Việc học trước nỗi sợ hãi cho phép đồng hóa nhanh chóng những ký ức sợ hãi mới trực tiếp vào mạng lưới vỏ não Phần 3

Thiết kế thử nghiệm

Khả năng tái tạo dữ liệu được đánh giá bằng các lần lặp lại khác nhau (Bảng S1). Các thí nghiệm khử hoạt tính CNQX đầu tiên ở Te2 (Hình 1A–1C) đã được thực hiện với số lần lặp lại cao hơn vì chúng là những thí nghiệm đầu tiên chúng tôi tiến hành và dùng để kiểm tra giả thuyết chính trong nghiên cứu của chúng tôi. Động vật được ưu tiên phân vào các nhóm hành vi khác nhau theo cách cân bằng trọng lượng. Các con đực trong cùng một lứa được phân ngẫu nhiên vào từng nhóm thử nghiệm. Trước tiên, chúng tôi đề cập đến giả thuyết chính trong nghiên cứu của mình, tức là, việc bất hoạt vỏ não có thể ảnh hưởng khác nhau đến việc củng cố ký ức sợ hãi mới ở những con chuột ngây thơ trong thực nghiệm và ở những động vật đã biết về một sự kiện sợ hãi trước đó.

Động vật đực có trí nhớ cực kỳ mạnh mẽ vì chúng có bản năng sinh tồn và ham muốn sinh sản mạnh mẽ hơn. Động vật sống sót trong tự nhiên cần ghi nhớ nhiều thông tin địa lý, loại thức ăn, dấu vết của động vật ăn thịt và vị trí của các thành viên trong nhóm để thích nghi tốt hơn với môi trường và bảo vệ sự sống.

Ví dụ, sư tử đực cần ghi nhớ trạng thái của toàn bộ lãnh thổ, mối quan hệ thành viên và vị trí của các đối thủ cạnh tranh để bảo vệ lãnh thổ và địa vị của chúng. Ngựa vằn đực cần ghi nhớ vị trí nguồn nước và thức ăn trên đồng cỏ để tồn tại và sinh sản. Một công ty nước ngọt từng chạy một quảng cáo cho thấy một con gấu Bắc Cực đực có thể nhớ một thợ lặn và mùi hương độc đáo của anh ta để có thể nhận dạng anh ta vào lần tiếp theo họ nhìn thấy anh ta.

Vì vậy, động vật đực cần có trí nhớ mạnh mẽ về việc bảo vệ lãnh thổ, cung cấp đủ thức ăn và sinh sản cho con cái. Điều này cũng khiến chúng trở thành đối tượng quan trọng trong nghiên cứu của con người, chẳng hạn như để khám phá các bệnh như suy giảm trí nhớ và bệnh Alzheimer.

Trong thế giới loài người, chúng ta cũng có thể lấy cảm hứng từ ký ức của những con vật giống đực. Tiếp xúc liên tục với những điều mới, học hỏi và suy nghĩ không ngừng có thể nâng cao trí nhớ và khả năng thích ứng của chúng ta, đồng thời cải thiện mức sống và hiệu quả làm việc của chúng ta. Vì vậy, chúng ta hãy học hỏi từ những con đực, tiếp tục tích lũy kiến ​​thức và kinh nghiệm, có bản năng sinh tồn và ham muốn sinh sản mạnh mẽ, đồng thời tạo dựng một tương lai tốt đẹp hơn. Có thể thấy rằng chúng ta cần phải cải thiện trí nhớ của mình. Cistanche Deserticola có thể cải thiện trí nhớ đáng kể vì Cistanche Deserticola là một dược liệu cổ truyền của Trung Quốc với nhiều tác dụng độc đáo, một trong số đó là cải thiện trí nhớ. Hiệu quả của thịt băm đến từ các hoạt chất khác nhau có trong nó, bao gồm axit, polysacarit, flavonoid, v.v. Những thành phần này có thể tăng cường sức khỏe não bộ theo nhiều cách khác nhau.

Bấm vào biết cách cải thiện chức năng não

Trong trường hợp có sự khác biệt thống kê giữa các nhóm này, cuối cùng chúng tôi đã thực hiện các nhóm đối chứng bổ sung thông qua việc tiêm nước muối. Một cách tiếp cận tương tự đã được áp dụng cho các thí nghiệm quang sinh học, trong đó nhóm kiểm soát AAV chỉ được thực hiện sau khi phát hiện ra sự khác biệt thống kê giữa những con chuột ngây thơ và những con chuột được huấn luyện trước đó. Những lịch trình thí nghiệm này cho phép chúng tôi tránh các nhóm kiểm soát không cần thiết và việc sử dụng động vật không cần thiết, một vấn đề then chốt trong luật pháp Châu Âu và Ý về thí nghiệm trên động vật (nguyên tắc 3 Rs).

Thủ tục hành vi

Tất cả các thí nghiệm được tiến hành trong giai đoạn ánh sáng trong ngày (8 giờ sáng đến 4 giờ chiều). Động vật được vận chuyển riêng lẻ từ cơ sở đến các phòng thí nghiệm trong các thùng nhỏ trong suốt khác nhau tùy theo nhu cầu thí nghiệm.

