smad7; ức chế sự biểu hiện của protein smad2, p-smad2, smad3 và p-smad3, và điều chỉnh tăng sự biểu hiện của protein smad7, cho thấy rằng CPhGs, echinacoside và acteoside cũng có vai trò ức chế hoạt hóa HSC và do đó ức chế xơ gan, làm nổi bật khả năng chống xơ hóa cơ chế.
Trình tự các tác dụng bảo vệ gan của ba chất thử nghiệm được chứng minh là acteoside> CPhGs> echinacoside. Để làm sáng tỏ thêm lý do của sự khác biệt trong cơ chế mà CPhGs, echinacoside và acteoside bảo vệ chống lại sự xơ hóa gan, cấu trúc hóa học của chúng đã được phân tích. Phần gốc phenethyl alcohol glycoside dường như là một cấu trúc cần thiết cho tác dụng bảo vệ gan [35]. Acteoside (C29H36Oi5) là một glycoside kép, và echinacoside (C35H46O20) là một triglycoside, tức là, echinacoside có thêm một glycoside trong cấu trúc so với acteoside, làm tăng kích thước không gian của nó. Bảo vệ gan hoặc ức chế hoạt động HSC của acteoside tốt hơn echinacoside, có thể là do sự tồn tại của cản trở steric.
bảo vệ gan: chiết xuất cistanche
4. Phần thực nghiệm
4.1. Hóa chất và Thuốc thử
TGF-pi được mua từ Peprotech (Rocky Hill, NJ, USA). Dòng tế bào HSC-T6 được mua từ Wuhan Procell Gene Bio-technology Co., Ltd. (Vũ Hán, Trung Quốc). Dimethyl sulfoxide (DMSO) được mua từ Sigma Inc. (St. Louis, MO, USA). Các loại sơn lót Smad2, smad3 và smad7 được sản xuất bởi Công ty Công nghệ và Sinh học Thượng Hải Sangon (Thượng Hải, Trung Quốc). Bộ tổng hợp cDNA sợi đầu tiên của Revert Aid được mua từ Thermo Scientific (Thượng Hải, Trung Quốc). Bộ phụ kiện PCR xanh Quantifast SYBR được mua từ QIAGEN GmbH (Hilden, Đức). kháng thể p-smad2 (ser465 / 467), mAb của thỏ Smad3 (C67H9) và mAb của thỏ p-smad3 (ser423 / 425) được mua từ Công nghệ Tín hiệu Tế bào (Boston, MA, USA). Kháng thể Smad7 được mua từ Boster (Vũ Hán, Trung Quốc). Kháng thể đa dòng Smad2 và kháng thể đơn dòng p-actin được mua từ Proteintech (Vũ Hán, Trung Quốc). Việc phát hiện kháng thể chính được thực hiện bằng dung dịch Kháng thể 2 độ (Alk-Phos. Conjugated, Anti-Rabbit) và Dung dịch Kháng thể 2 độ (Alk-Phos. Conjugated, Anti-mouse) mua từ Invitrogen ™ (Carlsbad, CA, USA). Bộ dụng cụ xét nghiệm lactate dehydrogenase đến từ Viện Kỹ thuật sinh học Nanjing Jiancheng (Nam Kinh, Trung Quốc).
4.2. Nguyên liệu thực vật
C. tubulosa được thu thập từ Tulufan, trong khu vực Tân Cương Uirghur autonomo us của Trung Quốc, vào năm 2006. Nguyên liệu thực vật được xác định là C. tubulosa bởi Jiang He, Viện Materia Medica của Tân Cương. Một mẫu chứng từ đã được gửi tại Viện Materia Medica ở Tân Cương, Trung Quốc.
