Nghiên cứu về tác dụng chống trầm cảm và cơ chế của cistanche phenylethanol glycoside ở chuột

Tóm tắt:

 

Nghiên cứu này nhằm mục đích điều tra các tác dụng điều trị và cơ chế củaCistanche phenylethanol glycosides(CPHG) về hành vi giống như trầm cảm gây ra bởi căng thẳng nhẹ không thể đoán trước (CUMS) ở chuột. Chuột được chia ngẫu nhiên thành nhóm đối chứng, nhóm mô hình, nhóm CPHG liều cao (700 mg/kg), nhóm CPHG liều giữa (350 mg/kg), nhóm CPHG liều thấp (175 mg/kg) và nhóm fluoxetine (15 mg/kg). Sau bốn tuần can thiệp thuốc tương ứng, các xét nghiệm thần kinh đã được tiến hành; Xét nghiệm miễn dịch liên kết với enzyme đã được sử dụng để phát hiện mức độ dẫn truyền thần kinh trong huyết thanh, cũng như nội dung của các yếu tố viêm và chất trung gian trong mô vùng đồi thị. Nhuộm hematoxylin-eosin và NISSL được sử dụng để quan sát những thay đổi bệnh lý trong mô vùng đồi thị. Hóa mô miễn dịch và phương pháp miễn dịch huỳnh quang đã được sử dụng để phân tích mật độ của tế bào hình sao và microglia trong mô vùng đồi thị của chuột, cũng như mức độ biểu hiện của thụ thể 4/Nf Kết quả cho thấy CPHG có thể cải thiện hành vi giống như trầm cảm ở chuột, tăng sự ưu tiên đối với nước ngọt và giảm thời gian bất động, tăng cường đáng kể mức độ serotonin và dopamine trong huyết thanh chuột, đồng thời ức chế sự biểu hiện của các chất trung gian gây viêm và các yếu tố ở vùng đồi thị. Phân tích hóa mô miễn dịch chỉ ra rằng CPHG có thể làm tăng mật độ tế bào hình sao ở vùng đồi thị, làm giảm việc kích hoạt microglia và ức chế sự biểu hiện của các protein liên quan đến inflammasome NLRP3. Các thí nghiệm miễn dịch huỳnh quang đã chứng minh rằng cơ chế thông qua đó CPHG làm giảm sự hình thành gây viêm là bằng cách giảm kích hoạt con đường truyền tín hiệu TLR4/NF-κB trong mô vùng đồi thị. Tóm lại, CPHG thể hiện tác dụng chống trầm cảm đáng kể đối vớiCums gây ra trầm cảm như hành vi, có khả năng thông qua việc điều chỉnh mức độ dẫn truyền thần kinh và ức chế các phản ứng viêm thần kinh, cung cấp bằng chứng thực nghiệm cho ứng dụng của nó trong điều trị trầm cảm.

Từ khóa: cistanche phenylethanol glycosides; trầm cảm; phản ứng thần kinh; tế bào hình sao; TLR4/NFκB/NLRP3 con đường

Thảo dược Cistanche nguyên liệu

 

Trầm cảm là một rối loạn tâm thần tình cảm phổ biến và phức tạp được đặc trưng bởi các triệu chứng như tâm trạng thấp, anhedonia, suy nghĩ chậm và rối loạn chức năng sinh lý. Trong trường hợp nghiêm trọng, xu hướng tự tử thậm chí có thể xảy ra [1]. Theo "Báo cáo về tình trạng dinh dưỡng và bệnh mãn tính của cư dân Trung Quốc (2020)", tỷ lệ trầm cảm ở nước tôi đạt 2,1%và được Tổ chức Y tế Thế giới liệt kê là một trong những bệnh tật bị khuyết tật cao nhất thế giới [2]. Vì sinh bệnh học của trầm cảm là rất phức tạp, cơ chế cụ thể vẫn chưa rõ ràng cho đến nay, điều này đặt ra một thách thức lớn đối với việc điều trị của nó. Trong những năm gần đây, các học giả trong và ngoài nước đã phát hiện ra rằng trầm cảm có thể liên quan chặt chẽ đến kích hoạt viêm miễn dịch. Trong quá trình kích hoạt phản ứng viêm trong hệ thống thần kinh trung ương, việc kích hoạt các tế bào viêm vùng đồi thị là biểu hiện đặc trưng của nó. Các tế bào viêm vùng đồi thị được kích hoạt liên tục gây ra sự giải phóng nhiều cytokine gây viêm, tạo thành một "tác dụng tầng" gây viêm, do đó tham gia vào quá trình sinh bệnh học và bệnh lý của các bệnh tâm thần như trầm cảm [3]. Hiện tại, việc điều trị bệnh này chủ yếu dựa vào y học phương Tây, chẳng hạn như fluoxetine, venlafaxine, duloxetine, v.v. Y học cổ truyền Trung Quốc có lợi thế của nhiều mục tiêu hơn và ít tác dụng phụ hơn trong điều trị các bệnh về tình cảm, và có triển vọng ứng dụng rộng rãi trong điều trị trầm cảm và các biến chứng của nó [5].

