để biết thêm information:ali.ma@wecistanche.com

Sante Princiero Berlingerio^1,†, Junling He^2,†, Dối trá De Groef³, Harold Taeter⁴, Tomas Norton⁴, Pieter Baatsen⁵, Sara Cairoli⁶, Bianca Goffredo⁶, Peter de Witte⁷, Lambertus van den Heuvel^1,8, Hans J. Baelde²và Elena Levtchenko^1,*

^{Phần I: Biểu hiện thận và thận phụ ở cá ngựa vằn trưởng thành Mô hình cystinosis}

¹Phòng thí nghiệm Thận nhi, KU Leuven, 3000 Leuven, Bỉ; santeprinciero.berlingerio@kuleuven.be (S.P.B.); Bert.vandenHeuvel@radboudumc.nl (L.v.d.H.)

²Khoa Bệnh học, Trung tâm Y tế Đại học Leiden, 2300 RC Leiden, Hà Lan; J.He@lumc.nl (J.H.); j.j.baelde@lumc.nl (H.J.B.)

³Nhóm nghiên cứu tái tạo và phát triển mạch thần kinh, KU Leuven, 3000 Leuven, Bỉ; lies.degroef@kuleuven.be

⁴Nhóm M3-BIORES, Phòng Kỹ thuật Sức khỏe Động vật và Con người, KU Leuven, 3000 Leuven, Bỉ; harold.taeter@kuleuven.be (H.T.); tomas.norton@kuleuven.be (T.N.)

⁵Sinh học thần kinh phân tử, VIB-KU Leuven, 3000 Leuven, Bỉ; pieter.baatsen@kuleuven.be

⁶Khoa Nhi, Phòng thí nghiệm Đơn vị Hóa sinh Chuyển hóa, Bệnh viện Nhi Bambino Gesù, IRCCS, 00146 Rome, Ý; sara.cairoli@opbg.net (S.C.); biancamaria.goffredo@opbg.net (B.G.)

⁷Phòng thí nghiệm khám phá sinh học phân tử, KU Leuven, 3000 Leuven, Bỉ; peter.dewitte@kuleuven.be

⁸Khoa Thận nhi, Trung tâm Y tế Đại học Radboud, 6525 GA Nijmegen, Hà Lan

^*Thư tín: elena.levtchenko@uzleuven.be; Điện thoại: +32-16-34-38-22

^†Những tác giả này đã đóng góp như nhau cho tác phẩm này.

Trừu tượng:Bệnh cystinosislà một bệnh lặn hiếm gặp, không thể chữa khỏi, trên NST thường do đột biến gen CTNS gây ra. Gen này mã hóa cystinosis vận chuyển cystine lysosomal, dẫn đến sự tích tụ cystine lysosomal trong tất cả các tế bào của cơ thể, với thận là cơ quan bị ảnh hưởng đầu tiên. Phương pháp điều trị hiện tại bằng cysteamine làm giảm tích lũy cystine nhưng không đảo ngược rối loạn chức năng ống gần, tổn thương cầu thận hoặc mấtThậnchức năng. Trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi, chúng tôi đã phát triển một mô hình cá ngựa vằn của bệnh cystinosis thông qua một đột biến vô nghĩa trong gen CTNS và đã chỉ ra rằng ấu trùng cá ngựa vằn tóm tắt lạithậnkiểu hình được mô tả ở người. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đã mô tả đặc điểm của người lớnbệnh cystinosismô hình cá ngựa vằn và đánh giá ảnh hưởng lâu dài của bệnh đối vớithậnvà extrarenal các cơ quan thông qua các nghiên cứu hoạt động sinh hóa, mô học, khả năng sinh sản và vận động. Chúng tôi thấy rằng người lớnbệnh cystinosiscá ngựa vằn có biểu hiện tích tụ cystine trong các cơ quan khác nhau, hình thái thận bị thay đổi, sắc tố da bị suy yếu, giảm khả năng sinh sản, hoạt động vận động thay đổi và dị thường về mắt. Nhìn chung, dữ liệu của chúng tôi chỉ ra rằng người lớnbệnh cystinosismô hình cá ngựa vằn tái tạo một số kiểu hình người của bệnh cystinosis và có thể hữu ích cho việc nghiên cứu sinh lý bệnh học và tác dụng lâu dài của các liệu pháp mới.

