AKT được kích hoạt bằng điều kiện tiên quyết kiểm soát khả năng chịu đựng của tế bào thần kinh đối với bệnh thiếu máu cục bộ thông qua con đường MDM2–p53Ⅰ

trừu tượng

Một trong những cơ chế quan trọng nhất của bảo vệ thần kinh qua trung gian điều kiện tiên quyết là làm suy giảm quá trình chết theo chương trình của tế bào, tạo ra khả năng chịu đựng của não sau khi bị thiếu máu cục bộ sau đó. Trong bối cảnh này, đường dẫn tín hiệu PI3K/AKT chống chết tế bào theo chương trình đóng vai trò chính trong việc điều chỉnh sự biệt hóa và sống sót của tế bào.

Bấm để cistanche tubulosa bột chobảo vệ thần kinh

AKT hoạt động được biết là làm tăng biểu hiện của chuột đôi phút-2 (MDM2), một dây chằng E3-ubiquitin làm mất ổn định p53 để thúc đẩy sự sống sót của các tế bào ung thư. Trong các tế bào thần kinh, gần đây chúng tôi đã chỉ ra rằng tương tác MDM2–p53 được tăng cường bằng điều kiện tiên quyết dược lý, dựa trên sự kích thích dưới độc tố của thụ thể glutamate NMDA, giúp ngăn ngừa quá trình chết theo chương trình của tế bào thần kinh do thiếu máu cục bộ.

Tuy nhiên, liệu cơ chế này có góp phần vào khả năng chịu đựng của tế bào thần kinh trong điều kiện tiên quyết thiếu máu cục bộ (IPC) hay không vẫn chưa được biết. Ở đây, chúng tôi chỉ ra rằng IPC gây ra sự phosphoryl hóa AKT qua trung gian PI3K tại Ser473, từ đó phosphoryl hóa MDM2 tại Ser166. Sự phosphoryl hóa này đã kích hoạt sự ổn định hạt nhân của MDM2, dẫn đến sự mất ổn định của p53, do đó ngăn ngừa quá trình chết theo chương trình của tế bào thần kinh khi bị thiếu máu cục bộ. Việc ức chế con đường PI3K/AKT bằng wortmannin hoặc bằng cách làm im lặng AKT đã gây ra sự tích tụ MDM2 trong tế bào chất, hủy bỏ khả năng bảo vệ thần kinh do IPC gây ra.

Do đó, IPC tăng cường kích hoạt đường dẫn tín hiệu PI3K/AKT và thúc đẩy khả năng chịu đựng của tế bào thần kinh bằng cách kiểm soát tương tác MDM2–p53. Phát hiện của chúng tôi cung cấp một lộ trình cơ học mới liên quan đến bảo vệ thần kinh do IPC gây ra thông qua điều chế tín hiệu AKT, cho thấy AKT là mục tiêu điều trị tiềm năng chống lại tổn thương do thiếu máu cục bộ. Từ khóa: AKT; MĐM2; p53; PI3K; dung nạp thiếu máu cục bộ; điều kiện tiên quyết

1. Giới thiệu

Ở người, sự tồn tại của cơn thiếu máu não thoáng qua (TIA) đã được tiết lộ là một trạng thái tiền định nội sinh với những lợi ích về kết quả chức năng ở bệnh nhân đột quỵ [1–3]. Bảo vệ thần kinh nội sinh gây ra bởi một kích thích thiếu máu cục bộ ngắn, cận độc, được gọi là điều kiện tiên quyết thiếu máu cục bộ (IPC), được coi là một chiến lược trong lĩnh vực bảo vệ thần kinh chống lại tổn thương do thiếu máu cục bộ mới nổi [4–6].

Bằng chứng cho thấy rằng bảo vệ thần kinh do IPC thúc đẩy phụ thuộc vào các cơ chế phiên mã, dịch mã và hậu dịch mã, làm thay đổi chức năng của các protein chính sau khi thiếu máu cục bộ [6–11]. Tuy nhiên, cơ chế liên quan đến dung nạp thiếu máu cục bộ do IPC gây ra (IT) vẫn chưa được làm rõ hoàn toàn trong não người [12,13].