Huấn luyện thính giác: Buổi học hành vi đầu tiên. Động vật có thính giác sợ hãi (CS1-CS2). Ở nhóm này, chuột được nhẹ nhàng đưa ra khỏi chuồng và mang từ phòng ở sang phòng cách âm. Khi đến đó, động vật được đặt bên trong thiết bị điều hòa bao gồm một cái lồng màu đen hình chữ nhật (35 × 40 cm) được trang bị lưới thanh thép không gỉ (đường kính 1 cm, cách nhau 1,5 cm) được kết nối với thiết bị truyền sốc.

Chuột được để yên trong 1 phút. Sau thời gian này, 7 kích thích có điều kiện (CS) bao gồm âm thuần tần số 15 kHz (mỗi kích thích có thời lượng 15 giây, 8 0 dB, khoảng thời gian thử nghiệm 36 giây) đã được sử dụng. 1 giây cuối cùng của mỗi âm được ghép với tín hiệu US đau đớn (0,5 mA, 1 giây). Kết thúc đợt biệt dưỡng, chuột được đưa về chuồng nuôi.

Động vật chỉ sốc (shock-CS2). Trong nhóm này, chuột được đặt tương tự bên trong cùng một thiết bị điều hòa. Ngay sau đó, mỗi con chuột phải chịu 7-những cú sốc ở chân (1 giây, 0,5 mA) ngay sau con kia. Khi kết thúc quá trình kích thích, các con vật được đưa về chuồng của chúng. Thời gian tồn tại trong lồng dưỡng ít hơn 9 giây. Các nghiên cứu trước đây cho thấy quy trình này cho phép tránh các quá trình liên kết giữa kích thích đau đớn và kích thích giác quan [29,30].

Động vật sợ mùi (odor-CS2). Trong nhóm này, chuột được đặt bên trong cùng một chiếc lồng màu đen hình chữ nhật được sử dụng trong các nhóm thử nghiệm ở trên và được kết nối với thiết lập phân phối sốc. Chuột được để yên trong 2 phút. Sau thời gian này, 7 CS bao gồm mùi vani đã được sử dụng (mỗi CS có thời lượng 10 giây, khoảng thời gian dùng thử 24 giây). 1 giây cuối cùng của mỗi mùi được ghép với một US đau đớn (0,5 mA, 1 giây). Mô-đun điều hòa được đặt gần nguồn thông gió để tránh sự tồn tại của các kích thích được truyền đi sau khi chúng được bù lại. Lồng được đảm bảo bằng lưới phía trên. Mùi được thể hiện bằng máy đo khứu giác pha loãng dòng chảy. Không khí sạch (1,5 L/phút) được dẫn đến van điện từ, khi vận hành sẽ đưa không khí vào chai 15 ml chứa 10 ml mùi vani.

Động vật chỉ có giai điệu (Tone-CS2). Những con chuột trong nhóm này được đặt trong cùng một chiếc lồng đen và được cung cấp âm 15-kHz (7 kích thích, thời lượng 15 giây, ITI 36 giây) được cung cấp khi không có Hoa Kỳ.

Động vật được tiếp xúc trước (Tone-CS1-CS2). Chuột được đặt bên trong lồng điều hòa và 1 phút sau, chúng được phát 20 lần chỉ với âm 15-kHz và 24 giờ sau, âm tương tự được ghép nối với việc Hoa Kỳ trở thành CS1.

Động vật sợ tiếng ồn trắng (WN-CS2). Trong nhóm này, chuột được đặt bên trong chiếc lồng màu đen hình chữ nhật và để yên trong 1 phút. Sau thời gian này, 7 CS bao gồm một WN (mỗi CS có thời lượng 15 giây, 75 dB, khoảng thời gian thử nghiệm xen kẽ 36 giây) đã được quản lý. 1 giây cuối cùng của mỗi âm được ghép với một nhịp US đau đớn (0,5 mA, 1 giây). Kết thúc đợt biệt dưỡng, chuột được đưa về chuồng nuôi.

Học về nỗi sợ thính giác: Huấn luyện hành vi thứ hai. Hai tuần sau các quy trình được mô tả ở đoạn trên, động vật được huấn luyện trong một nhiệm vụ điều hòa nỗi sợ hãi thính giác khác. Chuột được đặt trong hộp lột da tiêu chuẩn, như trong công việc trước đây của chúng tôi [10] và để yên trong 2 phút. Sau thời gian này, 7 CS bao gồm các âm thuần có tần số 3 kHz (mỗi âm có thời lượng 8 giây, 80 dB, khoảng thời gian thử nghiệm 22 giây) đã được phân phối. 1 giây cuối cùng của mỗi âm được ghép với tín hiệu US đau đớn (0,5 mA, 1 giây). Kết thúc đợt biệt dưỡng, chuột được đưa về chuồng nuôi.

Sợ lưu giữ trí nhớ. Khả năng lưu giữ ký ức sợ hãi thính giác gần đây thu được từ CS2 (3 kHz) đã được kiểm tra 4 ngày sau đó. Đối với các thí nghiệm quang di truyền học, việc kiểm tra trí nhớ gần đây đã được thực hiện bằng cách phân phát tia laser 24 giờ sau khi CS2-US học hỏi tương tự như khoảng thời gian mà chúng tôi thực hiện bất hoạt vỏ não thông qua việc sử dụng CNQX (tức là 24 giờ sau đào tạo). Chuột được làm quen với một thiết bị khác với thiết bị dùng để điều hòa và được đặt trong một phòng khác để tránh hành vi sợ hãi có điều kiện đối với các tín hiệu theo ngữ cảnh [10,62].