 

Cistanche sa mạclà thân thịt khô với lá phốt pho của sa mạc cistanche ycma và/hoặc cistanche tubulosa (Schenk), cả hai đều là thực vật của họ Orobanchaceae. Đó là một sản phẩm thực phẩm và thuốc ngon. Nghiên cứu dược lý hiện đại đã xác nhận rằng sa mạc Cistanche có tác dụng bảo vệ thần kinh (nó có thể ức chế bệnh Alzheimer, bệnh Parkinson, v.v.). "Cistanche tổng số glycoside", chủ yếu bao gồm phenylethanol glycoside trong sa mạc cistanche, được sử dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh thần kinh [6]. Phenylethanol glycoside (CPHG) là các thành phần hoạt động quan trọng trong tổng số glycoside cistanche. Chúng có nhiều chức năng sinh học như chống khối u, điều hòa miễn dịch và chất chống oxy hóa, và cho thấy triển vọng ứng dụng tốt [7]. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng CPHG có thể bảo vệ tác dụng của monoamine và làm giảm các triệu chứng trầm cảm bằng cách tăng con đường chuyển hóa ceramide trong provia nigra và hàm lượng dopamine (DA) trong vân [8]; Nó cũng có thể điều chỉnh hành vi giống như trầm cảm của chuột với hội chứng mãn kinh bằng cách cải thiện mức độ dẫn truyền thần kinh monoamine trong não [9]. Tuy nhiên, không có báo cáo nào về việc sử dụng nó trong việc điều trị mô hình trầm cảm do căng thẳng nhẹ không thể đoán trước (CUMS), và cơ chế hoạt động của nó vẫn còn được làm sáng tỏ. Dựa trên nghiên cứu trước đây và kết hợp với tiềm năng hiện tại của CPHG trong stress chống oxy hóa, điều chỉnh viêm thần kinh và ức chế apoptosis tế bào thần kinh, nghiên cứu này đã sử dụng mô hình chuột do CUMS gây ra Tác dụng chống trầm cảm của CPHG, mở rộng ứng dụng lâm sàng, và phát triển và sử dụng nó như một thực phẩm sức khỏe.

 

1 vật liệu và phương pháp

1.1 Vật liệu và Dụng cụ

Chiết xuất CPHG (phenylethanol glycoside trong chiết xuất lớn hơn hoặc bằng 85%, bao gồm echinacoside lớn hơn hoặc bằng 40%, verbascoside lớn hơn hoặc bằng 16%; Viên nang hydrochloride Fluoxetine (Fluoxetine, FLX) (số lô: 8533C, Công ty Dược phẩm Patheon France, Pháp); {{5} ara cảm ứng nitric oxide synthase (inos), cyclooxygenase -2 (cyclooxygenase -2, cox -2), prostaglandin E2 (interleukin -1, il -1), il -18 ( Bộ dụng cụ xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme (Batch số: ER050A332132, ER035PD09812, ER048H753146, ER10x6398452, ER051H648219, ER09X28 Công ty TNHH Công nghệ sinh học Vũ Hán, Ltd.); Phân tử chuyển đổi liên kết canxi ion hóa 1 (phân tử bộ chuyển đổi liên kết canxi bị ion hóa 1, IBA -1) kháng thể đơn dòng, protein axit fibrillary glial Gr 3379124-30, gr 3285067-28, abcam, uk); Kháng thể đơn dòng giống như thụ thể 4 (TLR4), yếu tố hạt nhân phosphoryl hóa-p65 (yếu tố phospho-nuccle-κB p65, p-NF-κB p65) 4% paraformaldehyd, bộ nhuộm miễn dịch huỳnh quang (Batch số 20240106, 20240315, Công ty TNHH Công nghệ sinh học Thượng Hải); Hematoxylin và eosin (hexa) eosin, he) Bộ nhuộm, bộ nhuộm Nissl (số lô: 20240401, 20240402, sinh học Meilun); Bộ dụng cụ hóa học miễn dịch (số lô: 43731a, Bắc Kinh Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd.).
ME2 0 4E 1/10, 000 Số dư điện tử (Mettler Toledo, USA); Hệ thống nước tinh khiết trong phòng thí nghiệm Milli-Q (Merck, Đức); Reader Macroplate đa chức năng ID3 (Thiết bị phân tử, Hoa Kỳ); Kính hiển vi huỳnh quang Leicadm 2000 (Leica, Đức); 63008 Cánh đồng mở, 63010 Mê cung cấp cao, 63022 Bơi bắt buộc, Mê cung nước DB001 Morris, Hệ thống phân tích video hành vi động vật thông minh 3.0 (Shenzhen Ruiwode Life Science Technology Co., Ltd.).

