Tác dụng bảo vệ của vi mô tế bào tiền thân nội mô đối với tổn thương tế bào thận của chuột do Ang II gây ra
Mar 11, 2022
Trừu tượng.Tăng huyết áp mãn tính có thể dẫn đếntổn thương thận,được gọi là bệnh thận do tăng huyết áp hoặc bệnh xơ cứng thận do tăng huyết áp. Hiểu biết thêm về các cơ chế phân tử mà qua đó bệnh thận tăng huyết áp phát triển là điều cần thiết để chẩn đoán và điều trị hiệu quả. Nghiên cứu hiện tại đã điều tra các cơ chế mà tế bào tiền thân nội mô (EPC) sửa chữa chuột nguyên phátquả thậntế bào (PRK). ELISA, Bộ đếm tế bào ‑ 8 và các xét nghiệm đo tế bào dòng chảy được sử dụng để phân tích tác động của EPCs hoặc EPC-MVs đối với stress oxy hóa, viêm, tăng sinh tế bào, apoptosis và chu kỳ của PRK do AngII gây ra. Một mô hình tổn thương PRK đã được thiết lập bằng cách sử dụng angiotensin II (Ang II). Sau khi cảm ứng Ang II, sự tăng sinh PRK giảm, quá trình apoptosis tăng lên và chu kỳ tế bào bị chặn lại ở pha G1 trước khi bước vào pha S. Người ta thấy rằng mức độ của các loại oxy phản ứng và malondialdehyde được tăng lên, trong khi mức độ của glutathione peroxidase và superoxide dismutase giảm. Hơn nữa, mức độ của các cytokine gây viêm IL-1, IL-6 và TNF‑ đã tăng lên đáng kể. Do đó, Ang II làm hỏng PRKs bằng cách kích thích stress oxy hóa và thúc đẩy phản ứng viêm. Tuy nhiên, khi các PRK được đồng nuôi cấy với EPC, thiệt hại do Ang II gây ra đã giảm đáng kể. Nghiên cứu hiện tại đã thu thập các vi nang (MV) được tiết ra bởi EPC và đồng nuôi cấy chúng với PRK gây ra Ang II, và xác định rằng EPC-MV vẫn giữ được tác dụng bảo vệ của chúng đối với PRK. Tóm lại, EPC bảo vệ PRK khỏi thiệt hại do Ang II gây ra thông qua các MV được tiết ra.
CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN BỆNH KIDNEY / RENAL
Giới thiệu
Tăng huyết áp là một yếu tố nguy cơ đối với tỷ lệ mắc các bệnh tim mạch và mạch máu não, và tỷ lệ tử vong liên quan của chúng (1). Cácthậncó thể gây tăng huyết áp và là một trong những cơ quan đích của tổn thương do tăng huyết áp (2). Mãn tínhbệnh thận(CKD) là một trong những nguyên nhân chính làm gia tăng tỷ lệ tử vong ở những người mắc bệnh cao huyết áp trên toàn thế giới trong hai thập kỷ qua (3,4). Vì vậy, việc thúc đẩy điều trị bệnh thận do tăng huyết áp và nghiên cứu cơ chế bệnh lý của nó là hết sức cấp thiết. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng angiotensin II (Ang II) gây ra tổn thương mạch máu và đóng vai trò quan trọng trong các bệnh mạch máu thông qua một số cơ chế, chẳng hạn như gây ra quá trình chết rụng (5), bắt giữ chu kỳ tế bào (6), tăng mức oxy phản ứng (ROS) ( 7), thúc đẩy phản ứng stress oxy hóa bằng cách tăng tiết malondialdehyde (MDA), và giảm tiết glutathione peroxidase (GSH ‑ Px) và superoxide dismutase (SOD) (8,9). Ang II cũng thúc đẩy sản xuất các yếu tố liên quan đến viêm, chẳng hạn như IL-6, IL-1 và TNF‑ (10‑12). Do đó, thiệt hại do Ang II gây ra đã được sử dụng để làm mô hình tăng huyết áp in vitro, bao gồm cả ở chuột nguyên phátquả thậnô (PRK) (13,14).
