Phenylethanol Glycoside từ Herba Cistanche Cải thiện môi trường vi mô khối u giảm độc và tăng cường tác dụng của Oxaliplatin

Tiếp xúc:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

LIMEI WEN1,2 *, JUNPING HU1 *, JIAWEI ZHANG1 và JIANHUA YANG1,2

Trừu tượng.Ung thư gan là một trong những loại u ác tính phổ biến và có đặc điểm là ác tính cao, tiến triển nhanh, tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ tử vong cao. Oxaliplatin (OXA) đã được báo cáo là có hiệu quả rõ rệt trong việc chống lại ung thư gan tiến triển với độc tính có thể chấp nhận được. Trong các khối u rắn, vi môi trường thiếu oxy thúc đẩy quá trình chuyển đổi trung mô biểu mô (EMT), điều này cũng có thể gây ra tình trạng kháng thuốc của ung thư gan đối với thuốc bạch kim. Herba Cistanche (Cistanche tubulosa) thường được sử dụng trong y học cổ truyền Trung Quốc và các glycoside phenylethanol từ Herba Cistanche (CPhGs) là những thành phần hoạt động chính. Nghiên cứu này nhằm mục đích điều tra tác động của CPhGs đối với khả năng tồn tại, quá trình chết theo phương pháp apoptosis, sự di cư và sự xâm lấn của các tế bào ung thư gan. Tế bào ung thư gan HepG2 được chia thành nhóm chứng, DMSO, CoCl2, OXA, OXA cộng với CoCl2 và CPhGs cộng với OXA cộng với CoCl2. Sau đó, PCR định lượng phiên mã ngược và phân tích Western blot được thực hiện để xác định mức độ biểu hiện của tình trạng thiếu oxy ‑ yếu tố cảm ứng 1 (HIF ‑ 1), lysyl oxidase like 2 (LOXL2), và các gen và protein liên quan đến EMT (ví dụ: E ‑Cadherin và Twist), để điều tra tác động của CPhGs đối với bệnh ung thư gan. Kết quả đã chứng minh rằng CPhGs có thể tăng cường tác động của OXA đối với ung thư gan và ức chế sự di cư, xâm lấn và tỷ lệ chết của tế bào ung thư gan. Ngoài ra, điều trị CPhGs gây ra hiệu quả giảm điều hòa HIF ‑ 1, LOXL2 và Twist, và tăng điều hòa E ‑ cadherin. Các phát hiện hiện tại chỉ ra rằng CPhGs kích hoạt sự gia tăng đáng kể độ nhạy cảm với OXA và ức chế EMT gây ra do thiếu oxy trong ung thư gan bằng cách ức chế con đường tín hiệu HIF-1. Do đó, CPhGs có thể được coi là một chất nhạy cảm với thuốc platinum hiệu quả, có thể cải thiện hiệu quả hóa trị liệu ở bệnh nhân ung thư gan.

Sistanchcó thểcải thiện hiệu quả hóa trị liệuở bệnh nhân ung thư gan.

Giới thiệu

Liver cancer is a malignant tumor that usually involves the digestive system, and consists of primary and secondary types. Primary liver cancer is divided into hepatocellular carcinoma and intrahepatic cholangiocarcinoma (1,2). Notably, liver cancer is associated with a high incidence and mortality rate worldwide (3). According to the World Health Organization, it is predicted that there will be >1, 000, 000 tử vong liên quan đến ung thư gan vào năm 2030 và trong số các trường hợp mới được xác nhận, những trường hợp ở Trung Quốc đại lục sẽ chiếm 46,6%.

Oxaliplatin (OXA) đã được báo cáo là có tác dụng ức chế sự phát triển của ung thư gan với độc tính có thể chấp nhận được trong các cơ sở lâm sàng. Tuy nhiên, hiệu quả tổng thể của liệu pháp điều trị bằng thuốc dựa trên bạch kim bị cản trở bởi sự kháng tế bào khối u (4). Người ta thừa nhận rằng ung thư gan có độ nhạy cảm với hóa trị thấp hơn so với các loại ung thư khác. Khả năng kháng đa thuốc của ung thư gan đã góp phần vào khả năng chống lại nhiều tác nhân điều trị (5). Trong một nghiên cứu trước đây, Xie và Zhong (6) đã báo cáo rằng các tế bào HepG2 có độ nhạy kém với adriamycin, 5 ‑ fluorouracil và cisplatin trong điều kiện thiếu oxy. Mặc dù thực tế là các tác nhân hóa trị dựa trên bạch kim là lựa chọn điều trị chính cho bệnh ung thư, nhưng tình trạng kháng thuốc này vẫn tồn tại ở các bệnh nhân. Hơn nữa, tiên lượng của bệnh nhân ung thư gan vẫn kém (7,8). Cho đến nay, nhiều nỗ lực đã được thực hiện để điều tra tình trạng kháng thuốc và cải thiện độ nhạy với thuốc ở bệnh nhân ung thư gan.

