Phân tích hóa thực vật, Chống tăng sinh trong ống nghiệm, Chống oxy hóa Phần 1

Xin vui lòng liên hệoscar.xiao@wecistanche.comđể biết thêm thông tin

Tiểu sử:Rumex rothschildianus là thành viên duy nhất của một bộ phận duy nhất của chi Rumex, trong họ Polygonaceae. Loài này là loài dioecit nhỏ rất hiếm gặp hàng năm, đặc hữu của Palestine, theo truyền thống được sử dụng làm thực phẩm và điều trị các bệnh khác nhau. Do đó, cuộc điều tra hiện nay nhằm sàng lọc các thành phần hóa học, chất chống oxy hóa, chống a-amylase, chống a-glucosidase, dự đoán và tác dụng gây độc tế bào của bốn phần dung môi của lá R. rothschildianus.

Phương pháp:Bột khô của lá R. rothschildianus được chiết xuất trong bốn dung môi có độ phân cực khác nhau. Một số thử nghiệm định tính và định lượng phytochemical đã được thực hiện để xác định các thành phần của chất chiết xuất. Phân tích so màu được sử dụng để xác định định lượng phenol, flavonoid và tannin. Các xét nghiệm in-vitro được thực hiện để đánh giá các chất chiết xuất chống oxy hóa, chống a-amylase, chống a-glucosidase và dự đoán các hoạt động ức chế, cũng như độc tính tế bào bằng xét nghiệm MTS chống lại dòng tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa) và dòng tế bào ung thư vú (MCF7).

Vui lòng bấm vào đây để biết thêm

Kết quả:Phần aceton của lá R. rothschildianus cho thấy có ý nghĩa nhấtchất chống oxy hóahoạt động, do có hàm lượng flavonoid và phenol cao nhất, với giá trị ICso là 6,3 ± 0. 4 ug / ml, so với 3,1 ± 0. 9 ug / ml đối với Trolox, và liên quan hoạt động ức chế lipase, phần axeton cho thấy hoạt tính mạnh nhất với giá trị ICso là 26,3 ± {{1 0}}. 6 ug / ml, so với ICso đối chứng dương tính orlistat 12,3 ug / ml. Cùng một chiết xuất là chất ức chế mạnh nhất của a-amylase và a-glucosidase, với giá trị ICso là 19,1 ± 0. 7 ug / ml và 54,9 ± 0. 3 ug / ml, tương ứng so với đến 28,8, 37,1 ± 0,3 ug / và của acarbose, tương ứng. Phần hexan cho thấy sự ức chế 99,9% đối với tế bào HeLa và 97,4% ức chế đối với tế bào MCF7.

Sự kết luận:Phần aceton của lá R. rothschildianus có thể cung cấp một nguồn hợp chất hoạt tính sinh học để điều trị stress oxy hóa. Tương tự, phần hexan cho thấy tiềm năng kháng u đầy hứa hẹn của R. rothschildianus. Rõ ràng, những chỉ định ban đầu này cần được tinh chế thêm các hợp chất có khả năng hoạt động, và cuối cùng là các nghiên cứu in-vivo để xác định hiệu quả của chúng.

Từ khóa:Rumex rothschildianus, Chất chống oxy hóa, Lipase, Amylase, Trolox, Hóa chất thực vật, Hoạt động chống tăng sinh

