Hành động thúc đẩy của Oenothera Biennis trên các nguyên bào sợi ở da người già nua Phần 1
Jul 04, 2023
trừu tượng: Sự tích tụ của các nguyên bào sợi lão hóa làm lão hóa da. Việc kích hoạt lại sự tăng sinh là một chiến lược để điều chỉnh sự lão hóa của tế bào. Gần đây, chúng tôi đã báo cáo thành phần hóa học chính xác của chiết xuất ưa nước của nuôi cấy tế bào Oenothera biennis (ObHEx) và chúng tôi đã chỉ ra đặc tính chống lão hóa da của nó. Công việc này nhằm mục đích đánh giá tác dụng sinh học của nó đặc biệt đối với sự lão hóa của tế bào. Hành động của ObHEx đã được đánh giá trên các nguyên bào sợi ở da người bình thường bị lão hóa sớm do căng thẳng (SIPS) thông qua một phân tích proteomic siêu sâu, dẫn đến hệ protein liên quan đến lão hóa toàn cầu nhất cho đến nay. Dữ liệu khối phổ cho thấy rằng việc xử lý bằng ObHEx tái thiết lập mức protein phân bào quan trọng, được điều hòa giảm mạnh trong các tế bào lão hóa. Để xác thực những phát hiện về proteomics của chúng tôi, chúng tôi đã chứng minh rằng ObHEx có thể, một phần, khôi phục hoạt động của '-ß-galactosidase liên quan đến lão hóa', dấu hiệu phổ biến nhất của các tế bào lão hóa. Hơn nữa, để đánh giá xem liệu sự điều chỉnh tăng mức độ protein phân bào có chuyển thành tái nhập chu kỳ tế bào hay không, các thí nghiệm FACS đã được thực hiện, cho thấy sự kích hoạt lại nhỏ nhưng có ý nghĩa của sự tăng sinh tế bào bạch cầu bởi ObHEx. Tóm lại, hồ sơ hệ protein toàn cầu liên quan đến lão hóa sâu được xuất bản ở đây cung cấp một bảng gồm hàng trăm protein được SIPS bãi bỏ quy định mà cộng đồng có thể sử dụng để hiểu thêm về lão hóa và tác dụng của các bộ điều biến tiềm năng mới. Hơn nữa, phân tích proteomics đã chỉ ra một hiệu ứng tiền nguyên phân cụ thể của ObHEx trên các tế bào bạch cầu. Do đó, chúng tôi đề xuất ObHEx như một chất bổ trợ mạnh mẽ chống lão hóa liên quan đến lão hóa da.
Glycoside của cistanche cũng có thể làm tăng hoạt động của SOD trong các mô tim và gan, đồng thời làm giảm đáng kể hàm lượng lipofuscin và MDA trong mỗi mô, loại bỏ hiệu quả các gốc oxy phản ứng khác nhau (OH-, H₂O₂, v.v.) và bảo vệ chống lại tổn thương DNA gây ra bởi gốc OH. Cistanche phenylethanoid glycoside có khả năng loại bỏ gốc tự do mạnh mẽ, khả năng khử cao hơn vitamin C, cải thiện hoạt động của SOD trong huyền phù tinh trùng, giảm hàm lượng MDA và có tác dụng bảo vệ nhất định đối với chức năng màng tinh trùng. Cistanche polysacarit có thể tăng cường hoạt động của SOD và GSH-Px trong hồng cầu và mô phổi của chuột lão hóa thực nghiệm do D-galactose gây ra, cũng như làm giảm hàm lượng MDA và collagen trong phổi và huyết tương, đồng thời tăng hàm lượng elastin, có tác dụng nhặt rác tốt đối với DPPH, kéo dài thời gian thiếu oxy ở chuột già, cải thiện hoạt động của SOD trong huyết thanh và làm chậm quá trình thoái hóa sinh lý của phổi ở chuột già thực nghiệm. Với sự thoái hóa hình thái tế bào, các thí nghiệm đã chỉ ra rằng Cistanche có khả năng chống oxy hóa tốt và có tiềm năng trở thành dược phẩm ngăn ngừa và điều trị các bệnh lão hóa da. Đồng thời, echinacoside trong Cistanche có khả năng đáng kể trong việc loại bỏ các gốc tự do DPPH và có thể loại bỏ các loại oxy phản ứng, ngăn chặn sự thoái hóa collagen do gốc tự do gây ra và cũng có tác dụng sửa chữa tốt đối với tổn thương anion gốc tự do của thymine.