4.3. Phân lập và làm sạch CPhG và các hợp chất của nó
Thân rễ khô và cắt lát của C. tubulosa (6. 0 kg) được chiết xuất liên tiếp ba lần trong điều kiện hồi lưu với 7 0 phần trăm etanol (4,8 L), và dung môi sau đó được loại bỏ khỏi các dịch chiết kết hợp để để thu được dịch chiết etanol (1,146 kg). Các đặc điểm của etanol được tinh chế bằng nhựa AB -8 để thu được chiết xuất phenyl etanol glyc os ides (CPhG s) thô. Sau khi hòa tan trong nước, hành vi đùn được tinh chế bằng sắc ký nhựa macroporous hấp thụ AB -8 để thu được tổng các mặt phenyl etanol glyco từ C. tubulosa (CPhGs, 21 0 g). CPhG được áp dụng trên cột ODS OP {{1 0}} và được rửa giải liên tiếp với hỗn hợp MeOH — H?. (0: 1 - ^ 1: 0). Elua tes được kết hợp thành năm phân số phụ theo hành vi TLC sử dụng hệ dung môi CHCh-MeOH-H?. (6: 4: 0,5). Các đốm được hình dung sau khi phun 1 phần trăm FeCih. Nhiều phân đoạn khác nhau được tinh chế nhiều lần bằng sắc ký cột Sephadex LH -20 với metanol làm chất rửa giải và hai phenyl etanol glycosit được phân lập từ CPhGs. Cấu trúc của chúng được xác nhận là echinacoside (C35H46O20) và acteoside (C29H36O15) sử dụng MS, 1H- và MC-NMR [35], độ tinh khiết được xác định lần lượt là 99,17% và 98,92% bằng UV-HPLC. Cấu trúc củaechinacoside và acteoside được thể hiện trong Hình 9.
4.5. Xác định định lượng CPhGs
Sắc ký lỏng (HPLC) (LC {{0}} Một thiết bị HPLC, Shimadzu Co., Kyoto, Nhật Bản) được sử dụng để phân tích hàm lượng của echina coside và cteoside trong CPhGs. Cột ODS của Phenomenex Gemini (250 x 4,6 mm, 5|^ m) được sử dụng ở 30 độ. Pha động đẳng cấp bao gồm metanol-axetonitril -1 phần trăm axit axetic (15:10:75, v / v / v) được sử dụng trong 40 phút chạy, với tốc độ dòng 0,6 mL / phút, với tia cực tím phát hiện ở bước sóng 334 nm.
4.6. Nuôi cấy tế bào
Tế bào HSC được nuôi cấy trong môi trường Eagle's đã sửa đổi (Glucose cao) của Dulbecco (DMEM, Bắc Kinh, Trung Quốc) được bổ sung với 1 0 phần trăm huyết thanh bò thai (FBS, Gibco, Carlsbad, CA, Hoa Kỳ), 1 0 0 IU / mL penicillin và 100 ^ g / mL streptomycin (HyClone, Logan, UT, USA) trong tủ ấm được làm ẩm ở 37 độ với 5% CO2. Những tế bào này thường xuyên được nuôi cấy bằng dung dịch trypsin 0,25 phần trăm (1x) (HyClone, Logan, UT, USA) và môi trường được thay đổi 2 ngày một lần. Ban đầu, các tế bào được nuôi cấy bằng DMEM chứa 10% FBS trong 48 giờ. Môi trường sau đó được thay thế bằng DMEM không có FBS để bỏ đói các tế bào trong 12 giờ. Các tế bào này được nhân giống trong 48 giờ và Sau 48 giờ, huyết thanh được bỏ đói với 0,5% FBS trong 12 giờ trước khi thêm 5 ng / mL TGF- & 1,
4.7. Xác định giá trịIC50
Sau khi ủ qua đêm trong môi trường bỏ đói có chứa {{0}}. 5 phần trăm FBS, tế bào HSC được gieo vào đĩa 96- giếng với mật độ 5 x 104 tế bào / mL trong 24 giờ. Tế bào HSC được xử lý bằng CPhGs, echinacoside và acteoside ở các nồng độ khác nhau (0, 3,90625, 7,8125, 15,625,31,25, 62,5, 125, 250 và 500 ^ g / mL) trong 48 giờ. Mỗi nồng độ có bốn giếng. Khi kết thúc điều trị, 20 卩 L MTT [3- (4, 5- dimethylthiazol -2- yl) -2, 5- diphenyltetrazolium bromide] (Sigma; 5 mg / mL) được thêm vào và các tế bào được ủ trong 4 giờ nữa. DMSO (200 rL) được thêm vào mỗi giếng sau khi loại bỏ phần nổi phía trên. Sau khi lắc đĩa trong 10 phút trên máy lắc, các giá trị IC50 thu được bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 490 nm sử dụng dụng cụ ghi nhãn enzyme (Benchmark PLUS, Hercules, CA, USA), phép thử này được thực hiện gấp ba lần. Giá trị IC50 của CPhGs, echinacoside và acteoside lần lượt là 119.125, 520.345 và 6.999 Rg / mL.