Đối với bệnh nhân vớichức năng thậnsuy giảm, tổn thương các tế bào nội mô và giảm khả năng tái tạo và sửa chữa là những nguyên nhân chính gây mất các vi mô phúc mạc (MV) (15). Tế bào tiền thân nội mô (EPC) có nguồn gốc từ tủy xương có thể thúc đẩy quá trình sửa chữa nội mô (16,17). Các nghiên cứu trước đây đã tiết lộ rằng EPC có thể cải thiện quá trình tái tạo tim mạch (18) và điều chỉnh sự hình thành mạch (19), cũng như có tác dụng điều trị đối với bệnh cấp tính.thậnchấn thương tái tưới máu do thiếu máu cục bộ (20) và ở những bệnh nhân bịghép thận(21). Tuy nhiên, theo hiểu biết tốt nhất của chúng tôi, tác dụng của EPC đối với bệnh thận tăng huyết áp chưa được báo cáo trước đây. Chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng EPC có thể có tác dụng bảo vệ chống lại bệnh thận do tăng huyết áp trongthậntế bào. MV được tiết ra liên tục bởi nhiều loại tế bào trong cơ thể, chẳng hạn như tế bào biểu mô, tế bào khối u và tế bào gốc, và tồn tại trong một số chất lỏng cơ thể, chẳng hạn như máu, nước tiểu và sữa, nơi chúng làm trung gian cho các chức năng sinh học (22). Tích lũy bằng chứng cho thấy tác dụng bảo vệ của EPC có liên quan chặt chẽ với việc giải phóng MV (23,24) Trong nghiên cứu này, ứng dụng tiềm năng của EPC-MVs để điều trị bệnh thận tăng huyết áp đã được kiểm tra bằng cách nghiên cứu tác dụng và cơ chế bảo vệ. qua đó EPC-MVs bảo vệ chống lại tổn thương PRK do Ang II gây ra, để cung cấp cơ sở lý thuyết sinh học cho việc điều trị bệnh thận do tăng huyết áp.
Từ khóa:EPC ‑ MVs, bệnh thận tăng huyết áp, Ang II, ROS, MVs, viêm, thận, thận
Nguyên liệu và phương pháp
Loài vật.Tổng số chuột đực Wistar ‑ Kyoto (WKY) 12 8 tuần tuổi không có mầm bệnh cụ thể (trọng lượng, 80‑120 g) được lấy từ Công ty TNHH Công nghệ Động vật Phòng thí nghiệm Sông Vital Bắc Kinh (giấy phép số SCXK, Quảng Đông, 2015‑0063). Những con chuột được đặt trong một căn phòng có nhiệt độ và độ ẩm không đổi (nhiệt độ, 23 ± 2˚C; độ ẩm, 50 ± 10 phần trăm), theo chu kỳ sáng / tối 12 ‑ h với quyền tiếp cận với thức ăn và nước tiêu chuẩn của chuột trong một cái lồng polystyrene. Tất cả các thí nghiệm trên động vật đã được phê duyệt bởi Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật của Đại học Y Hải Nam (Hải Khẩu, Trung Quốc; số phê duyệt HYLL ‑ 2021‑053) và được thực hiện theo hướng dẫn của Viện Y tế Quốc gia (25).
CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN CHỨC NĂNG KIDNEY / RENAL
Sự cô lập và văn hóa của các PRK.Những con chuột WKY được tiếp cận với nước miễn phí đã nhịn ăn trong 12 giờ trước khi thử nghiệm. Những con chuột WKY đã được gây tử vong bằng cách tiêm pentobarbital natri vào màng bụng (200 mg / kg thể trọng), sau đóthậnđã được loại bỏ một cách vô trùng, và phần vỏ não củaquả thậnđược cắt bỏ và cấy vào một cốc nhỏ. Cácthậnvỏ não được cắt thành các mảnh mô ~ 1 mm3, rửa ba lần bằng PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), ly tâm ở 1, 000 xg ở 25˚C trong 5 phút và phần nổi phía trên được loại bỏ. Các mảnh mô được thêm vào collagenase loại I (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) ở nồng độ cuối cùng là 1 g / l, và các mảnh mô được dao động và tiêu hóa ở 37˚C trong 3 0 phút. Sau khi lọc qua màn chắn thép không gỉ 200 ‑ mesh (0,075 mm), các tế bào được phân tách bằng ly tâm gradient mật độ Ficoll (Sigma ‑ Aldrich; Merck KGaA) (26). Sau khi ly tâm ở 1, 000 xg ở 25˚C trong 2 phút, huyền phù trung gian được thu thập và trộn với môi trường MEM / F12 (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), được cấy vào đĩa 6 giếng và được nuôi cấy ở 37˚C dưới 5% CO2. Sau 24 giờ, môi trường được lấy ra và thay thế bằng môi trường mới, và môi trường không gắnthậntế bào và mô đã bị loại bỏ. Sau 48 giờ, môi trường được lấy ra một lần nữa, các tế bào được rửa hai lần bằng PBS và được ký hiệu là PRKs (27,28); thành phần chính là tế bào trung mô cầu thận chuột. PRK được nuôi cấy trong ba thế hệ và được xử lý bằng Ang II (1 µM; Sigma ‑ Aldrich; Merck KGaA) ở 37˚C trong 24 giờ để thiết lập PRKtổn thương thậnngười mẫu. Viêm do Ang II gây ra ở chuộtthậncác tế bào biểu mô hình ống đã được thực hiện như Nair et al (29) đã mô tả trước đây.
Các PRK được xác định bằng xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang (IF).Sau khi rửa ba lần bằng PBS và cố định bằng 4 phần trăm paraformaldehyde ở 25˚C trong 1 giờ, các tế bào được ủ (25˚C) với Triton X ‑ 1 0 0 trong 2 giờ, tiếp theo là 5 phần trăm BSA (Bắc Kinh Solar Science & Technology Co., Ltd.) ở 25 ° C trong 30 phút. Các PRK sau đó được ủ qua đêm trong bóng tối với ‑smooth actin (‑SMA; 1 µg / ml; cat. No. Ab7817; Abcam) và vimentin (1: 250; cat. No. Ab92547; Abcam) ở 4˚C. Sau khi rửa ba lần bằng PBS, các tế bào được ủ với kháng thể thứ cấp Alexa Fluor® 488‑ (1: 100; cat. No. Ab150077; Abcam) hoặc 647 ‑ (1: 200; cat. No. Ab150075; Abcam) ở 37 ˚C trong 1 giờ. Sau đó, các tế bào được nhuộm bằng DAPI (0,5 µg / ml; Viện Công nghệ Sinh học Beyotime) ở 25˚C trong 5 phút. Cuối cùng, hình ảnh được chụp bằng kính hiển vi huỳnh quang (độ phóng đại, x400; Leica Microsystems GmbH).
Văn hóa và xác định EPC.Xương đùi và xương chày của chuột được mổ và mỗi ống tủy được rửa sạch bằng PBS vô trùng. Hỗn hợp thu được được ly tâm (1, 000 xg; 25˚C; 15 phút) và các hạt được lơ lửng lại trong môi trường MEM / F12. Tế bào được phân lập bằng phương pháp ly tâm gradient mật độ Ficoll (Sigma ‑ Aldrich; Merck KGaA) (1, 000 xg; 25˚C; 20 phút) và được đặt trong bình nuôi cấy 25 cm2 phủ fibronectin (BD Biosciences). Tế bào được duy trì trong môi trường hoàn chỉnh ở điều kiện tiêu chuẩn (37 ° C; 5% CO2). Môi trường nuôi cấy được thay đổi sau 4 ngày, và các tế bào kết dính được nuôi cấy thêm 3 ngày (30). Phương pháp nhuộm lipoprotein mật độ thấp (Dil ‑ Ac ‑ LDL) phức tạp pha loãng acetyl hóa (Công ty TNHH Khoa học & Công nghệ Mặt trời Bắc Kinh) được sử dụng để xác định EPC. Đối với hệ thống đồng nuôi cấy, PRK (1x104) được thêm vào buồng dưới của đĩa đồng nuôi cấy (Corning, Inc.) trong 24 giờ và sau đó Ang II (1 µM) hoặc 200 µl PBS và EPC (3x104) được được thêm vào buồng trên và ủ ở 37 ° C trong 24 giờ trước khi thực hiện thêm phân tích chức năng tế bào. Khi sàng lọc PRK và tỷ lệ EPC tốt nhất, tỷ lệ số tế bào là 2: 1, 1: 1, 1: 2, 1: 3, 1: 4, 1: 5, 1: 6 và 1: 7.