Trong điều kiện thiếu oxy, sự tái tuần hoàn xảy ra trong các tế bào ung thư, có thể dẫn đến chuyển đổi biểu mô-trung mô (EMT) và bắt chước mạch máu (VM). EMT và VM sau đó có thể thúc đẩy sự xâm lấn và di căn xa. Hơn nữa, EMT đã được suy đoán để đóng vai trò là động lực cho sự tiến triển của ung thư (9). Ngoài ra, các yếu tố cảm ứng thiếu oxy (HIFs) có liên quan đến sự hình thành neovessel, chuyển hóa năng lượng, tăng sinh tế bào, xâm lấn và di căn (10).

Protein lysyl oxidase (LOX) ‑like 2 (LOXL2) là một thành viên của họ LOX và có liên quan chặt chẽ với liên kết chéo cộng hóa trị của collagen và elastin, có thể dẫn đến xơ hóa và rất quan trọng đối với sự toàn vẹn của chất nền ngoại bào ( 11). Trong một nghiên cứu trước đây, LOXL2 được coi là có liên quan chặt chẽ đến sự di căn của tế bào ung thư (12). Hơn nữa, LOXL2 đã được chứng minh là điều chỉnh cơ chế bệnh sinh và sự tiến triển của nhiều loại ung thư ác tính thông qua các con đường ngoại bào và nội bào, là những chỉ số quan trọng để đánh giá tiên lượng xấu (13,14).

Herba Cistanche là một loại thảo mộc bổ thường phân bố ở các vùng sa mạc, thường được sử dụng trong y học cổ truyền Trung Quốc (15,16). Cistanche tubulosa (C. tubulosa) là một loại thảo dược tự nhiên thường được trồng ở khu tự trị Tân Cương. Các glycoside phenylethanol từ Herba Cistanche (CPhGs) đóng vai trò là một trong những thành phần hoạt động chính của Herba Cistanche. Trước đây, Hu và cộng sự (17) đã chỉ ra rằng CPhGs có thể làm giảm tổn thương gan ở chuột mang khối u H22 và ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Người ta cho rằng cơ chế cơ bản có thể liên quan đến việc giảm ‑fetoprotein huyết thanh và có thể tăng cường khả năng miễn dịch ở chuột.

Trong nghiên cứu này, một mô hình thiếu oxy của tế bào ung thư gan HepG2 được tạo ra bằng cách sử dụng CoCl2. Trên cơ sở này, nghiên cứu này nhằm mục đích điều tra tác động của OXA đối với sự tăng sinh, quá trình chết rụng, di chuyển và xâm lấn của tế bào ung thư khi có CPhGs trong điều kiện thiếu oxy. Ngoài ra, các mức biểu hiện mRNA và protein của HIF ‑ 1, LOXL2, E ‑ cadherin và Twist đã được phát hiện. Hơn nữa, các cơ chế chính xác cơ bản tác động của CPhGs lên cơ chế bệnh sinh của ung thư gan đã được nghiên cứu.

Nguyên liệu và phương pháp

Dòng tế bào.

Dòng tế bào ung thư gan HepG2, được xác định bằng phương pháp STR, được cung cấp bởi Viện nghiên cứu lâm sàng, Bệnh viện trực thuộc đầu tiên của Đại học Y Tân Cương (Urumqi, Trung Quốc). Các tế bào được nuôi cấy trong DMEM có hàm lượng glucose cao (HyClone; Cytiva) chứa 10% huyết thanh bò thai (FBS; Hyclone; Cytiva) ở 37 ° C trong tủ ấm có chứa 5% CO2.

Chuẩn bị CPhGs.

C. tubulosa extraction (CPhGs) was obtained from Hetian Dichen Biotech Co., Ltd. The content of CPhGs was >80%, trong đó hàm lượng echinacoside và verbascose tương ứng là 44,5 và 16,1%. Thân của C. tubulosa (Schrenk) Wight được thu hái vào tháng 10 năm 2016 từ Tân Cương, Trung Quốc. Nhà máy được xác định bởi Tiến sĩ Junping Hu. Tất cả các mẫu vật chứng từ này (số 201610) đã được lưu ký tại Plant Herbarium, Trường Dược, Đại học Y Tân Cương, Tân Cương, Trung Quốc.

costanchetrích xuấttừHetian Dichen Biotech Co., Ltd.