4.8. Hiệu ứng ức chế tăng sinh tế bào và khả năng tồn tại của tế bào
Tế bào HSC được tiếp xúc với các nồng độ khác nhau của CPhGs (25,50,100 Rg / mL), echinacoside (125,250,500 Rg / mL) và acteoside (1,5,3,6 Rg / mL). Các nồng độ khác nhau của CPhGs, echinacoside và acteoside được áp dụng trên đĩa trong bốn giếng liên tiếp và ủ trong 48 giờ. Tác dụng ức chế tăng sinh tế bào và mức độ tồn tại của tế bào (dựa trên việc đo hoạt tính LDH được giải phóng từ các tế bào bị tổn thương vào dịch nổi [36]) được xác định bằng xét nghiệm MTT. Tỷ lệ ức chế được tính theo công thức sau [37]:
Tỷ lệ ức chế (phần trăm) "[1 - (độ hấp thụ trung bình của nhóm thí nghiệm / độ hấp thụ trung bình của nhóm đối chứng trắng)] x 100%
Theo hướng dẫn của bộ,
LDH (U / L) {{0}} (OD đo được - OD kiểm soát) / (OD tiêu chuẩn - mẫu trống) x 0,2 mmol / L x 1000
Nghiên cứu sơ bộ của chúng tôi cho thấy CPhGs, echinacoside và acteoside không ảnh hưởng đến khả năng tồn tại của tế bào.
4.9. Các hoạt động chống sinh sôi nảy nở của TGF- ^ 1
HSC được kích hoạt bởi TGF-p1 từ lâu đã được coi là có liên quan đến xơ hóa gan, và việc ức chế sự phát triển của HSC đã được đề xuất như một phương pháp điều trị xơ hóa gan [36,38]. Tác dụng chống tăng sinh của CPhGs, echinacoside và acteoside trên HSC được kích hoạt bởi TGF-p1 được xác định bằng xét nghiệm MTT [39]. Sử dụng các quy trình và nồng độ thuốc như được mô tả,
các nhóm thực nghiệm bao gồm nhóm đối chứng, nhóm TGF-pi, TGF-pi cộng với các nhóm thuốc có nồng độ khác nhau. Tất cả các nhóm tế bào ngoại trừ nhóm đối chứng được nuôi cấy bằng DMEM chứa 5. 0 ng / mL TGF-p1 (không có FBS) trong 24 giờ. Hoạt động ức chế sự tăng sinh tế bào được tính bằng 100 x (độ hấp thụ của hợp chất được xử lý - độ hấp thụ của ánh sáng nền) / (độ hấp thụ của mô hình - độ hấp thụ của ánh sáng nền).
4.10. Phản ứng chuỗi phiên mã ngược-polymerase (RT-PCR)
Mức độ biểu hiện mRNA của smad2, smad3 và smad7 được xác định bằng PCR thời gian thực. Để xác định sự biểu hiện mRNA trong các tế bào HSC, các tế bào (5 x 1 0 4 tế bào) được gieo hạt trong các đĩa sáu giếng với 3. 0 mL DMEM với 10 phần trăm FBS và ủ qua đêm ở 37 độ và 5 phần trăm CO2. Sau khi môi trường nuôi cấy được thay đổi thành DMEM không có huyết thanh, CPhGs (100,50,25 卩 g / mL), echinacoside (500,250,125 昭 / mL) và acteoside (6, 3,1,5 ^ g / mL) được thêm vào giếng. Sau khi ủ trong 48 giờ với CPhGs và các chế phẩm monome, RNA tổng số được chiết xuất bằng thuốc thử TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) và được khuấy mạnh với chloroform trong 15 s. Sau khi để yên ở nhiệt độ phòng trong 3 phút, dịch ly tâm được ly tâm ở 12, 000 xg trong 15 phút ở 4 độ. RNA trong pha nước được kết tủa với isopropanol, và pha nước phía trên được chuyển sang một ống ly tâm siêu nhỏ mới. RNA được kết tủa bằng cách thêm 0,75 phần trăm etanol, sau đó ống ly tâm siêu nhỏ và ly tâm ở 12, 000 xg ở 4 độ trong thời gian không quá 5 phút. Phần nổi phía trên được loại bỏ và RNA được làm khô ở nhiệt độ phòng trong 5-10 phút. Các đoạn mồi (Sangon) được thiết kế bằng cách sử dụng Batch Primer 3, và được liệt kê trong Bảng 4. Kết quả đã được chuẩn hóa cho mRNA của gen vệ sinh p-actin như một kiểm soát nội bộ và được trình bày dưới dạng mức mRNA tương đối. Các phản ứng được thực hiện với 8|^ L iQ SYBR Green Supermix, cặp mồi 1 10 pM, 8,5 nước cất và 2,5 rL cDNA.