Sự phát triển của các phương pháp thử nghiệm mới để hiểu về bảo vệ thần kinh qua trung gian IPC đại diện cho một công cụ mạnh mẽ để giải mã các cơ chế nội sinh bên dưới CNTT của não [6], có khả năng tiết lộ các mục tiêu điều trị mới nhằm giảm thiểu tổn thương não ở bệnh nhân đột quỵ. Trong hai thập kỷ qua, cái chết của tế bào thần kinh theo chương trình đã tự định vị nó như một cơ chế thiết yếu liên quan đến tổn thương do thiếu máu cục bộ não [14–16]. Theo nghĩa này, protein kinase B hoặc AKT, một serine/threonine kinase cần một phosphoinositide kinase chức năng (PI3K) để được kích hoạt, đã được coi là mục tiêu thiết yếu cho các liệu pháp bảo vệ thần kinh sau thiếu máu cục bộ [17,18].

Gần đây, chúng tôi đã chứng minh rằng việc ức chế con đường truyền tín hiệu PI3K/AKT làm tăng tính nhạy cảm của tế bào thần kinh đối với độc tính kích thích [19]. AKT tham gia vào mạng báo hiệu chống apoptotic phức tạp [20], có các thành phần có thể hiện diện ở các vị trí dưới tế bào khác nhau tùy thuộc vào loại mô [21,22]. Ở tim, AKT đã tham gia vào việc bảo vệ tim mạch được thúc đẩy bởi điều kiện tiên quyết [23].

Bằng chứng cũng cho thấy AKT được phosphoryl hóa thúc đẩy sự sống sót của tế bào thần kinh khi bắt đầu thiếu máu não [24]. Mặc dù kích hoạt AKT có thể góp phần tạo ra CNTT trong não [25], cơ chế chính xác liên quan đến kích hoạt qua trung gian IPC của nó vẫn khó nắm bắt. Trong các tế bào khối u, việc kích hoạt đường truyền tín hiệu PI3K/AKT dẫn đến quá trình phosphoryl hóa MDM2 tại Ser166/186, thúc đẩy sự chuyển vị hạt nhân của MDM2 [26,27] và tăng cường hoạt động phổ biến của nó [28].

Trong nhân, MDM2 liên kết với p53 và thúc đẩy sự phổ biến của nó và sự thoái hóa proteasomal sau đó, ức chế chức năng p53 [29]. Trong điều kiện căng thẳng, p53 cũng có thể kích hoạt biểu hiện quá mức MDM2, điều này ngược lại ngăn chặn kích hoạt p53 trong vòng phản hồi tiêu cực [30]. Sự ức chế PI3K ngăn chặn sự kích hoạt AKT [31] và quá trình phosphoryl hóa MDM2 trong tim đã được điều hòa trước [32].

Trong bối cảnh này, trước đây chúng tôi đã phát hiện ra rằng điều kiện tiên quyết trong não in vivo đã làm giảm thể tích vùng nhồi máu sau khi tắc động mạch não giữa thoáng qua (tMCAO) bằng cách tăng biểu hiện mức độ protein MDM2. Do đó, phức hợp MDM2–p53 làm suy giảm thiếu máu cục bộ kích hoạt đường truyền tín hiệu p53/PUMA/caspase-3 trong các tế bào thần kinh vỏ não sơ cấp [33].

Ở đây, chúng tôi tìm hiểu vai trò của đường truyền tín hiệu PI3K/AKT trong dung nạp tế bào thần kinh qua trung gian IPC chống lại tổn thương do thiếu máu cục bộ tiếp theo, cũng như cơ chế cơ bản và chúng tôi chủ yếu tập trung vào mối liên hệ tiềm năng giữa kích hoạt AKT và phức hợp MDM2–p53 .

2. Kết quả

2.1. Bảo vệ thần kinh do IPC thúc đẩy

Được trung gian bởi quá trình Phosphoryl hóa AKT tại Ser473, Phosphoryl hóa MDM2 tại Ser166 và Mất ổn định p53 Trước đây chúng tôi đã mô tả tác động của tương tác MDM2–p53 đối với tính nhạy cảm của tế bào thần kinh đối với thiếu máu cục bộ [34] và IT [33]. Ở đây, chúng tôi đã khám phá vai trò tiềm năng của AKT đối với bảo vệ thần kinh qua trung gian IPC với tư cách là một ứng cử viên tham gia vào con đường MDM2–p53.