Chuẩn bị EPC ‑ MV. EPC được nuôi cấy trong 7 ngày như đã mô tả trước đây (30), được rửa hai lần bằng PBS và huyết thanh ‑ được bỏ đói trong 12 giờ. Sau đó, môi trường MEM / F12 chứa EPC được nuôi cấy được thu thập và ly tâm ở 4˚C (1, 000 xg; 15 phút), và phần nổi phía trên được chiết xuất ở 4˚C (100, 000 xg; 60 phút) cho bộ sưu tập EPC ‑ MV được tiết lộ. Sau khi nhúng vào nhựa epoxy Pon 812 (Structure Probe, Inc.), nó được đặt ở 37 ° C qua đêm. Sau đó, giải pháp cố định kính hiển vi điện tử (Wuhan Service Technology Co., Ltd.) được thêm vào trong 4 giờ, và uranium acetate (2%; Wuhan Service Technology Co., Ltd.) và chì citrate (Wuhan Service Technology Co., Ltd.) ) được nhuộm ở 25C trong 15 phút. Các MV đã được xác nhận qua kính hiển vi điện tử truyền qua. Trong hệ thống đồng nuôi cấy, 50 µg / ml EPC-MVs (31) được thêm vào ngăn trên cùng của đĩa xét nghiệm Transwell, và các hạt được thêm vào ngăn dưới cùng như đã mô tả trước đây và được ủ trong 24 giờ.
Xét nghiệm tăng sinh tế bào.PRK được tiêu hóa bằng trypsin, được cấy vào đĩa 96 giếng ở mật độ 3x103 tế bào / giếng và nuôi cấy trong 24 giờ. Mật độ quang học ở bước sóng 450 nm được đo bằng thuốc thử 10 µl Bộ đếm tế bào ‑ 8 (CCK ‑ 8; Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.) ở 37˚C trong 60 phút, theo hướng dẫn của nhà sản xuất, để đánh giá tốc độ tăng sinh tế bào.
CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN ĐAU KIDNEY / RENAL
Xét nghiệm apoptosis của tế bào.Một xét nghiệm về quá trình tự chết của tế bào được thực hiện bằng cách sử dụng bộ công cụ Phát hiện quá trình tự chết của Annexin V ‑ FITC (BD Biosciences), theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các PRK được thu hoạch, rửa sạch hai lần bằng PBS nước đá lạnh (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) và được tiếp tục lại trong dung dịch đệm liên kết 5 0 0 µl. Các PRK được tiếp tục sau đó được ủ với 5 µl Annexin V ‑ FITC và 5 µl PI trong bóng tối trong 15 phút ở 23 ± 2˚C. Quá trình chết của tế bào được đánh giá bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy (FCM; FACSCanto II; phần mềm BD FACSChorus ™, phiên bản: 1.0; BD Biosciences).
Hợp nhất EPC ‑ MV và PRK.Để quan sát xem liệu EPC-MV có được hợp nhất với PRK hay không, EPC-MV được đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang nhúng màng lipid (PKH26) trước khi cùng ủ. Tóm lại, 50 µg / ml EPC ‑ MV được kết hợp với 2 ml PKH26 (2x10‑6 M; Sigma ‑ Aldrich; Merck KGaA) và trộn ở 23 ± 2˚C trong 5 phút. Hỗn hợp được ghi nhãn được thêm vào 2 ml 1 phần trăm BSA (v) và ly tâm ở 100, 000 xg ở 4˚C trong 60 phút, sau đó tráng bằng PBS lạnh. Kết tủa được lơ lửng trong môi trường 1 ml MEM / F12, thêm vào PRKs và ủ ở 37 ° C trong 24 giờ. Cuối cùng, 1 µg / ml DAPI được thêm vào để nhuộm hạt nhân ở 25˚C trong 15 phút. Hình ảnh tế bào được thu thập bằng kính hiển vi huỳnh quang (độ phóng đại, x400; Leica Microsystems GmbH).