Từ khoá:thậnbệnh tật;bệnh cystinosis; mô hình cá ngựa vằn;Thậnvà extrarenal biểu hiện; đặc điểm kiểu hình người lớn

1. Giới thiệu

Bệnh cystinosislà một rối loạn lưu trữ lặn trên NST thường gây ra bởi các đột biến trong gen CTNS mã hóa cystinosis đồng vận chuyển proton cystinosis lysosomal, mang cystine từ lòng lysosomal đến cytosol. Một số cơ quan có liên quan đến căn bệnh này, chẳng hạn như cơ bắp, tinh hoàn, mắt và não, và trong số tất cả,thậnlà những cơ quan đầu tiên và bị ảnh hưởng nghiêm trọng nhất [1]. Biến thể lâm sàng thường gặp và nghiêm trọng nhất là bệnh thận ở trẻ sơ sinhbệnh cystinosis, trong đó biểu hiện lâm sàng đầu tiên làThậnHội chứng Fanconi, đặc trưng bởi một tế bào biểu mô ống gần bị suy yếu

(PTE) tái hấp thu dẫn đến mất nước tiểu của các axit amin, glucose, protein trọng lượng phân tử phân tử thấp đến trung gian và các chất chuyển hóa khác. Tổn thương PTEC được theo sau bởi rối loạn chức năng cầu thận tiến triển và, khi không được điều trị, dẫn đến kết thúcthậnbệnh [1]. Phương pháp điều trị hiện tại bao gồm cysteamine, là một thiol amin làm cạn kiệt cystine phá vỡ cầu disulfide của cysteine, dẫn đến sự hình thành axit amin cysteine và cysteamine-cysteine hỗn hợp disulfide. Phân tử thứ hai nàycanexitlysosomesviatheaminoacidtransporterPQLC2[2]. Tuy nhiên, điều trị bằng cysteamine, mặc dù làm giảm tích lũy cystine lysosomal, chỉ làm chậm sự tiến triển của bệnh [3 Trận5]. Do đó, hiểu thêm về cơ chế bệnh sinh củabệnh cystinosisvà phát triển mới rapeuticoption vẫn nằm trong chương trình nghiên cứu. Một số mô hình động vật đã được phát triển để tóm tắt lại kiểu hình cystinosis [6,7]. Một trong những mô hình được sử dụng nhiều nhất là chuột Ctns −/− C57BL/6, phát triển tích tụ cystine và bệnh xơ cứng gần nhẹ. Tuy nhiên, nó không cho thấy tổn thương cầu thận và kiểu hình đã được tìm thấy phụ thuộc vào nền tảng di truyền [8].

Cho đến nay, các mô hình cá ngựa vằn đã trở thành một công cụ hấp dẫn để điều tra các bệnh ở người do một số lợi thế như sự phát triển nhanh chóng, khả năng sinh sản cao, chi phí bảo trì thấp hơn và sự sẵn có của các công nghệ chỉnh sửa gen dễ áp dụng [9]. Trong một nghiên cứu trước đây, chúng tôi đã trình bày một mô hình ấu trùng cá ngựa vằn gây ra với đột biến vô nghĩa đồng hợp tử trong exon 8 của gen ctns −/−, dẫn đến mất chức năng của bệnh cystinosis [10], dẫn đến sự tích tụ cystine trong toàn bộ cơ thể, tăng biến dạng ấu trùng, chậm phát triển vàthậnthiệt hại. Tuy nhiên, hậu quả bệnh lâu dài ở cá ngựa vằn trưởng thành vẫn chưa được nghiên cứu cho đến nay. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi nhằm mục đích mô tả đặc điểm củaThậnvà các biểu hiện ngoại bào trong mô hình cá ngựa vằn trưởng thành củabệnh cystinosis.