Thiết kế thử nghiệm.

Tế bào HepG2 (5x1 0 4 / ml) được xử lý với các nồng độ CPhG khác nhau (5, 25, 50, 100, 200 và 500 µg / ml) trong 48 giờ ở 37˚C (24 giờ sau khi gieo hạt) để sàng lọc CPhGs, liều L / M / H. Tế bào HepG2 (5x104 / ml) được chia thành các nhóm sau: i) Nhóm đối chứng, được nuôi cấy trong DMEM có hàm lượng glucose cao; ii) Nhóm DMSO, được nuôi cấy trong 0,1% DMSO (v / v); iii) Nhóm CoCl2 (nhóm mô hình thiếu oxy), được nuôi cấy trong DMEM không chứa huyết thanh chứa 100 µM CoCl2; iv) Nhóm OXA (nhóm đối chứng dương tính), được nuôi cấy trong 5 µM OXA (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.); v) Nhóm OXA cộng với CoCl2, được nuôi cấy trong 5 µM OXA kết hợp với 100 µM CoCl2; và vi) Nhóm CPhGs, được xử lý bằng CPhGs ‑ L / M / H (25, 50 và 100 µg / ml, tương ứng) kết hợp với 5 µM OXA và 100 µM CoCl2.

Thử nghiệm khả năng sống của tế bào.

Khả năng sống sót của tế bào được xác định bằng cách sử dụng thử nghiệm Bộ đếm tế bào ‑ 8 (CCK ‑ 8) theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Công ty TNHH Khoa học & Công nghệ Bắc Kinh Solarbio) và như đã mô tả trước đây (18). Các tế bào (2. 0 x103 tế bào / giếng) được tạo hạt trong 96 đĩa giếng. Sau đó, ~ 24 giờ sau khi gieo hạt, các tế bào được xử lý trong 48 giờ theo các điều kiện xử lý trong mỗi nhóm. Môi trường sau đó được thay thế bằng 100 µl DMEM glucose cao, tiếp theo là thêm thuốc thử CCK-8 10 µl; các tế bào được ủ trong 1 giờ ở 37˚C. Mật độ quang học được đo bằng đầu đọc vi tấm đa phát hiện (Thermo Fisher Scientific, Inc.) ở bước sóng 450 nm. Sáu lần lặp lại đã được chuẩn bị cho mỗi điều kiện.

Xác định tỷ lệ apoptotic.

Tỷ lệ chết của con được xác định bằng cách sử dụng Bộ phát hiện chết con Annexin V / PI (Công ty TNHH Khoa học & Công nghệ Solarbio Bắc Kinh). Tế bào HepG2 (5x1 0 5) được cấy vào đĩa 6 giếng ở 37 ° C trong 5% CO2. Sau đó, ~ 24 giờ sau khi xử lý, các tế bào được nuôi cấy trong DMEM không chứa huyết thanh trong 4 giờ. Sau đó, các tế bào được tiêu hóa bằng cách sử dụng 0,25% trypsinized (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), tiếp theo là ít nhất ba lần rửa với PBS được làm lạnh trước. Sau khi ly tâm ở 167,7 xg trong 5 phút ở 4˚C, các tế bào được gắn lại với đệm liên kết 1X và nồng độ được điều chỉnh thành 1 ~ 5x106 / ml, và sau đó được nhuộm với 5 µl Annexin V ‑ FITC và 5 µl PI trong 15 phút ở nhiệt độ phong. Sau đó, các tế bào trải qua phép đo tế bào dòng chảy bằng cách sử dụng máy đo tế bào dòng BD LSRFortessa (BD Biosciences) và phần mềm FlowJo 10.6.2 (Tree Star, Inc.).

Bảng I. Trình tự mồi

Thử nghiệm chữa lành vết thương.