60 SPF C57BL/6 Chuột, cân 18-22 g, được mua từ Bắc Kinh Weitong Lihua Thử nghiệm Công nghệ Công nghệ động vật, Ltd.
Những con chuột được giữ trong môi trường SPF, với nhiệt độ môi trường được kiểm soát ở (21 ± 2), độ ẩm duy trì ở mức 60% ± 10% và chu kỳ tối-tối 12 giờ. Những con chuột có quyền truy cập miễn phí vào thực phẩm và nước uống, và thí nghiệm bắt đầu sau 1 tuần cho ăn thích nghi. Các động vật thí nghiệm được giữ tại trung tâm động vật thí nghiệm của Đại học Y khoa Trung Quốc. Tất cả các quy trình thí nghiệm của chuột trong nghiên cứu này đã được phê duyệt bởi Ủy ban Đạo đức Thí nghiệm Động vật của Đại học Y khoa Trung Quốc (SUCMDL20231015003).

 

1.2 Phương pháp thử nghiệm

1.2.1 Nhóm, mô hình hóa và quản lý thuốc

Sau 1 tuần cho ăn thích nghi 7- Chuột SPF C57BL/6 tuần tuổi, chuột không đàn hồi đáp ứng các yêu cầu của các thí nghiệm tiếp theo được sàng lọc thông qua thử nghiệm ưu tiên nước đường và phân chia ngẫu nhiên thành nhóm . Ngoại trừ con, những con chuột trong các nhóm khác bắt đầu bị căng thẳng trong 4 tuần [10]. Tổng cộng có 10 yếu tố gây căng thẳng, bao gồm hạn chế (1 giờ), lắc (1 giờ), huyền phù đuôi (1 h), 45- độ nghiêng lồng độ (24 h), giường ướt (24 giờ), lồng trống (24 giờ) Hai kích thích được chọn ngẫu nhiên mỗi ngày và cùng một kích thích không xuất hiện trong hai ngày liên tiếp. Sau 4 tuần mô hình hóa, chuột CPHGS-H, CPHGS-M và CPHGS-L đã được cung cấp liều CPHGS tương ứng bằng cách tăng trưởng theo trọng lượng cơ thể và chuột FLX đã được phát ra bằng fluoxetine (10 mg/kg). Liều lượng của CPHGS-M và FLX ở chuột được chuyển đổi theo hệ số tương đương của diện tích bề mặt cơ thể giữa người lớn và chuột, và sự dao động của 2 lần là liều CPHG thấp và cao. Chuột CON và MOD đã được cung cấp một khối lượng nước khử ion bằng nhau bằng cách gavage. Những con chuột đã được nuôi một lần một ngày trong 4 tuần. Các thử nghiệm thần kinh đã được thực hiện vào tuần thứ 8.