Xét nghiệm chu kỳ tế bào.Thử nghiệm chu kỳ tế bào được thực hiện bằng bộ công cụ Phát hiện Chu kỳ Tế bào (BD Biosciences). EPC hoặc PRK (1x1 0 6) được thu hoạch, rửa hai lần bằng PBS và sau đó cố định trong 500 µl etanol 70% đá lạnh trong 2 giờ ở 25˚C. Sau đó, các tế bào được rửa hai lần bằng PBS lạnh và ủ trong PI (400 µl) và RNase (100 µl) trong 30 phút ở 37oC trong bóng tối. Tín hiệu PI được phát hiện bằng FCM (FACSCanto II). Tỷ lệ phần trăm của các ô trong pha G1, S và G2 được đếm và so sánh bằng phần mềm FlowJo (phiên bản 10.0.6; FlowJo LLC).
Đo ROS bằng FCM.Các PRK được nuôi cấy đến 6 0 - 70 phần trăm hợp lưu và được thu hoạch thông qua quá trình trypsinization. Tất cả các tế bào được ủ với 1,0 µM 2 ', 7' ‑ dichlorodihydrofluorescein diacetate trong 15 phút ở 37˚C. Sau đó, các tế bào được rửa hai lần bằng PBS và phân tích qua FCM để phát hiện ROS bằng cách sử dụng laser 488 nm để kích thích và laser 535 nm để phát hiện.
ELISA.Sau khi ly tâm (1, 000 xg; 25˚C; 5 phút), phần nổi trên tế bào của mỗi phân nhóm được thu thập để phân tích mức MDA, GSH ‑ Px, SOD và các yếu tố gây viêm IL ‑ 6, IL‑ 1 và TNF‑. Các bộ dụng cụ sau được sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất: Bộ dụng cụ xét nghiệm Micro MDA (mèo. BC 00 20; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), Bộ xét nghiệm GSH ‑ Px (mèo. Số. BC1195; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), bộ phát hiện hoạt động SOD (mèo. BC0170; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), bộ ELISA IL ‑ 1 chuột (mèo. RLB { {13}}; R&D Systems, Inc.), bộ kit Quantikine ELISA IL ‑ 6 chuột (mèo. Số R6000B; R&D Systems, Inc.) và bộ kit TNF Quantikine ELISA chuột (mèo. Số RTA00; R&D Systems, Inc. ).
Phân tích thống kê.Tất cả các thí nghiệm được lặp lại ba lần và tất cả dữ liệu được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình ± SD. Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm SPSS phiên bản 21. 0 (IBM Corp.). Sự khác biệt giữa nhiều nhóm được đánh giá bằng cách sử dụng ANOVA một chiều và bài kiểm tra post hoc của Dunnett. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Kết quả
Identification of isolated EPCs and PRKs. The isolated EPCs were identified using Dil‑Ac‑LDL staining (Fig. 1A). Microscopic counting revealed that the degree of coincidence between red (Dil‑Ac‑LDL staining) and blue (nuclear staining with DAPI) fluorescence was >90%, xác nhận rằng EPC đã được phân lập thành công. Các PRK phân lập được phân tích qua IF (vimentin / ‑SMA). Kết quả chứng minh rằng mức độ biểu hiện của vimentin / ‑SMA trong PRKs cao và dương tính, cho thấy việc phân lập thành công các PRK (Hình 1B).
Tỷ lệ tối ưu giữa EPC và PRK.Hiệu quả của việc kết hợp các tỷ lệ PRK / EPC khác nhau trong một hệ thống đồng nuôi cấy đã được kiểm tra, và người ta thấy rằng PRK được phát triển với tỷ lệ 1: 3 PRK / EPCs không có tỷ lệ tăng sinh tăng so với PRK được trồng với tỷ lệ 2: Tỷ lệ 1, 1: 1 hoặc 1: 2 của PRK / EPC (Hình 1C). Hơn nữa, tỷ lệ EPC ngày càng tăng (1: 4, 1: 5, 1: 6 và 1: 7) dẫn đến sự gia tăng đáng kể của PRK so với EPC (1: 3). Do đó, tỷ lệ 1: 3 PRKs / EPCs đã được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo để ngăn chặn sự can thiệp có thể có từ EPCs quá mức trong các thí nghiệm tiếp theo.