Tác dụng ức chế của CPhG đối với sự di chuyển của tế bào đã được kiểm tra bằng xét nghiệm làm lành vết thương (19). Các tế bào được gieo vào các đĩa 6 giếng cho đến khi thu được một lớp đơn hợp lưu 1 0 0 phần trăm. Sau đó, các tế bào được làm vết thương bằng cách sử dụng đầu tip pipet 200 µl, được rửa sạch bằng PBS và ủ với các phương pháp xử lý trong môi trường không chứa huyết thanh. Sau khi điều trị bằng thuốc, tốc độ lành vết thương được đo lần lượt là 0, 12, 24 và 48 giờ. Hình ảnh vết thương thu được bằng kính hiển vi huỳnh quang (Nikon Ti ‑ S, Nhật Bản) dưới độ phóng đại x10. Việc đóng vết thương được đo bằng khoảng cách vết thương trong mỗi thời kỳ và được biểu thị bằng phần trăm của khoảng cách vết thương ban đầu tại 0 h.

Xét nghiệm Transwell.

Sự xâm lấn tế bào được đánh giá bằng các xét nghiệm Transwell. Tế bào (1x1 0 5 tế bào / ml) bị treo trong 2 0 0 µl DMEM đường huyết cao mà không có FBS. Sau đó, các tế bào được gieo vào các giếng phía trên phủ Matrigel được phủ bằng màng lọc polyethylene terephthalate (kích thước lỗ, 8,0 µm). Tổng cộng 500 µl DMEM glucose cao chứa 10% FBS được đặt trong buồng dưới. Tăm bông được sử dụng để loại bỏ các tế bào trên bề mặt trên của bộ lọc sau 48 giờ ở 37˚C. Các tế bào xâm nhập qua màng được cố định bằng 4% paraformaldehyde trong 30 phút. Sau đó, các tế bào được nhuộm bằng tinh thể tím 0,1% trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Các tế bào xâm nhập được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (Nikon Ti ‑ S) ở độ phóng đại x100.

Hình 1. Ảnh hưởng của các nồng độ CPhG khác nhau đến khả năng tồn tại của tế bào HepG2 sau 48 giờ.

PCR định lượng phiên mã ngược (RT ‑ qPCR).

RNA tổng số được chiết xuất từ ​​tế bào HepG2 bằng thuốc thử TRIzol® (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) và quá trình tổng hợp cDNA được thực hiện bằng cách sử dụng bộ thuốc thử PrimeScript RT (Takara Bio, Inc.) theo quy trình của nhà sản xuất. qPCR được thực hiện trên hệ thống 7500 Real ‑ Time PCR (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.) sử dụng TB green ™ Premix Ex Taq ™ (Takara Bio, Inc.) theo quy trình của nhà sản xuất. Các mồi được sử dụng cho qPCR được liệt kê trong Bảng I. Điều kiện PCR bao gồm biến tính ở 95oC trong 30 giây, tiếp theo là 40 chu kỳ biến tính ở 95oC trong 5 giây và ủ ở 60oC trong 30 giây. Cuối cùng, kết quả khuếch đại được phân tích bằng phương pháp 2 ‑ ΔΔCq (20).

Phân tích Western blot.

Protein được chiết xuất từ ​​các tế bào được xử lý trong 48 giờ bằng cách đồng nhất hóa trong đệm ly giải RIPA (Thermo Fisher Scientific, Inc.) có chứa chất ức chế protease và phosphatase. Hàm lượng protein tế bào được xác định bằng phương pháp BCA. Protein (4 0 µg) sau đó được SDS ‑ PAGE phân tách trên gel 10 phần trăm và chuyển sang màng PVDF. Màng được chặn trong sữa không béo 5% trong 1 giờ ở 4˚C và được ủ với các kháng thể chính sau: ‑actin (1: 5, 000; cat. No. Bs ‑ 0061R; BIOSS), HIF ‑1 (1: 1, 000; cat. No. Ab179483; Abcam), LOXL2 (1: 500; cat. No. Ab179810; Abcam), E ‑ cadherin (1: 1, 000 ; cat. no. bs ‑ 1 000 9R; BIOSS) và Twist1 (1: 500; cat. no. bs ‑ 2441R; BIOSS) qua đêm ở 4˚C. Sau đó, màng này được ủ với kháng thể thứ cấp IgG H&L của dê (1: 2.000; cat. No. Ab205718; Abcam) trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau khi rửa bằng TBS ‑ 0,05% Tween ‑ 20, các đốm màu được hình dung bằng cách sử dụng hệ thống Phát quang tăng cường (Amersham; Cytiva). Cường độ tương đối của các dải được định lượng bán phần bằng phân tích mật độ sử dụng phần mềm ImageJ2x (phiên bản 2.1.4.7; Rawak Software Inc.), và các đồ thị mật độ của kết quả được chuẩn hóa thành cường độ của ‑actin.