 

1.2.2 Thí nghiệm thần kinh

1.2.2.1 Thí nghiệm ưu tiên nước đường

Trước khi kiểm tra ưu tiên sucrose (SPT), chuột nên được đặt trong một lồng duy nhất và sau đó thích nghi với nước đường trong 3 ngày. Vào ngày đầu tiên, hai chai 1% nước sucrose đã được đưa ra trong 24 giờ, và vào ngày thứ hai, một chai nước đường và một chai nước khử ion đã được đưa ra trong 24 giờ. Vào ngày thứ ba, các vị trí của nước đường và nước tinh khiết đã được trao đổi trong 24 giờ, và thí nghiệm đã kết thúc 24 giờ sau đó. Vào ngày thứ tư, những con chuột bị nhịn ăn và thiếu nước trong 24 giờ. Vào ngày thứ năm, một chai nước đường và một chai nước tinh khiết được đưa ra sau khi cân, và các vị trí được trao đổi sau 12 giờ. Sau 24 giờ, hai chai được lấy ra và cân lại, và tỷ lệ tiêu thụ nước đường được tính toán (tỷ lệ tiêu thụ nước đường=tiêu thụ nước đường/(tiêu thụ nước đường + mức tiêu thụ nước) × 100%).

 

1.2.2.2 Kiểm tra trường mở

Thử nghiệm trường mở (OFT) được thực hiện trong hộp mở khối lập phương 50 cm × 50 cm × 50 cm. Trung tâm của hộp được xác định là một hình vuông có chiều dài bên 25 cm. Những con chuột được đặt ở giữa hộp và được phép thích nghi trong 5 phút. Quỹ đạo chuyển động của chuột được phân tích trong 5 phút qua. Các chỉ số đánh giá bao gồm tổng khoảng cách di chuyển của chuột trong trường mở, thời gian hoạt động ở trung tâm của trường mở và số lần chúng vào trung tâm. 1.2.2.3 Kiểm tra hệ thống treo đuôi Thử nghiệm treo đuôi (TST) là treo chuột bằng đuôi của nó để đầu của nó được giữ ở một khoảng cách nhất định từ mặt đất. Cuộc đấu tranh của những con chuột trong vòng 6 phút đã được ghi lại và thời gian bất động của chuột trong 4 phút qua đã được phân tích.

 

1.2.2.4 Thử nghiệm bơi bắt buộc

Thử nghiệm bơi bắt buộc (FST) là đặt chuột vào thùng hình trụ trong suốt (đường kính 15 cm × 50 cm) chứa đầy nước (25 ± 2) độ nước, với mực nước đạt 20 cm. Cuộc đấu tranh của chuột trong nước trong vòng 6 phút đã được ghi lại và thời gian bất động của chuột trong 4 phút cuối cùng đã được phân tích.

 

1.2.3 Bộ sưu tập mẫu

Vào cuối tuần thứ 8, chuột đã được gây mê sâu bằng cách tiêm natri pentobarbital trong màng bụng (3%, 10 ml/kg). Sau khi gây mê, trạng thái gây mê đã được xác nhận bằng cách quan sát hơi thở chậm, thư giãn cơ và không có phản ứng với phẫu thuật. Sau đó, máu của chuột được thu thập bằng cách loại bỏ mắt và chuột bị giết bởi trật khớp cổ tử cung. Trái tim được tưới máu bằng nước muối, và sau đó bộ não đã nhanh chóng được mở ra và bộ não nguyên vẹn đã được loại bỏ. Nó được rửa sạch bằng nước muối làm mát trước, và một nửa trong số đó được cố định với 4% paraformaldehyd trong 72 giờ; Các mô vùng đồi thị của nửa kia được tách ra trên băng và được lưu trữ trong nitơ lỏng để sử dụng sau này. Lấy 10 mg mẫu mô vùng đồi thị chuột, thêm nước muối sinh lý làm mát trước với tỷ lệ khối lượng khối là 1: 9, và đồng nhất hóa cơ học trong bể nước đá. Sau khi đồng nhất hóa, ly tâm tại 4 000 r/phút trong 15 phút (bán kính ly tâm 4,5 cm), thu thập phần nổi phía trên để phát hiện.

 

1.2.4 Xác định chỉ số dẫn truyền thần kinh

Lấy một lượng thích hợp của huyết thanh chuột và phần nổi phía trên của mô vùng đồi thị và phát hiện nội dung của nội dung 5- HT và DA theo phương pháp hoạt động của bộ.

