ABSTRACT

Lý lịch:Một bis resorcinol đã được phân lập như là thành phần chính của thân Heliciopsis terminals' (Proteaceae). Gần đây, resorcinol được sử dụng như một chất làm trắng tích cực trong các sản phẩm mỹ phẩm khác nhau. Do sự bắt chước cấu trúc của resorcinol, lợi ích của bis resorcinol như một chất đối kháng enzym lão hóa đã được chứng minh trong nghiên cứu này.

Theo các nghiên cứu có liên quan, cistanche là một loại thảo mộc phổ biến được mệnh danh là "thần dược kéo dài tuổi thọ". Thành phần chính của nó là cistanoside, có nhiều tác dụng như chống oxy hóa, chống viêm và tăng cường chức năng miễn dịch. Cơ chế giữa cistanche và làm trắng da nằm ở tác dụng chống oxy hóa của glycoside cistanche. Melanin trong da người được tạo ra bởi quá trình oxy hóa tyrosine được xúc tác bởi tyrosinase, và phản ứng oxy hóa cần có sự tham gia của oxy, do đó các gốc tự do oxy trong cơ thể trở thành một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình sản xuất melanin. Cistanche chứa cistanoside, một chất chống oxy hóa và có thể làm giảm sự hình thành các gốc tự do trong cơ thể, do đó ức chế sản xuất melanin.

Bấm vào Cistanche Tubulosa để làm trắng

Để biết thêm thông tin:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

phương pháp:Bis resorcinol được tinh chế từ chiết xuất etanol thô của thân cây H. terminal bằng cách chiết dung môi và sắc ký chuẩn bị tương ứng. Hoạt tính ức chế collagenase, elastase và tyrosinase của hợp chất đã được nghiên cứu bằng cách sử dụng một kỹ thuật quang phổ khác. Kết nối phân tử đã được thực hiện để dự đoán các tương tác có thể có của chất xung quanh các vị trí hoạt động của enzyme.

Kết quả:Giá trị IC50 trên collagenase của bis resorcinol và axit caffeic lần lượt là 156,7 ± 0.7 và 308,9 ± 1,6 µmole L−1. Đối với hoạt tính elastase, giá trị IC50 là 33,2 ± 0,5 và 34,3 ± 0,3 µmole L-1 tương ứng được xác định cho bis resorcinol và axit ursolic. Bis resorcinol ức chế tyrosinase bằng cách cho thấy IC50 là 22,8 µmole L−1, và 78,4 µmole L−1 là có mặt cho -arbutin. Bis resorcinol liên kết với collagenase, elastase và tyrosinase với năng lượng liên kết tương ứng là −5,89, −5,69 và −6,57 kcal mol−1. Những năng lượng liên kết này nằm trong cùng phạm vi với các chất ức chế được thử nghiệm. Các nhóm phenol thơm trong cấu trúc chịu trách nhiệm về nguyên tắc cũng như hỗ trợ các tương tác liên kết với enzyme. Liên kết hydro do các nhóm hydroxyl và lực hấp dẫn liên quan đến π từ (các) vòng thơm mang lại tính linh hoạt liên kết với bis resorcinol.

Phần kết luận:Bis resorcinol được tinh chế từ H. terminal có thể hữu ích để đưa vào các sản phẩm mỹ phẩm như một chất đối kháng enzym lão hóa.

Đối tượng Hóa sinh, Tin sinh học, Sinh học tế bào, Da liễu, Khai thác dữ liệu và Học máy

từ khóaThiết bị đầu cuối Heliciopsis, Bisresorcinol, Collagenase, Elastase, Tyrosinase, Thuộc tính chống lão hóa, Kết nối phân tử, Ức chế enzyme