Hình 2. Ảnh hưởng của CPhGs kết hợp với OXA đến khả năng tồn tại của tế bào HepG2 ở 48 giờ.

Phân tích thống kê.

Phần mềm SPSS 19. 0 (SPSS, Inc.) đã được sử dụng để phân tích dữ liệu. Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn và được phân tích bằng ANOVA một chiều, sau đó là bài kiểm tra sau bài học của Tukey. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="" difference.="" all="" experiments="" were="" performed="" at="" least="" in="">

Kết quả

Ảnh hưởng của CPhGs đến khả năng tồn tại của tế bào.

Tế bào HepG2 được xử lý với các nồng độ CPhG khác nhau (5, 25, 50, 100, 200 và 500 µg / ml) trong 48 giờ (24 giờ sau khi gieo hạt). Như thể hiện trong Hình 1, đã có sự suy giảm đáng kể về khả năng sống sót của các tế bào được xử lý với 200 và 500 µg / ml CPhG so với của nhóm đối chứng (P<0.05). these="" findings="" indicated="" that="" cphgs="" could="" modulate="" cell="" viability="" in="" a="" dose‑dependent="">

CPhG tăng cường tác động của OXA đối với bệnh ung thư gan.

Ảnh hưởng của CPhGs lên khả năng sống sót của tế bào HepG2 được điều chế bằng OXA sau đó đã được đánh giá (Hình 2). Sau ~ 48 giờ, sự kết hợp giữa CPhGs và OXA làm giảm đáng kể khả năng sống sót của tế bào HepG2 so với trong nhóm OXA cộng với CoCl2. Cụ thể, CPhGs ‑ M cộng với OXA cộng với CoCl2 và CPhGs ‑ H cộng với OXA cộng với CoCl2 đã ức chế đáng kể khả năng sống sót của tế bào HepG2 so với trong nhóm OXA cộng với CoCl2 (P<0.05 and=""><0.01,>

Hình 3. Tác động ức chế của CPhGs kết hợp với OXA trên sự di chuyển và xâm nhập của tế bào HepG2 ở 48 giờ.

CPhGs ức chế sự di cư và xâm lấn của các tế bào ung thư gan.

Để nghiên cứu sâu hơn về khả năng xâm lấn và khả năng di cư của các tế bào ung thư gan sau khi điều trị bằng CPhGs và OXA, các xét nghiệm Transwell và chữa lành vết thương đã được thực hiện. Xét nghiệm làm lành vết thương chỉ ra rằng, so với ở nhóm DMSO, sự di chuyển của tế bào HepG2 đã giảm sau khi điều trị bằng CoCl2, OXA và CPhGs (200 hoặc 500 µg / ml) (P<0.05; fig.="" 3a="" and="" b).="" for="" the="" transwell="" assay,="" the="" invasive="" ability="" of="" cells="" was="" markedly="" inhibited="" in="" the="" co-treatment="" groups="" (cphgs="" +="" oxa="" +="" cocl2)="" compared="" with="" that="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 3c="" and="" d).="" conversely,="" in="" the="" co‑treatment="" groups="" (cphgs="" +="" oxa="" +="" cocl2),="" the="" invasive="" potential="" and="" migratory="" ability="" of="" cells="" were="" markedly="">

Ảnh hưởng của CPhGs và OXA đối với quá trình apoptosis.

Sau khi điều trị với sự kết hợp của CPhGs và OXA trong 48 giờ, các tế bào HepG2 được nhuộm bằng Annexin V-FITC và PI, sau đó là đo tế bào dòng để xác định quá trình chết của tế bào. Như được thể hiện trong Hình 4A, các nhóm đồng xử lý (CPhGs ‑ L / M / H cộng với OXA và CoCl2) cho thấy tỷ lệ tế bào apoptotic tăng dần với sự gia tăng nồng độ CPhGs. Hầu hết các tế bào được điều trị bằng CPhGs và OXA đều khu trú ở vùng Q4, điều này cho thấy rằng sự kết hợp của CPhGs và OXA gây ra quá trình apoptosis ở giai đoạn đầu. So với nhóm OXA cộng với CoCl2, tỷ lệ tế bào chết tự bào được phát hiện tăng đáng kể ở các nhóm được điều trị bằng OXA, CoCl2 và CPhGs liều trung bình hoặc cao (P<0.01; fig.="" 4b).="" these="" findings="" indicated="" that="" the="" combination="" of="" oxa="" and="" cphgs="" may="" contribute="" to="" the="" apoptosis="" of="" hepg2="">

Mức độ biểu hiện mRNA của HIF ‑ 1, LOXL2, E ‑ cadherin và Twist sau khi CPhGs và OXA đồng thời ủ bệnh.