Ảnh hưởng của việc nuôi cấy đồng EPC đến thiệt hại do Ang II gây ra.PRK (1x104) được cấy trước 24 giờ vào ngăn dưới của đĩa Transwell. Buồng trên chứa 200 µl PBS trong nhóm đối chứng và 200 µl EPC (3x104) trong nhóm thực nghiệm. Để mô hìnhtổn thương thận,1 µM Ang II được thêm vào ngăn dưới. Sau 24 giờ, xét nghiệm CCK-8 và FCM được thực hiện để đo tốc độ tăng sinh của PRK. Các PRK nhận Ang II trong trường hợp không có EPC đã giảm đáng kể (P<0.05) proliferation="" rate="" (fig.="" 1d),="" and="" increased="" apoptosis="" rate="" (fig.="" 1e)="" and="" cell="" cycle="" arrest="" in="" the="" g1="" phase="" (fig.="" 1f)="" compared="" with="" the="" control="" group,="" while="" prks="" co‑cultured="" with="" epcs="" receiving="" ang="" ii="" showed="" the="" reverse="" effects.="" these="" results="" indicated="" that="" co‑culture="" with="" epcs="" can="" reduce="" the="" damage="" induced="" by="" ang="" ii="" in="" a="" rat="">quả thậnmô hình tế bào.
EPCs bảo vệ các PRK khỏi thiệt hại do Ang II gây ra, mức độ căng thẳng oxy hóa do Ang II gây ra trong các PRK được đồng nuôi cấy với EPC đã được kiểm tra. Kết quả từ xét nghiệm FCM cho thấy Ang II tăng lên đáng kể (P<0.05) the="" levels="" of="" ros="" in="" prks="" in="" the="" absence="" of="" epcs,="" while="" prks="" co‑cultured="" with="" epcs="" had="" comparatively="" lower="" ros="" levels="" (fig.="" 2a).="" similarly,="" the="" elisa="" results="" indicated="" that="" the="" levels="" of="" secreted="" mda="" (fig.="" 2b)="" were="" increased="" and="" gsh="" and="" sod="" (fig.="" 2c="" and="" d)="" levels="" were="" decreased="" in="" prks="" receiving="" ang="" ii,="" while="" prks="" receiving="" ang="" ii="" and="" co‑cultured="" with="" epcs="">
Figure 1. Recovery of PRKs by co‑culture with EPCs following injury induced by Ang II. (A) Confirmation of the isolation of EPCs via Dil‑Ac‑LDL staining. Magnification, x100. (B) Confirmation of the isolation of PRKs using an immunofluorescence assay. Magnification, x400. (C) CCK‑8 analysis of the effects of different proportions of co‑cultured EPCs on the proliferation of PRKs. NS P>0. 05 so với PRK: EPC, nhóm 2: 1; * P<0.05 vs.="" prks:epcs,="" 2:1="" group.="" (d)="" cck‑8="" analysis="" of="" the="" effects="" of="" co‑cultured="" epcs="" on="" the="" proliferation="" rate="" of="" ang="" ii‑treated="" prks.="" fcm="" analysis="" of="" the="" effects="" of="" co‑cultured="" epcs="" on="" the="" (e)="" apoptosis="" and="" (f)="" cell="" cycle="" of="" ang="" ii‑treated="" prks.="" *=""><0.05 vs.="" control;="" #=""><0.05 vs.="" ang="" ii.="" ang="" ii,="" angiotensin="" ii;="" epcs,="" endothelial="" progenitor="" cells;="" prks,="" primary="" rat="">quả thậntế bào; FCM, đo tế bào dòng chảy; CCK ‑ 8, Bộ đếm ô ‑ 8; Dil ‑ Ac ‑ LDL, Dil phức hợp acetyl hóa lipoprotein mật độ thấp; OD, mật độ quang học; ‑SMA, ‑ actin cơ mềm; NS, không đáng kể. kết quả ngược lại liên quan đến việc tiết các enzym này. Do đó, việc tạo ra ROS có thể liên quan đến tổn thương tế bào do Ang II gây ra, và có thể được cải thiện bằng cách đồng nuôi cấy với EPC.