Thiết bị mới bao gồm một lồng nhựa trong suốt với mặt sơn đen được đặt trong hộp giảm âm được trang bị quạt hút, giúp loại bỏ không khí có mùi ra khỏi vỏ và tạo ra tiếng ồn xung quanh 60 dB. Động vật được phép khám phá chuồng trong 5 phút mỗi ngày trong thời gian làm quen. Vào ngày kiểm tra khả năng duy trì trí nhớ về nỗi sợ hãi, sau 2 phút khám phá miễn phí, chúng tôi đã cung cấp 4 CS2 tần số 3 kHz (8 giây—22 ITI) mà không có bất kỳ Hoa Kỳ nào theo sau.

Sau đó, nếu nhu cầu thử nghiệm yêu cầu, chuột sẽ được kiểm tra khả năng lưu giữ ký ức sợ hãi từ xa, thu được 2 tuần trước thử nghiệm điều hòa nỗi sợ hãi thính giác thứ hai. Để đạt được mục tiêu này, 7 ngày sau cuộc kiểm tra khả năng duy trì trí nhớ sợ hãi ở âm 3-kHz, động vật được đưa vào một môi trường mới (lồng sọc đen trắng) và sau đó tiếp xúc với âm 15-kHz. Bốn âm được trình bày cách nhau 36 giây.

Đào tạo theo ngữ cảnh: Buổi học hành vi đầu tiên. Nhóm điều hòa nỗi sợ hãi theo ngữ cảnh (CtxA-CtxB). Ở nhóm này, chuột được nhẹ nhàng đưa ra khỏi chuồng, cho vào xô rồi mang từ phòng ở sang phòng cách âm. Khi đến đó, động vật được đặt bên trong thiết bị điều hòa bao gồm lồng màu đen hình chữ nhật nói trên, được trang bị lưới thanh thép không gỉ được kết nối với thiết lập phân phối sốc. Chuột được để yên trong 1 phút. Sau thời gian này, 5 US (0,5 mA, 1 giây) được quản lý với khoảng thời gian 51 giây. Kết thúc buổi học, các con vật được đưa về chuồng về nhà.

Nhóm chỉ sốc (shock-CtxB). Những con chuột sau khi được đặt bên trong thiết bị điều hòa sẽ ngay lập tức nhận được 5-những cú sốc ở chân (1 giây, 0,5 mA) ngay sau con kia. Thời gian tồn tại trong lồng điều hòa chưa đến 7 giây. Các nghiên cứu trước đây cho thấy quy trình này cho phép tránh các quá trình liên kết giữa kích thích đau đớn và kích thích giác quan [29,30].

Nhóm chỉ sốc (shock-CtxB). Những con chuột sau khi được đặt bên trong thiết bị điều hòa sẽ ngay lập tức nhận được 5-những cú sốc ở chân (1 giây, 0,5 mA) ngay sau con kia. Thời gian tồn tại trong lồng điều hòa chưa đến 7 giây. Các nghiên cứu trước đây cho thấy quy trình này cho phép tránh các quá trình liên kết giữa kích thích đau đớn và kích thích giác quan [29,30].

Điều kiện sợ hãi theo ngữ cảnh mới và khả năng lưu giữ ký ức sợ hãi gần đây. Hai tuần sau các quy trình được mô tả trong đoạn trên, tất cả các nhóm được đào tạo để liên kết môi trường ngữ cảnh mới (mô-đun hộp skinner, được đặt trong một phòng khác) với US đau đớn (0,5 mA, 1 s) . Mỗi con vật được đặt bên trong buồng mới và để yên trong 2 phút. Sau đó, nó được chiếu tới 5 sóng US cách nhau 30 giây.

Khả năng lưu giữ ký ức sợ hãi theo ngữ cảnh đã được kiểm tra 4 ngày sau quy trình điều hòa nỗi sợ hãi bằng cách đưa chuột lại vào buồng hộp Skinner trong 3 phút. Đối với các thí nghiệm quang sinh học, việc kiểm tra trí nhớ gần đây đã được thực hiện bằng cách phân phối tia laser 24 giờ sau khi học CtxB-US tương tự như khoảng thời gian mà chúng tôi thực hiện bất hoạt vỏ não thông qua việc sử dụng CNQX (tức là 24 giờ sau khi đào tạo). Sau đó, nếu nhu cầu thử nghiệm yêu cầu, chuột sẽ được kiểm tra khả năng lưu giữ ký ức sợ hãi từ xa bằng cách đặt động vật vào bối cảnh được ghép nối với Hoa Kỳ 2 tuần trước khi kết hợp mới.

Động vật được mang vào 2 thùng khác nhau đến buồng điều hòa theo các quy trình bối cảnh khác nhau.