There were no statistical differences in the mRNA expression levels of HIF‑1α, LOXL2, E‑cadherin and Twist between the control and DMSO groups (P>0. 05; Hình 5A ‑ D). Ngược lại, CoCl2 làm tăng đáng kể mức độ biểu hiện mRNA của LOXL2, HIF ‑ 1 và Twist so với những người trong nhóm DMSO (P<0.01; fig.="" 5a,="" b="" and="" d).="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group,="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" loxl2,="" hif‑1α="" and="" twist="" were="" significantly="" enhanced="" in="" the="" cphgs‑h="" +="" oxa="" +="" cocl2="" groups=""><0.01; fig.="" 5a,="" b="" and="" d).="" by="" contrast,="" cocl2="" induced="" a="" significant="" downregulation="" in="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" compared="" with="" those="" in="" the="" dmso="" group=""><0.01; fig.="" 5c).="" all="" concentrations="" of="" cphgs="" combined="" with="" oxa="" and="" cocl2="" were="" able="" to="" upregulate="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 5c).="" these="" results="" indicated="" that="" the="" combination="" of="" cphgs="" and="" oxa="" effectively="" inhibited="" the="" emt="" under="" hypoxic="">

Hình 4. Ảnh hưởng của CPhGs kết hợp với OXA đến tỷ lệ phần trăm tế bào HepG2 bị chết ở 48 giờ, được xác định bằng phương pháp nhuộm kép Annexin ‑ V / PI.

Mức độ biểu hiện protein của HIF ‑ 1, LOXL2, E ‑ cadherin và Twist sau khi CPhGs và OXA đồng thời ủ. Kết quả của phương pháp thấm phương tây cho thấy mức độ biểu hiện protein của HIF ‑ 1, LOXL2 và Twist được điều chỉnh trong điều kiện thiếu oxy so với ở nhóm DMSO. Ngược lại, mức độ biểu hiện protein của E-cadherin được điều chỉnh giảm trong điều kiện thiếu oxy (P<0.01; fig.="" 6a="" and="" b).="" notably,="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" hif‑1α,="" loxl2,="" and="" twist="" were="" significantly="" decreased="" in="" the="" cphgs‑m="" +="" oxa="" +="" cocl2="" or="" cphgs‑h="" +="" oxa="" +="" cocl2="" groups="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 6a="" and="" b).="" compared="" with="" the="" dmso="" group,="" the="" cocl2="" treatment="" significantly="" decreased="" the="" expression="" level="" of="" e‑cadherin.="" in="" the="" cphgs="" groups,="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" were="" significantly="" increased="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 6b).="" these="" findings="" indicated="" that="" cphgs="" treatment="" could="" effectively="" inhibit="" the="" downregulation="" of="" e‑cadherin,="" and="" the="" upregulation="" of="" hif‑1α,="" loxl2,="" and="" twist="" induced="" by="">

cistanche giảm cholesterol

Thảo luận

Tình trạng thiếu oxy là một đặc điểm phổ biến trong vi môi trường ung thư; điều này chủ yếu liên quan đến thực tế là sự gia tăng của các tế bào ung thư nhanh hơn so với sự hình thành mạch máu của các neovessel không ổn định. Ngoài ra, các quá trình sinh học khác, bao gồm tăng sinh, di căn và nhạy cảm với thuốc đều bị ảnh hưởng bởi tình trạng thiếu oxy (21). Môi trường vi mô thiếu oxy của khối u rất quan trọng đối với cơ chế bệnh sinh và sự tiến triển của ung thư, và nó cũng quan trọng trong việc kháng thuốc và tạo mạch của ung thư gan (22).