Tiểu sử

Thực vật đã được sử dụng như một liệu pháp từ thời cổ đại. Rễ, hạt, vỏ cây, lá và hoa đều đã được sử dụng cho mục đích chữa bệnh. Trong thời đại ngày nay, các loại thuốc tổng hợp có sẵn và có hiệu quả trong điều trị nhiều loại bệnh; tuy nhiên, một số người vẫn thích thuốc thảo dược vì chúng được coi là ít gây hại cho cơ thể con người hơn [1,2]. Theo định nghĩa, cây thuốc là nguồn cung cấp các hợp chất phytochemical có các hoạt tính chữa bệnh. Những đặc tính này phụ thuộc vào sự hiện diện của các chất chuyển hóa thứ cấp khác nhau, chẳng hạn như phenol, terpenoit và ancaloit [3]. Rumex rothschildianus Aarons. là thành viên duy nhất của một bộ phận duy nhất của chi Rumex, trong họ Polygonaceae. Loài này là loài đặc hữu nhỏ hàng năm rất hiếm, đặc hữu ở Palestine. Nó có chiều cao trung bình là 45 cm và được đặc trưng bởi thân thẳng đứng chứa các lá nhỏ gốc, có cuống ngắn ở gốc và thuôn ngắn ở đỉnh. Hoa có đường kính 3-4 mm, trong khi nhụy hoa có đường kính khoảng 2 mm với một lớp màng hình nón [4]. Rumex spp. phổ biến ở các vùng khác nhau của Thổ Nhĩ Kỳ, và được đại diện bởi 22 loài. Một số loài phổ biến nhất là R. diseaseia L, R. Crispus L, R. acetosa LR caucasicus rech, R. alpinus LR alpinus, và R. caucasicus là những cây lâu năm phân bố ở trung và đông Anatolia ở độ cao {{10 }} m trên mực nước biển. Chi Rumex đã được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền ở Thổ Nhĩ Kỳ để điều trị các chứng rối loạn, chẳng hạn như táo bón, tiêu chảy và chàm [5, 6]. Chi tử còn có một số tác dụng nhuận tràng, lợi tiểu, hạ sốt, làm lành vết thương, chống viêm nhiễm. Nhiều người ở miền đông của Thổ Nhĩ Kỳ sử dụng lá non của Rumex spp. làm chất bảo quản trong pho mát, cũng như tạo mùi thơm cho thực phẩm [7].

Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện trên các loài Rumex, chẳng hạn như các hoạt động kháng khuẩn được báo cáo đối với một số loài. Một số chất phytochemical có hoạt tính sinh học trước đây đã được tìm thấy trong Rumex vicarious L, chẳng hạn như carotenoid, tocopherols, polyphenol, flavonoid và axit ascorbic, có vai trò như chất chống oxy hóa và chất giải độc tự nhiên. Chế độ ăn uống bổ sung các chất phytochemical chống oxy hóa, như carotenoid,phenolics, vàflavonoidcó thể bảo vệ chống lại các bệnh không lây nhiễm ở người, chẳng hạn như ung thư, rối loạn tim mạch và các vấn đề sức khỏe khác liên quan đến stress oxy hóa [5, 8]. Các gốc tự do có hại được biết là đóng một vai trò quan trọng trong nhiều vấn đề sức khỏe lớn, chẳng hạn như ung thư, bệnh tim mạch, viêm khớp dạng thấp, đục thủy tinh thể,Bệnh Alzheimer, và các bệnh thoái hóa khác liên quan đến lão hóa. Chất chống oxy hóa là các thành phần có lợi giúp trung hòa các gốc tự do này trước khi chúng có thể tấn công tế bào, và do đó chúng ngăn ngừa thiệt hại đối với protein, lipid vàcacbohydrat. Một loạt các chất chống oxy hóa tự nhiên và tổng hợp đã được đề xuất để điều trị các bệnh ở người. Sự quan tâm như vậy đến vai trò của chất chống oxy hóa đối với sức khỏe con người đã thúc đẩy các nghiên cứu trong lĩnh vực khoa học thực phẩm và dược liệu, đánh giá chức năng của các loại thảo mộc như là chất chống oxy hóa. Tác dụng chống oxy hóa bao gồm khả năng quét gốc tự do, ức chế quá trình peroxy hóa lipid, khả năng chelat ion kim loại và cũng làm giảm khả năng [9,10].

Ung thư là một trong những vấn đề chăm sóc sức khỏe toàn cầu. Việc phát triển và khám phá ra loại thuốc chống ung thư mới vẫn cực kỳ quan trọng do nhiều yếu tố khác nhau. Những yếu tố này bao gồm các phương pháp điều trị có thể gây ra các tác dụng phụ lớn hoặc có thể khá tốn kém. Các giải pháp thay thế an toàn hơn về mặt sinh học và giá cả phải chăng hơn vẫn rất được mong đợi [11-14].

Một số loài thực vật được coi là nguồn tiềm năng của các phân tử hoạt tính sinh học như atropine từ lá Belladonna, cocaine từ lá coca, vincristine từ cây Vinca, và nhiều loài khác vẫn đóng một vai trò quan trọng trong y học hiện đại [15,16].

Hiệu quả điều trị hữu ích có thể đến từ việc trộn các sản phẩm thứ cấp có trong cây thuốc. Các hợp chất này hầu hết là các chất chuyển hóa thứ cấp, như alkaloid, steroid, tannin, flavonoid và phenolics, được tổng hợp và lắng đọng trong các bộ phận cụ thể của những cây này [17,18]. Nghiên cứu này khảo sát các hoạt động chống a-amylase, anti - - glucosidase, anti-lipase, chống tăng sinh và chống oxy hóa trong ống nghiệm của các phân đoạn khác nhau được chiết xuất từ ​​lá R. rothschildianus.