Mỗi phản ứng chuỗi polymerase được thực hiện trong các điều kiện sau: 95 độ trong 3 phút, sau đó 40 chu kỳ trong 10 giây ở 95 độ, 30 giây ở 55 độ và 10 giây ở 55 độ -95 độ để kéo dài, tiếp theo là một phép đo huỳnh quang duy nhất. Kết quả cuối cùng được mô tả với các giá trị tương đối (2_ AACt). Việc tính toán và phân tích được thực hiện bởi Hệ thống phát hiện PCR thời gian thực iQ5.
4.11. Phân tích Western Blot
Chiết xuất toàn bộ tế bào được chuẩn bị bằng cách sử dụng đệm Radioimmunoprecipitation Assay (RIPA) (Thermo Fisher Scientific, Inc.) với 1 phần trăm chất ức chế Halt protease và 1 phần trăm các loại cocktail có chất ức chế Halt phosphatase (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Tổng số protein được sử dụng để phát hiện smad2, p-smad2, smad3, p-smad3 và smad7. Nồng độ protein được đo và định lượng bằng phương pháp Bradford. Protein (10-30 Rg) được tách trên gel SDS-PAGE 1 0 phần trăm và được chuyển sang màng polyvinylidene fluoride (PVDF) (Millipore, Boston, MA, USA). Các màng được chặn trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng với 5% albumin huyết thanh bò và các kháng thể chính (kháng thể đa dòng smad2, kháng thể p-smad2, mAb thỏ smad3 và mAb thỏ p-smad3, độ pha loãng 1: 1000; mAb của thỏ smad7, 1 : Độ pha loãng 200, kháng thể đơn dòng p-actin, độ pha loãng 1: 5000) được ủ ở 4 độ qua đêm. Các Alk-Phos tương ứng. các kháng thể thứ cấp liên hợp được ủ ở nhiệt độ phòng. Cuối cùng, các màng được rửa ba lần bằng dung dịch muối 1 x Tris-HCl với 0,1% Tween 20, và các tín hiệu được quét và hiển thị bằng Hệ thống hình ảnh GEL DOC XR (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Phân tích mật độ được thực hiện trên các protein quan tâm và chuẩn hóa thành p-actin bằng phần mềm GEL DOC Image Studio (Bio-Rad). p-actin được sử dụng làm kiểm soát nội bộ.
4.12. Phân tích thống kê
Dữ liệu được biểu thị dưới dạng độ lệch chuẩn trung bình (SD). Các phân tích thống kê được thực hiện bằng phần mềm SPSS 16. 0 (Đại học Y Tân Cương). Phân tích Probit được sử dụng để phân tích các giá trị IC5 0. Ý nghĩa của sự khác biệt được tính toán bằng kiểm định ANOVA một chiều, và các giá trị với p <0,05 được="" coi="" là="" có="" ý="" nghĩa="" thống="">
5. Kết Luận
Kết luận, CPhGs từ C. tubulosa và các thành phần của nó là echinacoside và acteoside cho thấy tác dụng chống xơ hóa đáng kể. Trong số đó, hoạt động của acteoside là mạnh nhất, trong khi hoạt động của CPhGs là giữa hai hợp chất. Sự ức chế kích hoạt tín hiệu TGF-p1 / Smad có thể là cơ chế cơ bản mà CPhGs bảo vệ chống lại bệnh gan mãn tính liên quan đến xơ hóa, và echinacoside và acteoside là cơ sở vật chất chống xơ hóa hiệu quả của C. tubulosa.