Nhấp vào Bổ sung Cistanche Tubulosa
【Để biết thêm thông tin:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】
từ khóa: Chiết xuất ưa nước Oenothera biennis; lão hóa; nguyên bào sợi; proteomics; khối phổ; đường kínhPASEF; nguyên phân; Lão hóa da
1. Giới thiệu
Lão hóa là nguyên nhân chính gây lão hóa và các bệnh liên quan đến tuổi tác. Các tế bào bạch cầu trải qua quá trình ngừng tăng sinh như một phản ứng đối với sự xói mòn telomere sinh lý (sự lão hóa sao chép) hoặc các tác nhân gây căng thẳng bao gồm tổn thương DNA, stress oxy hóa, chủng cơ quan và kích hoạt gen gây ung thư (lão hóa sớm do căng thẳng, SIPS) [1]. Mặc dù việc ngăn chặn sự tăng trưởng do Phản ứng phá hủy DNA (DDR) gây ra, các tế bào bạch cầu thể hiện trạng thái trao đổi chất cao và hoạt động lysosomal, rất quan trọng đối với hoạt động bài tiết gia tăng của chúng, được gọi là kiểu hình bài tiết liên quan đến lão hóa (SASP) [2,3]. Các yếu tố SASP bao gồm một số họ protein hòa tan (interleukin, chemokine, yếu tố tăng trưởng, protease được tiết ra) và protein không hòa tan (protein không hòa tan được tiết ra và các thành phần ma trận ngoại bào) ảnh hưởng tiêu cực đến mô xung quanh, tạo ra tình trạng viêm cấp độ thấp mãn tính.
Sự tích tụ của các nguyên bào sợi lão hóa trong lớp hạ bì làm lão hóa da, làm suy yếu tính toàn vẹn của chất nền ngoại bào (ECM) và chức năng của các tế bào nội mô vi mạch lân cận, tế bào hắc tố biểu bì và tế bào sừng [4–6]. Ba chiến lược chính để chống lại sự lão hóa bao gồm (i) giải phóng các tế bào lão hóa bằng cách gây ra quá trình chết theo chương trình hoặc kích hoạt miễn dịch; (ii) điều chế SASP và (iii) kích hoạt lại quá trình tăng sinh tế bào. Thật vậy, mặc dù lão hóa ban đầu được mô tả là một sự ngừng lại không thể đảo ngược của chu kỳ tế bào, bằng chứng hiện tại cho thấy rằng sự tăng sinh có thể được phục hồi [7-9].
Trong trường hợp này, các thành phần có khả năng ngăn ngừa và/hoặc điều chỉnh quá trình lão hóa của tế bào rất được quan tâm trong lĩnh vực mỹ phẩm như những vũ khí quý giá để chống lại quá trình lão hóa da. Đặc biệt, các chất chiết xuất từ loài Oenothera biennis (O. biennis, Evening Primrose), thuộc họ Onagraceae, thường được sử dụng cho các ứng dụng mỹ phẩm do hoạt tính chống viêm và chống oxy hóa của chúng [10]. Dịch chiết metanol được điều chế từ các bộ phận trên mặt đất và dịch chiết nước lá chủ yếu chứa axit phenolic và flavonoid, trong khi dịch chiết metanol thu được từ rễ chủ yếu chứa sterol và triterpen [11]. Mặc dù các hoạt động sinh học của chiết xuất phần trên không bằng cồn và cồn đã được chứng minh [12–14], nhưng các chất chiết xuất được sử dụng thường xuyên nhất của O. biennis là dầu thu được từ hạt, rất giàu axit béo. Thật vậy, do hàm lượng axit linoleic (LA) và axit -linolenic (GLA) cao, dầu hạt O. biennis cải thiện hoạt động bình thường của da và đặc biệt, chúng đã cho thấy tác dụng có lợi ở những bệnh nhân bị viêm da mãn tính [11, 15].