Nhấp để tự nhiênCistanche cho bệnh thận

2. Kết quả

2.1. Cystine tích lũy trong Ctns −/− Cá ngựa vằn

Bệnh cystinosisđược coi là một rối loạn đa hệ thống dẫn đến sự tích tụ cystine trong tất cả các tế bào của cơ thể. Trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi, chúng tôi phát hiện ra rằng cá ngựa vằn cystinosis (ctns −/−) hiển thị sự tích tụ cystine bắt đầu từ giai đoạn phát triển của ấu trùng và trong một số cơ quan cho đến khi được 8 tháng tuổi [9]. Để đánh giá xem mô hình của chúng tôi có duy trì sự tích tụ cystine ở giai đoạn sau của bệnh hay không, chúng tôi đã đo nồng độ cystine trong toàn bộ cơ thể,thận, tinh hoàn, mắt, cơ và não ở cá ngựa vằn 18 tháng tuổi so với cá ngựa vằn đực kiểu hoang dã phù hợp với lứa tuổi. Chúng tôi đã tìm thấy sự gia tăng gấp 54 lần hàm lượng cystine trong toàn bộ cơ thể (Hình 1A) và sự gia tăng gấp 146 lần ở thận (Hình 1B) của cá ngựa vằn ctns −/− so với cá ngựa vằn loại hoang dã. Hơn nữa, chúng tôi đã quan sát thấy sự tích tụ cystine rộng rãi trong tinh hoàn, mắt, cơ và não (Hình 1C – F) ở cá ngựa vằn ctns −/−.

2.2. Biểu hiện ở thận

2.2.1. Ctns−/− Cá ngựa vằn thiệt hại PTEC hiện tại

Kể từ khithậnlà cơ quan bị ảnh hưởng nghiêm trọng nhất, chúng tôi đã kiểm tra các đặc điểm mô học của thận bằng cách sử dụng nhuộm Hematoxylin và Eosin (H&E) và Axit-Shiff (PAS) định kỳ. Chúng tôi ghi nhận sự hiện diện của sưng đục, các giọt bạch cầu ái toan giống hyaline và không bào chất trong PTEC của cá ngựa vằn ctns −/− (Hình 2B, D) nhưng không phải ở cá ngựa vằn loại hoang dã (Hình 2A, C). Đáng chú ý, không có thiệt hại hình ống xa đã được tìm thấy. Các tinh thể cystine trước đây đã được quan sát thấy trong PTEC dưới dạng các không bào chất với hình dạng hình chữ nhật hoặc đa hình [11]. Do đó, chúng tôi đã điều tra xem những cấu trúc này cũng có mặt trong các ống cá ngựa vằn hay không. Chúng tôi đã tìm thấy nhiều không bào chất trong PTEC của cá ngựa vằn ctns −/− thông qua nhuộm màu xanh toluidine (Hình 3B, D, được biểu thị bằng dấu hoa thị). Ngoài ra, chúng tôi đã tìm thấy không gian vacuolar với hình chữ nhật hoặc đa hình (Hình 3B, D, được chỉ định bằng đầu mũi tên). Chúng tôi đã xác nhận phát hiện này bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) (Hình 3F). Những cấu trúc này không có trong PTEC của cá ngựa vằn loại hoang dã (Hình 3A, C, E). Thật thú vị, ngoài sự hiện diện của các không bào hình dạng đa hình, chúng tôi đã quan sát thấy sự mất một phần của đường viền bàn chải trong siêu cấu trúc PTEC (Hình 3F).

Hình 1. Hàm lượng Cystine trong homogenates của cá ngựa vằn loại hoang dã và ctns−/−. (A–F) Hàm lượng Cystine trong toàn bộ cơ thể (A),thận(B), tinh hoàn (C), mắt (D), cơ (E) và não (F) ở cá ngựa vằn đực loại hoang dã và ctns -/− 18 tháng tuổi. Nồng độ Cystine được biểu thị dưới dạng protein nmol / mg. Mỗi chấm đại diện cho một con cá ngựa vằn, với tổng số n = 3 loại hoang dã và n = 3 xu −/− Cá ngựa vằn đực 18 tháng tuổi; kiểm tra t không ghép đôi với sự điều chỉnh của Welch, hai phía: * p< 0.05;="" **="" p=""><0.01; ns:="" not="" significant.="">