Ang II cũng có thể làm tổn thương tế bào bằng cách thúc đẩy sự bài tiết các cytokine gây viêm, trong khi EPCs có thể ngăn ngừa viêm (32). Tiếp theo, người ta nghiên cứu xem Ang II có thúc đẩy sự bài tiết các cytokine gây viêm trong PRK hay không và liệu EPC có thể phát huy vai trò bảo vệ của chúng bằng cách ức chế sự bài tiết của các cytokine gây viêm hay không. Sự tiết IL-1, IL-6 và TNF‑ được điều chỉnh đáng kể trong PRKs bằng cách bổ sung Ang II. Ngược lại, trong các PRK được đồng nuôi cấy với EPC, mức IL-1, IL-6 và TNF‑ (Hình. 2E-G) tương đối thấp hơn (P<0.05) than="" those="" in="" prks="" cultured="" alone.="" therefore,="" the="" damage="" induced="" by="" ang="" ii="" in="" prks="" was="" also="" associated="" with="" pro‑inflammatory="" cytokines,="" and="" co‑culture="" with="" epcs="" exerted="" protective="" effects="" by="" reducing="" the="" secretion="" of="" these="">
Tác dụng bảo vệ của EPC được thực hiện thông qua các MV.Các cơ chế qua đó EPC tạo ra tác dụng bảo vệ đối với Ang II ‑ gây raquả thậntế bào được phân tích thêm bằng cách phân lập MV từ EPC (Hình 3A). EPC ‑ MV được gắn nhãn PKH26 và được thêm vào PRK cùng với Ang II trong một tấm Transwell, như đã mô tả trước đây. Phát hiện huỳnh quang PKH26 trong tế bào chất của PRK (Hình 3B), cho thấy EPC-MVs đã hợp nhất với PRK. Sau đó, người ta thấy rằng tỷ lệ tăng sinh do Ang II gây ra giảm, thúc đẩy quá trình chết rụng và bắt giữ chu kỳ trong pha G1, bị ức chế bởi EPC-MVs (Hình 3C-E). Tương tự như các PRK được đồng nuôi cấy với EPC, các PRK được phát triển với sự hiện diện của EPC ‑ MV và tiếp xúc với Ang II đã làm giảm mức ROS và MDA (Hình 4A và B), tăng mức GSH và SOD (Hình 4C và D) và giảm tiết các cytokine gây viêm IL-1, IL-6 và TNF‑ (Hình 4E-G), so với nhóm Ang II.
Thảo luận
Theo hiểu biết tốt nhất của chúng tôi, nghiên cứu này lần đầu tiên chứng minh rằng EPC có thể bảo vệ PRK khỏi tổn thương tế bào do Ang II gây ra. Tác dụng bảo vệ này, ít nhất một phần, được trung gian bởi các MV được tiết ra bởi EPC và kết hợp với PRK trong quá trình đồng nuôi cấy. Bằng cách thêm các MV đã được làm giàu vào PRK tiếp xúc với Ang II, người ta thấy rằng chỉ riêng EPC-MVs có thể bảo vệ PRK khỏi tổn thương do Ang II gây ra bằng cách ức chế căng thẳng oxy hóa và viêm. MV được định nghĩa là màng nanodebris (0. 05‑1 µm) (33), và bị bong ra khỏi bề mặt tế bào sau khi kích hoạt, căng thẳng hoặc apoptosis. Hơn nữa, MV có thể có nguồn gốc từ nhiều loại tế bào khác nhau, chẳng hạn như tiểu cầu, tế bào nội mô, EPC và bạch cầu (34,35). Các MV thể hiện các dấu hiệu bề mặt tế bào cụ thể, thay đổi theo tế bào gốc và sự hình thành của chúng và có thể có tác dụng chống viêm, chống đông máu và tạo mạch (36). Các MV được giải phóng từ EPC có thể mang thông tin sinh học của tế bào mẹ của chúng, và do đó thực hiện một chức năng tương tự trên các tế bào đích (33). Ví dụ, EPC-MVs bảo vệ các tế bào cơ tim khỏi sự phì đại và apoptosis do Ang II gây ra (28), cải thiện chức năng nội mô và khả năng điều chỉnh sự hình thành mạch (37), và làm giảm bớt rối loạn chức năng nội mô do stress oxy hóa (38). Tuy nhiên, theo hiểu biết tốt nhất của chúng tôi, ảnh hưởng của EPC-MVs đối với bệnh thận tăng huyết áp chưa được báo cáo trước đây. Do đó, nghiên cứu này nhằm mục đích điều tra tác dụng bảo vệ tiềm năng của EPCs và EPC ‑ MVs trongtổn thương tế bào thận.