Gần đây, các chất chiết xuất thu được từ nuôi cấy tế bào O. biennis đã được đề xuất để thay thế hoàn toàn các chất chiết xuất từ thực vật tự phát vì chúng là hỗn hợp các chất chuyển hóa thứ cấp bền vững về mặt sinh học, không có chất gây ô nhiễm và được tiêu chuẩn hóa [16]. Chính sự kết hợp của các hợp chất với tác dụng hiệp đồng của chúng chịu trách nhiệm cho hoạt động tổng thể của chiết xuất thực vật [17].
Ở đây, chúng tôi tập trung vào chiết xuất ưa nước của nuôi cấy tế bào O. biennis (ObHEx), giàu lignan và triterpen, vì nó cho thấy đặc tính chống lão hóa da khi thử nghiệm trong các mô hình in vitro và ex vivo [18]. Đặc tính hóa học dựa trên khối phổ của chiết xuất này tiết lộ rằng nó có chứa một số loại chất chuyển hóa thứ cấp thú vị. Chúng thuộc về lignans (salvadoraside và liriodendron) và triterpenes (axit muriatic, axit arjunolic, axit aspartic và hederagenin), một số trong số đó trước đây có liên quan đến việc sản xuất pro-collagen I trong nguyên bào sợi của con người [19,20]. Cụ thể, trước đây chúng tôi đã chứng minh rằng ObHEx thúc đẩy sự co lại của ma trận collagen, trùng hợp actin và sản xuất protein ECM, do đó cải thiện độ săn chắc và đàn hồi của da, thông qua sự gia tăng biểu hiện gen Myosin light chain kinase (MYLK).
Cho đến nay, các cơ chế phân tử của tác dụng ObHEx đối với lão hóa da và lão hóa tế bào, đặc biệt, vẫn chưa được nghiên cứu. Công việc này nhằm mục đích khám phá hoạt động của ObHEx trên các nguyên bào sợi ở người già. Chúng tôi đã sử dụng phương pháp tiếp cận proteomic khối phổ siêu sâu độc lập với dữ liệu để có được gợi ý về cơ chế hoạt động và các phương pháp trực giao sinh học để xác thực và điều tra nó (Hình 1).
2. Kết quả
Lão hóa sớm do căng thẳng (SIPS) đã được thực hiện trong các nguyên bào sợi ở da người bình thường (NHDF) bằng cách xử lý bằng hydro peroxide (H2O2). Các tế bào lão hóa gây ra stress oxy hóa là một mô hình in vitro tuyệt vời cho nghiên cứu lão hóa và H2O2 được sử dụng rộng rãi để đạt được điều đó [21,22].
Để hiểu các con đường sinh học bị thay đổi bởi ObHEx trên các tế bào NHDF già cỗi, chúng tôi đã sử dụng một phương pháp tiếp cận proteomic cực sâu. SIPS và các tế bào đối chứng có được xử lý hay không trong 48 giờ với chiết xuất ở 0,01 phần trăm (p/v) vì, từ xét nghiệm MTT được báo cáo trong [18], điều này dẫn đến nồng độ cao nhất mà không gây ra bất kỳ độc tính tế bào nào sau 48 giờ ủ.
Các dung dịch tế bào sau đó được phân hủy bằng tryptic và phân tích nano-UPLC MS/MS. Để đạt được độ sâu tối ưu của hệ protein, dữ liệu khối phổ đã được thu thập ở chế độ Thu thập dữ liệu độc lập (DIA), cho phép định lượng mạnh mẽ 9650 protein (Bảng S1), với độ đầy đủ của dữ liệu là 98 phần trăm . Nghiên cứu của chúng tôi báo cáo phân tích hệ protein đầy đủ nhất của các tế bào bạch cầu cho đến nay.
2.1. Đánh giá lão hóa sớm do căng thẳng (SIPS)
Trước hết, chúng tôi đã xác minh xem liệu cảm ứng lão hóa trong NHDF có thành công hay không bằng cách phân tích hệ protein tổng thể của NHDF2-được xử lý H2O{1}}bằng phương pháp khối phổ (MS) và kiểm tra hình thái học của chúng bằng phương pháp tế bào học dòng chảy.