Hình 2.Thậnmô học trong loại hoang dã và ctns −/− cá ngựa vằn. (Đ,B) Hình ảnh đại diện củaThậnống cá ngựa vằn loại hoang dã (A) và ctns −/− (B) cá ngựa vằn 18 tháng tuổi. Chi tiết các ống gần nhất với các giọt bạch cầu ái toan giống hyaline (đầu mũi tên đen) và không bào chất (*). Nhuộm H&E. Các thanh vảy đại diện cho 50 μm. (C, D) Hình ảnh đại diện của nhuộm PAS của ống thận loại hoang dã (C) và ctns -/− (D) Cá ngựa vằn 18 tháng tuổi. Chi tiết các ống gần nhất với các giọt giống hyaline (đầu mũi tên màu đen) và không bào chất (*). Pas nhuộm. Các thanh vảy đại diện cho 50 μm. PT: ống gần; DT: ống xa.

Hình 3.Thậntinh thể cystine trong PTECs cá ngựa vằn loại hoang dã và ctns −/− zebrafish. (Đ,B) Hình ảnh màu xanh toluidine đại diện củaThậnống gần nhất ở cá ngựa vằn loại hoang dã (A) và ctns −/− (B) Cá ngựa vằn 18 tháng tuổi. Các thanh vảy đại diện cho 50 μm. (C, D) Hình 3C, D cho thấy độ phóng đại cao hơn của Hình 3A, B. Chi tiết về các ống gần thận với không bào chất ((D); *), không gian hình chữ nhật và đa hình ((D); đầu mũi tên màu đen). (E, F) Hình ảnh TEM đại diện của ống gần thận của cá ngựa vằn loại hoang dã (E) và ctns −/− Cá ngựa vằn 18 tháng tuổi (F). (F) Mất một phần bộ gần đây (PB) vàaccumulationoftherectangularandpolymorphousvacuoles (*) đã được quan sát thấy trong ống gần thận của ctns−/− cá ngựa vằn. Chế độ xem có độ phóng đại cao của hình chữ nhật ở góc dưới cùng bên phải cho thấy các không bào đa hình và một không bào lớn với các đoạn đường viền màng thẳng (một đường thẳng). Các thanh tỷ lệ đại diện cho 5 μm.

2.2.2. Ctns−/− Zebrafish cho thấy phì đại cầu thận

Vì tổn thương cầu thận thường theo tổn thương PTEC, chúng tôi đã đánh giá mô học cầu thậnofthectns−/− zebrafish,andweobservedthatctns−/− malezebrafishshowedsignificant enlargeion of Bowman's capsule (Figure 4B, E) and glomerular tuft (Figure 4B, F), nhưng không phải là không gian của Bowman (Hình 4B, G) khi so sánh với cá ngựa vằn đực loại hoang dã (Hình 4A, E – G). Thesamewasconfirmedfortheglomerulartuftinfemalezebrafishcarrying đột biến ctns−/− (Hình 4F), và một xu hướng tương tự đã được quan sát thấy khi đo lườngtheBowman'sspaceandtheBowman'scapsule(Hình4E, G). Noproliferationofmesangial tế bào hoặc glomerulosclerosis đã được quan sát thấy. Trên các hình ảnh TEM, chúng tôi đã không quan sát thấy sự thay đổi trên màng đáy cầu thận, quá trình effacement chân podocyte hoặc các tế bào nội mô fenestrated bất thường trong cầu thận của ctns -/− cá ngựa vằn (Hình 4D) so với cá ngựa vằn loại hoang dã (Hình 4C).

Hình 4. Hình thái cầu thận ở kiểu hoang dã và trong ctns −/− cá ngựa vằn. (Đ,B) Hình ảnh đại diện của cầu thận của cá ngựa vằn loại hoang dã (A) và ctns −/− (B) 18 tháng tuổi. Pas nhuộm. Các thanh tỷ lệ đại diện cho 50 μm. (C, D) Hình ảnh TEM đại diện của cầu thận của cá ngựa vằn loại hoang dã (ctns −/− (D). Các thanh tỷ lệ đại diện cho 1 μm. (E – G) Việc định lượng các diện tích bề mặt của viên nang Bowman (E), búi cầu thận (F) và không gian Bowman (G) của cá ngựa hoang dã và cá ngựa vằn ở cả hai giới tính.