Trong nghiên cứu này, một mô hình tổn thương PRK đã được thiết lập bằng cách gây ra tổn thương với Ang II. Phù hợp với các báo cáo trước đây (26,39), Ang II làm giảm sự tăng sinh PRK, tăng quá trình chết rụng và bắt giữ chu kỳ tế bào ở pha G1 trước khi bước vào pha S. Dựa trên các dấu hiệu liên quan đến tăng huyết áp này, người ta kết luận rằng mô hình tăng áp lực PRK gây ra Ang II đã được thiết lập thành công. Hơn nữa, người ta xác định rằng đồng nuôi cấy với EPC đã bảo vệ các PRK khỏi thiệt hại do Ang II gây ra. Sau khi đồng ủ EPC với PRK cộng với Ang II, mức độ của các enzym stress oxy hóa và các yếu tố gây viêm trong PRK đã giảm xuống. Do đó, các cơ chế tiềm năng mà qua đó EPCs phát huy tác dụng bảo vệ của chúng đối với PRK có thể liên quan đến việc điều chỉnh căng thẳng oxy hóa và viêm. Theo hiểu biết tốt nhất của chúng tôi, nghiên cứu hiện tại lần đầu tiên chứng minh rằng EPC có thể cải thiện phản ứng stress oxy hóa gây ra Ang II và phản ứng viêm ở PRK.
EPC bảo vệ hiệu quảchức năng thậnCKD (40) và đóng vai trò chính trong việc duy trì tính toàn vẹn của mạch máu và sửa chữa tổn thương nội mô (15), cũng như giảm rò rỉ mạch máu, cải thiện chức năng cơ quan và tăng tỷ lệ sống sót trong nhiễm trùng huyết (41). Tích lũy bằng chứng cho thấy EPC có thể đóng vai trò bảo vệ thông qua việc tiết MV (37,42,43). Để kiểm tra tác dụng bảo vệ của EPC-MV trong PRK, EPC-MV được phân lập và dán nhãn PKH26, và sau đó các MV có nhãn được ủ chung với PRK cộng với Ang II. EPC-MVs hợp nhất với PRK và ức chế đáng kể phản ứng stress oxy hóa và phản ứng viêm do Ang II gây ra, và những kết quả này tương tự như kết quả của Fu và cộng sự (44). Tác dụng ức chế của EPC-MVs đối với mức độ của các enzym gây stress oxy hóa lớn hơn so với EPCs đơn thuần; điều này có thể là do các MV hiện diện ở nồng độ cao hơn trong các PRK được xử lý bằng EPC ‑ MV so với các MV được đồng nuôi cấy với EPC. Những phát hiện này cho thấy tác dụng bảo vệ của EPC đối với PRK chống lại tổn thương tế bào do Ang II gây ra có thể phụ thuộc vào các MV được tiết ra. Một hạn chế của nghiên cứu này là các cơ chế tiềm năng qua đó EPC-MVs điều chỉnh microRNAs / mRNAs / trục dẫn truyền tín hiệu chưa được kiểm tra đầy đủ. Vai trò và các cơ chế mà qua đó EPC ‑ MV có tác dụng bảo vệ chống lạitổn thương thậnnên được đánh giá trên mô hình động vật về bệnh thận do tăng huyết áp, đây là một hướng nghiên cứu đầy hứa hẹn trong tương lai. Kết luận, nghiên cứu này đã chứng minh rằng EPC có thể bảo vệ các PRK khỏi stress oxy hóa do Ang II gây ra và sự gia tăng viêm nhiễm thông qua việc bài tiết MVs. Điều này cung cấp một hướng mới để điều trị bệnh thận tăng huyết áp và thiết lập một mô hình in vitro để nghiên cứuchấn thương thận.