GIỚI THIỆU

A bis resorcinol, (8′Z)-3,5-dihydroxy-1-[16′-(3″, 5″-dihydroxy phenyl)-8′-hexadecen{{ 11}}′-yl] benzen, đã được phân lập như một thành phần dồi dào từ thân cây Heliciopsis terminals (Kurz) Sleumer, một loại cây thuộc họ Proteaceae và đã được đồng bào các dân tộc ở Việt Nam sử dụng để bảo vệ gan. Cho đến nay, lợi ích y tế của hợp chất này như một tác nhân chống viêm, ức chế sản xuất malondialdehyd (MDA) và bảo vệ gan đã được làm rõ trong ống nghiệm và trong cơ thể sống (Giang và cộng sự, 2019). Rõ ràng là một phân tử của bis resorcinol chứa hai phân tử resorcinol (Số EC 203-585-2), được liên kết với nhau bằng liên kết meta-C7H14C=CC7H14 (Hình 1A). Resorcinol gần đây được áp dụng dưới dạng huyết thanh cô đặc trên mặt để trị liệu trắng. Dựa trên Ủy ban Khoa học về An toàn Người tiêu dùng, Brussels, Bỉ (SCCS 1270/09, Ủy ban Châu Âu, Ủy ban Khoa học về An toàn Người tiêu dùng, 2010), resorcinol đã được quy định là chất oxy hóa trong các sản phẩm dùng để nhuộm lông mi ở nồng độ lên tới 1,25 phần trăm , hoặc trong kem dưỡng tóc và dầu gội đầu với nồng độ lên đến 0,5 phần trăm . Do đó, các ứng dụng mỹ phẩm của resorcinol rất đa dạng. Đối với các chất làm trắng, sự ức chế tổng hợp melanin bởi các tế bào hắc tố cư trú trong lớp tế bào đáy của biểu bì đã được giả định. Tyrosinase (EC 1.14.18.1) là một enzym chủ chốt để xúc tác quá trình tạo hắc tố trong đó L-tyrosine được sử dụng làm cơ chất. Mặc dù melanin giúp bảo vệ da khỏi tác hại của tia UV, nhưng việc sản xuất dư thừa melanin có thể gây ra chứng tăng sắc tố da, tàn nhang và đồi mồi. Ngoài resorcinol, nhiều hợp chất tổng hợp và tự nhiên với cấu trúc hóa học riêng biệt đã được chứng minh là có hoạt tính chống tyrosinase (Dobos et al., 2015).

Bức xạ tia cực tím là một yếu tố bên ngoài chính gây lão hóa da. Thay vào đó, da có thể bị lão hóa theo thời gian bởi các loại oxy phản ứng (ROS) và lipid peroxide được sản sinh bên trong sau khi tiếp xúc với tia cực tím. Các sản phẩm thứ cấp từ quá trình chuyển hóa peroxide lipid có thể làm hỏng các sợi elastin và collagen của chất nền ngoại bào (ECM). Do đó, tiếp xúc với tia UV có thể dẫn đến mất nước, mất độ đàn hồi cũng như nếp nhăn trên da. Theo hiểu biết của chúng tôi, các ECM được điều chỉnh lại định kỳ để duy trì cấu trúc mô bình thường cùng với việc các protein mô đã hết hạn sử dụng bị phân hủy đúng cách bởi các metallicoproteinase ma trận, chẳng hạn như collagenase và protease serine như elastase (Thring, Hili & Naughton, 2009). Ngoài ra, cả số lượng và hoạt động của các enzym lão hóa đều tăng lên do mất cân bằng oxy hóa, dẫn đến suy thoái ECM trên diện rộng và quá trình lão hóa tiến triển (Sherratt và cộng sự, 2019). Do đó, các hợp chất có thể tạo phức với các ion kim loại được dự đoán là có khả năng ức chế collagenase, elastase và tyrosinase tương ứng (Selvaraj et al., 2014). Dự án này nhằm mục đích xác định tác dụng sinh học của bis resorcinol đối với tyrosinase, collagenase và elastase trong ống nghiệm và một kỹ thuật lắp ghép đã được thực hiện để làm rõ các tương tác của chúng ở cấp độ phân tử. Người ta hy vọng có thể trì hoãn quá trình lão hóa và cải thiện vẻ ngoài của da bằng bis resorcinol.

VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP

Hóa chất và dụng cụ

Thanh lọc hợp chất, xác định và phê chuẩn

Dịch chiết thô trong etanol của thân cây H. terminals được lấy từ Giáo sư PM Giang, Khoa Hóa học, Đại học Quốc gia Hà Nội, Việt Nam với mẫu chứng từ số HNIP-18473. Sau đó, nó được phân chia trong metanol/n-hexan lặp lại ba lần. Lớp metanol được làm bay hơi đến gần khô và sau đó được phân tách trong etyl axetat/1-butan. Lớp etyl axetat được làm bay hơi cho đến khi thể tích của nó giảm đi 80 phần trăm . Chất lỏng nhớt thu được sau đó được tinh chế trên cột silica gel sử dụng phương pháp rửa giải gradient chloroform/metanol như sau: 100% chloroform, 30:1, 20:1, 10:1, 7:1, 5:1, 3:1, 3 :2, và 2:1 lần lượt là chloroform/metanol và 100 phần trăm metanol. Dịch rửa giải từ dung môi hỗn hợp 5:1 được thu thập và làm bay hơi đến một phần tư thể tích, tiếp theo là quá trình tách trên cột ODS bằng cách rửa giải gradient metanol và axeton. Hợp chất mong muốn, tức là bis resorcinol (Hình 1), thu được từ dung dịch rửa giải chứa 70 phần trăm axeton và được xác nhận bằng quang phổ MS, NMR và IR liên quan đến dữ liệu thư viện công cụ. Sắc ký lớp mỏng được sử dụng để ước tính độ tinh khiết của nó.

Xét nghiệm hoạt tính sinh học

Trong ống nghiệm, các thí nghiệm bao gồm các thử nghiệm ức chế enzyme trên collagenase, elastase và tyrosinase đối với bis resorcinol và các chất ức chế đã biết đã được thực hiện như sau.

ức chế collagenase

Thử nghiệm chống collagenase gần đây đã được sửa đổi so với mô tả trước đây của Widyowati et al. (2016). Tóm lại, 50 mmol L−1 dung dịch đệm tricine pH 7,5 được bổ sung 400 mmol L−1 NaCl và 10 mmol L−1 CaCl2 được sử dụng làm chất pha loãng dung dịch đệm. Collagenase từ Clostridium histolyticum (EC.3.4.24.3) được hòa tan trong dung dịch đệm với nồng độ 1 mg L−1. Cơ chất-enzym, MOCAc-PRO-Leu-Gly-Leu-A2pr (Dnp)-Ala-Arg-NH2, trước đó đã được hòa tan trong DMSO và sau đó được pha loãng trong dung dịch đệm đến nồng độ 1 mmol L−1. Một mẫu được hòa tan trong DMSO được pha loãng thành các nồng độ khác nhau bằng cách sử dụng dung dịch đệm. Một 2-µl dung dịch mẫu được ủ với 100 μl dung dịch enzyme ở 37 ○C trong 10 phút. Sau đó, 50-µl chất nền được thêm vào và trộn kỹ. Sự phát xạ huỳnh quang (F) ở bước sóng 405nm ngay lập tức được ghi lại và được theo dõi liên tục trong 30 phút bằng cách sử dụng bước sóng 320nm để kích thích. Axit caffeic được sử dụng làm chất kiểm soát vị trí (Hình 1). Kiểm soát tiêu cực đã được thực hiện với nước. Phần trăm ức chế ( phần trăm ) được tính toán từ phương trình dưới đây:

phần trăm ức chế {{0}}{1 - (Fsam; 30 - Fsam; 0)÷(Fcont; 30 - Fcont; 0)} ×100.