2.2.3. Ctns −/− Zebrafish hiển thị quá trình Apoptosis tăng lên ở cấp độ PTEC

Tiếp theo, chúng tôi đã điều tra xem liệubệnh cystinosiskích hoạt chết tế bào trong mô hình cá ngựa vằn của chúng tôi [10,12]. Chúng tôi đã thực hiện cắt bỏ miễn dịch caspase-3 trongThậncác mô của cá ngựa vằn loại hoang dã và ctns −/− và chúng tôi đã quan sát thấy sự gia tăng đáng kể nồng độ protein caspase3 bị phân cắt trong PTEC của cá ngựa vằn ctns −/− (Hình 5B, D, G) so với cá ngựa vằn loại hoang dã (Hình 5A, C, G) ở cả hai giới tính. Biểu hiện của caspase-3 bị cắt chủ yếu xuất hiện trong các tế bào cho thấy các không bào chất đa hình (Hình 5B, D). Không có biểu hiện nào của caspase-3 bị cắt có trong cầu thận, cả ở cá ngựa vằn kiểu hoang dã và ctns −/− (Hình 5E, F).

Hình 5. Tăng quá trình chết rụng ở PTECs với không bào ở cá ngựa vằn −/−. (Đ,B) Hình ảnh đại diện của sự phân tách miễn dịch caspase-3 của các ống thuộc loại hoang dã (A) và ctns− cá ngựa vằn già. Các thanh tỷ lệ đại diện cho 50 μm. (C, D) Các tấm phía dưới cho thấy độ phóng đại cao hơn của các khu vực đóng hộp ở các bảng trên. Chi tiết về PTECs có không bào chất (*). Các thanh vảy đại diện cho 50 μm. (E, F) Hình ảnh đại diện của sự phân tách miễn dịch caspase-3 của cầu thận loại hoang dã (E) và ctns −/− (F) Cá ngựa vằn 18 tháng tuổi. Các thanh vảy đại diện cho 50 μm. (G) Việc định lượng khu vực dương tính nhuộm caspase-3 hình ống ở loại hoang dã và cá ngựa vằn ở cả hai giới. Mỗi dấu chấm đại diện cho một con cá ngựa vằn, với tổng số n = 3 loài cá ngựa vằn loại hoang dã và ctns −/− Cá ngựa vằn 18 tháng tuổi. ANOVA hai chiều với thử nghiệm sự khác biệt ít đáng kể nhất của Fisher (PLSD): ** p< 0.01;="" ***="" p="">< 0.001.="">

2.3. Biểu hiện thận phụ

2.3.1. Ctns−/− Zebrafish cho thấy một mô hình da đốm giảm sắc tố đặc trưng

Bệnh cystinosisbệnh nhân thường có biểu hiện lão hóa da sớm, giảm sắc tố và tóc vàng [1,13]. Điều thú vị là chúng tôi đã quan sát thấy một mô hình đốm giảm sắc tố trên da của cá ngựa vằn ctns −/−, trong khi cá kiểu hoang dã trình bày mô hình sọc đen điển hình. Kiểu hình có mặt ở cả hai giới trong suốt cuộc đời của họ (Hình 6A, B). Để điều tra sự khác biệt về sắc tố, chúng tôi đã thực hiện nhuộm PAS trên da cá ngựa vằn và chúng tôi nhận thấy rằng cá ngựa vằn ctns −/− hiển thị sự phân bố thay đổi của lớp melanin trong lớp biểu bì, gây ra mô hình đốm sáng (Hình 6C, D).

Hình 6. Mô hình da đốm giảm sắc tố ở ctns −/− cá ngựa vằn. (Đ,B) Hình ảnh đại diện của cá ngựa vằn loại hoang dã (A) và ctns -/− (B) 18 tháng tuổi. Các thanh tỷ lệ đại diện cho 0,5cm. Các đầu mũi tên màu đen chỉ ra các mẫu da sọc khác nhau. (C,D) Hình ảnh nhuộm PAS về lớp biểu bì của cá ngựa vằn loại hoang dã (C) và ctns −/− (D) 18 tháng tuổi. Các đầu mũi tên màu đen làm nổi bật lớp melanin. Sự gián đoạn trong lớp melanin hiện diện trong ctns−/− (D) trong khi nó không có ở cá ngựa vằn loại hoang dã (C). Các thanh tỷ lệ đại diện cho 50 μ