2.1.1. Đánh giá SIPS bằng Khối phổ (MS)
Để đánh giá cảm ứng SIPS, chúng tôi đã so sánh tổng số protein của các tế bào NHDF được xử lý H2O2-với các tế bào chưa được xử lý. Trong số 3256 protein đã được bãi bỏ quy định, một số dấu ấn sinh học của quá trình lão hóa đã bị thay đổi đáng kể (Hình 2A, B). Đầu tiên, chúng tôi quan sát thấy sự điều chỉnh tăng của dấu ấn sinh học được sử dụng rộng rãi nhất của các tế bào bạch cầu, '-ß-galactosidase liên quan đến lão hóa' (SA- -gal, GLB1). Mức độ gia tăng của các enzyme lysosomal GLB1 và Tissue alpha-L-fucosidase (FUCA1), cũng đã được tìm thấy điều chỉnh bởi MS, phản ánh sự gia tăng đặc trưng trong hàm lượng lysosomal của các tế bào bạch cầu [23,24]. Thật vậy, lysosome ủng hộ các quá trình dị hóa, cung cấp năng lượng và nguyên liệu cần thiết cho quá trình bài tiết liên quan đến tuổi già [25].
Thứ hai, mức độ protein của serine/threonine-protein kinase ATR và serine-protein kinase ATM, cả hai đều liên quan đến tín hiệu DDR, cũng được phát hiện là tăng lên [26]. DDR được kích hoạt do tổn thương DNA hạt nhân, thường liên quan đến việc thiết lập quá trình lão hóa tế bào và nó hội tụ thành việc kích hoạt chất ức chế khối u p53. Ngoài ra, người ta cũng đã quan sát thấy sự điều chỉnh lại của các biến thể histone 2A MACROH2A1 và MACRO2A2. Những protein này tham gia vào quá trình hình thành phụ thuộc vào ATR của các tiêu điểm dị nhiễm sắc liên quan đến lão hóa (SAHFs), cấu trúc nhiễm sắc thể dày đặc và ức chế đặc trưng của các tế bào lão hóa [1,2,27].
Cuối cùng, mức độ đã được bãi bỏ quy định của Chất ức chế Kinase phụ thuộc Cyclin 1A hoặc p21 (CDK1NA) và protein đánh dấu tăng sinh Ki-67 (MKI67) phản ánh việc bắt giữ chu kỳ tế bào lão hóa ở giai đoạn G2 [28,29]. Thật vậy, p21 làm tăng mức độ, được thúc đẩy bởi con đường p53 gây tổn thương DNA và ức chế phức hợp cyclin E2-CDK. Điều này gây ra sự khử phospho của protein u nguyên bào võng mạc (RB), ở trạng thái hypo-phosphoryl hóa cô lập E2F, một yếu tố phiên mã hỗ trợ sự tiến triển của chu kỳ tế bào [2].
Ngoài các dấu hiệu lão hóa đã biết này, một phân tích làm giàu con đường rộng hơn của các protein được điều hòa nhiều nhất trong H2O2 được xử lý so với các tế bào đối chứng chỉ ra sự kích hoạt con đường p53/p21 do tổn thương DNA gây ra (Hình 2C, Bảng S2). Thay vào đó, các protein liên quan đến sự tăng sinh và nguyên phân được điều hòa giảm, chỉ ra sự bắt giữ tăng sinh do đó (Hình 2D, Bảng S3).
2.1.2. Đánh giá SIPS bằng Flow Cytometry
SIPS cũng đã được xác nhận bằng phân tích tế bào học dòng chảy. Chúng tôi đã quan sát thấy sự gia tăng độ hạt tế bào chất của các tế bào được xử lý bằng H2O2- (Hình S1A, B), do sự gia tăng về số lượng và kích thước của lysosome trong các tế bào bạch cầu. Đây là kết quả của sự cân bằng giữa sự tích lũy dần dần của các lysosome bị rối loạn chức năng và việc sản xuất các lysosome mới [25]. Hơn nữa, chúng tôi cũng đã phát hiện ra sự tích tụ trong lysosomal của aggresome lipofuscin: sự tăng trưởng này, liên quan đến sự gia tăng tự phát huỳnh quang trong kênh thông dải 525/50nm của máy đo tế bào dòng chảy, là một dấu hiệu khác của sự lão hóa liên quan đến sự cố lysosomal (Hình S1C, Đ) [30].