Đầu tiên, chúng tôi xác nhận rằng thiếu máu cục bộ thúc đẩy kích hoạt AKT trong tế bào thần kinh, bằng chứng là sự phosphoryl hóa AKT tại Ser473. Như được hiển thị trong Hình 1A, OGD ngắn (20 phút) gây ra đáng kể biểu hiện p(Ser473)AKT và MDM2, trong khi mức protein AKT không thay đổi (Hình S1A). Tuy nhiên, quá trình phosphoryl hóa AKT không được quan sát thấy khi các tế bào thần kinh bị OGD kéo dài (90 phút). Ngoài ra, mức protein MDM2 thấp hơn, điều này phù hợp với biểu hiện cao hơn của protein p53 như thể hiện trong Hình 1A.

Sự điều chỉnh lại biểu hiện Mdm2 phụ thuộc vào thời gian sau OGD (Hình 1B) xác nhận rằng thiếu máu cục bộ bán cấp có thể quan trọng để tạo ra các cơ chế ngăn chặn sự ổn định p53 sau OGD, như đã mô tả trước đây [33]. Chúng tôi đã sử dụng OGD ngắn (20 phút) sau đó là 2 giờ tái tạo oxy như một mô hình của IPC (Hình S1B) [33]; do đó, chúng tôi đã phân tích các chiết xuất tế bào thần kinh được thu thập sau 4 giờ tái tạo oxy sau OGD (OGD/R) hoặc sau OGD trước giao thức IPC (IPC cộng với OGD/R). Song song, các tế bào thần kinh được ủ trong cài đặt Normoxia (Nx) hoặc điều kiện tiên quyết (IPC) (Hình S1B).

Như được hiển thị trong Hình 1C và Hình S1C, IPC đã tạo ra sự kích hoạt sớm của AKT, như được tiết lộ bởi quá trình phosphoryl hóa tại Ser473 [35], sau đó là quá trình ổn định và phosphoryl hóa protein MDM2 tại Ser166. IPC cũng ngăn cản quá trình ổn định p53 do OGD/R gây ra (Hình 1C). Thật thú vị, các hình ảnh miễn dịch huỳnh quang thể hiện trong Hình 1D tiết lộ rằng IPC đã thúc đẩy quá trình phosphoryl hóa AKT tại Ser473 trong tế bào thần kinh, phần lớn được tích lũy trong nhân và làm giảm sự ổn định p53 sau OGD/R (IPC cộng với OGD/R) khi so sánh với các tế bào thần kinh không được điều hòa trước (OGD /R).

Do đó, IPC đã ngăn chặn quá trình chết theo chương trình của tế bào thần kinh và kích hoạt caspase-3 do OGD/R gây ra, được đo bằng phương pháp tế bào học dòng chảy (Hình S1D) và xét nghiệm huỳnh quang (Hình S1E), tương ứng. Để xác nhận vai trò của p53 trong bảo vệ thần kinh qua trung gian IPC, chúng tôi đã sử dụng các tế bào thần kinh biểu hiện (loại hoang dã; wt) hoặc không (loại trực tiếp; ko) protein p53. Kết quả của chúng tôi cho thấy các tế bào thần kinh thiếu p53 (Hình S1F) có khả năng chống lại quá trình tự hủy do OGD gây ra cao hơn so với các tế bào thần kinh p53 wt.

Hơn nữa, mức độ chết theo chương trình trong tế bào thần kinh p53KO tương tự như mức độ được quan sát thấy trong tế bào thần kinh wt được điều hòa trước (IPC cộng với OGD/R) (Hình S1G), do đó xác nhận vai trò chính của sự mất ổn định p53 trong bảo vệ thần kinh qua trung gian IPC [33]. Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng IPC gây ra sự bảo vệ thần kinh chống lại sự xúc phạm do thiếu máu cục bộ thông qua cơ chế liên quan đến quá trình phosphoryl hóa AKT tại Ser473, ổn định MDM2 và phosphoryl hóa tại Ser166 và gây mất ổn định p53.

2.2. IPC Kích hoạt Phosphoryl hóa MDM2 tại Ser166 thông qua Con đường PI3K/AKT

Con đường truyền tín hiệu PI3K/AKT có liên quan đến CNTT nơ-ron cả trong ống nghiệm [36] và in vivo [37]. Tuy nhiên, vai trò kích hoạt qua trung gian IPC của con đường PI3K/AKT trong quy định của phức hợp MDM2–p53 vẫn chưa được khám phá. Để làm rõ điều này, các tế bào thần kinh đã được ủ với chất ức chế đặc hiệu và không thể đảo ngược của con đường PI3K/AKT, đó là wortmannin [19].