Biện pháp đóng băng. Trong tất cả các quy trình thử nghiệm, việc đánh giá khả năng duy trì ký ức sợ hãi được xác định là phản ứng đóng băng [10], được phân tích là hoàn toàn không có khả năng di chuyển của cơ thể ngoại trừ các cử động hô hấp. Đối với mỗi con vật, lượng thời gian (tính bằng giây) dành cho quá trình đóng băng được đo ngoại tuyến bởi 2 người quan sát độc lập không biết về các nhóm động vật.

Quy trình phẫu thuật

Để sử dụng các chất đã chọn tại các vị trí mục tiêu, chuột được gây mê bằng isoflurane: Quá trình cảm ứng được thực hiện ở mức 4% [vol/vol] trong 2 L/phút không khí y tế và kéo dài đến mức phơi nhiễm liên tục ở mức 2% [vol/vol]) khi chuột được gắn vào thiết bị định vị lập thể.

Một vết mổ trên hộp sọ đã được thực hiện và các lỗ khoan nhỏ được khoan để cho phép kim truyền 28-có thước đo xuyên qua. Một ống tiêm 10-ul Hamilton gắn trên máy bơm tiêm truyền được sử dụng để phân phối chất. Sau khi truyền, kim được giữ nguyên tại chỗ thêm 3 phút. Vết mổ sau đó được đóng lại bằng kẹp vết thương bằng thép không gỉ và con vật được tiêm dưới da thuốc giảm đau/chống viêm ketoprofen (2 mg/kg trọng lượng cơ thể), và con vật được giữ ấm và được theo dõi cho đến khi hồi phục sau khi gây mê.

Như trong các nghiên cứu trước đây [10,32–34], việc tiêm tĩnh mạch vào động vật là không cần thiết, với các hợp chất hoạt tính được sử dụng trực tiếp theo phương pháp lập thể. Thủ tục này thuận lợi vì tránh được chấn thương phẫu thuật vốn có của thủ thuật đặt ống thông vĩnh viễn, do đó hạn chế chấn thương khi đâm một kim duy nhất [10,32–34]. Thật vậy, gây mê toàn thân không ảnh hưởng đáng kể đến việc củng cố trí nhớ [10,32–34]. Để đảm bảo rằng thời gian sử dụng hợp chất liên quan đến thử nghiệm học tập là chính xác để chuột nhận được các hợp chất đã chọn trong khoảng 1 giờ và khoảng 1 ngày sau khi huấn luyện, gây mê bằng isoflurane được gây mê 5 phút trước thời điểm tiêm theo kế hoạch, ví dụ: lúc 55 tối thiểu ở chuột được tiêm 60 phút sau khi huấn luyện và 23 giờ 55 phút ở động vật được tiêm vào lúc 24 giờ sau khi huấn luyện. Mỗi con chuột được điều hòa và sau đó được vận hành riêng biệt. Động vật thuộc các nhóm hành vi khác nhau bị thao túng theo cách xen kẽ.

Chất ức chế chọn lọc các thụ thể AMPA/kainate glutamate CNQX ({{0}}Cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione) (Tocris, 10 ng /ul) [20,21] được hòa tan trong dung dịch muối vô trùng (NaCl, 0.9%) và điều chỉnh đến độ pH 7,4 bằng HCl. Chất ức chế tổng hợp protein anisomycin (Merck, 125 ug/ul) được hòa tan trong HCl cân bằng mol, pha loãng với nước muối vô trùng và điều chỉnh đến pH 7,4 bằng NaOH. Nước muối vô trùng (NaCl 0,9%) được sử dụng làm chất kiểm soát phương tiện. Các chất này được tiêm hai bên với tốc độ 0,1 ul/phút và thể tích 0,5 ul trên mỗi vị trí ở tọa độ lập thể sau được lấy từ tập bản đồ Paxinos và Watson [26], với trường vỏ não Te2 được tham chiếu đến tập bản đồ Zilles [25]:

Vỏ não thính giác thứ cấp (Te2): 1) AP: −5,8 L: ±7,2 DV: −6. 2) AP: -6,8 L: ±7,2 DV: −6.

Vỏ não vành trước (ACC): 1) AP: +2,5 L: ±0,6 DV: −2,2. 2) AP: +3,7 L: ±0,6 DV: −2,2.

Thể tích tiêm (0,5 ul mỗi vị trí) đã được chọn dựa trên các nghiên cứu trước đây trong đó các hợp chất hoạt tính được tiêm vào Te2 [10,34] và ACC [55,63] ở chuột trưởng thành.

Để làm bất hoạt vùng hồi hải mã phía sau, các hợp chất hoạt động được tiêm với thể tích 0,6 ul trên mỗi vị trí ở tọa độ định vị sau:

Vùng lưng đồi thị: 1) AP: −2,8 L: ±1,6 DV: −3,3. 2) AP: −4,2 L: ±2,6 DV: −3.

Các tổn thương không thể phục hồi của vùng đồi thị lưng được gây ra bằng cách sử dụng NMDA (Tocris, 18 ug/ul, hòa tan trong dung dịch muối vô trùng, 0,4 ul mỗi vị trí) với tốc độ 0.1 ul/ min tại các điểm ở tọa độ nói trên. Các tọa độ tương tự đã được sử dụng cho các biện pháp kiểm soát được tiêm nước muối và động vật được vận hành giả.