Phương pháp

Nguyên liệu thực vật, hóa chất và dụng cụ

Lá R. rothschildianus được thu hoạch từ các vùng phía Tây của Palestine, từ tháng 2 đến tháng 3 năm 2018. Chúng được xác định bởi Tiến sĩ Nidal Jaradat, từ Phòng thí nghiệm Dược lý tại Đại học Quốc gia An-Najah, theo mã mẫu chứng từ Pharm-PCT {{3} }. Tất cả các hóa chất đều được mua từ Sigma-Aldrich. Máy đo quang phổ-UV / Visible (Jenway độ 7135, Stafford-shire, Vương quốc Anh), giấy lọc (Whitman số 1, Washington, Hoa Kỳ), thiết bị lắc (Memmert 531-25-1, Stockholm, Thụy Điển), thiết bị quay vòng (Heidolph -VV 2000, Schwa-bach, Đức), máy xay (Máy xay trộn Aero Plus 500 W, I01, Wan Chai, Trung Quốc), cân bằng điện tử (Radwag, AS 220 / c / 2, Torunska, Ba Lan), máy sấy đông lạnh-BT85 (Công nghệ Millrock, Trung Quốc) và bình hút ẩm lạnh (công nghệ Mill-rock, BT85, Kingston, Hoa Kỳ) đã được sử dụng.

Chuẩn bị các chất chiết xuất và phân đoạn

Bột khô của lá R. rothschildianus được chiết xuất bằng cách thêm các dung môi tuần tự dựa trên độ phân cực của chúng, bắt đầu bằng dung môi không phân cực hexan, và sau đó là axeton (một dung môi hữu cơ không phân cực), metanol (rượu phân cực), và cuối cùng là nước cất (a dung môi protic phân cực). Đối với mỗi lần chiết, khoảng 25g lá khô xay được đặt trong 0 51 hexan trong 72 giờ trong thiết bị lắc ở 1 0 0 vòng quay mỗi phút ở 25 độ. Đầu tiên, hexan được thay thế bằng 0,5L axeton, và sau đó thay thế bằng thể tích metanol và nước tương đương. Ủ trong dung môi như đã mô tả ở trên đối với hexan. Mỗi phần hữu cơ được lọc và cô đặc trong chân không trên thiết bị bay hơi quay, trong khi phần nước được làm khô bằng máy sấy đông lạnh. Cuối cùng, tất cả các phân đoạn thô được bảo quản ở 4 độ [19,20].

Sản lượng của mỗi phần được tính theo công thức sau:

Đánh giá sơ bộ hóa thực vật

Các xét nghiệm sàng lọc phytochemical của lá R. rothschildianus trong bốn phần được thực hiện để xác định các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính. Các kết quả định tính được biểu thị bằng (cộng) cho sự hiện diện và (-) cho sự vắng mặt của các chất phytochemical có hoạt tính sinh học [10,21].

Xác định tổng hàm lượng phenol (TPC)

Quy trình xác định TPC dựa trên quy trình của Cheung et al. TPC được biểu thị bằng miligam đương lượng axit gallic trên gam trọng lượng khô của lá (mg GA / g trọng lượng khô). Dung dịch natri cacbonat 7,5% mới chuẩn bị được tạo ra bằng cách cho 7,5g Na2CO3 vào bình định mức và điều chỉnh thể tích đến 1 0 0ml bằng nước cất. Dung dịch đối chiếu tiêu chuẩn (dung dịch axit gallic) được chuẩn bị bằng cách hòa tan 100 mg axit gallic trong nước cất đến thể tích cuối cùng là 100ml. Từ đó, một sự pha loãng nối tiếp được thực hiện để thu được các dung dịch axit gallic ở 100,70,50,40 và 10ug / ml）. Dung dịch gốc của các phân đoạn từ lá được chuẩn bị bằng cách hòa tan 100mg chiết xuất thực vật trong nước cất, và điều chỉnh đến tổng thể tích là 100ml. Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị bằng cách trộn 0,5 ml dung dịch mỗi phần với 2,5 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu 10%, được hòa tan trong nước với 2,5 ml natri bicacbonat 7,5%. Các ống mẫu được ủ trong 45 phút ở 45 độ. Sau đó, độ hấp thụ của mỗi chất được đo trong máy quang phổ ở bước sóng 765 nm. Các mẫu làm việc được chuẩn bị ba lần cho mỗi phép thử phân tích, từ đó các giá trị trung bình và độ lệch chuẩn được tính toán [21].