Sự nhìn nhận:Nghiên cứu này được hỗ trợ bởi Quỹ Khoa học Tự nhiên Quốc gia Trung Quốc (81260624). Các tác giả xin chân thành cảm ơn Giáo sư Tao Liu vì sự cải thiện của bài viết trong bài báo này.
Sự đóng góp của tác giả:TL, JZ, S.-PY, LM và S.-LZ đã hình thành và thiết kế các thí nghiệm. S.-PY, TL và JZ đã phân tích dữ liệu. S.-PY và JZ đã viết bản thảo. TL, LM và JZ đã xem xét bản thảo. Tất cả các tác giả đã đọc và duyệt bản thảo cuối cùng.
Xung đột lợi ích:Các tác giả tuyên bố không có xung đột lợi ích.
Người giới thiệu
1. Subramoniam, A.; Pushpangadan, P. Phát triển phytomedicine cho các bệnh gan. Ind. J. Pharmacol. 1999, 31, 166-175.
2. Friedman, SL Cơ chế bệnh: Cơ chế gây xơ hóa gan và ý nghĩa điều trị. Nat. Clin. Cắt đôi. Gastroenterol Hepatol. 2004,1, 98-105. [CrossRef] [PubMed]
3. Friedman, SL; Cuộn, FJ; Boyles, J .; Bissell, DM Tế bào mỡ gan: Tế bào sản xuất collagen chính của gan chuột bình thường. Proc. Natl. Acad. Khoa học. Hoa Kỳ 1985, 82, 8681-8685. [CrossRef] [PubMed]
4. Friedman, SL; Bansal, MB Sự đảo ngược của xơ hóa gan 一 Sự thật hay giả tưởng? H 叩 atology 2006, 43, S 82- S88. [CrossRef] [PubMed]
5. Ahmad, A.; Ahmad, R. Tìm hiểu cơ chế của xơ hóa gan và các phương pháp điều trị tiềm năng. Saudi J. Gastroenterol. 2012,18, 155-167. [CrossRef] [PubMed]
6. Peter, H.; Quạ; Zhang, họ LB Orobanchaceae Ventenat. In Flora of China, ấn bản thứ 23; Ủy ban biên tập Flora of China: Viện Khoa học Trung Quốc, Bắc Kinh, Trung Quốc, 2013; tr. 1-16.
7. Ủy ban Dược điển Trung Quốc của Bộ Vệ sinh Cộng hòa Nhân dân Trung Hoa. Dược điển Trung Quốc; Phần 1; Nhà xuất bản Công nghiệp Hóa chất: Bắc Kinh, Trung Quốc, 2010; P. 126.
8. Li, J.; Hoàng, D.; He, L. Ảnh hưởng của roucongrong (Herba Cistanches Deserticolae) đối với độc tính sinh sản ở chuột do glycoside của Leigongteng (Radix et Rhizoma Tripterygii) gây ra. J. Tradit. Cái cằm. Med. 2014, 34, 324-332. [CrossRef]
9. Xing, Y.; Liao, J .; Tang, Y.; Zhang, P.; Tân, C.; Ni, H.; Ngô, X.; Li, N.; Jia, X. ACE và các chất ức chế kết tập tiểu cầu từ Tamarix hohenackeri Bunge (cây ký chủ của Herba Cistanches) mọc ở Tân Cương. Dược lý. Mag. 2014,10, 111-118. [PubMed]
10. Giả, Y; Quan, Q.; Giang, Y .; Salh, B.; Guo, Y. Tư, P.; Du, C. Cải thiện tình trạng viêm đại tràng do dextran sulphat natri gây ra ở chuột bằng chiết xuất làm giàu echinacoside của Cistanche tubulosa. Phytother. Res. 2014, 28, 110-119. [CrossRef] [PubMed]
11. Wong, HS; Ko, KM Herba Cistanches kích thích chu trình oxy hóa khử glutathione tế bào bằng các loại oxy phản ứng được tạo ra từ quá trình hô hấp của ty thể trong tế bào cơ tim H9c2. Dược phẩm. Biol. 2013, 51, 64-73. [CrossRef] [PubMed]