Retrobead đỏ (Lumafluor, pha loãng 1:2 trong nước muối, 0.6 ul) được tiêm vào BLA theo tọa độ sau: AP: −2,8; L: ±5,4; ĐV: −8,3.

Khi kết thúc thí nghiệm, các vết kim trong trường hợp tiêm CNQX, anisomycin hoặc nước muối hoặc sự mở rộng của tổn thương trong trường hợp tiêm NMDA đã được xác minh về mặt mô học. Chuột được gây mê sâu và được tưới máu nội tâm bằng 4% formaldehyde. Bộ não của họ được cắt ở mức 30 μm trên máy điều hòa nhiệt độ. Các phần nối tiếp nhuộm Nissl được chuẩn bị bằng quy trình thông thường và các phần được xác minh về mặt mô học dưới kính hiển vi phóng đại 2, 5 ×.

Thí nghiệm quang sinh

Tiêm virus. Vi-rút liên quan đến adeno AAV5:CaMKII ::eNpHR3.0-cherry và vectơ kiểm soát AAV5:CaMKII -cherry được lấy từ Lõi Vector của Đại học Bắc Carolina (Chapel Hill, Bắc Carolina, Hoa Kỳ). Câu nàyViraltiterwas5:8 Hiệu giá vi-rút là 5,8 × 10^12 vg/ml đối với cả hai loại vi-rút. Việc sử dụng chất kích thích CaMKII cho phép biểu hiện gen chuyển có lợi cho các tế bào thần kinh hình chóp. Virus được đặt trong tủ đông −80˚C. Việc truyền virut nhắm vào Te2 hoặc ACC được thực hiện ở tọa độ lập thể ở trên với thể tích 0,5 ul cho mỗi lỗ. Virus được tiêm với tốc độ 0,1 ul/phút và kim được giữ nguyên tại chỗ thêm 5 phút. Việc tiêm virus được thực hiện 4 tuần trước khi thí nghiệm quang sinh học.

Chiếu sáng.

Các sợi quang (Plexon, lõi 200/230 μm; chiều dài 10 mm) được cấy hai bên trong BLA (AP=−2,8, L=± 5,4, V=−8,2 mm từ bregma). Sự ức chế quang sinh của các phép chiếu Te2 đối với BLA hoặc của các phép chiếu ACC đối với BLA đã đạt được bằng cách sử dụng Hệ thống kích thích quang học PlexBright kết hợp với một diode laser (Công nghệ Laserglow). Ánh sáng vàng (589 nm) được tạo ra và truyền qua sợi quang. Mật độ công suất ước tính ở đầu sợi quang là 10 đến 15 mW để chiếu sáng các vị trí chiếu. Trong quá trình lưu giữ ký ức về nỗi sợ hãi, quá trình phát ánh sáng được bắt đầu 4 giây trước khi phát ra âm, tồn tại trong suốt âm và dừng lại 4 giây sau khi bù âm. Động vật thuộc nhóm điều hòa nỗi sợ hãi theo ngữ cảnh nhận được sự kích thích ánh sáng trong toàn bộ quá trình khám phá bối cảnh (3 phút). Chuột được làm quen với dây vá trong 2 ngày trước khi thử nghiệm duy trì trí nhớ.

Hóa mô miễn dịch. Sau khi hoàn thành các thí nghiệm quang di truyền, chuột được gây mê sâu và tưới máu nội tâm với 4% PAF để kiểm tra sự khuếch tán của virus. Não được mổ xẻ, bảo quản qua đêm ở nhiệt độ 4˚C và cuối cùng được chuyển sang 30% sucrose. Các phần vành (30 m) được cắt trên bộ điều hòa nhiệt độ và thu thập trong PBS. Các phần nổi tự do được ủ trong dung dịch chặn trong 1 giờ tại RT. Sau đó, chúng được ủ trong kháng thể kháng mCherry đơn dòng sơ cấp của chuột (độ pha loãng 1:500, Abcam) trong dung dịch ngăn chặn qua đêm tại RT. Sau đó, các phần được rửa bằng PBS và ủ trong 1 giờ tại RT bằng kháng thể chống chuột AlexaFluor-568 huỳnh quang thứ cấp (1:600, Invitrogen) được pha loãng trong PBS. Các phần được rửa trong PBS, được gắn với phương tiện gắn có chứa DAPI (Vector) và lớp phủ.

Não của những con chuột được tiêm NMDA cũng được thu thập tương tự. Các phần nổi tự do, sau vài lần rửa, được ủ bằng kháng thể đơn dòng sơ cấp chống chuột Neun (pha loãng 1: 1, 000, Merck) trong dung dịch chặn qua đêm ở nhiệt độ phòng. Sau đó, các phần được rửa bằng PBS và ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng bằng kháng thể chống chuột đánh dấu biotin cho ngựa (pha loãng 1:2{13}}0, Vector). Phức hợp avidin-biotin (phức hợp ABC 1:100, Vector, 2 giờ rưỡi ủ) được ghép với diaminobenzidine (0,03%, Merck) để nhuộm Neun. Sau đó, các phần được rửa trong PBS và chuyển sang các phiến được phủ gelatin, khử nước và phủ một lớp phủ.