Xác định tổng hàm lượng flavonoid (TFC)

TFC trong bốn phần lá R. rothschildianus được đánh giá bằng cách sử dụng đường chuẩn của rutin (hợp chất đối chứng tiêu chuẩn). Kết quả được biểu thị bằng miligam rutin đương lượng trên gam trọng lượng khô của dịch chiết lá (mg RU / g trọng lượng khô). Đường chuẩn cho rutin được thiết lập bằng cách sử dụng các dung dịch pha loãng nối tiếp được tạo ra từ dung dịch gốc 1 {{1 0}} 0 ug / ml. Để tạo dung dịch gốc, 10 mg rutin được hòa tan trong 10ml nước cất và sau đó pha loãng thành 100ml. Sau đó, dung dịch gốc được pha loãng để cung cấp rutin ở các nồng độ 10, 30, 40,50,70 và 100 ug / ml. Để chuẩn bị dung dịch làm việc, 0,5ml của mỗi phần dung dịch được trộn với 3 ml metanol, 0,2ml 10% AlCl3,0,2ml kali axetat 1M, và 5ml nước cất, sau đó ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Các bước trước đó được lặp lại đối với từng phần trong số các phân đoạn, sau đó, độ hấp thụ được đo ở bước sóng 415 nm. Đối với mẫu trắng đối chứng, dung dịch làm việc được pha bằng nước cất thay cho dịch chiết mẫu. Các mẫu được chuẩn bị ba lần cho mỗi phép thử phân tích, từ đó các giá trị trung bình và độ lệch chuẩn được tính toán [22].

Xác định hàm lượng tanin tổng số (TTC) Đề cương của Sun et al. được sử dụng để xác định TTC trong bốn phân đoạn lá R. rothschildianus, là quy trình được sử dụng phổ biến nhất. Catechin được sử dụng như một hợp chất đối chứng để xây dựng đường chuẩn. Dự trữ 1 0 0ug / ml trong metanol được chuẩn bị, từ đó một loạt pha loãng được tạo ra để tạo ra các nồng độ catechin là 10, 30, 50,70 và 100 ug / ml. Dung dịch vanilin 4% trong metanol mới được chuẩn bị. Dung dịch gốc của các phân đoạn ở 100 ug / ml được chuẩn bị bằng cách sử dụng metanol làm dung môi. Đối với dung dịch làm việc, 0,5ml của mỗi phần dung dịch được trộn với 3ml dung dịch vanilin và 1,5ml HCl đặc. Để yên hỗn hợp trong 15 min, và sau đó đo độ hấp thụ ở bước sóng 500 nm, sử dụng dung dịch làm việc được pha với metanol thay cho dịch chiết mẫu làm mẫu trắng. Tất cả các mẫu làm việc được phân tích ba lần, từ đó các giá trị trung bình và độ lệch chuẩn được tính toán. Tổng số tanin trong mỗi phần được biểu thị bằng đương lượng catechin (mg CAE / g trọng lượng khô của lá) [23].

Phương pháp hoạt động chống oxy hóa

Xét nghiệm nhặt rác gốc tự do 2, 2- diphenyl-picrylhydrazyl (DPPH) được sử dụng để đo hoạt tính chống oxy hóa trong các phần khác nhau của lá R. rothschildianus. Dung dịch gốc 1 0 00ug / ml của mỗi phần thực vật được chuẩn bị trong metanol. Ngoài ra, dung dịch Trolox 1000 ug / ml cũng được chuẩn bị (chuẩn đối chiếu). Một loạt pha loãng được chuẩn bị từ các dung dịch gốc cho mỗi phần, tạo ra sáu độ pha loãng nối tiếp ở 2, 5, 10,20, 50 và 100 ug / ml. Một ml của mỗi dung dịch pha loãng chiết xuất được trộn với 1 ml 0,002 g / ml DPPH trong metanol. Một ml metanol được thêm vào để có thể tích làm việc cuối cùng là 3 ml. Dung dịch DPPH mới được chuẩn bị, vì nó rất nhạy cảm với ánh sáng. Mẫu trắng đối chứng nồng độ loạt là DPPH trong metanol theo tỷ lệ 1: 2, không bổ sung dịch chiết. Tất cả các dung dịch làm việc được ủ ở nhiệt độ phòng (25 độ) trong bóng tối trong khoảng 30 phút. Mật độ quang học sau đó được đo bằng máy quang phổ ở bước sóng 517 nm. Phương trình sau đây được sử dụng để tính toán phần trăm ức chế DPPH cho mỗi phần cây, với Trolox là hợp chất tiêu chuẩn:

Trong đó, Ag là độ hấp thụ được ghi lại của dung dịch trắng và A là độ hấp thụ được ghi lại của dung dịch mẫu thử nghiệm [21].