Như được hiển thị trong Hình 2A, quá trình phosphoryl hóa AKT tăng cường IPC (Ser473) và sự mất ổn định p53 của wortmannin bị hủy bỏ, như được hiển thị trong Hình 1D. Những kết quả này cho thấy mối liên hệ trực tiếp giữa kích hoạt AKT và ức chế quá trình chết theo chương trình của tế bào thần kinh qua trung gian p53- (Hình S1D) và kích hoạt caspase-3 (Hình S1E) gây ra sau OGD/R. Bộ điều chỉnh chính của ổn định p53, MDM2, là mục tiêu của AKT [26], chất này phosphoryl hóa MDM2 ở Ser166 và Ser186 [26]. Ức chế PI3K với wortmannin đã ngăn chặn quá trình phosphoryl hóa của cả (Ser473)AKT và (Ser166)MDM2 do IPC gây ra (Hình 2B).

Sự phosphoryl hóa cụ thể qua trung gian Akt của MDM2 tại Ser166 do IPC gây ra đã được xác nhận bằng cách sử dụng một RNA can thiệp nhỏ (siRNA) được thiết kế đặc biệt để chống lại protein AKT1 (siAkt), được biểu hiện cao trong các tế bào thần kinh vỏ não và hoạt động của nó rất cần thiết cho sự sống sót của tế bào thần kinh sau thiếu máu cục bộ [ 38]. Như được hiển thị trong Hình 3, siAkt đã giảm tổng mức protein AKT và p(Ser473)AKT vào ngày thứ 3 sau khi truyền máu, cả trong các tế bào HEK-293T (Hình 3A) và trong các tế bào thần kinh vỏ não (Hình 3B).

Hơn nữa, việc hạ gục AKT (siAkt) đã ngăn cản quá trình phosphoryl hóa MDM2 (Ser166) (Hình 3B). Những kết quả này chứng minh rằng đường dẫn tín hiệu PI3K/AKT được kích hoạt bởi IPC thúc đẩy quá trình phosphoryl hóa MDM2 tại Ser166, có thể chịu trách nhiệm ổn định MDM2 và hậu quả là mất ổn định p53 sau tổn thương do thiếu máu cục bộ.

2.3. Kích hoạt AKT kích hoạt IPC Ổn định protein hạt nhân MDM2 sau khi thiếu máu cục bộ

Việc kích hoạt AKT có liên quan đến sự chuyển vị nhân của MDM2 trong các tế bào khối u [26]. Xem xét mức độ liên quan của việc ổn định MDM2 hạt nhân đối với sự sống sót của tế bào thần kinh sau khi thiếu máu cục bộ [34] và cụ thể hơn là vai trò bảo vệ thần kinh của nó trong IPC [33], chúng tôi quyết định nghiên cứu thêm về mức độ liên quan của con đường truyền tín hiệu PI3K/AKT trong quy định về nội địa hóa MDM2 dưới tế bào chất đạm.

Do đó, tế bào thần kinh hoặc tế bào HEK-293T đã được thay thế bằng protein2-được gắn thẻ MDM của con người (MDM2-GFP). Các khối đại diện của các tế bào HEK-293T đã được chuyển nhiễm và hình ảnh từ tế bào thần kinh biểu hiện ngoài tử cung protein MDM2 của con người sau bốn điều kiện thí nghiệm khác nhau (Nx, IPC, OGD/R và IPC cộng với OGD/R) được thể hiện trong Hình 4A và Hình S1H , tương ứng.

Sự biểu hiện ngoài tử cung của MDM2- GFP đã xác nhận rằng IPC thúc đẩy sự tích lũy hạt nhân MDM2 so với các tế bào thần kinh thiếu máu cục bộ không được điều hòa trước (OGD/R) hoặc các tế bào thần kinh Normoxic (Nx) (Hình 4A, B), như được tiết lộ bằng cách định lượng tỷ lệ huỳnh quang hạt nhân/tế bào chất (Hình S2B) và cường độ huỳnh quang hạt nhân của MDM2-GFP (Hình S2C).