Các phần Te2 của chuột được tiêm hạt retro đã trải qua quá trình ủ với kháng thể kháng Fos đa dòng sơ cấp của thỏ (1:2,000, Tín hiệu tế bào) trong dung dịch ngăn chặn qua đêm tại RT. Sau đó, các lát cắt được rửa bằng PBS và ủ trong 1 giờ tại RT với chất chống thỏ Alexa 488 (1:1,000, Invitrogen, trong PBS). Cuối cùng, các phần được dán nhãn miễn dịch được rửa trong PBS, gắn trên các phiến được phủ gelatin và được phủ bằng môi trường gắn bổ sung DAPI.

kính hiển vi

Việc ghi nhãn mCherry được kiểm tra bằng kính hiển vi đồng tiêu Zeiss Airyscan: Hai tia laser được sử dụng (405 và 561 nm), mỗi tia tương ứng với phổ phát xạ cực đại cho DAPI (nhuộm Nissl cho nhân tế bào) và Alexa 568 (mCherry ), tương ứng. Để phân tích sự khuếch tán của vi-rút tại các vị trí tiêm, ảnh vi mô của Te2 và ACC được thu dưới dạng hình ảnh khảm (mỗi ảnh đơn lẻ được thu được bằng cách sử dụng vật kính 10 ×). Các đầu sợi trục vào BLA được phân tích bằng cách sử dụng vật kính 40 × làm ngăn xếp z gồm 10 phần, cách nhau 1 μm (vuông 159 μm; tỷ lệ thu phóng, 1.0).

Đối với động vật được tiêm retrobead đã trải qua quá trình dán nhãn miễn dịch cFos, hình ảnh được thu được ở độ phóng đại 40× (159 μm vuông; tỷ lệ thu phóng, 1.0) bằng 3 tia laser khác nhau, tương ứng với phổ phát xạ cực đại tương ứng cho DAPI (vết Nissl cho nhân tế bào), AlexaFluor 488 (cFos) và Texas Red (Retrobeads). Các phần có kích thước 0,7 μm được thu thập dọc theo ngăn xếp z 10-μm. Số lượng hạt nhân biểu hiện cFos, được gắn nhãn hạt và dương tính kép (hạt cFos+ được dán nhãn) đã được định lượng cho từng động vật trong vùng Te2 ở tọa độ trước sau từ 6,7 đến 7,3 mm tính từ bregma [10]. Dữ liệu sau đó được tính trung bình để tạo ra giá trị trung bình của từng con vật và kết quả được so sánh về mặt thống kê. Hình ảnh các phần được nhuộm DAB của Neun được phân tích bằng phần mềm Neurolucida được kết nối với kính hiển vi thông qua camera CCD màu [10].

Tiêu chí phân tích và loại trừ dữ liệu

N cho mỗi nhóm được thiết lập tiên nghiệm theo các nghiên cứu trước đây của chúng tôi [10,16,17], các công trình đã được xuất bản trước đây trong lĩnh vực này (xem phần tài liệu tham khảo cho ACC [6,22,55] và Te2 [10,59]), và thông qua ước tính G-power theo bảng sau (Bảng 1):

Đối với mỗi phân tích, chúng tôi ước tính số lượng trung bình cuối cùng từ 8 đến 10 con cho mỗi nhóm. Các nhóm được thực hiện với các biện pháp kiểm soát nội bộ trong cùng một phiên thử nghiệm (Bảng S1). Do sự thay đổi của các thủ tục phẫu thuật và hành vi, chúng tôi đã đưa vào một số lượng lớn hơn các đối tượng thử nghiệm (nhiều hơn tới 15%) trong một số trường hợp đáp ứng các tiêu chí thử nghiệm và được đưa vào, do đó tránh được việc loại trừ tùy tiện. Trong trường hợp nghiên cứu hồi hải mã, để đánh giá tác động của việc tiêm NMDA và CNQX trong các khoảng thời gian khác nhau, chúng tôi đã cân bằng tổng số động vật đối chứng giữa xe và chuột vận hành giả giữa các nhóm khác nhau.

Phân tích hành vi, kiểm tra mô học và số lượng tế bào được thực hiện một cách mù quáng. Các động vật có vị trí không đầy đủ của đường kim hoặc tổn thương trong trường hợp tổn thương không thể phục hồi bằng NMDA đã bị loại khỏi phân tích dữ liệu (Bảng S1). Trong các nghiên cứu dược lý, chúng tôi đã loại trừ 57 con vật trên tổng số 465 con vật do đặt kim không chính xác (22/255 đối với Te2, 31/179 đối với ACC và 4/31 đối với đồi hải mã). Trong các nghiên cứu theo dõi, trên 21 loài động vật, chúng tôi đã loại bỏ 3 đối tượng trong đó việc tiêm retrobead không đạt được BLA. Trong các nghiên cứu về quang di truyền Te2, trên tổng số 30 loài động vật, chúng tôi đã loại trừ 1 con chuột vì vị trí của các sợi quang không cao hơn vùng mục tiêu, 1 con chuột. Rốt cuộc, virus không có ở Te2 và 2 con chuột vì mức độ khuếch tán của virus lần lượt nhỏ hơn 4,7% và 5,3% diện tích Te2 tại vị trí tiêm. Ở những con chuột được đưa vào phân tích thống kê, mức độ khuếch tán virus tối thiểu là 39,6% ở tọa độ lập thể phía trước hơn và 50,2% ở tọa độ lập thể phía sau hơn.