2.2. ObHEx Các protein phân bào được khôi phục một phần được điều hòa quá mức trong các tế bào NHDF lão hóa
Phương pháp xử lý ObHEx có thể khôi phục một phần mức độ của 71 protein đã được bãi bỏ quy định trong điều kiện lão hóa (giá trị q của thử nghiệm ANOVA hai chiều < 0.05). Chính xác hơn, 46 protein đã được điều chỉnh giảm bởi dịch chiết và 25 protein đã được điều chỉnh tăng (Hình 3A, Bảng S4 và S5).
Phân tích làm giàu phản ứng của 46 protein có mức độ bị giảm bởi ObHEx cho thấy chiết xuất có thể làm giảm kích hoạt con đường p53 và ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa phosphatidylinositol và tín hiệu Hedgehog, những thay đổi được tìm thấy trong quá trình lão hóa [31,32] (Hình 3B, Bảng S6).
Liên quan đến 25 protein được điều hòa tăng cường, phân tích làm giàu chỉ ra sự kích hoạt lại con đường chu kỳ tế bào phân bào và đặc biệt là sự giải phóng và sao chép DNA, ngưng tụ nhiễm sắc thể và phân giải các nhiễm sắc thể chị em (Hình 3, Bảng S7).
Một phân tích chuyên sâu cho thấy 18 trong số 25 protein được phục hồi kết hợp chặt chẽ với nhau (Hình 4A). Trong cụm này, có thể phân biệt CDK1, tất cả các tiểu đơn vị của phức hợp ngưng tụ I (SMC2, SMC4, NCAPD2, NCAPH và NCAPG), ba protein liên quan đến kinetochore (KNTC1, NUF2 và TRIP13), tất cả sáu tiểu đơn vị của phức hợp bảo trì nhiễm sắc thể nhỏ (MCM) sao chép (MCM2-7) cùng với IQGAP3, PBK và DHFR.
Khả năng khôi phục một phần mức độ của các protein này của ObHEx được thể hiện rõ ràng trong sơ đồ cấu hình trong Hình 4B: mức độ biểu hiện protein hầu như không thay đổi trong các tế bào tăng sinh được xử lý hoặc không được xử lý bằng dịch chiết, giảm xuống trong các tế bào lão hóa và tăng lên một phần sau khi Điều trị bằng ObHEx.
2.3. Các xét nghiệm sinh học đã xác nhận cơ chế hoạt động tiên tiến của ObHEx
Dấu hiệu phổ biến nhất của các tế bào lão hóa là hoạt động gal SA{{0}} tăng lên có thể được đánh giá bằng xét nghiệm nhuộm màu. Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng xử lý H2O2 tạo ra sự gia tăng đáng kể số lượng tế bào SA- -gal dương tính (màu xanh lam), từ 4,7 phần trăm lên 22,9 phần trăm (Hình 5A, B). Quá trình ủ ObHEx làm giảm đáng kể hoạt động SA- -gal với mức giảm 38,4 phần trăm (p < 0,01).
Ngoài ra, để đánh giá xem việc khôi phục biểu hiện protein phân bào của ObHEx có chuyển thành kích hoạt lại chu kỳ tế bào hay không, các tế bào đối chứng và tế bào bạch cầu có được xử lý hay không bằng dịch chiết trong 72 giờ và các thí nghiệm Phân loại tế bào được kích hoạt bằng huỳnh quang (FACS) đã được thực hiện. Kết quả tế bào lão hóa cho thấy một khối trong các pha G2/M của chu kỳ tế bào (36,8 phần trăm ), trong khi chỉ một phần thấp hơn nhiều của các ô đối chứng (7,2 phần trăm ) ở trong các giai đoạn này kể từ khi chúng đạt đến hợp lưu, theo tài liệu [ 33] (Hình 5C, D). Việc xử lý các tế bào bạch cầu bằng ObHEx có thể giảm 4,3% số lượng G2/M (p < 0.05). Đáng chú ý, khi liên quan đến phần tế bào lão hóa sau SIPS (22,9 phần trăm ), tỷ lệ thoát khỏi G2/M có thể được ước tính là 18,9 phần trăm . Phương pháp điều trị ObHEx tương tự trong 48 giờ đã được thực hiện, nhưng kết quả không có ý nghĩa thống kê.
【Để biết thêm thông tin:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】