 

1.2.5 Xác định chỉ số sinh hóa mô vùng đồi thị

Lấy phần nổi phía trên của hopogenate mô vùng đồi thị và sử dụng bộ BCA để xác định nồng độ protein. Theo các hướng dẫn của bộ, độ hấp thụ a của các chất trung gian gây viêm (inos, cox -2 và pge2) và các yếu tố viêm (TNF, IL -1, IL Điểm đánh dấu và nội dung của mỗi chất được tính toán và dữ liệu được ghi lại và phân tích thống kê.

 

1.2.6 Anh ta nhuộm mô hải mã

Các mẫu mô não toàn bộ cố định trong hơn 72 giờ đã được lấy và các phần parafin được thực hiện với độ dày 4 μm. Sau khi khử wewax bằng xylene, các mẫu được ngậm ethanol gradient (ngâm trong ethanol I và II 100% trong 5 phút và trong 95%, 90%, 80% và 70% ethanol trong 2 phút Axit ethanol trong 2 giây và rửa sạch trong nước máy trong 10 phút. Mất nước với ethanol gradient (80% ethanol trong 2 phút, 95% ethanol trong 2 phút, ethanol I và 100% ethanol II trong 5 phút mỗi lần), trong suốt bằng xylene, được niêm phong bằng kẹo cao su trung tính và sấy khô không khí. Những thay đổi hình thái của các tế bào mô vùng đồi thị ở mỗi nhóm chuột được quan sát dưới kính hiển vi.

 

1.2.7 Nissl nhuộm mô vùng đồi thị

Các phần parafin được điều chế trong "1.2.5" được khử wewax và ngậm nước, sau đó nhuộm bằng dung dịch nhuộm NISSL trong 10 phút, rửa hai lần bằng nước cất trong 3 phút mỗi lần, khử nước bằng ethanol gradient (ethanol 80% trong 2 phút với ethanol. Những thay đổi hình thái của các tế bào mô vùng đồi thị ở mỗi nhóm chuột được quan sát dưới kính hiển vi.

 

1.2.8 Hóa mô miễn dịch mô hải mã

Các mẫu mô vùng đồi thị được nhúng parafin được xử lý bởi nhuộm hóa mô miễn dịch (IHC) theo hướng dẫn của bộ hóa mô miễn dịch toàn cầu. Sau khi khử wewax, hydrat hóa, sửa chữa kháng nguyên, chặn peroxidase và chặn, IBA -1 (1: 400), GFAP (1: 400), LRP31: 300) và các kháng thể chính Caspsae1 (1: 400) đã được thêm vào và ủ qua đêm ở 4 độ. Sau khi phát triển màu DAB, nhuộm hạt nhân, mất nước và niêm phong, biểu hiện tích cực của IBA1, GFAP, NLRP3 và Caspsae -1 đã được quan sát dưới kính hiển vi ánh sáng và hình ảnh được phân tích bằng hình ảnh J.

1.2.9 Phát hiện miễn dịch huỳnh quang mô vùng đồi thị

Các mẫu mô vùng đồi thị nhúng parafin được xử lý bằng nhuộm miễn dịch huỳnh quang theo hướng dẫn của bộ dụng cụ miễn dịch huỳnh quang. Các phần parafin được điều chế theo "1.2.5" đã bị khử wewax, ngậm nước, sửa chữa kháng nguyên và bị chặn, và sau đó TLR4 (1: 400) và P-NF-p65 (1: 200) kháng thể được thêm vào các phần và được ủ qua đêm ở 4 độ. Kháng thể chính đã được loại bỏ vào ngày hôm sau, rửa ba lần bằng PBS và kháng thể thứ cấp (1: 500) đã được thêm vào và ủ trong bóng tối trong 1 giờ. Sau khi rửa ba lần, các phần được niêm phong bằng một bản cố định có chứa DAPI. Tín hiệu huỳnh quang của vùng mô vùng đồi thị được quan sát thấy bằng kính hiển vi huỳnh quang và hình ảnh được phân tích bằng hình ảnh J.

 

1.3 Xử lý dữ liệu

Dữ liệu thử nghiệm được phân tích thống kê bằng phần mềm thống kê SPSS 26. 0 và GraphPad Prism 9. 0. Dữ liệu được biểu thị dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (x ± S) và phân tích được thực hiện bằng ANOVA một chiều. Việc so sánh giữa hai nhóm được thực hiện bằng cách sử dụng thử nghiệm của Dunnett. P<0.05 indicated that the difference was statistically significant.