Tương tự, trong các thí nghiệm di truyền quang học của ACC, trên tổng số 32 con vật, 2 con chuột đã bị loại vì vị trí của các sợi quang không cao hơn vùng mục tiêu. Hai con chuột đã bị loại vì vi-rút trong ACC không có, 1 con vì vi-rút xâm nhập vào vỏ não vận động thứ cấp liền kề và 1 con chuột do vi-rút khuếch tán nhỏ hơn 2,3% diện tích ACC tại vị trí tiêm. Ở những con chuột còn lại, mức độ khuếch tán virus tối thiểu là 33,3% ở tọa độ lập thể phía trước hơn và 42,2% ở tọa độ phía sau hơn.

Trong các nghiên cứu về tổn thương NMDA, các tổn thương chủ yếu nhắm vào vùng CA1 của vùng lưng đồi thị. Mức độ lan rộng tối thiểu (màu đỏ) và tối đa (màu hồng) của các tổn thương vùng đồi thị trên toàn bộ khu vực vùng lưng đồi thị lần lượt là 23,2% và 53,5% ở tọa độ lập thể phía trước nhiều hơn và 28,3% và 62,3% ở tọa độ phía sau hơn. Trong tổng số 73 con vật, 4 con chuột đã bị loại vì không có tổn thương, trong khi thêm 3 con nữa bị loại bỏ vì mức độ lan rộng của vết thương nhỏ hơn 5.0% (cụ thể là 4,8%, 4,3%, 3,1 %) liên quan đến vùng hồi hải mã ở 2 tọa độ.

Phân tích đường viền khu vực được thực hiện thông qua kiểm tra trực quan và định lượng thủ công bằng công cụ đường viền vùng của phần mềm ZEN 3.0. Giá trị diện tích sau đó được chuẩn hóa trên tổng diện tích của khu vực. Các tọa độ định vị lập thể của Te2, ACC và hải mã được dựa trên tập bản đồ Paxinos [26] và, trong trường hợp của Te2, với trường vỏ não được tham chiếu đến tập bản đồ Zilles [25].

Phân tích thống kê

Tất cả dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± SEM. Tất cả dữ liệu đều vượt qua bài kiểm tra của Levene về sự bằng nhau của phương sai. Do đó, thống kê tham số đã được sử dụng trong tất cả các thí nghiệm. Dữ liệu từ 2 nhóm được so sánh bằng cách sử dụng 2-bài kiểm tra t của Học sinh không ghép đôi theo đuôi. So sánh nhiều nhóm được đánh giá bằng cách sử dụng bài kiểm tra ANOVA 1-với bài kiểm tra hậu kiểm của Tukey. Để giải quyết sự khác biệt giữa và trong các nhóm, chúng tôi đã tính toán mô hình ANOVA thiết kế hỗn hợp 3 × 2 với một nhóm (CS1-CS2, Tone-CS1-CS2, WN-CS2) làm giữa- biến chủ thể và điều kiện (trước và sau điều kiện +tiêm gần đây) là biến bên trong chủ thể. Khi tương tác điều kiện nhóm × là đáng kể, chúng tôi đã thực hiện phân tích tác động chính đơn giản và chúng tôi điều chỉnh từng giá trị p bằng hiệu chỉnh Bonferroni. Đối với mỗi mô hình ANOVA hỗn hợp, chúng tôi đã đánh giá giả định về Độ cầu thông qua Kiểm tra độ cầu của Mauchly.

Các tham số thống kê (nghĩa là giá trị chính xác của n cho mỗi nhóm, SEM, kiểm tra thống kê, kích thước hiệu ứng và giá trị p chính xác) được báo cáo trong truyền thuyết. Đối với các kích thước mẫu bằng nhau, kích thước hiệu ứng cho các thử nghiệm t không ghép đôi được xác định bằng cách tính toán Cohen's d hoặc Glass's d theo độ giống nhau của SD trong khi đối với các kích thước mẫu khác nhau, Hedges'g. Mối tương quan giữa số lượng tế bào và đông lạnh được tính toán bằng hệ số Pearson. Để xác định xem dữ liệu có đáp ứng các giả định của phương pháp thống kê hay không, chúng tôi đã bác bỏ giả thuyết không ở mức P < 0.05. Tất cả các phân tích thống kê được thực hiện bằng SPSS Statistic 22 (IBM).