Trong nghiên cứu này, các tế bào HepG2 được xử lý với các nồng độ CPhG khác nhau, trong đó CPhGs (200 µg / ml) có thể làm giảm đáng kể khả năng sống của tế bào. Đáng chú ý, CPhG có thể điều chỉnh khả năng tồn tại của tế bào theo cách phụ thuộc vào liều lượng. Trong điều kiện thiếu oxy, sự kết hợp của OXA và CPhGs (50 hoặc 100 µg / ml) đã ức chế đáng kể khả năng sống của tế bào HepG2 so với chỉ điều trị OXA. Một xu hướng phụ thuộc vào liều lượng tương tự đã được quan sát thấy trong các xét nghiệm di cư và xâm lấn của tế bào ung thư gan. Hiện nay, các nghiên cứu mở rộng đã được tiến hành để điều tra vai trò của quá trình chết theo phương pháp apoptosis của tế bào ung thư trong cơ chế bệnh sinh của bệnh gan (23‑26). Một số chiến lược đã được phát triển để điều trị ung thư gan bằng cách thúc đẩy quá trình apoptosis (27‑29); do đó, can thiệp vào quá trình apoptosis của tế bào HepG2 có thể là một ứng cử viên đầy hứa hẹn cho việc phòng ngừa và điều trị ung thư gan. Quá trình apoptosis của tế bào HepG2 được tăng cường đáng kể sau khi điều trị với sự kết hợp của CPhGs ‑ M / ‑H và OXA so với ở những tế bào được điều trị chỉ với OXA. Do đó, người ta chỉ định rằng CPhGs có thể tăng cường đáng kể tác dụng chống khối u của OXA.

HIF ‑ 1 có thể điều chỉnh mức độ biểu hiện của E ‑ cadherin, N ‑ cadherin và Vimentin, cũng như một số yếu tố phiên mã, chẳng hạn như Snail1 / 2, Zeb1 và Twist1. Sau đó, điều này có thể dẫn đến mất phân cực tế bào, nới lỏng các liên kết tế bào, thay đổi protein tế bào, và sự di cư và xâm lấn của các tế bào ung thư, có thể dẫn đến sự di chuyển của các tế bào ung thư đến hệ tuần hoàn qua màng đáy. và di căn tiếp theo (30). Trong nghiên cứu này, CoCl2 được sử dụng để gây ra một mô hình thiếu oxy, gây ra sự gia tăng khả năng sống sót của tế bào HepG2, cũng như sự di cư và xâm nhập của tế bào. Hơn nữa, mức độ biểu hiện mRNA và protein của HIF-1 đã tăng lên đáng kể, cho thấy rằng CoCl2 gây ra sự tạo ra một vi môi trường thiếu oxy. Điều trị kết hợp CPhGs và OXA ức chế rõ rệt mức độ biểu hiện mRNA và protein của HIF-1 do thiếu oxy gây ra. Những phát hiện này cho thấy rằng CPhGs có thể làm giảm vi môi trường của ung thư gan theo cách phụ thuộc vào liều lượng.

E-cadherin là một phân tử kết dính phụ thuộc Ca2 cộng với, có vai trò quan trọng trong việc kết dính tế bào, duy trì tính toàn vẹn của cấu trúc mô và truyền tín hiệu. Trong trường hợp giảm điều hòa hoặc thậm chí mất chức năng kết dính, các tế bào ung thư có thể biểu hiện sự tăng sinh không kiểm soát được và quá trình biệt hóa, điều này có thể thúc đẩy gia tăng sự xâm lấn của các tế bào ung thư và di căn sau đó (31). Ngoài ra, E-cadherin rất quan trọng để ức chế EMT của tế bào ung thư, có liên quan chặt chẽ với sự biệt hóa, xâm lấn, di căn và tiên lượng của nhiều khối u ác tính biểu mô. Các yếu tố phiên mã gây ra EMT (EMT ‑ TF), chẳng hạn như Twist, Snail và Zeb, là rất quan trọng đối với EMT. Tình trạng thiếu oxy đã được báo cáo là kích hoạt các đường truyền tín hiệu gây ra biểu hiện EMT ‑ TF; đáng chú ý, nó có thể trực tiếp thúc đẩy EMT thông qua việc kích hoạt phiên mã của các yếu tố này (32). Sự xoắn là một yếu tố phiên mã xoắn vòng được bảo tồn cao mới được xác định trong những năm gần đây. Biểu hiện xoắn cao đã được phát hiện ở nhiều loại tế bào ung thư (33). Do đó, điều cần thiết là phải điều tra mối liên quan giữa biểu hiện Twist và sự di chuyển hoặc di căn của tế bào ung thư, cũng như phòng ngừa và điều trị di căn trên lâm sàng (34). Trong nghiên cứu này, nó đã được tiết lộ rằng mức độ biểu hiện mRNA và protein của E-cadherin được điều chỉnh giảm khi thiếu oxy, trong khi mức độ biểu hiện mRNA và protein của Twist được tăng lên. Những phát hiện này phù hợp với kết quả của các xét nghiệm xâm nhập và di cư, điều này ngụ ý rằng tình trạng thiếu oxy có thể góp phần vào sự xuất hiện của EMT. Sau khi điều trị bằng OXA, mức độ biểu hiện protein của E-cadherin được điều chỉnh giảm; điều này chỉ ra rằng OXA thể hiện hiệu quả kém trong việc ức chế sự phát triển của tế bào ung thư gan, trong khi nó có thể thúc đẩy EMT. Tuy nhiên, khi kết hợp với CPhGs, độ nhạy của tế bào HepG2 với OXA cho thấy sự cải thiện rõ rệt khi có tình trạng thiếu oxy. Hơn nữa, điều trị bằng CPhGs và OXA có thể ức chế khả năng tồn tại của tế bào, sự di cư và sự xâm lấn của các tế bào HepG2. Nghiên cứu hiện tại chỉ phát hiện biểu hiện Twist và E ‑ cadherin; do đó, các nghiên cứu trong tương lai nhằm mục đích tập trung vào nhiều dấu hiệu liên quan đến EMT hơn, để đánh giá tác dụng ức chế của CPhG đối với EMT do thiếu oxy gây ra trong ung thư gan.