ức chế elastase

Thử nghiệm theo Abhijit & Manjushree (2010) đã được áp dụng với một số sửa đổi. Tóm lại, hệ đệm là 0.2 mM đệm Tris-HCl (pH 8,0). Dung dịch chứa 1 µg mL−1 elastase tụy lợn (EC.3.4.21.36) được chuẩn bị trong nước vô trùng. Cơ chất của enzym, N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (SANA), được hòa tan trong dung dịch đệm với nồng độ 80 mmol L−1. Một mẫu được hòa tan trong DMSO được pha loãng thành các nồng độ khác nhau bằng cách sử dụng dung dịch đệm. Một 100-µl dung dịch mẫu được trộn với 50 μl dung dịch enzyme và ủ trong 15 phút. Sau đó, 50 µl dung dịch cơ chất-enzym được thêm vào và trộn kỹ. OD410 được đo ngay lập tức (0 phút) và sau khi ủ qua đêm (o/n) ở 37 độ bằng cách sử dụng đầu đọc vi bản. Axit ursolic được sử dụng làm đối chứng dương (Hình 1) và nước được sử dụng làm đối chứng âm. Phần trăm ức chế ( phần trăm ) được tính theo phương trình sau:

phần trăm ức chế {{0}} {1 - [(Asam; o/n - Asam; 0)÷(Acont; o/n - Acont; 0)]} ×100:

ức chế tyrosinase

Thử nghiệm ức chế tyrosinase được sử dụng đã được điều chỉnh từ phương pháp đã mô tả trước đó (Jiratchayamaethasakul et al., 2020). Tóm lại, thử nghiệm được thực hiện trong 0.05 mol L−1 dung dịch đệm phốt phát pH 6,8. Tyrosinase của nấm (EC.1.14.18.1) được hòa tan trong dung dịch đệm đến nồng độ 100 đơn vị mL−1. L-tyrosine, một chất nền của enzyme, được điều chế ở nồng độ 0,25 mg mL−1 trong dung dịch đệm. Hợp chất thử nghiệm được hòa tan trong DMSO được pha loãng thành các nồng độ nằm trong khoảng từ 0,625 đến 10 mg mL−1. Cho vào một giếng 96-các đĩa giếng, 10 µl mẫu và 40 µl dung dịch L-tyrosine được trộn lẫn và ủ trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, 50 µl dung dịch enzyme được cấy và trộn đều. Phản ứng được dừng lại sau đó bằng cách ủ trên băng trong 1 phút. OD475 được đo bằng đầu đọc vi bản. -Arbutin và nước lần lượt được sử dụng làm đối chứng dương (Hình 1) và đối chứng âm. Phần trăm ức chế ( phần trăm ) được tính theo phương trình như sau:

NGHIÊN CỨU GÓI PHÂN TỬ

Chuẩn bị phối tử và thụ thể

Cấu trúc ba chiều (3D) của bis resorcinol (CID 8917124) và các hợp chất tham chiếu, bao gồm chất nền và chất ức chế, đã được tải xuống từ cơ sở dữ liệu PubChem cho nghiên cứu lắp ghép phân tử. Một cấu trúc phối tử đã được chuẩn bị trong tệp định dạng Ngân hàng Dữ liệu Protein (PDB) bằng cách sử dụng Trình dịch SMILES và Trình tạo tệp cấu trúc trực tuyến. Cấu trúc tinh thể của các enzym, chẳng hạn như collagenase (PDB ID 2Y6I), elastase (PDB ID 1BRU) và tyrosinase (PDB ID 2Y9X) được lấy từ cơ sở dữ liệu protein RCSB. Nước và các phân tử đính kèm được tách ra khỏi tất cả các cấu trúc protein đã chọn. Trong khi đó, các nguyên tử hydro phân cực đã được thêm vào cấu trúc protein kết tinh bằng AutoDockTools 1.5.6. Các tệp protein mục tiêu và các hợp chất được sử dụng khác đã được lưu ở định dạng PDBQT trước khi thực hiện quá trình ghép nối phân tử.