Thông tin hỗ trợ

S1 Hình. Độ phóng đại của các rãnh kim của vỏ não Te2 (A) và ACC (B) được tiêm CNQX, được chọn làm ví dụ. (C) Khi được trình bày trong cùng bối cảnh 2 tuần sau quy trình, động vật chỉ bị sốc cho thấy phản ứng sợ hãi ở mức độ thấp, chứng tỏ rằng quy trình không gây ra hiện tượng đóng băng có điều kiện trong bối cảnh xảy ra sốc. (D) Các kết quả tương tự như trong Hình 1 thu được bằng cách cân bằng đối trọng 2 âm được sử dụng làm CS (CS1, 3 kHz và CS2, 15 kHz) (Bài kiểm tra t của sinh viên, t(14)=3.44, p {{ 13}}.0040, Glass's d=4.14). (E) Ở những con chuột được điều hòa mùi-CS, khả năng đóng băng trước mùi, 2 tuần sau khi điều hòa, ở mức cao ngay cả khi được thử nghiệm trong một môi trường khác liên quan đến bối cảnh điều hòa, qua đó cho thấy rằng nỗi sợ hãi có liên quan cụ thể đến việc đưa ra tín hiệu này. Thanh tỷ lệ, 300 m. ��P < 0,01. Tất cả dữ liệu là giá trị trung bình và SEM. Có thể tìm thấy dữ liệu tóm tắt cho Hình S1 trong thông tin hỗ trợ trong tệp có tên Dữ liệu Hình hỗ trợ S1. (TIF)

S2 Hình. Việc tiêm CNQX làm suy giảm khả năng lưu giữ ký ức sợ hãi thính giác gần đây ở chuột khi khả năng khái quát hóa nỗi sợ hãi bị giảm xuống chỉ bằng một âm báo trước khi tiếp xúc hoặc bằng cách sử dụng âm nhiễu trắng như CS1. ANOVA thiết kế hỗn hợp 3 × 2 (tác dụng chính của nhóm: F(2,42)=6.478, p {{10}}.00 4, η2=0.236, tác dụng chính của điều kiện: F(1,42)=0.161, p=0.691, η2=0.004, nhóm × tương tác điều kiện F(2,42)=3.942, p=0.027, η2=0.158) cho thấy rằng việc đóng băng ở âm 3 kHz trước khi liên kết với Hoa Kỳ thấp hơn ở động vật nhận được âm thanh 15 kHz trước khi ghép nối 15 kHz-US (n=10, p=0.001) hoặc ở chuột được điều hòa với tiếng ồn trắng (n=13 , p=0.008) so với động vật CS1-CS2 (n=22) cho thấy phản ứng khái quát hóa nỗi sợ hãi có thể thay đổi. Tuy nhiên, sau khi học CS-US và tiêm cnqx vào vỏ não Te2, trí nhớ sợ hãi gần đây bị suy giảm ở tất cả các nhóm (p > 0,05). Hiệu ứng chính đơn giản trong các nhóm (trước và sau khi học CS-US, sau đó là chèn cnqx): CS1-CS2, p=0.025; Giai điệu-CS1-CS2, p=0.189; WN-CS2, p=0.347) �P < 0,05, ��P < 0,01. Tất cả dữ liệu là giá trị trung bình và SEM. Có thể tìm thấy dữ liệu tóm tắt cho Hình S2 trong Thông tin hỗ trợ trong tệp có tên Dữ liệu hình hỗ trợ S1. (TIF)

S3 Hình. (A) Ví dụ ngẫu nhiên về việc tiêm retrobead nhắm mục tiêu BLA. (B và C) Ví dụ về vị trí sợi quang phía trên BLA của động vật được tiêm vectơ AAV trong vỏ não Te2 (B) và ACC (C). Thanh tỷ lệ, 500 m.

Sự nhìn nhận

Chúng tôi cảm ơn Tiến sĩ E. Manassero vì sự hỗ trợ và lời khuyên liên tục của họ.

Sự đóng góp của tác giả

Khái niệm hóa: Giulia Concina, Annamaria Renna, Benedetto Sacchetti.

Giám tuyển dữ liệu: Giulia Concina, Luisella Milano, Benedetto Sacchetti.

Phân tích chính thức: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Mua lại tài trợ: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Điều tra: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Phương pháp: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Giám sát: Benedetto Sacchetti.

Xác nhận: Benedetto Sacchetti.

Viết – bản thảo gốc: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Viết – phê bình & biên tập: Annamaria Renna, Luisella Milano.

Người giới thiệu
1. Frankland PW, Bontempi B. Việc tổ chức những ký ức gần đây và xa xôi. Nat Rev Neurosci. 2005; 6:119–130. https://doi.org/10.1038/nrn1607 PMID: 15685217

2. Dudai Y. Sinh học thần kinh của sự hợp nhất, hay engram ổn định đến mức nào? Annu Rev Tâm lý. 2004; 55:51–86. https://doi.org/10.1146/annurev.psych.55.090902.142050 PMID: 14744210

3. Squire LR, Genzel L, Wixted JT, Morris RG. Hợp nhất trí nhớ. Phối cảnh Harb mùa xuân lạnh Biol. 2015; 3:7. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021766 PMID: 26238360

4. Alvarez P, Squire LR. Hợp nhất trí nhớ và thùy thái dương giữa: một mô hình mạng đơn giản. Proc Natl Acad Sci US A. 1994; 91:7041–7045. https://doi.org/10.1073/pnas.91.15.7041 PMID: 8041742

5. McClelland JL, McNaughton BL, O'Reilly RC. Tại sao có các hệ thống học tập bổ sung ở vùng hải mã và vỏ não mới: những hiểu biết sâu sắc về thành công và thất bại của các mô hình học tập và trí nhớ theo chủ nghĩa kết nối. Tâm lý Rev. 1995; 102:419–457.

For more information:1950477648nn@gmail.com