Thử nghiệm ức chế lipase tuyến tụy ở heo

Dung dịch gốc 5 0 0 ug / ml được làm từ mỗi phần thực vật trong 1 0 phần trăm DMSO. Từ những chất này, một loạt pha loãng gồm năm nồng độ 50,100,200, 300 và 400 ug / ml đã được tạo ra. Dung dịch gốc 1 mg / ml của lipase tụy lợn trong dung dịch đệm Tris-HCl được chuẩn bị mới ngay trước khi sử dụng. Chất nền, p-nitrophenyl butyrat (PNPB) được chuẩn bị bằng cách hòa tan 20,9mg trong 2ml acetonitril. Đối với mỗi dung dịch làm việc, 0,1ml lipase tụy lợn được trộn với 0,2ml phần thực vật từ mỗi thành viên của chuỗi pha loãng. Tris-HCl được thêm vào để tạo thể tích cuối cùng của dung dịch làm việc là 1ml, và chúng được ủ ở 37 độ C trong 15 phút. Sau khi ủ, 0,1 ml dung dịch p-nitrophenyl butyrat được thêm vào mỗi ống nghiệm. Sau đó, hỗn hợp này được ủ thêm 30 phút ở 37 độ. Hoạt tính lipase tuyến tụy được xác định bằng cách đo sự thủy phân của PNPB thành p-nitrophenolate ở bước sóng 410 nm, sử dụng máy quang phổ UV. Quy trình tương tự được lặp lại bằng cách sử dụng orlistat làm hợp chất đối chứng tiêu chuẩn. Tỷ lệ phần trăm ức chế lipase bởi các phân đoạn thực vật được tính theo công thức sau:

Trong đó, Ap là độ hấp thụ được ghi lại của dung dịch trắng và A là độ hấp thụ được ghi lại của dung dịch mẫu thử nghiệm [24]. Thử nghiệm ức chế a-amylase

A1 0 0 mg mỗi phần được hòa tan trong vài milimét của 1 0 phần trăm DMSO, và sau đó được hòa tan thêm đến 1 0 0ml trong 0,02 M Na HPOq / NaH-PO4,0,006M NaCl, pH 6,9 để tạo dung dịch gốc cuối cùng có nồng độ 1000 ug / ml. Từ những dung dịch này, các dung dịch pha loãng sau đây được chuẩn bị là 10,50,70,100 và 500 ug / ml, sử dụng 10% DMSO làm chất pha loãng. Một thể tích 0,2ml của 2 đơn vị / ml -amylase tụy lợn được trộn với 0,2ml

phần thực vật và được ủ trong 1 0 phút ở 3 0 độ. Sau khi ủ, 0. 2ml dung dịch tinh bột 1% mới chuẩn bị trong nước được thêm vào và sau đó các ống này được ủ thêm ít nhất ba phút. Tại thời điểm này, phản ứng dừng lại bằng cách thêm 0,2ml thuốc thử màu 3, 5- dinitro salicylic acid (DNSA) và được pha loãng với 5ml nước cất, trước khi được đun nóng ở 90 độ trong 10 phút trong nước. bồn tắm. Sau đó, hỗn hợp này được làm lạnh đến nhiệt độ phòng, và độ hấp thụ được đo ở bước sóng 540 nm. Mẫu đối chứng trắng được chuẩn bị bằng cách sử dụng cùng số lượng được mô tả ở trên, nhưng thay thế phần thực vật bằng 0,2ml đệm. Acarbose được sử dụng làm chất tham chiếu tiêu chuẩn theo quy trình được mô tả ở trên. Hoạt tính ức chế a-amylase được tính theo công thức sau:

Trong đó, Ag: là độ hấp thụ của mẫu trắng và Ar là độ hấp thụ của mẫu thử [25].

Bài báo này được trích từ Jaradat et al. Thuốc và Liệu pháp Bổ sung BMC (2021) 21: 107