2.4. IPC thúc đẩy tương tác p(Ser473)AKT và MDM2, giúp tăng cường ổn định MDM2 trong nhân và giảm quá trình chết theo chương trình của tế bào thần kinh do thiếu máu cục bộ

Sau khi chứng minh vai trò của việc kích hoạt con đường PI3K/AKT được tăng cường IPC trong quá trình ổn định hạt nhân của MDM2, chúng tôi đã nghiên cứu thêm xem liệu p(Ser473)AKT và MDM2 có tương tác trong nhân hay không (Hình 6A). Kích thích miễn dịch MDM2 từ chiết xuất protein hạt nhân, sau đó là quá trình tạo miễn dịch mô phỏng chống lại MDM2 và p(Ser473)AKT, tiết lộ rằng IPC đã thúc đẩy sự tương tác giữa p(Ser473)AKT và MDM2, sau OGD/R, do đó ngăn chặn sự ổn định hạt nhân p53 do OGD/R gây ra, như thể hiện trong đầu vào hạt nhân (Hình 6A).

Cuối cùng, chúng tôi đã nghiên cứu tác động bất lợi của sự gián đoạn con đường PI3K/AKT đối với quá trình chết theo chương trình của tế bào thần kinh (Hình 6B). Sự ức chế AKT đã chống lại tác dụng bảo vệ của IPC trước OGD, điều này khẳng định vai trò bảo vệ thần kinh của AKT–MDM2 trong bối cảnh CNTT. Do đó, kết quả của chúng tôi chứng minh rằng IPC gây ra quá trình phosphoryl hóa và kích hoạt AKT, thúc đẩy quá trình phosphoryl hóa MDM2 tại Ser166 và chuyển vị hạt nhân, nơi nó tương tác với p (Ser473) AKT. Cơ chế này có thể góp phần tăng cường ổn định hạt nhân của MDM2, đóng vai trò thiết yếu trong khả năng chịu thiếu máu cục bộ do IPC gây ra.

Làm thế nào để Cistanche bảo vệ tế bào thần kinh?

Có một số bằng chứng cho thấy rằng Cistanche có thể bảo vệ tế bào thần kinh bằng cách giảm quá trình chết theo chương trình (chết tế bào theo chương trình) và thúc đẩy sự sống sót của tế bào thần kinh. Apoptosis là một quá trình tự nhiên xảy ra trong cơ thể để loại bỏ các tế bào bị hư hỏng hoặc không mong muốn, nhưng nó có thể gây hại khi xảy ra quá mức hoặc không phù hợp. Cistanche đã được tìm thấy để ức chế quá trình chết theo chương trình trong các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm và tác dụng này có thể giúp bảo vệ tế bào thần kinh khỏi bị hư hại.

Ngoài ra, Cistanche chứa một số hợp chất hoạt tính sinh học đã được chứng minh là có tác dụng bảo vệ thần kinh. Ví dụ, nó có chứa echinacoside, đã được chứng minh là bảo vệ tế bào thần kinh khỏi stress oxy hóa và viêm nhiễm. Nó cũng chứa acteoside, được phát hiện là có đặc tính chống viêm và chống oxy hóa.

Còn tiếp...

Emilia Barrio 1,†, Rebeca Vecino 1,2,†, Irene Sánchez-Morán 1 , Cristina Rodríguez 1,2,3, Alberto Suárez-Pindado 1 , Juan P. Bolaños 1,2,3,4, Angeles Almeida 1, 2,3 và Maria Delgado-Esteban 1,2,3,*

1 Viện Sinh học Chức năng và Hệ gen, Đại học Salamanca, CSIC, 37007 Salamanca, Tây Ban Nha; emibg7@gmail.com (EB); rebecavecino@usal.es (RV); irene_sm@usal.es (IS-M.); c.rodriguez@usal.es (CR); Alsuap77@gmail.com (AS-P.); jbolanos@usal.es (JPB); aaparra@usal.es (AA)

2 Viện Nghiên cứu Y sinh Salamanca, Bệnh viện Đại học Salamanca, Đại học Salamanca, CSIC, 37007 Salamanca, Tây Ban Nha

3 Khoa Hóa sinh và Sinh học phân tử, Đại học Salamanca, 37007 Salamanca, Tây Ban Nha 4 Centro de Investigación Biomédica en Red de Fragilidad y Envejecimiento Saludable (CIBERFES), Instituto de Salud Carlos III, 28029 Madrid, Tây Ban Nha * Thư từ: mdesteban@usal.es ; Điện thoại: cộng với 34-923-29-4908