2.3.2. Ctns−/− Cá ngựa vằn cho thấy u nang sinh tinh được làm giàu trong tinh trùng

Bệnh cystinosisđược biết là ảnh hưởng đến chức năng tinh hoàn, dẫn đến azoospermia và vô sinh ở bệnh nhân nam [14–16]. Nguồn gốc của azoospermia vẫn chưa rõ ràng, mặc dù sự sinh tinh trùng đã được chứng minh là còn nguyên vẹn ở cấp độ tinh hoàn. Trái ngược với bệnh nhân nam, nữ giới bị bệnh cystinosis có khả năng sinh sản [17]. Trong mô hình cá ngựa vằn của chúng tôi, cả cá ngựa vằn cái và cá ngựa vằn đực đều có khả năng sinh sản. Để điều tra xem liệu đột biến ctns −/− có ảnh hưởng đến giải phẫu tinh hoàn hay không, chúng tôi đã thực hiện nhuộm PAS và chúng tôi tìm thấy sự tích tụ gia tăng của tinh trùng trong u nang sinh tinh trùng ở ctns −/− cá ngựa vằn

Hình 7. U nang sinh tinh được làm giàu trong tinh trùng ở ctns −/− cá ngựa vằn. (Đ,B) Đại diện H&E nhuộm hình ảnh tinh hoàn loại hoang dã (A) và ctns−/− (B) cá ngựa vằn 18 tháng tuổi. Màu xanh đậm và nhuộm tròn đại diện cho tinh trùng tích lũy trong các u nang sinh tinh trùng (được chỉ định bằng dấu hoa thị). Các thanh tỷ lệ đại diện cho 200 μm.

2.3.3. Ctns−/− Cá ngựa vằn cái cho thấy sản lượng trứng giảm

Để điều tra chức năng của hệ thống sinh sản, chúng tôi đã đo sản lượng trứng và tỷ lệ trứng được thụ tinh ở cả cá ngựa vằn loại hoang dã và ctns −/−. Chúng tôi phát hiện ra rằng ctns−/−con cái cho thấy sản lượng trứng giảm (Hình 8A) và giảm tỷ lệ trứng được thụ tinh (Hình 8B) so với con cái kiểu hoang dã.

Hình 8. Sản lượng trứng và tỷ lệ trứng được thụ tinh ở cá ngựa vằn loại hoang dã và ctns −/−. (A) Sản lượng trứng được đo bằng tổng số trứng ở loại hoang dã và ctns −/− cá ngựa vằn 18 tháng tuổi. Tỷ lệ sản xuất trứng cao 1,941 ở cá ngựa vằn loại hoang dã so với cá ngựa vằn loại 18 tháng tuổi (tỷ lệ = 1,941); CI 95% (giới hạn dưới = 1,165, giới hạn cao hơn = 3,234); Phân tích hồi quy Poisson; p = 0, 011. (B) Tỷ lệ trứng được thụ tinh được đo trên tổng số trứng. Tỷ lệ trứng được thụ tinh là 3.504 ở cá ngựa vằn loại hoang dã cao hơn so với cá ngựa vằn 18 tháng tuổi (tỷ suất chênh = 3.504); CI 95% (giới hạn dưới = 2.005, giới hạn cao hơn = 6.124); Phân tích hồi quy logistic; p< 0.001;="" n/a:="" not="" applicable.="">

2.3.4. Ctns−/− Zebrafish Display Giảm hoạt động vận động của Locomotor

Kể từ khi lãng phí cơ bắp và yếu đã được chẩn đoán trongbệnh cystinosisbệnh nhân, nói chung là từ thập kỷ thứ hai của cuộc đời [1,18], chúng tôi đã đánh giá hoạt động vận động trong mô hình cá ngựa vằn của chúng tôi. Chúng tôi phát hiện ra rằng cá ngựa vằn ctns −/− từ cả hai giới cho thấy hoạt động vận động của người vận động giảm so với cá ngựa vằn kiểu hoang dã, cho thấy chức năng cơ bắp bị suy giảm (Hình 9). Tuy nhiên, phân tích mô học của mô cơ xương không cho thấy những bất thường rõ ràng ở cá ngựa vằn ctn−/−.