HIF ‑ 1 đã được báo cáo là thúc đẩy sự biểu hiện của LOXL2, và tăng cường sự di cư và xâm lấn của các tế bào ung thư gan, có thể liên quan chặt chẽ đến tiên lượng xấu của ung thư gan (30). Trong một nghiên cứu trước đây, mức độ biểu hiện của LOXL2 trong các mô ung thư gan liền kề đã tăng lên rõ rệt so với mức độ biểu hiện của LOXL2 trong các mô ung thư gan liền kề đã tăng lên rõ rệt so với trong các mô ung thư (35). Ngoài ra, nó có liên quan mật thiết đến sự xâm lấn và di căn của ung thư gan. Sự im lặng của gen LOXL2 bởi RNA can thiệp nhỏ đã ức chế sự tăng sinh của tế bào HepG2 và SMCC ‑ 7721, dẫn đến sự ngăn chặn chu kỳ tế bào của các tế bào ung thư và tăng quá trình chết rụng (36). Shao và cộng sự (35) đã nghiên cứu mối tương quan giữa LOXL2 trong các mẫu ung thư gan, các yếu tố bệnh lý lâm sàng, VM và tiên lượng trong số 201 trường hợp được phẫu thuật để điều trị. Người ta giả thuyết rằng LOXL2 đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh bệnh và tiến triển của ung thư gan, có thể là mục tiêu phát triển thuốc. Hơn nữa, Peng và cộng sự (37) đã chứng minh rằng LOXL2 có thể kích hoạt Snail / E ‑ cadherin và Src kinase / Con đường truyền tín hiệu kinase bám dính khu trú, có thể góp phần vào quá trình sinh bệnh và tiến triển EMT của tế bào ung thư dạ dày. Trong nghiên cứu này, trong điều kiện thiếu oxy, mức độ biểu hiện mRNA và protein của LOXL2 được tăng lên, trong khi sự biểu hiện của nó được điều chỉnh giảm sau khi điều trị bằng OXA. Hơn nữa, điều trị với sự kết hợp của CPhGs và OXA dẫn đến điều hòa rõ ràng biểu hiện LOXL2, có thể hỗ trợ hiệu quả tác dụng chống khối u của OXA đối với bệnh ung thư gan.

costanchecó hiệu quảhỗ trợ các hiệu ứng chống khối ucủaOXA về ung thư gan.

Để biết thêm thông tin, xin vui lòng bấm vào đây.

Có một số hạn chế đối với nghiên cứu hiện tại. Nghiên cứu hiện tại lẽ ra nên sử dụng thêm hai dòng tế bào ung thư gan, bao gồm cả dòng tế bào SMCC ‑ 7721, nhưng không thể sử dụng những dòng tế bào này vì không thể mua những dòng tế bào này vì chúng được xác định sai và có nguồn gốc từ tế bào HeLa. Ngoài ra, nghiên cứu này không phân tích tác dụng chống oxy hóa của các nồng độ CPhG khác nhau trong tế bào.

Kết luận, CPhG có thể thay thế vi môi trường khối u thiếu oxy của tế bào ung thư gan bằng cách điều chỉnh con đường tín hiệu HIF-1. Ngoài ra, độ nhạy của tế bào ung thư gan với OXA đã tăng lên đáng kể khi điều trị bằng sự kết hợp của CPhGs và OXA. Những phát hiện này có thể cung cấp một chiến lược điều trị mới để cải thiện độ nhạy của ung thư gan với hóa trị.