Lựa chọn dư lượng trang web hoạt động và lắp ghép phân tử

Các giao thức lưới và kết nối của các dự đoán trang web đang hoạt động đã được chuẩn bị bằng AutoDockTools 1.5.6. Các trang lưới được đặt với khoảng cách 0.375 Å. Kích thước xyz được đặt thành 126-135-160 Å3 cho collagenase, 130-120-126 Å3 cho elastase và 80-80-80 Å3 cho tyrosinase. Tâm hộp lưới (với các giá trị bù trong AutoDockTools) là 31.869 (5.000), −19,41 (−25.{{20}}) và 17,815 đối với collagenase , 30.048 (−0,972), 51,253 (−2,722), 17,6 cho elastase và −8,407 (−1.000), −23,795 (−0,250), −36,019 (−3,500 ) đối với tyrosinase, tương ứng. Cấu trúc protein được sử dụng như một thực thể cứng nhắc trong khi hợp chất phối tử được thiết lập như một phân tử linh hoạt. Nghiên cứu lắp ghép được thực hiện bằng thuật toán di truyền Lamarckian (GA) do AutoDock4 phiên bản 4.2 triển khai. Số lần chạy GA là 50 với kích thước phổ biến là 200. Năng lượng liên kết (ΔGbind) được phân tích bởi ADT. (Các) tương tác được hiển thị trực quan bằng BIOVIA Discovery Studio (BIOVIA, 2020). Tương tác phân tử giữa hợp chất và thụ thể protein đã được phân tích và hiển thị trực quan bằng phần mềm BIOVIA Discovery Studio (BIOVIA, 2020). Cấu trúc của hợp chất vị trí liên kết protein được hình dung bằng cách sử dụng gói Visual Molecular Dynamics (VMD) (Humphrey, Dalke & Schulten, 1996).

Phân tích thống kê

KẾT QUẢ

Một thành phần chính đã được tinh chế thành công từ thân của thiết bị đầu cuối H. bằng cách sử dụng kỹ thuật chiết dung môi và kỹ thuật HPLC pha đảo ngược tương ứng. Phổ 1 H-NMR và 13C-NMR thu được được so sánh với phổ của các chất tham chiếu thông qua SciFinder (//scififinder.cas.org/) và được tìm thấy tương ứng với (8′Z)-1,{ {6}}dihydroxy-5- [16′-(3″,5″-dihyroxyphenyl)-8′-hexadecen-1′-yl] benzen (Chaturvedula và cộng sự, 2{{ 23}}02). Nó được phân loại là một trong những bisresorcinol. Bis resorcinol gần đây này có công thức phân tử là C28H40O4 với trọng lượng phân tử là 463,2819 Dalton. Năng suất khai thác được tính toán là 0,086 phần trăm, dựa trên trọng lượng khô của thân cây. Độ tinh khiết của nó là hơn 98 phần trăm , liên quan đến phổ 1 H và 13C-NMR thu được (xem Hình S1 và S2).

Phân tích hoạt tính sinh học trong ống nghiệm

Tác dụng đối kháng của bisresorcinol đối với các enzym lão hóa, chẳng hạn như collagenase, elastase và tyrosinase được xác định trong ống nghiệm bằng cách sử dụng phương pháp quang phổ riêng biệt. Kết quả được tóm tắt trong Bảng 1 và Hình 2. Để ức chế collagenase, các mẫu thử nghiệm trong khoảng 50–550 µmol L−1 đã được chuẩn bị bằng cách sử dụng MOCAc-PRO-Leu-Gly-Leu-A2pr (Dnp)-Ala Arg-NH2 như chất nền-enzym và axit caffeic như một chất ức chế enzym. Người ta chỉ ra rằng bisresorcinol ở nồng độ 156,7 µmol L−1 làm giảm 50% hoạt tính của enzym (IC50). Thay vào đó, IC50 của axit caffeic là 308,9 ± 13,7 µmol L−1. Do đó, hoạt tính chống collagenase của bisresorcinol mạnh hơn đáng kể so với axit caffeic.

Để biết thêm thông tin: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501