12. Martin, A. .; Clynes, M. Acid phosphatase: Điểm cuối cho các thử nghiệm độc tính trong ống nghiệm. Tế bào ống nghiệm. Nhà phát triển. Biol. Năm 1991, 27, 183-184. [CrossRef]
13. Lechuga, CG; Hernandez-Nazara, ZH; Dominguez Rosales, JA; Morris, ER; Rincon, AR; Rivas-Estilla, AM; Esteban-Gamboa, A.; Rojkind, M. TGF -01 điều chỉnh sự biểu hiện ma trận metalloproteinase -13 trong tế bào hình sao gan bằng các cơ chế phức tạp liên quan đến p38MAPK, PI 3- kinase, AKT và p70S6k. Là. J. Physiol. Gastrointest Liver Physiol. 2004, 287, G 974- G987. [CrossRef] [PubMed]
14. Nguyễn, J.; Tang, SY; Nguyễn, D.; Alliston, T. Load điều chỉnh sự hình thành xương và biểu hiện Sclerostin thông qua cơ chế phụ thuộc TGFp. PLoS ONE 2013, 8, e53813. [CrossRef] [PubMed]
15. Pessah, M.; Marais, J .; Prunier, C.; Ferrand, N. .; Lallemand, F.; Mauviel, A. .; Atfi, A. C-Jun liên kết với oncoprotein Ski và ngăn chặn hoạt động phiên mã Smad2. J. Biol. Chèm. 2002, 277, 29094-29100. [CrossRef] [PubMed]
16. Ding, N.; Yu, RT; Subramaniam, N.; Sherman, MH; Wilson, C.; Rao, R.; Leblanc, M.; Coulter, S.; Anh ấy, M.; Scott, C.; et al. Một thụ thể Vitamin D / mạch gen SMAD cổng phản ứng xơ gan. Ô 2013,153, 601-613. [CrossRef] [PubMed]
17. Dương, FR; Fang, BW; Lou, JS Tác dụng của Fufang Biejia Ruangan Pills đối với bệnh xơ gan in vivo và in vitro. Thế giới J. Gastroenterol. 2013,19, 5326-5333. [CrossRef] [PubMed]
18. Sakaida, tôi; Hironaka, K .; Kimura, T.; Terai, S.; Yamasaki, T.; Okita, K. Thuốc thảo dược Sho-saiko-to (TJ -9) làm tăng metalloproteinase ma trận biểu hiện (MMPs) với việc giảm biểu hiện của chất ức chế mô metalloproteinase (TIMPs) trong tế bào hình sao chuột. Khoa học đời sống. 2004, 74, 2251-2263. [CrossRef] [PubMed]
19. Chen, M.; Chen, J .; Tsai, C.; Vương, W .; Chang, D.; Tu, DG; Hsieh, HY Vai trò của TGF -01 và các cytokine trong việc điều chỉnh quá trình xơ hóa gan của Sho-saiko-to trong mô hình nối ống mật của chuột / s. J. Ethnopharmacol. 2005, 97, 7-13. [CrossRef] [PubMed]
20. Bolarin, DM; Azinge, EC Dấu ấn sinh hóa, các thành phần ngoại bào trong xơ hóa gan và xơ gan. Nig. QJ Hosp. Med. 2007,17, 42-52. [CrossRef] [PubMed]
21. Kong, D.; Zheng, S.; Lu, Y. Nguồn và vai trò của nguyên bào sợi trong gan xơ hóa. Cái cằm. Pharmacol. Bò đực. 2011, 27, 297-300.
22. De Lavor, MSL; Binda, NS; Fukushima, FB; Caldeira, FMC; Da Silva, JF; Silva, CMO; de Oliveira, KM; Martins Bde, C.; Torres, BB; Rosado, IR; et al. Mô hình tái tưới máu do thiếu máu cục bộ trong tủy sống chuột: Nghiên cứu khả năng tồn tại của tế bào và tín hiệu apoptosis. Int. J. Clin. Hết hạn. Pathol. 2015, 8, 9941-9949. [PubMed]
23. Bahadar, H.; Maqbool, F.; Niaz, K .; Abdollahi, M. Độc tính của hạt nano và tổng quan về các mô hình thí nghiệm hiện nay. Iran Biomed. J. 2016, 20, 1-11. [PubMed]
